CN115558677A - 一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法 - Google Patents

一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法。本发明通过敲除质粒同源重组、插入回补质粒以及环出敲除质粒三步法方案来构建基于自杀质粒的细菌必需基因的缺失突变菌株。利用该方法，以铜绿假单胞菌PA0006基因作为目的基因，团队详细研究了假单胞菌必需基因PA0006的功能与抑制分析，结合显微观察、免疫印迹、转录组测序与DNA重测序等技术发现PA0006在细胞形态和脂多糖核心寡糖的生物合成中发挥着调节作用。PA0006基因也是开发治疗和预防铜绿假单胞菌引起疾病的新药靶标。与现有技术对比，本发明简单、快速、有效，方法可广泛应用于细菌必需基因的表型和抑制分析。

Description

一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法。
背景技术
微生物必需基因是那些在丰富培养基中编码细胞生长不可缺少的功能的基因。转座子插入测序(Tn-seq)技术允许在微生物基因组水平上通过插入排除来鉴定必需基因，目前通过使用Tn-seq方法，已经在铜绿假单胞菌PAO1中提出了近350个必需基因，对铜绿假单胞菌的必需基因进行了全面的基因组研究，为挖掘细胞生长所必需的新生物过程和新药开发的目标提供了资源。然而这些必需基因的抑制性分析尚未完成，350个必需基因中超过15.7％被归类为编码假设蛋白或保守假设蛋白，现有技术中缺乏构建铜绿假单胞菌必需基因条件等位基因型的系统方法。
可调控的启动子，如依赖阿拉伯糖的PBAD启动子和杂合的trp-lac启动子Ptac，常通过控制它们的转录水平用于必需基因的分析。最近，利用dead-Cas9(dCas)介导的抑制靶基因转录的CRISPR干涉(CRISPRi)技术已被报道用于大规模研究枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌的必需基因。然而，CRISPRi介导的突变体倾向于在dCas9中积累突变，导致长时间生长后转录抑制缺失。因此，转录调控介导的突变不适合用于必需基因的抑制因子分析。
授权公告号为CN109777830B、授权公告日为2022年5月20日的中国专利公开了一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法，构建双质粒系统：敲除质粒(KO质粒)和营救质粒(Rescue质粒)，将两个质粒同时转入细胞后用药筛若干天，分选单克隆，通过测序鉴定，获得必需基因纯合敲除细胞系。许多必需基因在酵母中被发现是可抑制的。通过使用互补质粒的条件致死基因，必需基因抑制性的系统分析已经鉴定出7-17％的必需基因在酵母中是可抑制的。酵母中必需基因的缺失等位基因可以在二倍体细胞中构建成有活力的杂合子。引入回补质粒后，诱导杂合二倍体细胞形成孢子，产生单倍体孢子或含有带有回补质粒的缺失等位基因的细胞。然而，这些方法不适用于细菌细胞。
发明内容
为了解决现有技术中缺乏对必需基因进行反向遗传分析的方法的技术问题，本发明提出了一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法。本发明简单、快速、有效，能达到对细菌中必需基因进行反向遗传分析的效果。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种对必需基因进行反向遗传分析的方法，包括以下步骤：
(1)向细菌细胞中引入含有缺失目的基因等位基因片段的敲除质粒，筛选出敲除质粒通过单交换同源重组整合到细菌细胞染色体中的细菌细胞；
(2)转化含有目的基因自身启动子及其控制的野生型等位基因片段的回补质粒，筛选出含有回补质粒的细菌细胞；
(3)通过环出效应切除细菌细胞基因组中的部分片段，而后筛选出切除了目的基因并保留缺失目的基因等位基因的细菌细胞；
(4)对缺失突变体细胞控制表达并观察表型，进行表型评估和抑制性分析。
作为优选，所述方法具体包括以下步骤：
(S1)用渗透物将细菌细胞制备成电感受态细胞，通过电穿孔或接合的转化方法，引入含有用于筛选转染成功的细胞的抗药基因A、反向选择标记基因a和目的基因自身启动子加上其缺失目的基因等位基因片段的敲除质粒，敲除质粒通过单交换同源重组整合到细胞染色体中；用与抗药基因A对应的药物A筛选，得到敲除质粒转染成功的细菌细胞；
(S2)转化含有与抗药基因A不同的抗药基因B、用于观察表型的基因b和目的基因自身启动子及其控制的野生型等位基因片段的回补质粒；用与抗药基因B对应的药物B筛选，得到回补质粒转染成功的细菌细胞；
(S3)使用反向选择标记基因a进行负筛选，得到通过环出效应切除敲除质粒的细菌细胞；(S4)使用药物A、药物B和反向选择标记基因a对细菌细胞进行表型检查，细胞对反向选择标记基因a和药物A敏感，培养细胞；
(S5)使用引物特异性PCR对细胞染色体环出序列进行检测，保留染色体缺失目的基因的缺失突变体细胞；
(S6)培养缺失突变体细胞，控制用于观察表型的基因b表达并观察细胞，进行表型评估分析。
作为优选，所述敲除质粒的制备方法包括以下步骤：
以质粒1为原料，将抗药基因A、反向选择标记基因a通过同源重组克隆，产生质粒1-A-a；将目的基因缺失盒克隆到质粒1-A-a中，得到敲除质粒1-A-a；目的基因缺失盒包含带有中间缺失目的基因编码的上游和下游序列。
质粒是一段具有自主复制能力的环状DNA序列，在子代细胞中可以保持恒定的拷贝数，同时表达质粒上所携带的遗传信息。质粒可以作为载体将有用的外源基因通过基因工程手段插入到质粒序列中，然后通过转化技术，转入受体细胞使目标基因在受体菌中得以扩增或表达。
质粒上如果含有和宿主相同的序列片段(通常100-1000bp)，则会发生同源重组，质粒序列会完整地整合到宿主基因组中，如果质粒上含有可在宿主中自主复制的复制子序列，则同源重组发生概率会极大降低。如果质粒没有可在宿主中自主复制的序列，则当质粒通过外源转化进入宿主细胞后，质粒上的DNA序列只能以同源重组的方式得以在分裂的子细胞中保留。因此我们利用这一原理，来构建细菌必需基因敲除质粒。
由于敲除质粒的复制子序列无法在细菌中独立复制，只能通过同源重组的方式插入细菌的基因组内，这一事件被称为单次交叉。重组频率随着同源序列长度的增加而增加；在等位基因交换的第二步中，细胞通过罕见的第二次同源重组事件从染色体上切除质粒骨架，这被称为双交叉。这个双交叉突变体是通过反向筛选分离出来的。
作为优选，所述回补质粒的制备方法包括以下步骤：
以具有复制子的质粒2为原料，将抗药基因B、用于观察表型的基因b通过同源重组克隆，产生质粒2-B-b；将目的基因互补盒克隆到质粒2-B-b中，得到目的基因回补质粒2-B-b；目的基因互补盒包含自身启动子和目的基因野生型编码序列。
作为优选，在所述步骤(4)之后，通过目的基因的直系同源物进行功能互补分析。作为优选，在所述步骤(4)之后，分离缺失突变体的抑制子。
更优选的，所述分离缺失突变体的抑制子的方法包括，使缺失突变体细胞自发突变，得到含有缺失目的基因等位基因的突变株。
作为优选，步骤(4)中，所述对缺失突变体细胞控制表达并观察表型，进行表型评估和抑制性分析的方法包括旁路抑制。
第二方面，本发明提供了一种敲除PA0006基因的菌株在降低假单胞菌致病性的药物中的应用。
本发明团队基于理论研究和实验后发现，PA0006基因在调节铜绿假单胞菌细胞形态和核酸脂多糖LPS的生物合成中起作用，降低PA0006表达水平会影响细菌细胞形态，产生生长缺陷，PA0006可以作为潜在的降低假单胞菌致病性的靶位点基因。基于此，本发明提供一种降低PA0006表达水平的试剂，能够用于制备降低假单胞菌致病性的药物。
第三方面，本发明提供了一种敲除PA0006基因的菌株在研究细胞壁脂多糖O抗原生理功能中的应用。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明简单、快速、有效，能达到反向分析必需基因的遗传功能的目的，评估其抑制作用，这不仅可以为细胞恢复缺失基因功能的机制提供线索，也可通过识别出无法抑制或难以抑制的必需基因作为药物靶点。
附图说明
图1为构建基于自杀质粒的必需基因PA0006缺失突变体三步法。其中，图1(A)PA0006基因、缺失盒、互补盒和用于等位基因验证的引物的物理图谱。图1(B)敲除质粒转化和整合体产生的示意图。指出了染色体和质粒。敲除质粒序列包含基因X的非极性缺失等位基因、选择标记GmR和反选择标记sacB。通过上游(up)和下游(dn)同源序列交换产生的整合子分别用ins@upstr和ins@downstr表示。P、X、Y和Y'分别表示启动子、靶基因、下游基因和截短的基因。图1(C)用于sacB蔗糖反向筛选的基于微型培养的点平板试验。图中圆圈表示蔗糖敏感整合体。图1(D)回补质粒转化和通过sacB蔗糖反向筛选的环出敲除质粒的示意图。回补质粒包含温度敏感复制子和自身启动子控制的野生型等位基因X。环出序列可以是野生型或基于质粒的ts突变体(红线)。图1(E)温度敏感性的点板试验。红圈表示基于ts质粒的突变体。
图2为PA0006(Ts)突变体的末端表型。其中，图2(A)野生型和PA0006(Ts)菌株在30℃和42℃下的生长曲线。x轴和y轴分别表示时间(h)和细胞密度(600nm处的光密度[OD600])。显示了来自三次重复的平均值和标准偏差。图2(B)野生型和PA0006(Ts)菌株在30℃(或转换至42℃后0小时)和3，6，和在转换到42℃后12小时。比例尺为2微米。图2(C)图b中剪切图像的原始图像。与图b相比，更好地显示了细胞的全长。比例尺为2微米。
图3为大肠杆菌中推定的直系同源gmhB在功能上回补了铜绿假单胞菌中PA0006的缺陷。其中，图3(A)维恩图显示了铜绿假单胞菌PAO1和大肠杆菌K-12的相互最佳命中(MBH)。括号中的数字表示必需基因，有下划线标识的表示PAO1，有矩形线框标识的表示K-12。插图显示了PAO1(下划线)和K-12(矩形线框)共有或特有的必需基因的数量。图3(B)PA0006p和GmhB的推定直系同源对之间的蛋白质序列比对。图3(C)42℃下野生型、PA0006(Ts)、PA0006-OE和gmhB-OE质粒在PA0006(Ts)中的生长曲线。x轴和y轴分别表示时间(h)和细胞密度(OD600)。显示了来自三次重复的平均值和标准偏差。
图4为PA0006p是装配野生型样核心LPS和附着B带O抗原所必需的。其中，图4(A)在30℃和42℃下分析野生型(wt)和PA0006(Ts)(ts)菌株中的LPS、B带O抗原。左图显示了银染的8％SDS-PAGE凝胶。泳道1至4中的样品分别是30℃和42℃下的wt和30℃和42℃下的ts。泳道5和6分别是泳道2和4中样品的四倍上样量。右图显示了针对B带O抗原的MAb MF15-4的免疫印迹(WB)，矩形表示42℃时ts中缺乏O抗原信号的位置。图4(B)在30℃和42℃下分析wt和ts中的LPS核心。左图显示了银染的16％Tricine-SDS-PAGE凝胶。右图显示了用MAb 5c101对外核的免疫印迹，矩形表示在42℃下ts中缺少外部核心信号的位置。图4(C)gmhB-OE和PA0006-OE中LPS、O抗原的分析。左图和右图分别显示了针对O抗原的MAb MF15-4的银染PAGE凝胶和免疫印迹。图4(D)gmhB-OE和PA0006-OE菌株中LPS核心的分析。上图和下图分别显示了针对外核的银染PAGE凝胶和MAb 5c101的免疫印迹。
图5为抑制子sup的表型分析。其中，图5(A)区分抑制子和回复子PCR分析。在c1中仅发现PA0006缺失等位基因(d)，表明是一个抑制基因。在c2中发现PA0006野生型等位基因(w)，表明是回复突变。图5(B)42℃下wt、ts和sup的生长曲线。x和y轴表示42℃下各种菌株的时间(h)和密度(OD600)。图5(C)sup细胞的显微分析。图片显示了sup细胞在30℃(或移至42℃后0小时)和移至42℃后3、6和12小时的尼罗红染色结果。。比例尺为2微米。图5(D)在30℃和42℃下分析sup菌株中的O抗原。左图和右图分别显示了针对O抗原的银染PAGE凝胶和使用MAb MF15-4的免疫印迹。泳道5、6和7中的样品分别是泳道1、3和4中上样量的四倍。图5(E)在30℃和42℃下分析sup菌株中的LPS核心。左图和右图分别显示了针对外核心的银染PAGE凝胶和MAb 5c101的免疫印迹。
图6为sup突变体中候选抑制基因的鉴定和验证。其中，图6(A)在30℃和42℃下，三份野生型、PA0006(Ts)和sup的转录组谱之间的相关矩阵图。图6(B)维恩图显示一组257个基因在sup中富集了候选抑制基因。图6(C)257个基因的聚类分析。插图显示了包含两个基因(PA0123和PA5110/fbp)的集群，这两个基因在上游调控序列中带有单核苷酸多态性(SNP)(见星号)。图6(D)FBP的过表达抑制了PA0006(Ts)在42℃下的生长缺陷。42℃下wt、ts和ts fbp-OE菌株的生长曲线分析。
图7为fbp过表达抑制PA0006Δ缺失的表型分析。其中，图7(A)在PA0006Δ缺失菌株中分离fbp过表达，没有回补质粒。PCR检测显示两个分离的fbp-OE菌株没有PA0006+野生型等位基因。图7(B)wt、ts和Δfbp-OE菌株的生长曲线分析。x和y轴分别表示时间(h)和细胞密度(OD600)。图7(C)Δfbp-OE菌株的显微镜分析。尼罗红染色的细胞在30℃时(或移至42℃后0小时)以及移至42℃后3、6和12小时的荧光图。比例尺为2微米。图7(D)在30℃和42℃下分析Δfbp-OE菌株中的O抗原。左图和右图分别显示了针对O抗原的银染PAGE凝胶和使用MAb MF15-4的免疫印迹。泳道5、6和7中的样品分别是泳道1、3和4中装载量的四倍。图7(E)在30℃和42℃下分析Δfbp-OE菌株中的LPS核心。左图和右图分别显示了针对外核心的银染PAGE凝胶和用MAb 5c101的免疫印迹。
图8为PA0006(Ts)中PA0005的非极性效应评价。其中，图8(A)为PA0006回补片段的物理图谱。新版本的PA0006回补片段在下游含有约100bp的PA0005，而之前的版本含有约500bp。图8(B)为ts菌株ts和ts-2回补质粒分别用初始回补质粒和新版回补质粒进行点板实验，测定其温度敏感性。观察到两种回补质粒效果没有差别。图8(C)为PA0006(ts)菌株中PA0006和PA0005过表达的点板实验。PA0006(Ts)中PA0005过表达未见影响。
质粒：
pTS-PA0006：pUC57 repts TcR PA0006+PA0005--500bps
pTS-PA0006-2'：pUC57 repts TcR PA0006+PA0005--100bps
pOE-PA0006+：pBBR1 P-BAD：PA0006+
pOE-PA0005+'：pBBR1 P-BAD：PA0005+
菌株：
wt：铜绿假单胞菌PAO1，野生型
ts：PA0006-del pTS-PA0006回补片段
ts-2：PA0006-del pTS-PA0006-2回补片段
ts PA0005-OE：PA0006(Ts)pOE-PA0005
ts PA0006-OE：PA0006(Ts)pOE-PA0006
图9为在构建ts菌株过程中分离株的PCR检测。其中，图9(A)为敲除质粒整合子分析。由于敲除质粒是一种非复制质粒，所以耐庆大霉素菌落很可能是同时包含PA0006野生型和缺失等位基因的质粒整合子。图9(B)为sacB蔗糖反向筛选法去除敲除质粒。在没有导入回补质粒之前，只有野生型菌株存活。图9(C)为在回补质粒存在的情况下，野生型和缺失等位基因都被观察到。带有缺失等位基因的菌株用圆圈突出显示。
图10为大肠杆菌gmhB对PA0006(Ts)的功能互补。
图11为抑制子生长验证的点板实验。分离抑制子在平板上42℃进行测试。
图12为sup突变体fbp启动子的一个SNP的测序验证。其中，图12(A)为在基因组重测序分析中检测到的SNP ID。图12(B)为fbp启动子序列(plus strand)。有椭圆圈标识的部分表示检测到的SNP位置。图12(C)中显示了其中带下划线的序列。图12(C)为野生型(wt)、PA0006(Ts)和sup株fbp相关核苷酸序列测序结果。SNP T/C变化用箭头表示。
图13为42℃时PA3292的抑制无法抑制PA0006(Ts)的缺陷。染色体上唯一的PA3292拷贝由阿拉伯糖依赖启动子PBAD控制。对PA3292的抑制(不含阿拉伯糖)并不能挽救PA0006(Ts)在42℃下的致死性。这一结果表明PA3293不是PA0006的抑制因子。
图14为42℃点板实验验证fbp-OE对PA0006(Ts)的抑制作用，而不是PA0123-OE。
图15为pUC19-GmR-SacB载体示意图。
图16为pUC57-TcR-REPts载体示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种对必需基因进行反向遗传分析的方法，包括以下步骤：
(1)向细菌细胞中引入含有缺失目的基因等位基因片段的敲除质粒，筛选出敲除质粒通过单交换同源重组整合到细菌细胞染色体中的细菌细胞；
(2)转化含有目的基因自身启动子及其控制的野生型等位基因片段的回补质粒，筛选出含有回补质粒的细菌细胞；
(3)通过环出效应(loop-out)切除细菌细胞基因组中的部分片段，而后筛选出切除了目的基因并保留缺失目的基因等位基因的细菌细胞；
(4)对缺失突变体细胞控制表达并观察表型，进行表型评估和抑制性分析。
作为优选，所述方法具体包括以下步骤：
(S1)用渗透物将细菌细胞制备成电感受态细胞，通过电穿孔或接合的转化方法，引入含有用于筛选转染成功的细胞的抗药基因A、反向选择标记基因a和目的基因自身启动子加上其缺失目的基因等位基因片段的敲除质粒，敲除质粒通过单交换同源重组整合到细胞染色体中；用与抗药基因A对应的药物A筛选，得到敲除质粒转染成功的细菌细胞；
(S2)转化含有与抗药基因A不同的抗药基因B、用于观察表型的基因b和目的基因自身启动子及其控制的野生型等位基因片段的回补质粒；用于抗药基因B对应的药物B筛选，得到回补质粒转染成功的细菌细胞；
(S3)使用反向选择标记基因a进行负筛选，得到通过环出效应切除敲除质粒的细菌细胞；(S4)使用药物A、药物B和反向选择标记基因a对细菌细胞进行表型检查，细胞对反向选择标记基因a和药物A敏感，培养细胞；
(S5)使用引物特异性PCR对细胞染色体环出序列进行检测，保留染色体缺失目的基因的缺失突变体细胞；
(S6)培养缺失突变体细胞，控制用于观察表型的基因b表达并观察细胞，进行表型评估分析与抑制性分析。
作为优选，所述敲除质粒的制备方法包括以下步骤：
以质粒1为原料，将抗药基因A、反向选择标记基因a通过同源重组克隆，产生质粒1-A-a；将目的基因缺失盒克隆到质粒1-A-a中，得到敲除质粒1-A-a；目的基因缺失盒包含带有中间缺失目的基因编码的上游和下游序列。
作为优选，所述回补质粒的制备方法包括以下步骤：
以具有复制子的质粒2为原料，将抗药基因B、用于观察表型的基因b通过同源重组克隆，产生质粒2-B-b；将目的基因互补盒克隆到质粒2-B-b中，得到目的基因回补质粒2-B-b；目的基因互补盒包含自身启动子和目的基因野生型编码序列。
作为优选，在所述步骤(5)之后，通过目的基因的直系同源物进行功能互补分析。
作为优选，在所述步骤(5)之后，分离缺失突变体的抑制子。
更优选的，所述分离缺失突变体的抑制子的方法包括，使缺失突变体细胞自发突变，得到含有缺失目的基因等位基因的突变株。
作为优选，步骤(5)中，所述对缺失突变体细胞控制表达并观察表型，进行表型评估和抑制性分析的方法包括旁路抑制。
一种敲除PA0006基因的菌株在制备降低假单胞菌致病性的药物中的应用。
一种敲除PA0006基因的菌株在研究细胞壁脂多糖O抗原生理功能中的应用。
实施例1：以铜绿假单胞菌PAO1为例，构建基于温度敏感型自杀质粒的必需基因PA0006缺失突变菌株。
(1)制备敲除质粒
我们以pUC19(中国武汉Vector Science有限公司)载体为骨架构建必需基因敲除质粒，必需基因敲除质粒包含基因删除片段(含有两段和宿主相同的序列片段用于引发同源重组)、庆大霉素抗性序列GmR和蔗糖敏感序列SacB，GmR用于正筛选，sacB用于负筛选。如图1所示，其中基因删除片段由基因的自身启动子、上游序列和下游序列三部分组成，每个基因被删除的序列长度约为总CDS长度的70％；上游序列取删除序列上游约500bp；下游序列取删除序列下游约500bp。
以质粒pUC19为原料，使用同源重组酶克隆试剂盒(ClonExpress II一步克隆试剂盒；Vazyme，中国)将庆大霉素抗性基因GmR标记和蔗糖敏感基因sacB标记克隆到质粒pUC19上，得到质粒pUC19-GmR-sacB，如图15所示。将PA0006缺失盒克隆到pUC19-GmR-sacB中，得到PA0006Δ缺失质粒。PA0006缺失盒的序列如图8所示。
由于pUC19载体上的复制子序列无法在铜绿假单胞菌中独立复制，只能通过同源重组的方式插入铜绿假单胞菌的基因组内，这一事件被称为单次交叉。重组频率随着同源序列长度的增加而增加；在等位基因交换的第二步中，细胞通过罕见的第二次同源重组事件从染色体上切除质粒骨架，这被称为双交叉。这个双交叉突变体是通过反向筛选分离出来的。
(2)制备回补质粒
对于构建非必需基因的等位基因，一般在第一步，后通过sacB诱导插入的质粒序列跳出基因组重新形成环状DNA，如果跳出与插入发生在不同的同源臂，目标基因则会缺失，如果目标基因是必需基因，会导致细胞死亡，无法获得突变型菌株。因此我们在跳出与跳入之间在第一步缺失质粒的整合与第三步缺失质粒的环出之前开创性地增加一步带有温度敏感型复制子序列的回补质粒的转化步骤，防止跳出后死亡。
必需基因回补质粒包含基因回补片段、四环素抗性序列TcR以及温度敏感性质粒复制子REPts序列，TcR用于正筛选，REPts用于负筛选。如图8所示，基因回补片段由基因的自身启动子与完整的CDS序列组成。回补质粒的构建过程与敲除质粒相似：具体方法如下：以质粒pUC57(中国武汉Vector Science有限公司)为原料，使用同源重组酶克隆试剂盒(ClonExpress II一步克隆试剂盒；Vazyme，中国)将四环素抗性基因TcR标记和温度敏感复制子rep(Ts)标记克隆到pUC57上，得到质粒pUC57-TcR-rep(Ts)，如图16所示。将PA0006互补盒克隆到pUC57-TcR-rep(Ts)中，得到PA0006回补质粒。PA0006互补盒的序列如图8所示，包含自身启动子和PA0006野生型编码序列组成的PA0006互补序列。
(3)引入敲除质粒
以甘油为渗透物，将铜绿假单胞菌PAO1制备成电感受态细胞，通过电穿孔将PA0006敲除质粒转化到铜绿假单胞菌PAO1中，并在添加了50μg mL-1庆大霉素的LB平板上筛选质粒和染色体单交叉同源重组得到的整合子。由于pUC19质粒骨架上不含有假单胞菌自主复制的序列，因此转化子通常即敲除质粒通过同源重组整合至细菌基因组中；PCR验证Gm阳性菌落中是否有载体序列插入。敲除质粒整合时不同交换方式如图1所示。
因为已知sacB是不稳定的，为了确保sacB的功能，我们尝试在不引入回补质粒的情况下，在进行下一步之前，对10到20个选定的整合子进行了小型培养板试验，以测试sacB对蔗糖的反选择性。简单地说，将选定的菌落重新悬浮在96孔板上的50mL的LB培养基中，并根据OD600对微型培养浓度进行归一化。使用48针复制器(V&P Scientific Inc.，SanDiego，CA，USA)将微量培养物转印到添加50μg mL-1庆大霉素或15％蔗糖的LB板上，并在30℃孵育过夜。随后，使用反选择性蔗糖敏感标记sacB通过同源重组切除整合敲除质粒序列。使用小型培养板试验，结果如图1(B)和(C)所示，大约一半的庆大霉素选择的转化体表现出蔗糖敏感的表型。使用引物对F1-R1的PCR分析，结果如图1(A)所示，证实这些转化体包含PA0006野生型和缺失等位基因，具体如图9(A)所示，这表明PA0006敲除质粒通过单交换同源重组事件整合到染色体中。PCR分析表明没有回补质粒的所有环出序列都是PA0006野生型，如图9(B)所示，支持PA0006是必需基因的预测。
(4)转化回补质粒
验证无误后制备含有敲除质粒插入的菌株的感受态细胞，并将构建好的必需基因回补质粒电转化至上述感受态细胞中。在添加100μg mL-1四环素的LB平板上进行筛选。
(5)敲除质粒环出
使含有回补质粒的细胞在添加5％蔗糖的LB平板上生长，通过蔗糖LB培养基进行sacB负筛选，发生敲除质粒环出(loop-out)的菌株即为必需基因条件致死突变菌株。在30℃下，微型培养板法，在添加100μg mL-1四环素、15％蔗糖和50μg mL-1庆大霉素的LB平板上对环出菌落进行表型检查。显示蔗糖抗性和庆大霉素敏感性的菌株环出了敲除质粒。其中，预计一半的菌株环出序列为染色体中含有PA0006缺失等位基因。
(6)检测
在42℃的限制温度下，使用引物特异性PCR检测染色体等位基因，对细胞染色体环出序列进行检测。我们发现，回补质粒补充了染色体缺失等位基因，菌株环出为染色体中含有PA0006缺失等位基因或野生型等位基因，菌株基因型如图1(D)所示，PA0006序列如图9(C)所示。同时我们发现，在42℃的限制温度下，由于回补质粒含有温度敏感复制子rep(Ts)，其失去了对染色体含有PA0006缺失等位基因环出的保护，如图1(E)所示。因此，通过使用这种新的方法，我们以铜绿假单胞菌PAO1为例构建了基于温度敏感型自杀质粒的PA0006缺失突变菌株。该突变体在下文中被称为PA0006(Ts)。
在实施例1中，以假设的必需基因PA0006为例，我们验证了PA0006是必需基因，可以在制备敲除质粒和回补质粒后的一周或两周内，构建基于自杀质粒的必需基因缺失突变体；在敲除质粒整合体中保留可反向选择功能基因的sacB是随后环出敲除质粒的关键。已知sacB易于突变，导致蔗糖敏感性的丧失。为了克服这个问题，我们使用甘油代替蔗糖作为渗透物来制备电感受态细胞；而且，在导入敲除质粒且不引入回补质粒的情况下，通过使用小型培养板试验，测试庆大霉素选择的敲除质粒整合体的蔗糖敏感性，结果如图1所示。
实施例2：在铜绿假单胞菌PAO1中验证必需基因PA0006片段缺失突变体遗传分析的功能
(1)PA0006(Ts)在限制性温度下表现出具有生长缺陷的丝状形态
为了评估PA0006(Ts)菌株的生长表型，对野生型和PA0006(Ts)菌株进行生长曲线分析。新鲜培养基接种过夜培养物，并在摇床中于30℃和42℃孵育。在48小时内，每3小时监测一次细胞密度，结果如图2(A)所示，在30℃和42℃下，野生型培养物的密度约在30h达到平台期(例如，在600nm处的光密度[OD600]为2.20±0.04对2.25±0.04；n＝3；)另一方面，野生型培养物在42℃下达到半最大密度约只需要10小时，比在30℃下少5小时(即10±0.03小时对15±0.04小时；p值＝1.1e—4；n＝3)。我们发现PA0006(Ts)培养物在30℃下的生长曲线与野生型几乎相同。然而，在42℃时，PA0006(Ts)培养物的最大密度仅为0.55OD600，30℃时密度约为25％(P＝1.02e—5)。这一结果表明PA0006(Ts)在非许可温度下存在生长缺陷。
随后，我们检查了野生型和PA0006(Ts)菌株的形态。如图2(B)中的上部面板所示，野生型细胞在30℃和转换到42℃后3、6和12小时表现出相似的形态，细胞长度在1和2μm之间。相比之下，如图2(B)与2(C)所示，PA0006(Ts)在30℃时以及转换到42℃后的3、6和12小时则显示出逐渐增加的细胞长度。由此可知PA0006(Ts)在非许可温度下的生长缺陷与丝状形态有关。
(2)大肠杆菌中推定的直系同源基因gmhB在功能上回复了铜绿假单胞菌中PA0006的缺陷。
如图3(A)所示，我们使用BLASTp并基于E值的截止值＜1.0e—5获得了1954个推定的直系同源物的列表。以铜绿假单胞菌PAO1中的345个必需基因和大肠杆菌K-12中的356个必需基因为研究对象，我们发现，在铜绿假单胞菌中，推定的直系同源物亚组中必需基因的出现率比背景高2.45倍(P值＜2.2e—16)，在大肠杆菌中，必需基因的出现率比背景高1.85倍(P值＜2.2e—16)。值得注意的是，大肠杆菌K-12中77个必需基因的推定直系同源基因在铜绿假单胞菌PAO1中是非必需的。同样，铜绿假单胞菌PAO1中的82个必需基因的推定直系同源基因在大肠杆菌K-12中是非必需的。PA0006在铜绿假单胞菌中是必需的，而其假定的直系同源基因gmhB在大肠杆菌中是可有可无的。
我们使用SIM软件对铜绿假单胞菌PAO1中的PA0006p和大肠杆菌K-12中的GmhB的直系同源物进行了比对分析。结果如图3(B)所示，这两个蛋白序列在191个重叠残基中有32.4％的同一性。由于同一性低于40％，不能保证两种蛋白质结构的相似性。为了确定大肠杆菌中的gmhB是否为铜绿假单胞菌中PA0006的直系同源物，我们进行了补充实验。结果如图3(C)所示，生长曲线分析与点平板试验一致，显而易见地，诱导gmhB表达可以拯救PA0006(Ts)在42℃的致死性。这些结果都证实了，来自大肠杆菌的gmhB可以在功能上补充铜绿假单胞菌中PA0006的生长缺陷。大肠杆菌gmhB对PA0006(Ts)的功能互补如图10所示。
通过PA0006(Ts)，我们确定大肠杆菌中的gmhB为铜绿假单胞菌中PA0006的直系同源物，验证了它们的直系同源关系，因此，能够通过gmhB进行功能互补分析，为铜绿假单胞菌的直系同源互补分析提供了一种方法。
(3)PA0006是铜绿假单胞菌核心寡糖生物合成所必需的。
大肠杆菌中的gmhB编码D-甘油-β-D-甘露糖-庚糖1，7-二磷酸7-磷酸酶(EC3.1.3.82/83)参与核苷酸活化糖ADP-L-甘油-β-D-甘露糖-庚糖的生物合成途径，是内核心脂多糖LPS的前体。脂多糖由脂质A、核心寡糖和O抗原组成。为了研究PA0006p是否参与铜绿假单胞菌中核心脂多糖的生物合成，采用Hitchcock和Brown方法，分别在允许和限制温度下从PA0006(Ts)细胞中制备LPS，并用SDS-PAGE银染色法进行分析。
使用8％的SDS-PAGE凝胶银染方法，结果如图4(A)所示，30℃时，PA0006(Ts)的LPS模式与野生型相似；与之相反的，42℃时，PA0006(Ts)中的O抗原水平降低，这与野生型不同。使用单克隆抗体(MAb MF15-4进行免疫印迹分析，结果如图4(A)矩形所示，42℃时，即使增加了样品添加量，在PA0006(Ts)中仍未检测到B带O抗原(B-band O-antigen)。使用16％SDS-PAGE法，结果如图4(B)所示，42℃时，PA0006(Ts)中脂质A和核心寡糖的模式不同于野生型。使用单克隆抗体MAb 5c101进行免疫印迹分析，结果如图4(B)矩形所示，42℃时，PA0006(Ts)缺乏野生型核心寡糖。这一结果证实，与PA0006p在大肠杆菌中的直系同源物GmhB相似，铜绿假单胞菌中的PA0006p参与了核心LPS的生物合成。
随后，我们研究了大肠杆菌gmhB的过表达是否会在非允许的温度下恢复PA0006(Ts)中野生型核心LPS和O抗原附着，使用SDS-PAGE和Western blotting分析，结果如图4中的(C)和(D)所示，gmhB的过表达可以恢复PA0006(Ts)与PA0006-OE相同野生型核心LPS和O抗原。这些结果表明，野生型核心LPS是B带O抗原附着所必需的。
(4)PA0006(Ts)的抑制子能恢复细胞形状，但不能恢复核心寡糖。
为了分离抑制子，将超过1.0e+9的PA0006(Ts)细胞铺展在多个LB平板上，使其在允许自发突变的半限制性温度40℃下生长2周。分离出两个菌落，即c1和c2，它们能够在42℃生长；c1和c2的序列如图11所示。然而，使用引物对F1-R1的PCR分析，结果如图5显示，c1突变株仅含有缺失PA0006等位基因，而c2株含有野生型等位基因，这表明，c1株含有一个PA0006Δ缺失和一个抑制PA0006缺失致死性的突变，而c2株是回复突变。分析生长曲线图5(B)，可知c1培养物的最大细胞密度可达到野生型的90％(例如，OD600为2.05±0.05对2.25±0.05)，与图11所示的点板试验结果一致。因此，研究抑制子需要进一步分析c1和sup。
使用荧光显微镜分析，图5(C)表明，42℃时，sup突变体的丝状表型被完全抑制，细胞长度小于1μm。
使用SDS-PAGE和免疫印迹分析，图5(D)和(E)表明，在30℃或42℃下，由MAb MF15-4检测，在sup突变体中没有检测到B带O抗原；由MAb 5c101检测，没有检测到野生型核心LPS。这些结果表明，野生型核心LPS是O抗原附着所必需的，而不是铜绿假单胞菌PAO1细胞存活所必需的。
(5)PA0006(Ts)和sup突变体的转录谱分析揭示了一种候选磷酸酶Fbp，其过表达回复了PA0006缺失的致死性。
使用PE 150Illumina NoveSeq进行实验对sup突变体进行基因组重测序分析，产生1.4Gb的纯净数据，平均读取深度约为铜绿假单胞菌PAO1基因组的200倍。使用BreakDancer和SAMtools软件确定结构变异(SV)，例如大DNA片段的插入、缺失、倒位和易位，以及长度小于50bp的DNA的插入和缺失(indel)，和单核苷酸多态性(SNP)。如表1所示，分析确定了一个SV、两个indels，以及如表2所示的，超过1600个SNPs。SV是对PA0006编码序列构造性删除约400bp，以验证sup中PA0006是缺失的。一个indel是在操纵子中基因PA0980和PA0981之间的基因间插入一个单核苷酸。另一个indel是PA3292的编码序列单核苷酸的缺失，导致移码突变。为了测试PA3292突变是否可以抑制PA0006缺陷的致死性，在PA0006(Ts)的背景下构建了一个菌株，其PA3292的染色体拷贝被设定为受PBAD启动子控制。分析结果如图13所示，表明PA3292不是PA0006的抑制子。
在sup 871个染色体特征中总共发现了1665个SNP，包括基因和基因间；每个碱基对SNP出现的平均频率为2.35e—3。虽然基因中每个碱基对的SNP发生频率为1.85e—3，但我们发现基因间的频率为5.76e—3，比平均频率高2.45倍(P值＝2.2e—61)。基因间序列中SNP密度的增加表明突变比sup中的编码序列更频繁地影响调控序列。
表1在sup突变体中检测到的结构变体和indels
变体类型 受影响的特征类型 变体数量 sup中受影响的功能
SV 编码区 1 PA0006<sup>a</sup>
Indel 编码区 1 PA3292<sup>b</sup>
Indel 基因间 1 PA0980-PA0981<sup>c</sup>
(a)在PA0006(Ts)菌株中构建了缺失等位基因。
(b)PA3292编码一种可有可无的假设蛋白，其中在1855位缺失了一个单核苷酸导致了移码。
(c)PA0980和PA0981编码非必要的假想蛋白，它们之间的间区序列发生单核苷酸缺失。
Figure BDA0003778368400000141
表2sup中检测到的单核苷酸多态性(SNP)发生汇总
a大约75％的SNP是同义的，大约25％的SNP是非同义的，没有SNP导致过早出现终止密码子。基因组重测序分析缺乏PA0006(Ts)菌株对照，SNP分析结果应谨慎对待。
为了确定在42℃时是哪个基因表达增加抑制了PA0006Δ的致死性，我们使用PE150Illumina RNA测序法(RNA-seq)进行实验。在30℃和42℃时，分别对野生型PA0006(Ts)和sup进行了转录谱分析。使用Salmon单个转录组谱的相关矩阵分析，结果如图6(A)表明样品重复性较好。
我们假设与30℃相比，候选抑制基因在42℃下在PA0006(Ts)和野生型中都下调，但在sup并没有。我们发现，与30℃时野生型相比，如图6(B)wt所示，在42℃时，2288个基因的转录水平显著下调。类似地，如图6(B)ts所示，在PA0006(Ts)中发现1511个基因的转录水平显著下调。如图6(B)sup所示，在sup突变体中，3275个基因的转录水平没有下调。所有三种情况共有的257个基因的子集包含潜在的候选基因，其过表达可以抑制PA0006Δ的生长缺陷。
聚类分析表明一组16个基因的转录谱共享0.973的最小相关性，如图6(C)所示，其中两个(即PA0123和PA5110)在上游调控序列中携带SNP。PA0123编码可能的转录调节因子，PA5110编码果糖-1，6-二磷酸酶Fbp。如图6(D)和图14所示，fbp而非PA0123的过表达能够抑制PA0006(Ts)在42℃的致死率。通过测序分析，验证了sup突变体的fbp基因启动子上与野生型和PA0006(Ts)相比存在一个SNP，结果如图12所示。
(6)fbp过表达在sup突变体中起到主要的旁路抑制PA0006的功能。
如图5所示，我们发现在sup中，PA0006(Ts)的丝状形态能够得到恢复，但野生型核心LPS或O抗原没有恢复。为了验证fbp-OE是否是回复PA0006致死性的主要参与者，在PA0006(Ts)中转化fbp过表达质粒pBBR-fbp-OE后，我们在42℃时在补充有0.4％阿拉伯糖的LB平板上分离了PA0006Δ/pBBR-fbp-OE(PA0006Δfbp-OE或Δfbp-OE)菌株。使用PCR检测，结果如图7(A)所示，该分离物显示含有PA0006Δ等位基因。通过分析PA0006Δfbp-OE的生长曲线图7(B)和sup的生长曲线分析图5(B)，表明PA0006Δfbp-OE的最大细胞密度与sup的几乎相同。使用显微镜分析，结果如图7(C)显示，PA0006Δfbp-OE的细胞长度介于sup和野生型之间；sup和野生型的图谱如图2(B)和图5(C)。使用SDS-PAGE和免疫印迹分析方法，结果显示PA0006Δfbp-OE中没有检测到野生型核心LPS(具有MAb5c101)和O抗原(具有MAbMF15-4)，分析结果如图7(D)和(E)所示。以上结果表明，fbp的过表达是sup突变体抑制PA0006Δ致死性的重要因素。与PA0006Δfbp-OE相比，sup突变体表达更短的细胞长度可能与sup基因组中的其他突变有关。
在实施例2中，通过缺失突变菌株PA0006(Ts)，我们确定大肠杆菌中的gmhB为铜绿假单胞菌中PA0006的直系同源物，验证了它们的直系同源关系，因此，能够通过gmhB进行功能互补分析，为铜绿假单胞菌的直系同源互补分析提供了一种方法。
PA0006(Ts)在限制性温度下呈现丝状细胞形态，通过表型分析，确定了其丝状形态与生长缺陷有关。PA0006(Ts)细胞形态调节存在缺陷，铜绿假单胞菌中的PA0006p参与了核心LPS的生物合成，核心LPS是B带O抗原附着所必需的。
对野生型、PA0006(Ts)和sup在30℃和42℃下的转录谱进行比较分析，发现了一组候选抑制子，其中两个在上游调控序列包含SNP(s)。一个SNP影响了候选抑制因子fbp编码果糖-1，6-二磷酸酶。我们发现，在非允许温度下，fbp的过表达抑制了PA0006(Ts)的条件致死率，PA0006是gmhB在大肠杆菌中直系同源物，编码甘油甘露糖-1，7-二磷酸酶。
总之，以PA0006为例，我们通过三步方案构建的铜绿假单胞菌中基于自杀质粒的必需基因缺失突变体，证明了其适用于必需基因的遗传分析。我们发现PA0006(Ts)在限制性温度下呈现丝状细胞形态，在不允许的温度下缺乏野生型核心LPS和O抗原。通过PA0006(Ts)的自发诱变分离到一个具有多重突变的抑制子sup1，sup1突变体能恢复细胞形态，细胞长度缩短，但它缺失核心寡糖，不能恢复野生型核心LPS和O抗原。sup1突变体和PA0006(Ts)突变体之间的转录组分析显示，在42℃下，一些过表达的候选磷酸酶可能在恢复PA0006(Ts)的致死性中发挥作用。进一步研究发现，只有PA5110/fbp的过表达可恢复PA0006(Ts)的致死表型。通过对转录组分析，发现sup中候选的过表达抑制基因fbp，一些过表达的候选磷酸酶可能在恢复PA0006(Ts)的致死性中发挥作用。与sup相似，fbp-OE表达呈现非丝状形态，但也缺乏野生型核心LPS和O抗原。该三步法适用于遗传分析和旁路抑制，我们认为该方案应广泛适用于铜绿假单胞菌中其他必需基因的反向遗传分析。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向细菌细胞中引入含有缺失目的基因等位基因片段的敲除质粒，筛选出敲除质粒通过单交换同源重组整合到细菌细胞染色体中的细菌细胞；
(2)转化含有目的基因自身启动子及其控制的野生型等位基因片段的回补质粒，筛选出含有回补质粒的细菌细胞；
(3)通过环出效应切除细菌细胞基因组中的部分片段，而后筛选出切除了目的基因并保留缺失目的基因等位基因的细菌细胞；
(4)对缺失突变体细胞控制表达并观察表型，进行表型评估和抑制性分析。
2.根据权利要求1所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(S1)用渗透物将细菌细胞制备成电感受态细胞，通过电穿孔或接合的转化方法，引入含有用于筛选转染成功的细胞的抗药基因A、反向选择标记基因a和目的基因自身启动子加上其缺失目的基因等位基因片段的敲除质粒，敲除质粒通过单交换同源重组整合到细胞染色体中；用与抗药基因A对应的药物A筛选，得到敲除质粒转染成功的细菌细胞；
(S2)转化含有与抗药基因A不同的抗药基因B、用于观察表型的基因b和目的基因自身启动子及其控制的野生型等位基因片段的回补质粒；用与抗药基因B对应的药物B筛选，得到回补质粒转染成功的细菌细胞；
(S3)使用反向选择标记基因a进行负筛选，得到通过环出效应切除敲除质粒的细菌细胞；(S4)使用药物A、药物B和反向选择标记基因a对细菌细胞进行表型检查，细胞对反向选择标记基因a和药物A敏感，培养细胞；
(S5)使用引物特异性PCR对细胞染色体环出序列进行检测，保留染色体缺失目的基因的缺失突变体细胞；
(S6)培养缺失突变体细胞，控制用于观察表型的基因b表达并观察细胞，进行表型评估分析。
3.根据权利要求2所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，所述敲除质粒的制备方法包括以下步骤：
以质粒1为原料，将抗药基因A、反向选择标记基因a通过同源重组克隆，产生质粒1-A-a；将目的基因缺失盒克隆到质粒1-A-a中，得到敲除质粒1-A-a；目的基因缺失盒包含带有中间缺失目的基因编码的上游和下游序列。
4.根据权利要求2所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，所述回补质粒的制备方法包括以下步骤：
以具有复制子的质粒2为原料，将抗药基因B、用于观察表型的基因b通过同源重组克隆，产生质粒2-B-b；将目的基因互补盒克隆到质粒2-B-b中，得到目的基因回补质粒2-B-b；目的基因互补盒包含自身启动子和目的基因野生型编码序列。
5.根据权利要求1所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，在所述步骤(4)之后，通过目的基因的直系同源物进行功能互补分析。
6.根据权利要求1所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，在所述步骤(4)之后，分离缺失突变体的抑制子。
7.根据权利要求6所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，所述分离缺失突变体的抑制子的方法包括，使缺失突变体细胞自发突变，得到含有缺失目的基因等位基因的突变株。
8.根据权利要求1所述对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述对缺失突变体细胞控制表达并观察表型，进行表型评估和抑制性分析的方法包括旁路抑制。
9.敲除PA0006基因的菌株在降低假单胞菌致病性的药物中的应用。
10.敲除PA0006基因的菌株在研究细胞壁脂多糖O抗原生理功能中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116732108A (zh) * 2023-03-03 2023-09-12 江南大学 一种提高基因敲除效率的方法及其应用

Cited By (1)

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CN116732108A (zh) * 2023-03-03 2023-09-12 江南大学 一种提高基因敲除效率的方法及其应用

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