CN103981276A - 一种用于诊断乳腺癌的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化学与分子生物学领域，提供一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有特异性扩增检测人HERC4基因mRNA表达水平的荧光定量PCR引物：5’-GTCTCCACAGTTGCCAGTAATA-3’(SEQ NO.1)，5’-CTAAAGCACTGCAGCATCAATAA-3’(SEQ NO.2)；和荧光探针：5’FAM-ACCCAGTGATTGGTGCTCATAGTAGC-BHQ13’(SEQ NO.3)。该试剂盒对乳腺癌中HERC4基因的表达检测具有良好的敏感性和特异性，重复性很好，可以有效的区分乳腺癌癌变的上皮细胞和正常乳腺上皮细胞(或乳腺良性病变细胞，包括乳腺增生、乳腺囊肿、乳腺纤维瘤、乳腺炎导管内乳头状瘤等)，从而为乳腺癌的临床诊断和鉴别诊断提供参考依据。

Description

一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及生物化学及分子生物学领域，具体涉及包含核酸测定或检验方法的检测试剂。
背景技术
自上世纪70年代末开始，全球乳腺癌发病率一直呈上升趋势。世界卫生组织GLOBOCAN网站统计预测，2013年全球有130万妇女被诊断患有乳腺癌，45万死于乳腺癌。国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的数据显示：在全国肿瘤登记地区，2009年乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率(粗率)全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万。可见乳腺癌已成为威胁女性生命和健康，影响当前社会的重大公共卫生问题。
乳腺癌的早期发现、早期诊断，是提高疗效的关键。据国内资料报道，乳腺癌I期的5年生存率在90％～95％以上，II期是70％到80％，III期是50％到60％，IV期则是10％左右，其治愈率与临床分期存在相关关系。早期乳腺癌的治愈率高，晚期的治愈率低，因此早期诊断、早期治疗对于乳腺癌的防治具有重要意义。然而，早期乳腺癌往往不具备典型的症状和体征，不易引起重视。多数患者是自己无意中发现乳腺肿块来医院就诊的，少数患者是通过定期体检或筛查被发现乳腺肿物或可疑病变。这种被动诊断的结果常常造成了早期治疗的延误。
目前国内乳腺癌的诊断主要是通过实验室检查和辅助检查。应用免疫学的方法对于肿瘤标志物的检查，普遍存在特异性差、灵敏度低等问题，尤其对于早期乳腺癌的诊断效率更低。而影像学检测对于占位较大的肿瘤才有较高的诊断率。同样脱落细胞学检查主要是针对乳头溢液涂片、乳腺肿物破溃处等症状已经较为明显的组织进行检查。除此之外，中国属于发展中国家，人口基数庞大，开展以影像学为主的筛查还需要一段时间。多数乳腺癌患者确诊时已处于晚期，对于病人术后预后的检测和有效治疗方法的选择需要更有效、更简便的方法。
研发具有灵敏度高、特异性强、简单方便的乳腺癌诊断产品，是提高乳腺早期检出率，改善预后的关键之一。蛋白质的降解主要有两条途径，其中一条是通过溶酶体的非特异性降解；另外一条是通过泛素-蛋白酶系统(UPS)的特异性降解，被选择的蛋白质连接有泛素“标签”以后，就会被转入26S蛋白酶体中进行特异性降解。泛素是由76个氨基酸组成的蛋白质，广泛存在于生物体内。泛素连接至蛋白质的氨基酸残基上主要通过三种酶的作用：泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。E3泛素连接酶决定了泛素化底物的特异性,大量研究表明，泛素-蛋白酶系统(UPS)在肿瘤的发展、发展过程中起到了关键作用。
HERC4是近年来才被鉴定出的一种E3泛素连接酶，其特点是具有HECT结构域和至少一个RCC1样结构域。免疫荧光结果显示HERC4定位于细胞的核内体和溶酶体中。研究证明，在小鼠中突变HERC4基因，可通过减弱成熟精子的运动性而间接影响雄性小鼠的生育能力。关于HERC4基因在乳腺癌发生、发展过程中起到的作用，及其可以作为一种新的乳腺癌临床诊断和鉴别诊断的分子标志物应用于临床，目前国内外尚未有报导。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒对乳腺癌中HERC4基因表达检测具有良好的敏感性和特异性等特点。
本发明解决上述问题的技术方案具体是：
一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括一对引物、荧光探针和定量阳性模板，其特征在于，
(1)所述的一对引物是特异性扩增HERC4基因的引物，其序列为：
上游引物序列为：5’-GTCTCCACAGTTGCCAGTAATA-3’(SEQ NO.1)；
下游引物序列为：5’-CTAAAGCACTGCAGCATCAATAA-3’(SEQ NO.2)；
(2)所述的荧光探针的序列为：
5’FAM-ACCCAGTGATTGGTGCTCATAGTAGC-BHQ13’(SEQ NO.3)，
其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，BHQ1为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；
(3)所述的定量阳性模板为克隆有HERC4基因片段的pMD18-T载体重组质粒，其中所述的HERC4基因片段的序列为：
GTCTCCACAGTTGCCAGTAATAAAAAGAAACATTGGCTACTATGAGCACCAATCACTGGGTTATAGCTTTCAAAATTATTGATGCTGCAGTGCTTTAG(SEQ NO.4)。
本发明所述的用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒还包括Taq DNA聚合酶预混液和参比染料。
本发明所述的特异性扩增HERC4基因的引和物荧光探针可以采用本领域常用的方法合成。
上述的荧光定量PCR试剂盒中的，所述的Taq DNA聚合酶预混液为来自大连宝生物(Takara)公司的Premix Ex TaqTM，所述的参比染料为来自大连宝生物(Takara)公司的ROXReference Dye II。
本发明所述的定量阳性模板的构建方法是将HERC4基因片段(SEQ NO.4)插入到pMD18-T质粒载体中构建重组质粒得到，其中所述的将HERC4基因片段(SEQ NO.4)插入到质粒载体的方法为本领域的常规方法，具体的步骤和参数按照所选的质粒载体、插入片段、DNA连接酶等而定。
根据Genbank检索结果，HERC4基因在人体内主要有两个可变转录本(transcriptvariant)，Genbank登录号分别为NM_022079.2及NM_015601.3，BLAST结果显示，这两个转录本仅有24个碱基(1个外显子)的差别，本发明人通过前期研究发现，这两个转录本在正常乳腺上皮细胞中均不表达，而在乳腺癌组织中明显高表达，因此本发明试剂盒针对HERC4基因的两个转录本中的共有序列设计了上游及下游扩增引物(SEQ NO.1和SEQ NO.2)，其位置在靠近HERC4基因多聚腺苷酸尾部(如图1所示)，以保证该片段在逆转录过程中能够得到有效的合成。
本发明所述的试剂盒的使用方法为：
(1)荧光定量PCR，反应体系如下：
表1本发明试剂盒Real-Time PCR反应体系
反应条件：95℃30s
(2)绘制定量标准曲线：将定量阳性模板按10倍稀释法稀释成107～103copies/mL5个浓度梯度，按照上述反应体系和反应程序，反应结束后计算机自动绘制标准曲线Y＝A×logX+B，R2，其中X表示起始模板拷贝数，Y表示Ct值。
(3)样品检测：首先采用大连宝生物(Takara)公司RNAiso Plus试剂盒从乳腺癌手术切除标本中提取总RNA；然后使用大连宝生物(Takara)公司PrimerScriptTM RT reagent kit逆转录试剂盒将上述总RNA逆转录为cDNA第一链，以此作为荧光定量PCR的模板DNA；依照上述反应体系和反应条件进行扩增即可。
(4)结果判断：设置阴性对照和空白对照，取待测样本进行荧光定量PCR检测，Ct值小于30.0为阳性，大于30.0时为阴性，其中阴性对照样本是水稻cDNA。
本发明具有以下优点：
1)本发明设计的引物及荧光探针的重复性好。
2)本发明试剂盒在具有很好的敏感性，可检出模板浓度仅1copy/μL的HERC4基因表达。
3)本发明试剂盒在具有很好的灵敏度，以病理诊断为金标准，在48例乳腺浸润性导管内癌中本试剂盒检测的阳性率为93.75％。
4)本发明试剂盒在具有很好的特异性，以病理诊断为金标准，在35例正常乳腺上皮细胞以及乳腺增生、乳腺囊肿、乳腺纤维瘤、乳腺炎导管内乳头状瘤等乳腺良性病变检测均为阴性，能够有效避免假阳性的出现。
附图说明
图1是本发明试剂盒扩增的DNA片段的在HERC4基因的两个可变转录本(Genbank登录号：NM_022079.2及NM_015601.3)上的位置图，图中黑色斜线方框所示的部位是本发明试剂盒扩增的DNA片段。
图2是定量阳性模板重组质粒、以及重组质粒单酶切线性化后琼脂糖凝胶电泳结果，以pMD18T载体构建的重组质粒大小为2790bp。
图3是利用阳性模板质粒制作标准曲线时，不同稀释度的质粒荧光定量PCR扩增曲线，从左至右各条曲线代表107、106、105、104、103个copies/mL拷贝数质粒的扩增曲线。
图4是荧光定量PCR标准曲线结果，标准曲线回归方程Y＝-3.00885logX+35.946461，相关系数R2＝0.994423。
图5是灵敏度检测结果，为48例乳腺浸润性导管内癌的扩增曲线。
图6是特异性检测结果，为35例正常乳腺上皮细胞以及乳腺良性病变的扩增曲线。
具体实施方式
实施例1(本发明所述的试剂盒的制备)
1.检测HERC4基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒的组成：
上游引物：5’-GTCTCCACAGTTGCCAGTAATA-3’，10μM
下游引物：5’-CTAAAGCACTGCAGCATCAATAA-3，10μM
荧光探针：5’FAM-ACCCAGTGATTGGTGCTCATAGTAGC-BHQ13’，3μM
定量阳性模板：含有HERC4基因片段(SEQ NO.4)的PMD18-T重组载体，108copies/mL。
Taq DNA聚合酶预混液：Premix Ex TaqTM(2×)，购自大连宝生物(Takara)公司。
参比染料：Rox Reference Dye II，购自大连宝生物(Takara)公司。
2.阳性模板制备
(1)从本室保存的人胎盘cDNA文库中获取克隆有HERC4基因全长cDNA的质粒，用序列为SEQ NO.1和SEQ NO.2的上、下游引物扩增出序列为SEQ NO.4的HERC4基因片段，扩增条件为：94℃变性5min后进入下述循环，94℃30s、57℃30s、72℃60s，共25个循环；
(2)1％琼脂糖电泳，切胶回收后，使用Qiagen切胶回收试剂盒(QIAquick GelExtraction Kit)回收纯化扩增所得的HERC4基因片段(SEQ NO.4)，并将浓度调整至0.3pmol/μL；
(3)将DNA片段SEQ NO.4插入到pMD18-T载体中，具体方法是：
a.DNA片段SEQ NO.4与T载体的连接和转化：
1)在微量离心管中加入：
18-T Vector*1           1μL
HERC4基因片段(SEQ NO.4)      1μL
ddH2O                        3μL；
2)加入5μL的连接反应预混液Solution I；
3)16℃反应2h；
4)取2μL连接反应产物，冰上预冷。与50μL感受态大肠杆菌DH5α混合，冰上放置30min，42℃90s，冰上5min，以重组DNA分子转化感受态大肠杆菌。
5)加入无抗生素LB液体培养基500μL，120r/min速度37℃振荡1h，取150μL菌液涂板于含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上，37℃培养14h；
6)挑取白色菌落进行鉴定。将所得重组质粒用限制性内切酶BamH I进行单酶切线形化，用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定,所得产物大小为2790bp。重组质粒及酶切后的线形化质粒电泳结果见附图2。
(4)重组质粒提取：对于鉴定含有HERC4基因片段(SEQ NO.4)的菌落扩大培养500mL，采用Qiagen质粒中提试剂盒(QIAGEN Plasmid Midi Kit)抽提重组质粒，并将终浓度调整为108copies/mL，获得定量阳性模板。
实施例2(体外实验绘制标准曲线，检测重复性及敏感性)
1、模板准备：采用本发明试剂盒的定量阳性模板绘制定量标准曲线，检测本试剂盒的重复性、敏感性。
2、荧光定量PCR反应：
1)反应体系如发明内容中的表1所示。
2)反应条件：每批反应设一个空白对照和阴性对照，取待测样本进行荧光定量PCR反应，其中空白对照样为双蒸水，其中阴性对照样本是水稻cDNA。反应条件为：
95℃ 30s
仪器：7500型荧光定量PCR仪，美国ABI公司。
3、标准曲线制备
将定量阳性模板线性化后10倍倍比稀释，依次从107稀释到103copies/mL。各取2μL进行荧光定量PCR，制作标准曲线。扩增曲线见附图2，标准曲线见附图3。标准曲线回归方程Y＝-3.00885logX+35.946461，相关系数R2＝0.994423。从图可以看出，用阳性质粒所作的标准曲线的Ct值与初始浓度有较好的线性关系。
4、重复性和再现性
以上述标准曲线稀释后的5个浓度定量阳性模板，分不同的时间重复三次，每次做三个重复孔，获得Ct值，计算各模板浓度下Ct值的均值(Mean)、标准差(SD)以及相对标准差(RSD)，并列出理论值和检测值(见表2)。以上数据充分表明建立的方法具有很好的重复性和再现性。
表2各个浓度的Ct值的均值以及变异系数
a RSD(relative standard deviation)是指标准差除以平均值，以百分数表示。SDr，重复性标准差；SDR，再现性标准差。
4.敏感性检测
在标准曲线检测107、106、105、104、103个copies/mL五个稀释度模板的基础上，将上述线性化后的定量阳性模板继续稀释到100copies/mL(0.5copy/μL)、10copies/mL(0.05copy/μL)时，取2μL作为模板，行荧光定量PCR检测，三个重复孔Ct值均为阴性结果，提示本发明试剂盒检测的敏感性为103copies/μL(即1copy/μL)。
实施例3(临床标本检测灵敏度及特异性)
1、实验方法：
1)临床标本收集：
乳腺癌及癌旁正常乳腺组织、乳腺良性病变组织收集自南方医院乳腺中心，手术切除标本后，立刻切成厚度<5mm的组织块，并浸泡于10倍体积的RNAlater溶液(美国Ambion公司)中，4℃过夜，然后长期保存在－20℃。
2)临床标本检测：
A.RNA提取：
对南方医院乳腺中心收集到的48例乳腺浸润性导管内癌及35例正常乳腺上皮细胞以及乳腺增生、乳腺囊肿、乳腺纤维瘤、乳腺炎导管内乳头状瘤等乳腺良性病变标本，采用大连宝生物(Takara)公司RNAiso试剂抽提总RNA,具体步骤为：
a.将低温冻结的组织标本称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒)。
b.按照每50～100mg组织样品中加入1mL的RNAiso，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。
c.将匀浆液转移至离心管中，室温静置5min。
d.12,000g4℃离心5min。
e.小心吸取上清液，移入新的离心管中。向上述匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s。待溶液充分乳化后，再室温静置5min。
f.12,000g4℃离心15min。
g.吸取上清液转移至另一新的离心管中，并向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10min。
h.12,000g4℃离心10min。
i.小心吸去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l mL洗涤沉淀，12,000g4℃离心5min后小心弃去乙醇。
j.室温干燥沉淀2～5分钟后加入20uL的RNase-free水溶解沉淀。取2μL RNA样品于1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，并使用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，其余样品于-80℃保存。
B.逆转录反应
对于RNA A260/A280值处于1.8-2.2之间的合格RNA样品进行逆转录反应。反应液参照RT reagent Kit说明书于冰上进行配置，10μL反应体系如下：
反应条件：37℃15min(反转录反应)
85℃5sec(反转录酶的失活反应)
逆转录反应产物直接进行实时荧光定量PCR反应或置于-20℃中保存。
C.本发明所述的荧光定量PCR试剂盒检测
荧光定量PCR反应体系如发明内容中的表1所示。
反应程序为：
95℃ 30s
仪器：7500型荧光定量PCR仪，美国ABI公司。
判断标准：Ct值小于30.0为阳性，大于30.0时为阴性。
2、实验结果：
采用实施例1所述的试剂盒对48例乳腺浸润性导管内癌标本检测到HERC4阳性表达为45例，以病理诊断作为金标准，实验采取双盲法，阳性率达到93.75％(见表4)。在35例正常乳腺上皮细胞以及乳腺增生、乳腺囊肿、乳腺纤维瘤、乳腺炎导管内乳头状瘤等乳腺良性病变检测均为阴性，能够有效避免假阳性的出现。以上数据表明本发明试剂盒具有很好的灵敏度与特异性，从而为乳腺癌的临床诊断和鉴别诊断提供参考依据。
(1)检测范围
2.灵敏度
灵敏度(真阳性率)＝93.75％
3.特异度
特异度(真阴性率)＝100.00％

Claims (2)

1.一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括一对引物、荧光探针和定量阳性模板，其特征在于，
(1)所述的一对引物是特异性扩增HERC4基因的引物，其序列为：
上游引物序列为：5’-GTCTCCACAGTTGCCAGTAATA-3’；
下游引物序列为：5’-CTAAAGCACTGCAGCATCAATAA-3’；
(2)所述的荧光探针序列为：
5’FAM-ACCCAGTGATTGGTGCTCATAGTAGC-BHQ13’，
其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，BHQ1为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；
(3)所述的定量阳性模板为克隆有HERC4基因片段的pMD18-T载体重组质粒，其中所述的HERC4基因片段的序列为：
GTCTCCACAGTTGCCAGTAATAAAAAGAAACATTGGCTACTATGAGCACCAATCACTGGGTTATAGCTTTCAAAATTATTGATGCTGCAGTGCTTTAG。
2.根据权利要求1所述的一种用于诊断乳腺癌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括Taq DNA聚合酶预混液和参比染料。
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