CN114703286A - Her2/cep17基因检测探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及HER2/CEP17基因检测探针及其应用。本发明通过对多个核酸片段进行筛选，获得最优标记效果的探针。本发明提供的探针基于FISH技术对样品进行检测，将其作为乳腺癌诊断的试剂，能够获得更准确、更灵敏的检测效果。

Description

HER2/CEP17基因检测探针及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及HER2/CEP17基因检测探针及其应用。

背景技术

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，是由乳房组织发展成的癌症。研究表明，一种受体型的酪氨酸激酶-人类表皮生长因子受体2(HER2)在20％～30％的原发性乳腺浸润性导管癌中有基因的扩增和蛋白的过度表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强，无病生存期短，预后差。《2005 St Gallen国际治疗指南》指出，在乳腺癌风险级别评估因子当中，虽然淋巴结状态仍然是最重要的因素，但HER2状态直接影响风险的级别。当淋巴结阴性或只有1～3个淋巴结有转移时，如HER2过表达或基因扩增则风险级别分别由低上升为中，中上升为高。另外，把HER2状态作为乳腺癌药物(环磷酞胺、阿霉素、5-氟尿嚓咙和曲妥珠单抗)治疗的主要参考指标。曲妥珠单抗(赫赛汀)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于HER2的细胞外部位，适用于治疗HER2过度表达的乳腺癌。由于只有HER2过度表达和基因扩增的乳腺癌患者用曲妥珠单抗治疗才有效，因此正确检测和评定乳腺癌的HER2状态至关重要。

HER2基因位于17号染色体上，大约有47％的乳腺癌存在17号染色体非整体性(aneusomy)，即17号染色体不是正常的二体(2条17号染色体)，而是单体(1条17号染色体)或多体(3条或以上17号染色体)。在检测中应将17号染色体的非整体性和单纯的HER2基因扩增，尤其是低水平的扩增区分开。当HER2基因与17号染色体数目比值大于2时，即为HER2基因扩增。因此，在检测HER2的同时检测17号染色体着丝粒作为对照，就排除了单色探针(探针中仅有HER2基因)可能造成的假阴性(17号染色体单体)或假阳性(17号染色体多体)。

当HER2/CEP17比值＞2.0时，为HER2阳性；HER2/CEP17比值<2.0，但平均HER2拷贝数/细胞≥6.0时也为HER2阳性。扩增细胞应均质、连续，且占浸润癌的10％以上。需要注意的是对于HER2/CEP17比值≥2.0，但平均HER2拷贝数/细胞<4.0的病例是否应该视为ISH阳性目前尚存一定争议。

目前一般采用免疫组织化学(IHC)检侧HER2受体蛋白过度表达，应用荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization,FISH)和显色原位杂交(chromogenic insituhybridization,CISH)法检测HER2基因扩增的水平。其中，FISH是一种分子细胞遗传学技术，通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交。在荧光显微镜下，于细胞和(或)组织原位观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信息。临床使用美国FDA已经批准的探针对HER2进行检测，但其标记效果仍有待进一步提高。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供标记效果更好的尤其涉及HER2/CEP17基因检测探针及其应用。

本发明提供了HER2基因的检测探针，其为17号染色体上第39655584位～39817309位核酸。

本发明所述的HER2基因的检测探针来自HER2基因的BAC克隆。本发明所述的HER2基因的检测探针即为命名为RP11-94L15的BAC克隆。经验证，该探针的标记效果优于HER2基因的BAC克隆：CTD-2019C10、RP11-1044P23或RP11-62N23。

本发明所述HER2基因的检测探针上标记orange 552dUTP。

所述orange 552dUTP的标记方法采用缺口平移法。作为优选，标记温度为15℃，标记时间为1h，将标记产物放置冰上加入Stop buffer 5μl，65℃5min终止反应。

标记后的探针用纯化柱进行纯化，每个探针过柱后的所有反应液合并。用乙醇沉淀，DEPC水溶解测定浓度。

本发明还提供了CEP17位点的检测探针，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明查找并筛选人17号染色体着丝粒的高特异性区域，最终获得序列如SEQIDNO:1所示的片段标记效果最优。然后，通过人工合成含有此序列的质粒pUc-CEP17。

本发明提供的CEP17位点检测探针上标记CF488AdUTP。

CEP17位点检测探针的标记采用PCR法。以含有标记的专用PCR mix对核酸序列进行扩增和标记。

本发明所述检测探针在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。

本发明所述诊断包括根据患者HER2是否过表达选择治疗药物。

HER2过表达或称为HER2阳性，该类患者应给予药物赫赛汀或拉帕替尼。

本发明还提供了一种乳腺癌的诊断试剂，其包括本发明所述的检测探针。

本发明中所述的诊断试剂中，还包括Human cot-1和FISH试剂。

检测中添加Human cot-1能够封闭样品中的DNA重复序列，减少非特异性结合。

本发明所述诊断试剂中，HER2基因检测探针、CEP17基因检测探针和Human cot-1的质量比为0.05:1:25。

本发明所述FISH试剂包括3M醋酸钠、无水乙醇、70vol％乙醇和探针杂交液。

本发明中，所述探针杂交液包括硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺和2×SSC。

本发明通过对多个核酸片段进行筛选，获得最优标记效果的探针。本发明提供的探针基于FISH技术对样品进行检测，将其作为乳腺癌诊断的试剂，能够获得更准确、更灵敏的检测效果。

附图说明

图1示ENZO试剂盒标记(bac克隆标记效果)

图2示质粒DNA荧光标记结果；

图3示4个不同病例的乳腺组织切片结果；

图4示基因组中HER2的位置。

具体实施方式

本发明提供了尤其涉及HER2/CEP17基因检测探针及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

HER2检测探针的制备方法包括以下步骤：

挑选包含目的基因HER2基因序列的克隆，如图1所示，具体如下表，其购买于Invitrogen RP11BAC及CTD BAC克隆库。

BAC	插入片段起止位置	大小(bp)
			CTD-2019C10	chr17:39577926-39786803	208878
RP11-1044P23	chr17:39715531-39910359	194829
			RP11-94L15	chr17:39655584-39817309	161726
RP11-62N23	chr17:39569388-39726617	157230

探针制备：使用OMEGA的BAC/PAC DNA大量提取试剂盒，按照说明书要求的操作方法对不同BAC克隆进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定A260和A280的吸光度对质粒DNA定量，要求提取DNA的浓度大于200ng/μl，得到HER2基因的一种、两种或三种的混合质粒。

每种克隆均进行标记，用有中期分裂相的外周血进行验证，根据杂交信号的荧光亮度、杂交效率、杂交位置是否正确对上述克隆进行筛选。上述提取获得的质粒用ENZO试剂盒标记，其中，RP11-94L15荧光信号最优,其余bac克隆杂交信号弱，杂交效率低。筛选出最优标记效果质粒RP11-94L15(图1)。

通过缺口平移的方法对质粒DNA进行荧光标记，HER2基因标记的荧光染料为orange 552-dUTP，采用ENZO的Nick translation kit，按如下体系进行配制：

质粒DNA	1μg DNA用无核酸酶的水定容至30μL
		Reaction Buffer	5μL
dNTP Mix(dATP,dGTP,dCTP)	5μL
		dTTP*	3.3μL
Orange 552 dUTP	1.7μL(0.3mM)
		NT Enzyme Mix	5μL

(2)配制完成后震荡混匀，15℃标记1h，反应结束后将标记产物放置在冰上，加入5μL的stop buffer，65℃反应5min。取标记后产物5μL在2％琼脂糖凝胶做电泳，要求在50bp-250bp之间有条带(图2)。

(3)标记产物纯化，纯化方法如下：

①每50μL反应体系需要1个mini spin G-50柱。

②将mini spin G-50柱1000g离心2min。

③弃掉管底溶液，将柱子重新放置于原离心管上。

④再于1000g离心2min，将G-50柱子放置于新的离心管上。

⑤将每50μL的反应液加入一个G-50柱子中。

⑥1000g离心5min。

⑦丢弃柱子。

⑧将每个探针过柱后的所有反应液合并。

⑨对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，加入(V/10)醋酸钠及2.5V预冷无水乙醇。混匀后在-20℃冰箱中过夜。4℃14000rpm离心15min，去除上清，加入1/2倍体积的70％乙醇，4℃14000rpm离心15min，小心去除上清，避光干燥。加入10μL左右的DEPC水溶解沉淀，微量紫外分光光度测定浓度。

实施例2

CEP17检测探针的制备方法包括以下步骤：

(1)查找CEP17特异性序列，并根据筛选获得的高特异性片段设计引物，构建含有此片段质粒pUc-CEP17。

设计引物序列：探针引物1，tggatggagcaggtttgagaca

探针引物2，tcgttttccaccacaggcct

(2)pUc-CEP17质粒提取，用omega试剂盒进行提取。

(3)探针标记方法为PCR标记

非标记PCR体系如下

成份	用量
		2×标记专用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
		探针引物1(10pmol/μL)	1μL(10μM)
探针引物2(10pmol/μL)	1μL(10μM)
		模板DNA	1ng质粒DNA
超纯水	补到50μL

反应条件：

琼脂糖电泳：在500-700bp之间有较亮条带

(5)胶回收

用胶回收试剂盒对目的产物进行切胶回收，回收后进行浓度测定。

(6)标记PCR反应体系

dNTPmix配制：10mM dATP 5μL，10mM dGTP 5μL，10mM dCTP 5μL，10mM dTTP 1.5μL，1mM dUTP 4.5μL，超纯水4μL

成份	用量
		2×标记专用PCR Mix	25μl
dNTP mix	5μl
		探针引物1和探针引物2	每种50pmol
胶回收所得PCR产物	10ng
		超纯水	补到50μL

反应条件：

琼脂糖电泳：在500bp上方有较亮的条带。

(7)探针的纯化沉淀步骤同实施例1。

实施例3

HER2/CEP17探针混合液制备方法包括以下步骤：

混合后加入(V/10)3M醋酸钠(pH5.2)和(2.5V)无水乙醇(-20℃预冷)混合，-20℃沉淀过夜，4℃14000g离心15min，70％乙醇洗涤，50μL探针杂交液(包括硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、2×SSC)进行溶解。

实施例4：HER2/CEP17基因探针检测方法

1、玻片脱蜡

1.1将FFPE玻片56℃烤片机烘烤2-4h，或过夜。1.2用钻石笔在玻片背面标记出固定标本的位置。1.3将玻片浸入装有新鲜TO型生物片透明剂的考普林瓶，常温放置10min，重复一次。1.4将玻片浸入100％酒精脱水，常温放置5min，重复1次(第二次需换瓶)。1.5自然燥玻片。

2、玻片预处理

2.1将50ml1x预处理溶液在考普林瓶，90±1℃循环水浴锅预热。

2.2将玻片浸入90±1℃预热的1×预处理溶液，90±1℃孵育45分钟至1小时。

2.3将玻片浸入2×SSC，室温放置1min，重复1次。

2.4将玻片浸入纯化水1min，然后自然干燥。

3、蛋白酶处理

3.1将玻片置于原位杂交仪37℃预热10min。3.2取胃蛋白酶至溶解完全。(胃蛋白酶不要预热)3.3滴加胃蛋白酶溶液(每张玻片400-500ul)至预热的玻片上，覆盖样本区域，避免枪头接触样品。3.4 37℃原位杂交仪上10-20min。3.5去掉蛋白酶溶液Ⅰ，将玻片浸入2×SSC，室温放置2min，重复1次。3.6将玻片依次置于70％、90％和100％乙醇中各1min。3.7自然干燥玻片

4、探针与样本杂交

4.1在玻片杂交仪上设置杂交程序：80℃变性5分钟，然后45℃过夜杂交。4.2将10uL探针混合溶液直接滴加到上述步骤处理好的各张玻片，用枪头去除气泡。4.3小心地盖上22×22mm盖玻片，让样品备被探针混合液缓慢扩展全面覆盖。4.4用橡胶水泥封边。4.5进行“玻片洗涤”

5、玻片洗涤(避光操作)

5.1将50ml洗涤溶液Ⅰ置于考普林瓶，73±1℃水浴锅预热。5.2用镊子小心移去胶水封边。5.3将玻片浸于装有2×SSC的玻片缸，轻轻摇动让盖玻片自行脱落。5.4将玻片置于上述预热的洗涤溶液中洗涤5min，每隔1min轻轻摇动或上下抽动玻片2-3次。5.5将玻片转移到常温下的洗涤溶液Ⅱ中，室温放置1min。5.6使用纯化水漂洗一下甩掉水迹，自然干燥。

6、镜检

6.1滴加10ulDAPI于杂交区域，去除气泡，小心地盖上22×22mm盖玻片，让DAPI溶液在盖玻片下缓慢扩散全面覆盖。6.2室温避光放置10-20min。6.3在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察玻片。

7、结果分析

以临床乳腺组织切片观察结果为例，相关DAPI和荧光需用合适的滤块观察，其中CEP17探针显示绿色信号，HER-2探针显示橙色信号(图3)。使用合适的滤镜，在40×镜下寻找，在100×镜下计数。扫描几个肿瘤细胞区域，选择细胞轮廓清晰，DAPI染色均匀，细胞核无重叠，探针信号清晰的部位进行计数。选取相间的20个肿瘤细胞，每个细胞核内的橙色和绿色荧光信号进行计数统计，计算HER-2与CEP17的比值以及HER-2拷贝数与细胞数的比值。

结果分析注意事项：

1、只计数病发的肿瘤组织。2、避免选取背景较高、信号弱或没有信号的区域。3、计数的细胞各通道信号清晰可辨。4、避免选取细胞轮廓不清晰的区域。

计数结果的判读：

当HER-2/CEP17比值≥2.0时，为HER-2扩增阳性；

当HER-2/CEP17＜2.0，但平均HER-2拷贝数/细胞≥6.0，HER-2扩增阳性。扩增细胞应均质、连续，且占浸润癌的10％以上；

当HER-2/CEP17＜2.0，且平均HER-2拷贝数/细胞＜4.0时为阴性结果；

当HER-2/CEP17＜2.0且平均HER-2拷贝数/细胞＜6.0，但≥4.0为FISH HER-2扩增不确定。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州科蒂亚生物技术有限公司

<120> HER2/CEP17基因检测探针及其应用

<130> MP21036124

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 799

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaacattcc tattgataga gcagtttgga aacactcttg ttgtggaatg tgcaagtgga 60

gatttggagc gctttgaggc ctatggtagt aaagggaata gcttcataga aaaactagac 120

agaagcattc tcagaaaata ctttgtgatg attgagttta actcacagag ctgaacattc 180

ctttggatgg agcaggtttg agacactctt tttgtacaat ctacaagtgg atatttggac 240

ctctctgagg atttcgttgg aaacgggata actgcaccta actaaacgga agcattctca 300

gaaacttctt ggtgatgttt gcattcaaat cccagagttg aaccttcctt tgatagttca 360

ggtttgaaac actctttttg taggatctgc aagtggatat ttggaccact ctgtggcctt 420

cgttcgaaac gggtatatct tcgcataaaa tctagacaga agccttctca gaaacttctc 480

tgtgatgatt gcattcaact cacagagttg aaccctccta tggatagagc agtgttgaaa 540

ctctcttttt gtggaatctg caagtggata tgtggacctc tccgaagatg tctttggaaa 600

cgggaatatc ttcacataaa aactaaacag aagcattctc agaaacttct ctgtgatgtt 660

tgtgttcaac tcccagagtt tcacattgct tttcatagag tagttctgaa acatgctttt 720

cgtagtgtct acaagtggac atttggagcg ctttcaggcc tgtggtggaa aacgaattat 780

ggtcacataa aaactggag 799

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggatggagc aggtttgaga ca 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgttttcca ccacaggcct 20

Claims (10)

1.HER2基因的检测探针，其为17号染色体上第39655584位～39817309位核酸。

2.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于，所述探针上标记orange 552 dUTP。

3.CEP17位点的检测探针，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的检测探针，其特征在于，所述探针上标记CF488A dUTP。

5.权利要求1～4所述检测探针在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述诊断包括根据患者HER2是否过表达选择治疗药物。

7.一种乳腺癌的诊断试剂，其特征在于，包括权利要求1～4所述的检测探针。

8.根据权利要求7所述的诊断试剂，其特征在于，还包括Human cot-1和FISH试剂。

9.根据权利要求8所述的诊断试剂，其特征在于，HER2基因检测探针、CEP17基因检测探针和Human cot-1的质量比为0.05:1:25。

10.根据权利要求8所述的诊断试剂，其特征在于，所述FISH试剂包括3M醋酸钠、无水乙醇、70vol％乙醇和探针杂交液；

所述探针杂交液包括硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺和2×SSC。

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