CN116732108A - 一种提高基因敲除效率的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高基因敲除效率的方法及其应用。本发明提供的敲除技术是基于CRISPR‑Cas9质粒，进一步采用“回补策略”来进行目标基因的敲除。本发明所述的“回补策略”即是将目标敲除基因突变后表达于外源质粒，将基因组上的目标基因敲除后再将回补质粒消除，从而达到目标基因的缺失。“回补策略”的使用使得目标基因的敲除效率从0提高到了8％。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种提高基因敲除效率的方法及其应用。
背景技术
基因工程是构建底盘细胞的关键技术，代谢途径关键基因的缺失或基因的过表达已经成为一种常规的策略，目前比较成熟的手段是CRISPR-Cas9技术。
CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。
成簇的规律性间隔的短回文重复序列(Clustered RegularlyInterspaced ShortPalindromic Repeats,CRISPR)，是在细菌中发现的有规律成簇又带间隔的短回文序列，可以帮助细菌抵抗噬菌体的入侵，是细菌针对噬菌体的获得性免疫。CRISPR序列由众多短而保守的重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)组成。重复序列含有回文序列，可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，他们是被细菌俘获的外源DNA序列，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。在上游的前导区(leader)被认为是CRISPR序列的启动子。另外，上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与CRIPSR序列区域共同发生作用，因此，该基因被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated,Cas)。Cas基因与CRIPSR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。
CRISPR/Cas9系统应用于基因敲除的原理是，tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA(即sgRNA)时用来指导Cas9作用。针对目的基因，通过人工设计的sgRNA(small guideRNA,sgRNA)来识别目的基因序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式(Non-homologousEndJoining,NHEJ)对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。
CRISPR/Cas9对于无意义基因的缺失、中性位点插入目的基因以及敲除对菌株正常代谢影响不明显的基因的效率比较高，然而如果待敲除的目的基因对菌株正常生长影响较大，或者构建的工程菌株需要连续敲除同一代谢途径的多个基因时，普通的CRISPR-Cas9介导的基因敲除效率较低甚至达到0。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种提高基因敲除效率的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：先构建包含目的菌株基因组中需要敲除基因片段的外源质粒，再通过无缝克隆技术将外源质粒导入目标菌株，后使用CRISPR-Cas9技术敲除菌株基因组上的目的基因片段，最后通过多次传代逐步丢失外源质粒，从而达到目的基因敲除的效果。
作为本发明所述基因敲除方法的一种优选方案，其中：所述外源质粒为含有回补基因表达盒的质粒。
作为本发明所述基因敲除方法的一种优选方案，其中：所述同义突变后的回补基因不被sgRNA所识别。
作为本发明所述基因敲除方法的一种优选方案，其中：所述基因回补敲除质粒为SX1628-71sgX，其基因序列如SEQ ID NO：2所示。
作为本发明所述基因敲除方法的一种优选方案，其中：所述使用外源质粒过表达需要敲除的基因。
作为本发明所述基因敲除方法的一种优选方案，其中：所述基因敲除效率可达到8％。
本发明的再一个目的是，解决现有技术中的不足，提供一种提高基因敲除效率的方法的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：本基因敲除方法可用于连续敲除同一代谢途径的多个基因。
作为本发明所述基因敲除方法应用的一种优选方案，其中：所述基因敲除方法可用于敲除对于待敲除菌株生长影响较大的目的基因。
本发明有益效果：
(1)本发明基于CRISPR-Cas9介导的基因敲除，通过“基因回补策略”增加了基因敲除的效率。
(2)因此本发明使用外源质粒过表达需要敲除的基因，从而达到即使该基因缺失也不影响菌株的正常代谢的效果，随后在敲除目的基因后通过多次传代逐步丢失外源质粒，从而达到目的基因敲除的效果。
(3)本发明以GS115-ΔAgt菌株为出发菌株，分别构建了敲除Gly1基因的回补敲除质粒SX1628-71sgX和不含回补基因表达盒的敲除质粒SX1628-71sgXG，结果表明质粒SX1628-71sgXG敲除Gly1基因的效率为0，然而质粒SX1628-71sgX敲除Gly1基因的效率可达到8％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1是人工改造的质粒SX1628-71的结构示意图。
图2是人工改造的质粒SX1628-71sgX的结构示意图。
图3是质粒SX1628-71构建过程中的片段电泳图。
图4是JM109-SX1628-71转化子平板图。
图5是基因Gly1优化片段电泳图。
图6是SX1628-71质粒的两个片段电泳图，a是SX1628-71质粒片段1，b是SX1628-71质粒片段2。
图7是SX1628-71sgX测序结果比对图。
图8是Gly1敲除同源臂构建电泳图。
图9是SX1628-71sgX介导的Gly1敲除电泳图。
图10是SX1628-71sgXG测序结果。
图11是SX1628-71sgXG介导的Gly1敲除电泳图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
生物材料来源
培养基
(1)LLBZ液体培养基(g/L):酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化钠5，博来霉素终浓度为25ug/ml，pH为7.0；
(2)LLBZ固体培养基(g/L):酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20，博来霉素终浓度为25ug/ml，pH为7.0；
(3)YPDSZ液体培养基(g/L)：酵母浸粉10，蛋白胨20，山梨醇182，葡萄糖20，博来霉素终浓度为100ug/ml，pH为7.0；
(4)YPDSZ固体培养基(g/L)：酵母浸粉10，蛋白胨20，山梨醇182，葡萄糖20，琼脂20，博来霉素终浓度为100ug/ml，pH为7.0。
实施例1：
SX1628-71质粒的构建
本实验使用的SX1628-71质粒的步骤如下：
1)以质粒SX1628-7为模版，设计引物通过PCR构建SX1628-71质粒，此质粒可作为骨架进一步构建敲除质粒。设计引物构建pGAP-EGFP-RPS25Att表达盒，随后与SX1628-7进行同源重组构建SX1628-71质粒。
构建质粒SX1628-71的引物如表13所示，在金唯智公司合成该引物；质粒构建过程的PCR程序如表1所示，PCR程序如表2所示。
表1PCR反应体系
表2PCR反应程序
回收正确分子量的琼脂糖凝胶条带，测定浓度后备用；其PCR扩增后产物的电泳图如附图3所示，其中SX1628-7质粒片段(4979bp)、pGAP(477bp)、EGFP表达盒(1012bp)、RPS25Att(485bp)、Bleo表达盒(1153bp)。
2)设计引物将片段Bleo表达盒与RPS25Att表达盒通过融合PCR获得RPS25Att+Bleo表达盒片段；如图3所示，序列如SEQ ID NO：3；
3)设计引物将RPS25Att+Bleo表达盒片段与EGFP表达盒片段和pGAP片段进行重叠PCR，得到片段pGAP+EGFP表达盒+RPS25Att+Bleo表达盒，序列如SEQ ID NO：4；
4)将pGAP+EGFP表达盒+RPS25Att+Bleo表达盒片和质粒片段通过无缝克隆连接后转化JM109，后培养1h后将菌液涂布于LLBZ平板。
5)挑取平板上绿色的单菌落于37℃培养16h后提取SX1628-71质粒备用，平板如图4所示。
实施例2：
SX1628-71sgX质粒的构建。
本实施例主要提供敲除基因Gly1所构建的SX1628-71sgX质粒和同源臂，具体步骤如下：
即以SX1628-71质粒为基础，构建了包含Gly1优化基因和sg序列的SX1628-71sgX质粒。
1)使用引物sgX-F1和sgX-R1获得sg片段；即使用引物sgX-F1和sgX-R1互为模板进行PCR，体系如表3所示：
表3sg片段构建PCR体系
2)使用引物sgX-F2和GLY1-sg2-yh-R1，引物GLY1-sg2-yh-F1和sgX-R2进行Gly1基因的sg优化，优化之前的Gly1基因序列如SEQ ID NO：5所示，优化后的Gly1基因序列如SEQID NO：6所示；PCR程序如表2所示，将Gly1优化基因片段1和片段2通过融合PCR构建Gly1优化基因完整片段，PCR体系如表4到表6所示
表4Gly1优化基因片段1的PCR体系
表5Gly1优化基因片段2的PCR体系
表6Gly1优化基因片段1和片段2的融合体系
表7Gly1优化基因PCR体系
Gly1优化基因(1176bp)PCR完成后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图5所示，胶回收后置于低温保存备用；
3)使用引物SX1628-71-F1和SX1628-71-R1构建SX1628-71质粒片段1(5403bp)，使用引物SX1628-71-F2和SX1628-71-R2构建SX1628-71质粒片段2(1310bp)，电泳图如图6(a)和(b)；
4)将实施例2中的sg片段、Gly1优化基因完整片段、SX1628-71质粒片段1以及SX1628-71质粒片段2进行无缝克隆重组构建SX1628-71sgX质粒，重组体系如表8所示，重组程序如表9所示；重组产物转化大肠杆菌JM109，涂布LLBZ平板，37℃过夜培养。
表8同源重组体系
表9同源重组程序
5)挑取平板单菌落于LLBZ液体培养基培养12h后提取质粒测序，测序结果如图7所示，测序正确的质粒即为质粒SX1628-71sgX，保存质粒于-20℃备用。
实施例3：
GS115-ΔAgt菌株中Gly1基因的敲除。
1)敲除同源臂的构建。使用引物GLY1-TY-F1和GLY1-TY-R11构建Gly1敲除同源片段1，使用引物GLY1-TY-F2和GLY1-TY-R2构建Gly1敲除同源片段2，模板为GS115基因组；PCR体系参照表4-表6，PCR程序参照表2；Gly1敲除同源片段1和Gly1敲除同源片段2的核酸电泳图如图8(a)所示，最终构建的Gly1敲除同源片段核酸电泳图如图8(b)所示；将Gly1敲除同源片段进行胶回收后置于低温备用。
2)GS115-Δagt菌株感受态的制备。将GS115-ΔAgt菌株从-80℃冰箱中取出置于室温解冻后置于超净工作台，在无菌环境下吸取200μL菌液涂布于YPDS培养基培养16h后制备感受态，制备完毕的感受态置于-80℃冰箱备用。
3)分别将2μg的Gly1敲除同源片段和实施例2中构建的SX1628-71sgX质粒转化进入进入GS115-ΔAgt感受态，30℃培养1.5h后涂布于YPDSZ培养基培养2d。
4)挑取实施例3步骤3中的平板单菌落于YPDSZ液体培养基中培养2d后提取基因组，通过PCR进行Gly1基因的缺失验证，同源臂验证引物为GLY1-TY-F1和GLY1-TY-R2，Gly1基因内部验证引物为GLY1-NBYZ-F和GLY1-NBYZ-R，PCR体系如表10所示，程序如表11所示，核酸电泳图如图9所示。
表10Gly基因缺失验证PCR体系
表11PCR反应程序
实施例4：
质粒SX1628-71sgX敲除Gly基因的效率计算。
1)根据对实施例3步骤(4)中的核酸电泳图计算敲除效率，计算公式如下所示：
公式(1)：敲除效率＝基因缺失单菌落数/挑取的单菌落数；敲除效率结果如表12所示。
对比例1：
使用质粒SX1628-71sgXG进行Gly1基因的敲除。
1)质粒SX1628-71sgXG的构建。以质粒SX1628-71sgX为模板，使用引物Bleo-F和SX1628-71sgX-CZ-R进行PCR，PCR体系如表1所示，PCR程序如表2所示，PCR完毕后使用DpnI消除模板质粒后转化JM109感受态，置于摇床37℃，200rpm培养1h后涂布于LLBZ平板，将平板置于37℃过夜。
2)挑取平板单菌落培养于3mL LLBZ液体培养基，置于摇床37℃，200rpm培养16h后提取质粒测序，测序结果如图10所示，保存测序正确的质粒备用。
3)分别将2μg的Gly1敲除同源片段和对比例1步骤(2)中构建的SX1628-71sgXG质粒转化进入进入GS115-ΔAgt感受态，30℃培养1.5h后涂布于YPDSZ培养基培养2d。
4)挑取实施例3步骤3中的平板单菌落于YPDSZ液体培养基中培养2d后提取基因组，通过PCR进行Gly1基因的缺失验证，同源臂验证引物为GLY1-TY-F1和GLY1-TY-R2，Gly1基因内部验证引物为GLY1-NBYZ-F和GLY1-NBYZ-R，PCR体系如表10所示，程序如表11所示，核酸电泳图如图11所示。
对比例2：
质粒SX1628-71sgXG敲除Gly基因的效率计算。
1)根据对比例1步骤(4)中的核酸电泳图计算敲除效率，计算公式如公式(1)所示，敲除效率结果对比如表12所示。
表12回补质粒敲除效率对比表
| 质粒类型 | SX1628-71sgXG | SX1628-71sgX |
| 敲除效率 | 0 | 8％ |
表13引物序列表
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应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种提高基因敲除效率的方法，其特征在于：包括，先构建包含目的菌株基因组中需要敲除基因片段的外源质粒，再通过无缝克隆技术将外源质粒导入目标菌株，后使用CRISPR-Cas9技术敲除菌株基因组上的目的基因片段，最后通过多次传代逐步丢失外源质粒。
2.如权利要求1所述的提高基因敲除效率的方法，其特征在于：所述外源质粒为含有回补基因表达盒的外源质粒。
3.如权利要求2所述的提高基因敲除效率的方法，其特征在于：所述回补基因是待敲除的目的基因的同义突变体。
4.如权利要求3所述的提高基因敲除效率的方法，其特征在于：所述同义突变后的回补基因不被sgRNA所识别。
5.如权利要求1所述的提高基因敲除效率的方法，其特征在于：敲除对菌株正常生长存在影响的目的基因时，敲除效率可达到8％。
6.如权利要求1所述的提高基因敲除效率的方法，其特征在于：所述使用外源质粒过表达需要敲除的基因。
7.如权利要求1所述的提高基因敲除效率的方法，其特征在于：所述外源质粒为SX1628-71sgX，其基因序列如SEQ ID NO：2所示。
8.如权利要求1所述的提高基因敲除效率的方法，其特征在于：所述基因敲除方法的敲除效率相比不使用基因回补策略的敲除效率实现了从0到8％的突破。
9.如权利要求1所述的提高基因敲除效率的方法的应用，其特征在于：所述基因敲除方法可用于敲除对于待敲除菌株生长影响较大的目的基因。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述基因敲除方法还可用于连续敲除多个基因。
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| CN113322272A (zh) * | 2021-06-08 | 2021-08-31 | 上海大学 | 一种基于同源重组原理对耳道念珠菌进行基因敲除以及敲除株回补的方法 |
| CN115125262A (zh) * | 2022-06-20 | 2022-09-30 | 厦门大学 | 一种水稻垩白相关基因及其编码蛋白和应用 |
| CN115558677A (zh) * | 2022-08-02 | 2023-01-03 | 浙江海洋大学 | 一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法 |
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2023
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