CN117607443A - 用于诊断乳腺癌的生物标志物组合 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术和医学诊断领域，具体而言，本发明涉及用于诊断乳腺癌的生物标志物组合，所述生物标志物组合包括针对SHCBP1、IPL1、SNX33和NCAPG2的自身抗体的组合。本发明还涉及用于诊断乳腺癌的试剂盒，其包含用于检测所述生物标志物组合的试剂。本发明还涉及于检测所述生物标志物组合的试剂在制备用于诊断乳腺癌的工具中的用途。与现有技术相比，本发明的生物标志物组合为全新的一组肿瘤自身抗体，这些自身抗体在组合使用时，具有相当高的检测灵敏度和检测特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学诊断领域，具体而言，本发明涉及用于诊断乳腺癌的生物标志物组合。
背景技术
乳腺癌(breast cancer，BC)是女性中最常见的癌症，也是世界范围内女性因癌症死亡的常见癌种。乳腺癌筛查在改善患者的预后方面发挥着重要作用，因为早期发现的患者预后明显更好。乳房X线摄影术目前是最主要的乳腺癌筛查工具，但它有几个众所周知的缺点，包括难以检测致密乳房中的癌症，这种情况在年轻女性中很常见，以及假阳性率高和可能引起过度诊断。
因此，需要从易于获取的样本中筛选可靠的生物标志物，以建立用于常规筛查的、平价的、高效的检测方法。源于血液的生物标志物恰恰符合这种标准，并且提供了一种非侵入性的策略来改善乳腺癌筛查。血液生物标志物包括与肿瘤组织相关或从肿瘤组织释放的物质、其他组织响应肿瘤而释放的物质。尽管目前使用的血液生物标志物，例如癌胚抗原（CEA）、癌抗原15-3等，对早期乳腺癌不够敏感，但随着近年来的技术进步，出现了不少与血液生物标志物筛查有关的新发现。
有应用前景的新型候选生物标志物，如蛋白质、自身抗体、miRNA等，已显示出检测乳腺癌的潜力，包括在疾病的侵袭前和早期阶段进行检测。
自身抗体是机体针对肿瘤相关抗原发生免疫反应而产生的特异性抗体，在肿瘤的早期诊断中具有较大的应用潜力。作为早期诊断的一类指标，自身抗体具有以下特点：伴随肿瘤的发生过程产生，先于临床症状，适用于早期诊断；自身抗体的产生是免疫反应的结果，经过免疫系统的放大，抗体更容易被检测；具有特定类型肿瘤特异性；对于一个特定的肿瘤相关抗原，其自身抗体仅出现在10％-30％的病人中，作为诊断工具，其灵敏度偏低。因此，需要通过联合多个指标，建立一个标志物组合，在维持较高特异性的前提下，提高检测灵敏度，从而可应用于临床诊断。
迄今为止，临床实践中尚没有独立用于乳腺癌早期检测或诊断的血液生物标志物。本领域仍需要一种针对乳腺癌的分子标志物组合来辅助诊断该疾病，仍有必要发现新的自身抗体生物标志物组合。
发明内容
为了解决上述问题，在第一方面，本发明提供了一种用于诊断乳腺癌的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物组合包括针对SHCBP1、IPL1、SNX33和NCAPG2的自身抗体的组合。
进一步地，所述自身抗体为受试者外周血(优选为血浆或全血)中的自身抗体。
进一步地，所述受试者为哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。
在第二方面，本发明提供了一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，包含用于检测生物标志物组合的试剂，其中所述生物标志物组合包括针对SHCBP1、IPL1、SNX33和NCAPG2的自身抗体的组合。
进一步地，所述自身抗体为受试者外周血中的自身抗体。
进一步地，所述用于检测生物标志物组合的试剂包括用于检测所述自身抗体的水平的试剂。
进一步地，所述试剂盒通过抗原抗体反应对自身抗体进行检测。
进一步地，所述用于检测所述自身抗体的水平的试剂包括所述自身抗体的抗原。
进一步地，所述抗原包括SHCBP1蛋白、IPL1蛋白、SNX33蛋白和NCAPG2蛋白。
进一步地，所述试剂盒是采用以下方法进行检测：酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白/肽段芯片检测、化学发光、免疫印迹、微珠免疫检测、微流控免疫、或其组合。
优选地，试剂盒为酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒。即，采用该试剂盒，通过酶联免疫吸附法来检测受试者的外周血中自身抗体生物标志物是否是阳性的。相应地，除了抗原蛋白以外，所述试剂盒还可包括用于对自身抗体生物标志物进行ELISA检测的所需其他组分，这些均是本领域公知的。出于检测目的，例如，试剂盒中的抗原蛋白可连接有标签肽，例如His标签、链霉亲和素标签、Myc标签；又如，该试剂盒可以包括固相载体，如具有可固定抗原蛋白的微孔的载体，如酶标板；或者微珠或磁珠固相载体。还可以包括用于将抗原蛋白固定于固相载体上的吸附蛋白、血液如血清的稀释液、洗涤液、带有酶标记的二抗或者荧光或化学发光的物质的二抗、显色液、终止液等。通过间接或直接包被在固相载体表面的抗原蛋白，和血清/血浆/组织液等中的抗体进行反应形成抗原－抗体复合物的原理来检测体液中的相应抗体的浓度。
在第三方面，本发明提供了用于检测本文所述的生物标志物组合的试剂在制备用于诊断乳腺癌的工具中的用途。
进一步地，所述用于检测本文所述的生物标志物组合的试剂包括用于检测所述自身抗体的水平的试剂。
进一步地，所述用于检测所述自身抗体的水平的试剂包括所述自身抗体的抗原。
进一步地，所述抗原包括SHCBP1蛋白、IPL1蛋白、SNX33蛋白和NCAPG2蛋白。
在第四方面，本发明提供了一种用于诊断乳腺癌的方法，其包括以下步骤：
(1)对来自受试者的外周血进行本发明提供的生物标志物组合中的每个自身抗体的定量；
(2)将所述自身抗体的量与参考阈值进行比较，在其高于参考阈值时，确定所述受试者患有乳腺癌或具有乳腺癌患病风险。
在步骤(1)中，所述定量包括采用本发明提供的试剂(即抗原蛋白组合) 或包含该试剂的试剂盒对所述自身抗体组合中的每个自身抗体进行检测。
根据本发明，所述受试者为哺乳动物，优选为灵长类哺乳动物，更优选为人。并且，优选地，所述乳腺癌包括Luminal乳腺癌、HER2乳腺癌和三阴性乳腺癌。
在步骤(2)中，所述参考阈值可以是来自健康人或健康人群的参照水平；例如，可以被定义为经身体检查确认未患有癌症的人群的平均值加2个标准偏差或3个标准偏差。
本发明的有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种用于诊断乳腺癌的新型生物标志物组合，其为全新的一组肿瘤自身抗体。这些自身抗体在组合使用时，具有相当高的检测灵敏度和检测特异性。
附图说明
图1显示了本发明的自身抗体组合在Luminal乳腺癌分子亚型检测中的灵敏度和特异性。
图2显示了本发明的自身抗体组合在HER2阳性乳腺癌分子亚型检测中的灵敏度和特异性。
图3显示了本发明的自身抗体组合在三阴性乳腺癌分子亚型检测中的灵敏度和特异性。
具体实施方式
在本发明中，术语“抗原”或术语“抗原蛋白”可互换使用。此外，本发明中涉及以下实验操作或定义。应注意，本发明还可采用本领域其他常规技术进行实施，并不仅限于以下实验操作。
(一)重组抗原蛋白的制备
将肿瘤抗原的cDNA片段克隆到含6XHis标记的PET28(a)表达载体上。在抗原的N端或C端，引入链霉亲和素蛋白或类似物(结合生物素的标签蛋白)。获得的重组表达载体转化大肠杆菌进行表达。上清表达的蛋白通过 Ni-NTA亲和柱和离子柱进行纯化。当蛋白表达在包涵体内，用6M盐酸胍对蛋白进行变性处理，并在体外按照标准方法进行复性折叠，然后通过6XHis 标签进行Ni-NTA亲和柱纯化，获得抗原蛋白。
(二)血清或血浆的制备和保存
乳腺癌患者血清或血浆在患者最初诊断为乳腺癌，尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集。血浆或血清按标准临床程序制备，置于-80℃冰箱中长期保存。
(三)ELISA检测
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量样本中自身抗体的浓度。
纯化的肿瘤抗原通过其标签链霉亲和素或类似物固定到微孔表面。微孔预包被生物素标记的牛血清白蛋白(BSA)。血清或血浆样本用磷酸盐缓冲稀释1:110倍，加入微孔进行反应(50毫升/孔)。用洗液冲洗未结合的血清或血浆成分后，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗-人IgG进行反应。然后加入反应底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)进行显色。加入终止溶液(1N HCl)，吸光度为450nm单光谱进行酶标仪进行读值(OD)。用标准曲线定量血清自身抗体浓度。
(四)自身抗体的临界值(截断值)
自身抗体的截断值（也即参考阈值）被定义为在经身体检查确认未患有癌症的对照正常人群的检测吸光度值的平均值加2个标准偏差(SD)或平均值加3个标准偏差(SD)。每个自身抗体的截断值的确定根据以下原则：1.在采用两个不同数值(平均值加两个标准偏差和平均值加三个标准偏差)作为参考阈值的情况下，每个自身抗体对所述对照正常人群的检测特异性均为95％或以上；2.在采用所述两个不同数值作为参考阈值的情况下，得到每个自身抗体对所述对照正常人群的特异性和对乳腺癌患者人群的灵敏度，计算二者总和，选择该总和更大情况下的数值作为该自身抗体的确定的截断值。
(五)单个自身抗体的阳性、阴性判断
对于每种自身抗体测定，阳性反应定义为对样本中自身抗体的水平进行定量后，将其与截断值进行比较，≥截断值为阳性；相应地，阴性反应定义为＜截断值为阴性。
(六)自身抗体组合的阳性判断
由于单个自身抗体的阳性率低，为了增加自身抗体检出的阳性率，分析结果时联合多个自身抗体的结果来判断预测效果。规则是：在样本中检测多个自身抗体，只要有其中一个或者多个自身抗体显示阳性，则判断抗体组合结果为阳性；而如果所有的自身抗体均为阴性，则判断抗体组合结果为阴性。
(七)统计分析方法
使用GraphPad Prism v.6(Graphpad Prism软件，加利福尼亚州圣地亚哥) 和针对Windows的IBM SPSS Statistics 23(IBM，纽约)，使用 Mann–Whitney U检验对两组进行了统计学分析。在分析每个参数之间的关系时，执行了Spearman的相关分析。
(八)灵敏度和特异性判断
灵敏度：金标准诊断全部乳腺癌病例中，自身抗体组合检测结果为阳性的病例占全部有病病例的比例。
特异性：金标准诊断全部无病的受试者中，自身抗体组合检测结果为阴性的受试者占全部无病受试者的比例。
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例中包括了健康体检人群50例和乳腺癌患者83例，进行自身抗体标志物的筛选。健康体检人群来自不少于3个不同体检中心。所有的乳腺癌患者的外周血都是在患者诊断为乳腺癌尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的，并在-80℃冰箱保存。实施例中乳腺癌患者的信息见表1。
表1
实施例1：筛选自身抗体
提取35例乳腺癌患者和20例健康人对照的外周血，采用Huprot芯片检测血液自身抗体。
1、样品制备步骤
收集入组人群的静脉血标本，经过3500r/min，4℃离心10分钟后，将上清液分离到干净的1.5mL Ep管中，每个样本分装成3份，做好标记信息后放入-80℃冰箱保存，待实验时取用，避免反复冻融。
2、筛选步骤
1)芯片准备：从-80℃冰箱取出Huprot芯片，放入芯片盒中，保鲜膜包裹后，室温放置20min复温。
2)封闭：蒸馏水浸湿孵育槽，芯片蛋白面朝上放入其中，加入5mL的封闭液轻晃并没过芯片蛋白面，盖上槽盖；置于摇床缓慢的水平摇晃，室温孵育1.5h。
3)样品准备：提前从-80℃取出样品，室温溶解，振荡混匀后高速(12000rpm)离心10min；取上清5μL与5mL封闭液1:1000涡旋混匀，即为配制好的样品。
4)加样：倒掉孵育槽封闭液，直接加入第3)步配制好的样品，轻晃没过芯片；盖上槽盖，室温孵育1h。
5)漂洗：用PBST缓冲液洗6次，后3次漂洗过程需置于摇床，快速的左右摇晃10min/次。
6)二抗准备：关灯，提前10min从冰箱取出封闭液和二抗IgG。取5mL冻存管，用锡箔纸包住冻存管，加入10μL二抗IgG和5mL封闭液，涡旋混匀，获得配置好的二抗溶液。
7)加二抗：漂洗后，孵育槽中加入5mL第6)步配制好的二抗溶液，轻轻摇晃保证全部没过；盖上槽盖，包上锡箔纸以避光。置于摇床缓慢的水平摇晃，室温孵育1h。
8)漂洗：先用PBST缓冲液洗6次，后3次漂洗过程需置于摇床，快速的左右摇晃10min/次。再用10x的PBST缓冲液洗3次，置于摇床，快速的左右摇晃10min/次。
9)晾干芯片：漂洗后，从孵育槽中取出芯片，竖直于吸水纸上沥干，放入芯片盒。
10)扫描和读片：
第一、提前20min开机预热：打开电脑电源键，主机开关，扫描仪开关；打开软件Genepix pro-Device。
第二、放入芯片，有条形码蛋白面朝下，设置激发光波长为635，光电被增管(PMT)设置为700，激光能量(Power)设置为10％，像素大小(Pixel size)设置为10m，点击绿三角开始按钮，扫描开始。扫描完点击白色信封，第三条，保存，tif格式；
第三、数据提取/圈点：打开Genepix软件——将tif文件和gal文件一起拉到小窗口——设置(左上image和右下蓝色设置PMT-GAN——整理数据：选中区，根据固定阳性点(2个挨着的都有强信号算阳性)调整区的位置，没必要拉掉假阳性点到黑色背景区，只操作保证准阳性点(强度约在背景10倍)恰好圈住(上下左右移动，Ctrl加上下调大小)——保存为gps格式，名字与tif格式命名相同。
3、试验结果
利用卡方检验筛选差异自身抗体，其中乳腺癌病人与健康对照相比有3857种差异蛋白，结果筛选出差异最为显著的SHCBP1、IPL1、SNX33和NCAPG2自身抗体。
实施例2：自身抗体组合在受试人群中灵敏度和特异性检测
将SHCBP1、IPL1、SNX33和NCAPG2抗原经过表达纯化后包被到96孔板表面，封闭后和稀释1:110倍的乳腺癌血清或体检对照人群血清反应，接着和抗人IgG抗体-HRP辣根过氧化氢酶反应，然后进行显色反应，并用酶标仪OD450nm波长检测。实验结果如表2所示。
表2：单个自身抗体作为乳腺癌标志物的灵敏度和特异性。
从表2的结果可知，由于肿瘤患者免疫系统的强弱不同，加上肿瘤产生机理多样性，单个肿瘤自身抗体在肿瘤患者的分布灵敏度低。
对此，将自身抗体进行组合并使用对应的检测试剂对其进行检测。实验结果如表3所示。
表3：各乳腺癌自身抗体组合的灵敏度和特异性。
从表3的结果可知，随着抗原的数目增多，检测灵敏度不断增加，而特异性逐渐减少。当四种自身抗体组合时，检测灵敏度和特异性分别是51.2%和91.7%，达到了相当高的水平，并且相较于两种或三种自身抗体的组合检测灵敏度明显更高，说明这四种自身抗体作为诊断标志物可以相互补充，从而协同提升检测灵敏度。
实施例3：自身抗体组合在不同乳腺癌分子亚型检测中的灵敏度和特异性
本发明对受试患者的乳腺癌分子亚型进行分类，根据癌细胞分子标志物的表达情况，将其分为Luminal、HER2和三阴性乳腺癌。对不同类型的患者，分析其血清检测数据。利用本发明的自身抗体组合（自身抗体SHCBP1+IPL1+SNX33+NCAPG2），分析其对不同分子亚型乳腺癌的检测能力。结果如表4和图1-3所示。
表4：自身抗体组合在不同乳腺癌分子亚型检测中的灵敏度和特异性
从表4的结果可知，本发明的自身抗体组合可以用于诊断不同乳腺癌分子亚型，具有较高的诊断灵敏度和特异性。
需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于诊断乳腺癌的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物组合包括针对SHCBP1、IPL1、SNX33和NCAPG2的自身抗体的组合。
2.根据权利要求1所述的生物标志物组合，其特征在于，所述自身抗体为受试者外周血中的自身抗体。
3.一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，包含用于检测生物标志物组合的试剂，其中所述生物标志物组合包括针对SHCBP1、IPL1、SNX33和NCAPG2的自身抗体的组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述自身抗体为受试者外周血中的自身抗体。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测生物标志物组合的试剂包括用于检测所述自身抗体的水平的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测所述自身抗体的水平的试剂包括自身抗体的抗原。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原包括SHCBP1蛋白、IPL1蛋白、SNX33蛋白和NCAPG2蛋白。
8.用于检测权利要求1或2所述的生物标志物组合的试剂在制备用于诊断乳腺癌的工具中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述用于检测权利要求1或2所述的生物标志物组合的试剂包括用于检测所述自身抗体的水平的试剂。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述用于检测所述自身抗体的水平的试剂包括所述自身抗体的抗原；
所述抗原包括SHCBP1蛋白、IPL1蛋白、SNX33蛋白和NCAPG2蛋白。
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