ES2440747T3

ES2440747T3 - Procedimientos de diagnóstico para determinar el pronóstico del cáncer de pulmón de células no pequeñas

Info

Publication number: ES2440747T3
Application number: ES09732531.0T
Authority: ES
Inventors: Larry E Morrison; John Coon
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 2008-04-14
Filing date: 2009-04-13
Publication date: 2014-01-30
Anticipated expiration: 2029-04-13
Also published as: AU2009236418A1; CA2721446A1; EP2281061A1; EP2281061B1; US20090258350A1; US20150167102A1; US9994909B2; JP2011517573A; US8951725B2; WO2009129154A1; US20180291467A1

Abstract

Un procedimiento para determinar el pronóstico del cáncer de pulmón en un paciente humano, comprendiendo elprocedimiento: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente humano clasificado como quetiene un cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio temprano con un conjunto de sondas cromosómicasque comprende al menos dos sondas seleccionadas de entre el grupo que consiste en una sonda específica dellocus del cromosoma 5p15, una sonda específica del locus del cromosoma 8q24, una sonda de enumeración delcromosoma 6, y una sonda específica del locus del cromosoma 7p12 bajo condiciones suficientes para que seproduzca la hibridación de las sondas del conjunto a los cromosomas en la muestra, si existen; (b) identificación delpatrón de hibridación para un pronóstico favorable del conjunto de sondas cromosómicas en la muestra biológicaseleccionada a partir del patrón de hibridación que consiste en: (i) el clasificador de % de pérdida de 8q24/7p12 que utiliza un límite de >= 31% de células, (ii) el clasificador Rango3 y el patrón de % de pérdida 8q24/CEP6 con límites de >= 45% de células o >= 24% decélulas respectivamente (iii) la relación de señal total 8q24/5py la relación total 5p15/CEP6 con límites de < 0,80 o < 1,1respectivamente (iv) el Intervalo Medio de Señal y el patrón Rango3 con límites de < 2,5 o >= 42% de células, respectivamentey (c) determinar el pronóstico de cáncer de pulmón en un sujeto basándose en el patrón de hibridación identificadoen la etapa (b), en la que el clasificador Rango3 es el intervalo de células que muestran una diferencia en una basede célula por célula, de al menos tres señales de sonda de FISH en el locus cromosómico con el mayor número deseñales de FISH menos las señales de FISH en el locus cromosómico con el número más bajo de señales de FISHy en la que el Intervalo Medio de Señal se calcula determinando en cada célula del número total de células de lamuestra que se evalúa, la diferencia entre la sonda con el número más alto de señales de hibridación y la sonda conel menor número de señales de sonda, luego se recopila el número Rango de Señal individual celular y se divide porel número de células evaluadas.

Description

Procedimientos de diagnóstico para determinar el pronóstico del cáncer de pulmón de células no pequeñas

5 Campo de la invención

La invención se refiere a un ensayo de diagnóstico in vitro de muestras de tejidos de pacientes con cáncer de pulmón para determinar el pronóstico del paciente, y en particular se refiere a un ensayo in vitro para determinar el pronóstico en los pacientes en estadios tempranos, tales como aquellos que se diagnosticaron de cáncer de pulmón de células no pequeñas en Estadio Ib o Estadio II.

Antecedente de la invención

El cáncer de pulmón supuso casi un tercio de las muertes por cáncer en los Estados Unidos en 2005, y se clasifica

15 en general en dos tipos: el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el cáncer de pulmón de células pequeñas. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) comprende el 80-85% de los casos de cáncer de pulmón en los Estados Unidos. Los tipos de NSCLC se denominan por las clases de células encontradas en el cáncer y el aspecto de las células bajo el microscopio. El NSCLC comprende tres tipos principales: (i) Carcinoma de células escamosas, que empieza en las células escamosas, que son células finas y planas que se parecen a las escamas de los peces. El carcinoma de células escamosas también se llama carcinoma epidermoide, (ii) Carcinoma de células grandes, que empieza en varios tipos de células pulmonares grandes; (iii) Adenocarcinoma, que empieza en las células de delimitan los alveolos del pulmón y producen sustancias como el mucus. Otros tipos menos comunes de NSCLC incluyen el carcinoma pleomórfico, el tumor carcinoide y el carcinoma sin clasificar.

25 El diagnóstico del NSCLC se hace por examen del tejido sospechoso por un patólogo, tal como una muestra de biopsia. Después del diagnóstico del NSCLC, la enfermedad del paciente se remite al pronóstico (la probabilidad de recuperación) que utiliza la salud general del paciente y la edad, la gravedad de los síntomas tales como tos y dificultad al respirar, el tipo particular de NSCLC, y la estadificación del cáncer. La estadificación tiene en cuenta el tamaño del tumor y si el tumor está presente solo en el pulmón o se ha diseminado a otros lugares del cuerpo. Las opciones particulares de tratamiento para un paciente con NSCLC se seleccionan entonces basándose en estas consideraciones y la estadificación del cáncer es un componente importante de la selección del tratamiento. Los pacientes con NSCLC en estadio temprano pueden curarse potencialmente por resección quirúrgica para eliminar el tumor, pero las modalidades actuales de diagnóstico no son capaces de predecir qué pacientes recurrirán después de la cirugía.

35 La página de internet National Comprehensive Cancer Network describe la estadificación de NSCLC de la siguiente manera: “El sistema utilizado más a menudo en la práctica clínica en Estados Unidos para describir el crecimiento y diseminación de un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es el sistema de estadificación TNM, también conocido como el sistema del Comité Conjunto Americano del Cáncer (AJCC). En la estadificación TNM, se combinan la información sobre el tumor (T), cualquier diseminación a los ganglios linfáticos cercanos (N), y cualquier metástasis a órganos distantes (M) y se asigna un estadio a los agrupamientos específicos TNM. Los estadios agrupados se describen utilizando el número 0 y la numeración Romana del I al IV.

Las categorías “T” se basan en el tamaño del cáncer de pulmón, su diseminación y localización en los pulmones y

45 su diseminación a tejidos adyacentes. En la categoría Tis, el cáncer se encuentra solamente en la capa de células que delimitan los pasajes aéreos. No se ha diseminado a otros tejidos pulmonares. Esta categoría se conoce también como carcinoma in situ.

En la categoría “T1”, el cáncer no es mayor de 3 centímetros (ligeramente menor de 1 a 1 ¼ pulgadas), no se ha diseminado a la pleura visceral (membrana que rodea los pulmones), y no afecta las ramas principales de los bronquios.

En la categoría “T2”, el cáncer tiene una o más de las siguientes características: (i) es mayor de 3 cm; (ii) implica un bronquio principal de un pulmón pero no está más cerca de 2 cm (aproximadamente 3 ¼ a 4 pulgadas) del punto

55 donde la tráquea se ramifica en los bronquios principales izquierdo y derecho, o (iii) se ha diseminado a la pleura visceral. El cáncer puede bloquear parcialmente las vías aéreas, pero esto no produce que se colapse completamente el pulmón o que se desarrolle neumonía.

En la categoría “T3”, el cáncer tiene una o más de las siguientes características: (i) se ha diseminado a la pared torácica, el diafragma (el músculo respiratorio que separa el tórax del abdomen), la pleura mediastínica (las membranas que rodean el espacio entre los 2 pulmones), o el pericardio parietal (las membranas del saco que rodea el corazón); (ii) implica un bronquio principal de un pulmón, y está más cerca de 2 cm (aproximadamente 3 ¼ a 4 pulgadas) del punto donde la tráquea se ramifica en los bronquios principales izquierdo y derecho, pero no implica este área; o (iii) ha crecido en las vías aéreas lo suficiente para producir el colapso completo de un pulmón o para

65 causar neumonía de todo el pulmón.

En la categoría “T4”, el cáncer tiene una o más de las siguientes características: (i) se ha diseminado al mediastino (el espacio detrás del esternón y delante del corazón), el corazón, la tráquea, el esófago (el tubo que conecta la garganta con el estómago), la columna vertebral, o el punto donde la tráquea se ramifica en los bronquios principales izquierdo y derecho; (ii) están presentes en el mismo lóbulo dos o más nódulos tumorales separados; o

5 (iii) está presente un derrame pleural maligno, que es la existencia de fluido que contiene células cancerosas en el espacio que rodea los pulmones.

La categoría “N” depende de que, si los hay, los ganglios linfáticos cercanos a los pulmones estén afectados por el cáncer. En la categoría N0, el cáncer no se ha diseminado a ningún ganglio linfático. En la categoría N1, el cáncer 10 se ha diseminado a los ganglios linfáticos en el pulmón o a los ganglios linfáticos del hilio (los que se localizan alrededor del área donde los bronquios entran en el pulmón). En la categoría N1 los ganglios linfáticos afectados son solamente los del mismo lado que el pulmón canceroso. En la categoría N2, el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos subcarínicos (lo que están localizados alrededor del punto donde la tráquea se ramifica en los bronquios izquierdo y derecho) o los ganglios linfáticos del mediastino (el espacio detrás del esternón y delante del

15 corazón). En la categoría N2, los ganglios linfáticos afectados están en el mismo lado que el pulmón canceroso. En la categoría N3, el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos cercanos a la clavícula en cada lado, y/o a los ganglios linfáticos del hilio o mediastínicos en el lado opuesto del pulmón canceroso.

La categoría “M” depende de si el cáncer ha metastatizado y diseminado a cualquier tejido y órgano distantes. En la

20 categoría M0, no hay diseminación distante del cáncer. En la categoría M1, el cáncer se ha diseminado a 1 o más sitios distantes. Los sitios que se consideran distantes incluyen otros lóbulos pulmonares, otros ganglios linfáticos que los que se utilizaron para determinar la categoría N del cáncer, y otros órganos o tejidos tales como hígado, huesos o cerebro.

25 Una vez que las categorías T, N y M se han asignado para un NSCLC en particular, esta información se combina (agrupamiento de estadios) para asignar un estadio general de 0, I, II, III, o IV (véase la Tabla 1). Se combinan varias combinaciones de las categorías T y N en estadios. Los estadios identifican tipos tumorales que tienen un pronóstico similar y que se tratan de manera similar. Como se observa en la Tabla 1, un tumor con diseminación distante (es decir, un cáncer de categoría M1) se considera Estadio IV, teniendo en cuenta el tamaño del tumor o los

30 ganglios linfáticos implicados. La siguiente Tabla de la página de internet NCCN muestra la clasificación de las categorías combinadas y estadios para el NSCLC.

TABLA 1

Estadio General: Categoría T Categoría N Categoría M

Estadio 0: Tis N0 M0

Estadio IA: T1 N0 M0

Estadio IB: T2 N0 M0

Estadio IIA: T1 N1 M0

Estadio IIB: T2 T3 N1 N0 M0 M0

Estadio IIIA: T1 T2 T3 T3 N2 N2 N1 N2 M0 M0 M0 M0

Estadio IIIB: Cualquier T T4 N3 Cualquier N M0 M0

Estadio IV: Cualquier T Cualquier N M1

35 Los pacientes con NSCLC y números de estadio más bajos tienen generalmente un pronóstico más favorable y perspectivas de supervivencia, y estos pacientes se tratan generalmente por resección quirúrgica del tumor. Sin embargo, incluso en los pacientes con NSCLC en estadios tempranos, tales como aquellos con Estadio IB, Estadio IIA o IIB, un porcentaje significativo de estos pacientes recurrirá después de la resección quirúrgica con una enfermedad más agresiva y morirá. Los procedimientos actuales de diagnóstico clínico son incapaces de identificar

40 pronósticos de NSCLC en estadio temprano con la suficiente precisión para dirigir una terapia más agresiva contra estos pacientes con mayor probabilidad de recurrencia. Por tanto se necesitan mejores procedimientos diagnósticos in vitro para identificar los pacientes con NSCLC en estadios tempranos con más alto riesgo que deberían recibir quimioterapia neoadyuvante o adyuvante o incluso renunciar totalmente a una resección quirúrgica.

45 Se han desvelado ensayos moleculares de diagnóstico in vitro que se basan en hibridación fluorescente in situ (FISH) que utiliza sondas de hibridación de ADN marcadas de manera fluorescente para identificar las anormalidades cromosómicas, para su uso en la selección de quimioterapia para pacientes con NSCLC, véase PCT/ US200S/018879 "Methods for prediction of clinical outcome to epidermal growth factor inhibitors by cancer patients",

M. Garcia y col. Los ensayos de FISH también se han utilizado como un ensayo de diagnóstico inicial de NSCLC, 50 véase la Solicitud de Patente de Estados Unidos 20060063194, "Methods and probes for the detection of cancer", L.

Morrison y col., publicado el 23 de marzo de 2006 (a la que a partir de ahora se hace referencia como “Morrison ‘194”), la cual se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. La aplicación Morrison ‘194 describe muchos grupos de sondas de FISH útiles para la selección y diagnóstico de NSCLC, y un grupo de sondas descritas en Morrison ‘194 está disponible comercialmente como el conjunto de sondas LAVysionTM en Abbott

5 Molecular, Inc. (Des Plaines, Illinois, EE.UU.) bajo la etiqueta ASR (Analyte Specific Reagent) para su uso en laboratorios clínicos para producir ensayos clínicos diagnósticos. Según los requisitos de etiquetado ASR de la Administración de Fármacos y Alimentos de Estados Unidos, el etiquetado ASR no debe incluir ninguna reivindicación como utilidad médica del ASR. El conjunto de sondas LAVysion ASR comprende cuatro sondas de FISH: una sonda específica del locus cromosómico 5p15 marcada con el fluoróforo verde SpectrumGreen, una sonda específica del locus cromosómico 8q24 marcada con el fluoróforo amarillo SpectrumGold, una sonda de enumeración del cromosoma 6 marcada con el fluoróforo azul SpectrumAqua, y una sonda específica del locus cromosómico 7p12 marcada con el fluoróforo rojo SpectrumRed.

Múltiples publicaciones de investigación describen las investigaciones llevadas a cabo utilizando el conjunto de

15 sondas LAVysion, véase por ejemplo, M. Garcia y col., "Multi-target interphase fluorescence in situ hybridization assay increases sensitivity of sputum cytology as a predictor of lung cancer", Cancer Detection and Prevention, Vol. 24, Issue 4, 2004: 244-251; K. Halling y col., "A Comparison of Cytology and Fluorescence in Situ Hybridization for the Detection of Lung Cancer in Bronchoscopic Specimens", Chest, 2006; 130:694-701; y I. Zudaire y col., "Molecular characterization of small peripheral lung tumors based on the analysis of fine needle aspirates", Histol. Histophathol. (2008) 23: 33-40. Véase también el artículo de revisión de K. Halling y col., "Fluoresence in situ hybridization in diagnostic cytology". Hum. Path. (2007) 38: 1137-1144. Ninguna de estas solicitudes de patente o publicaciones anteriores sobre ensayos de FISH para NSCLC ha desvelado la utilización de sondas de FISH para identificar el pronóstico de manera más precisa para NSCLC en estadios tempranos, en particular, aquellos clasificados como Estadio IB o Estadio II.

25 Kang Ji Un y col: "High frequency of genetic alterations in non-small cell lung cancer detected by multitarget fluorescence in situ hybridization" Journal of Korean Medical Science, vol. 22, nº. Supl. S, septiembre 2007 (200709), páginas S47-S51, y Romeo Maura Santos y col: "Chromosomal abnormalities in non-small cell lung carcinomas and in bronchial epithelia of high-risk smokers detected by multi-target interphase fluorescence in situ hybridization.", The Journal of Molecular Diagnostics: jmd may 2003 lnkd-pubmed: 12707375, vol. 5, nº. 2, mayo 2003 (2003-05), páginas 103-112, desvelan el uso del kit de sondas LAVysion para diagnóstico por FISH de cáncer de pulmón de células no pequeñas. Sin embargo, ninguno de ellos desvela o sugiere la combinación reivindicada actualmente y las relaciones de sondas para un pronóstico fiable del cáncer de pulmón.

35 Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento de determinación del pronóstico del cáncer de células no pequeñas en estadio temprano en un ser humano, comprendiendo el procedimiento:

(a) Poner en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente humano clasificado como que tiene un cáncer de pulmón de células no pequeñas en un estadio temprano con un conjunto de sondas cromosómicas que comprenden al menos dos sondas seleccionadas de un grupo que consiste en una sonda específica del locus cromosómico 5p15, una sonda específica del locus cromosómico 8q24, una sonda de enumeración del cromosoma 6, y una sonda específica del locus cromosómico 7p12 bajo condiciones suficientes para que sea

45 posible la hibridación de las sondas del conjunto con los cromosomas de la muestra, si los hay; (b) identificar un patrón de hibridación para un pronóstico favorable del conjunto de sondas cromosómicas con la muestra biológica seleccionada a partir del patrón de hibridación que consiste en:

(i): el clasificador de % de pérdida de 8q24/7p12 que utiliza un límite de ! 31% de las células

(ii): el clasificador Rango3 y el patrón de % de pérdida 8q24/CEP6 con límites de ! 45% de las células o ! 24% de las células, respectivamente

(iii) la relación total de señal de 8q24/5p15 y la relación total de 5p15/CEP6 con límites de < 0,80 o < 1,1, respectivamente

(iv) el Intervalo Medio de Señal y el patrón Rango3 con límites de < 2,5 o ! 42% de las células, 55 respectivamente.

y (c ) determinar el pronóstico del cáncer de pulmón en el sujeto basándose en el patrón de hibridación identificado en la etapa (b), en el que el Clasificador Rango3 es el intervalo de células que muestra una diferencia en base de célula por célula, de al menos tres señales de sondas de FISH entre las señales de FISH en el locus cromosómico con el mayor número de señales de FISH menos las señales de FISH en el locus cromosómico con el menor número de señales de FISH y en el que el Intervalo Medio de Señal se calcula determinando en cada célula de un número total de células de la muestra que se evalúa, la diferencia entre la sonda con el número más alto de señales de hibridación y la sonda con el número más bajo de señales de hibridación, obteniendo entonces el número de rango de señal individual celular y dividiéndolo por 65 el número de células evaluado. La invención se basa en el descubrimiento de que la detección de patrones de número de copias cromosómicas anormales a partir de al menos dos de estos cuatro loci cromosómicos específicos se puede utilizar para identificar más precisamente los pacientes con NSCLC en estadios tempranos con más probabilidades de recurrencia tras la resección quirúrgica. Los solicitantes han identificado cuatro clasificaciones distintivas de NSCLC en estadio temprano basándose en los patrones de anormalidad en el número de copias en la muestra del paciente que separan los pacientes con pronóstico 5 favorable (nunca recurrieron o no recurrieron en los tres años después de la cirugía) y desfavorable (recurrieron antes del año o entre uno y tres años después de la cirugía). Preferentemente, la muestra biológica es una biopsia o resección de tejido tumoral pulmonar y la muestra se ha clasificado como de un cáncer en estadio temprano, por ejemplo, tal como cualquiera del Estadio IB, Estadio IIA, o Estadio IIB, utilizando el sistema de estadificación TNM. La invención utiliza preferentemente la hibridación in situ y, más preferentemente, la hibridación in situ fluorescente (FISH) con sondas de ácido nucleico marcadas de manera fluorescente o sondas marcadas de manera fluorescente que comprenden análogos de ácidos nucleicos para determinar el número de copias de cada uno de estos loci. La invención es beneficiosa particularmente para proporcionar una información pronóstica mejorada para los pacientes con NSCLC en estadios tempranos y permite la selección de una terapia mejor para aquellos pacientes con NSCLC en estadios tempranos con

15 alto riesgo de recurrencia del cáncer.

Se ha utilizado un ensayo de FISH con el conjunto de sondas LAVysion ASR para evaluar las anormalidades en el número de copias cromosómicas en muestras de biopsias de tumores NSCLC embebidas en parafina como herramienta pronóstica para NSCLC en estadios tempranos en una cohorte de 60 pacientes, y todos habían sido tratados por cirugía sin quimioterapia. En esta cohorte, 16 pacientes desarrollaron un cáncer de pulmón recurrente en el año de la cirugía; cuatro desarrollaron cáncer de pulmón recurrente entre uno y tres años después de la cirugía; 16 desarrollaron cáncer de pulmón recurrente más de tres años después de la cirugía; y 24 no desarrollaron nunca cáncer recurrente, en un mínimo de 34,5 meses de seguimiento tras la cirugía. Se derivaron varios clasificadores a partir de las anormalidades del número de copias determinadas por el ensayo de FISH LAVysion. Se

25 utilizó un intervalo de valores límite para cada clasificador para categorizar los pacientes en dos grupos, y se compararon los tiempos de recurrencia del cáncer en los dos grupos por tablas de contingencia (valores p del ensayo exacto de Fischer bilateral) y análisis de Kaplan Meyer (valores p de rango logarítmico).

Se encontraron cuatro clasificadores de FISH que se asociaban fuertemente con el pronóstico cuando los pacientes que progresaron en los 3 años de la cirugía (pronóstico desfavorable) se compararon con los pacientes que o no progresaron o progresaron después de más de 3 años de la cirugía (pronóstico favorable), o cuando los tiempos medios de progresión (TTR) se compararon entre los grupos de pacientes que se distinguieron con los clasificadores. Estos clasificadores son:

35 (i) % de pérdida de MYC/EGFR, el porcentaje de células que muestran menos señales de sonda MYC de FISH que señales de sonda EGFR de FISH;

(ii) una combinación del Rango3 y un porcentaje de células (por ejemplo, menos del 13%) que muestran una pérdida relativa de señales de sonda MYC de FISH con respecto a la señal de la sonda de FISH para CEP6 (% de pérdida MYC/CEP6); Donde el Rango3 es el rango de células que muestran una diferencia en una base de célula por célula, de al menos tres señales de sonda de FISH entre las señales de FISH en el locus cromosómico con mayor número de señales de FISH menos las señales de FISH en el locus cromosómico con el número más bajo de señales de FISH;

(iii) una combinación de la relación total de señales de la sonda MYC de FISH con respecto a las señales de la sonda 5p15 de FISH (la relación MYC/5p15, es igual a la suma de todas las señales de la sonda MYC en

45 las células enumeradas, dividida por la suma de todas las señales 5p15 en las células enumeradas) y la relación total de las señales de la sonda 5p14 de FISH con respecto a las señales de la sonda CEP6 de FISH (la relación 5p15/CEP6, es igual a la suma de todas las señales de la sonda 5p15 en las células enumeradas, dividida por la suma de todas las señales CEP6 en las células enumeradas); y (iv) una combinación del intervalo medio de las diferencias de señal de la sonda en las células evaluadas y el patrón del Rango3. Cada uno de estos cuatro clasificadores proporciona una clasificación estadísticamente significativa de los pacientes con pronóstico favorable y desfavorable, con valores de p= 0,0346 (% de pérdida MYC/EGFR); p= 0,0008 (Rango3 y % de pérdida MYC/CEP6); p= 0,0026 (relación MYC/5p15 y 5p15/CEP6); y p= 0,0001 (intervalo medio de diferencias de señal de la sonda y Rango3) cuando los umbrales óptimos (también

55 denominados límites) se aplican a cada parámetro como se trata en el presente documento.

Los tiempos medios de progresión en los grupos de % de pérdida MYC/EGFR fueron de 113 y 53,3 meses respectivamente, para los grupos con los porcentajes celulares más altos y más bajos (límite=42% de células); p= 0,0346. Los tiempos medios de progresión los grupos en el Rango3 y % de pérdida MYC/CEP6 fueron de 10,1 y 78,8 meses, respectivamente, para los pacientes con porcentajes más bajos para ambos Rango3 (límite=45%) y % de pérdida MYC/CEP6 (límite 13%), con respecto a los otros pacientes; p < 0,0001. Los tiempos medios de progresión en los grupos de la relación MYC/5p15 y 5p15/CEP6 fueron 22,7 y 121 meses, respectivamente para los pacientes con relaciones más altas de ambos MYC/5p15 (límite=0,8) y 5p15/CEP6 (límite= 1,1) con respecto a los otros pacientes; p= 0,0046. Los tiempos medios de progresión en los grupos del intervalo medio de diferencias de 65 señal de sonda y el Rango3 fueron de 9,86 y 83,1 meses, respectivamente, para los pacientes que tenían un alto intervalo medio (límite= 2,5) y un Rango3 bajo (límite= 42% de células) con respecto a los otros pacientes; p<0,0001.

Los procedimientos de la invención son por tanto capaces de proporcionar una información pronóstica mejorada significativamente para el NSCLC en estadio temprano.

Breve descripción de los dibujos

5 La figura 1 es una curva de referencia de Kaplan-Meyer que muestra el tiempo de recurrencia del cáncer de pulmón en una cohorte de 60 pacientes con NSCLC en estadio temprano, clasificados por el patrón Rango3.

La figura 2 es una curva que muestra el tiempo de recurrencia de cáncer de pulmón en una cohorte de 60 10 pacientes con NSCLC en estadio temprano, clasificados por el patrón de % de pérdida MYC/EGFR.

La figura 3 es una curva de Kaplan-Meyer que muestra el tiempo de recurrencia de cáncer de pulmón en una cohorte de 60 pacientes con NSCLC en estadio temprano, clasificados por la combinación del patrón Rango3 y el patrón de la relación MYC/CEP6.

15 La figura 4 es una curva de Kaplan-Meyer que muestra el tiempo de recurrencia de cáncer de pulmón en una cohorte de 60 pacientes con NSCLC en estadio temprano, clasificados por la combinación del patrón Rango3 y el patrón de la relación MYC/CEP6, pero con un límite más alto del porcentaje de células que tiene el patrón MYC/CEP6.

20 La figura 5 es una curva de Kaplan-Meyer que muestra el tiempo de recurrencia de cáncer de pulmón en una cohorte de 60 pacientes con NSCLC en estadio temprano, clasificados por la combinación del patrón de la relación MYC/5p15 y el patrón de la relación 5p15/CEP6.

25 La figura 6 es una curva de Kaplan-Meyer que muestra el tiempo de recurrencia de cáncer de pulmón en una cohorte de 60 pacientes con NSCLC en estadio temprano, clasificados por la combinación del intervalo medio de diferencias en la señal de la sonda y el patrón Rango3.

Descripción detallada de la invención

30 Pronóstico de NSCLC. La invención incluye procedimientos para determinar el pronóstico de pacientes con NSCLC clasificados como cánceres en estadio temprano, en particular aquellos clasificados como Estadio IB, Estadio IIA o Estadio IIB (colectivamente se denominan como Estadio II, los Estadios IIA y IIB) utilizando el sistema de estadificación TNM genérico. Se pueden utilizar sistemas alternativos de estadificación de NSCLC que se basen en

35 otras clasificaciones diagnósticas para identificar los pacientes cuyas muestras de tejido se puedan ensayar por los procedimientos de la invención. Como se utiliza en el presente documento, un NSCLC en estadio temprano se refiere a un tumor NSCLC que no se ha diseminado a más de un ganglio linfático, ni ha metastatizado a otro órgano. Los pacientes con NSCLC en estadio temprano casi siempre se tratan con resección quirúrgica buscando la eliminación completa del tumor, aunque existe un riesgo significativo de recurrencia en estos pacientes en estadio

40 temprano incluso cuando el tumor se cree que ha sido resecado completamente. Las modalidades actuales de diagnóstico no permiten una predicción precisa de cuales de estos cánceres en estadio temprano tienen alto riesgo de recurrencia y que por lo tanto deberían tratarse post-resección con quimioterapia adyuvante o antes de la resección utilizando quimioterapia neoadyuvante. La invención proporciona la identificación pronóstica de todos los pacientes en estado temprano con alto riesgo determinando el número de copias cromosómicas en la muestra del

45 paciente en al menos dos de estas cuatro evaluaciones del número de copias: tres loci cromosómicos diferentes: 5p15, 7p12 y 8q24 y el número de copias para el cromosoma 6. Para los fines del presente documento, un paciente de NSCLC en estadio temprano con un pronóstico favorable es el que se determina que no tendrá ni recurrencia del cáncer ni progresión del cáncer en los tres años después de la resección quirúrgica del tumor del paciente; y un paciente con NSCLC en estadio temprano con un pronóstico desfavorable es el que se determina que tendrá o

50 recurrencia del cáncer o progresión del cáncer en los tres años de la resección quirúrgica del tumor del paciente.

Se utilizó un ensayo de FISH con el conjunto de sondas LAVysion ASR para evaluar el número de anormalidades de las copias cromosómicas en muestras de biopsias de tumores NSCLC embebidas en parafina como herramienta pronóstica para NSCLC en estadio temprano en una cohorte de 60 pacientes, y todos habían sido tratados por

55 cirugía sin quimioterapia. En esta cohorte, 16 pacientes desarrollaron cáncer de pulmón recurrente en el año de la cirugía; cuatro desarrollaron cáncer de pulmón recurrente entre uno y tres años después de la cirugía; 16 desarrollaron cáncer de pulmón recurrente más de tres años de la cirugía; y 24 nunca desarrollaron cáncer recurrente, en un mínimo de 34,5 meses de seguimiento tras la cirugía. Se encontraron cuatro clasificadores separados basados en patrones de anormalidad en el número de copias cromosómicas identificados utilizando el

60 conjunto de cuatro sondas LAVysion que se asociaban fuertemente con el pronóstico de los pacientes cuando los pacientes que progresaron en los 3 años de la cirugía (pronóstico desfavorable) se compararon con los pacientes que no progresaron o progresaron más de 3 años después de la cirugía (pronóstico favorable), o cuando se compararon los tiempos medios de progresión (TTR) entre los grupos de pacientes que diferenciaron los clasificadores.

65 Estos cuatro clasificadores se utilizaron para analizar el patrón de hibridación de las cuatro sondas en 40 a 120 células de muestra de tejido. Los clasificadores son:

(i) patrón de % de pérdida 8q24/7p12 (también llamado en el presente documento patrón de % de pérdida

5 MYC/EGFR) evaluando el porcentaje de células que mostraban menos señales de sonda de FISH 8q24 (MYC) que señales de sonda de FISH 7p12 (EGFR); (ii) una combinación del patrón Rango3 y el patrón de relación 8q24/centrómero 6 (también llamado en el presente documento como el patrón de relación MYC/CEP6) de menos de aproximadamente el 13% de las células que muestran una pérdida relativa de señales de sonda FISH de 8q24 (MYC) con respecto a la señal de la sonda de FISH de CEP6; (iii) el patrón de relación 8q24/5p15 (también llamado en el presente documento patrón de relación MYC/5p15) mostrando una relación de las señales de los loci 8q24 y 5p15 de ! 0,80 y la relación 5p15/centrómero 6 (también llamado en el presente documento el patrón de relación 5p15/CEP6) evaluando el porcentaje de células que tiene una relación relativa de señales de sonda FISH 5p15 con respecto a las señales de sonda FISH CEP6 ! 1,1; y (iv) una combinación del intervalo medio de las diferencias de señal de la sonda igual o mayor que

15 aproximadamente 2,5 (en el presente documento Intervalo Medio de Señal) con el patrón Rango3 en menos de aproximadamente el 42% de las células. Cada uno de estos cuatro clasificadores proporciona una clasificación estadísticamente significativa de los pacientes en pronóstico favorable y desfavorable, con valores de p de p= 0,0346 (% de pérdida MYC/EGFR); p= 0,0008 (Rango3 y % de pérdida MYC/CEP6); p= 0,0026 (relación MYC/5p15 y relación 5p15/CEP6); y p=0,0001 (Intervalo Medio de Señal y Rango3).

En referencia a los tiempos medios de progresión, los grupos del Rango3 fueron 121 y 14,5 meses, respectivamente (p=0,0035). Los tiempos medios de progresión en los grupos de % de pérdida MYC/EGFR fueron 113 y 53,3 meses, respectivamente (p=0,0346). Los tiempos medios de progresión en los grupos del Rango3 y la relación relativa MYC/CEP6 fue de 10,1 y 78,8 meses, respectivamente (p<0,0001). Los tiempos medios de progresión en los grupos

25 de la relación MYC/5p15 y 5p15/ CEP6 fueron de 22,7 y 121 meses, respectivamente (p=0,0046). Los tiempos medios para la progresión en los grupos de Intervalo Medio de Señal y Rango3 fueron de 9,86 y 83,1 meses, respectivamente (p<0,0001). El procedimiento de la invención es por tanto capaz de proporcionar una información pronóstica significativamente mejorada para el NSCLC en estadio temprano.

La identificación del pronóstico del NSCLC en estado temprano de la invención se hace sobre una muestra biológica adecuada, obtenida del paciente por hibridación in situ para establecer la presencia y el patrón de las anormalidades cromosómicas en la muestra del paciente. En general, la hibridación in situ incluye las etapas de fijar una muestra biológica, hibridar una o más sondas cromosómicas con el ADN diana contenido en la muestra fijada, lavar para eliminar las sondas unidas no específicamente, y detectar la sonda hibridada. La hibridación in situ también se

35 puede llevar a cabo con células especímenes de la muestra biológica en suspensión líquida, seguida de detección por citometría de flujo.

La identificación del pronóstico del NSCLC de la invención también se puede utilizar con otros ensayos diagnósticos del pronóstico in vitro, tales como los de evaluación de la expresión en la muestra del paciente de proteínas adecuadas tales como EGFR, pAKt, y PTEN. Los pacientes en cuyas muestras se encuentra la expresión de tales proteínas en conjunción con un patrón anormal del número de copias cromosómicas, que se asocia con un resultado desfavorable (pronóstico malo), pueden elegirse para un tratamiento post-quirúrgico más agresivo, tal como la quimioterapia.

45 Sondas cromosómicas. Las sondas adecuadas para su uso en los procedimientos de la hibridación in situ utilizadas en la invención para la detección de patrones anormales del número de copias (aneusomía o polisomía) son una combinación de una sonda de enumeración cromosómica para el cromosoma 6 y tres sondas específicas de locus cromosómico, con cada sonda marcada para ser distinguible de las otras. Las sondas de enumeración cromosómica se hibridan con una región cromosómica, normalmente una región de secuencia repetida, e indica la presencia o ausencia del cromosoma diana 6. Como es bien conocido en la técnica, una sonda de enumeración cromosómica puede hibridarse con una secuencia repetitiva, localizada o bien cerca o que fue eliminada de un centrómero, o puede hibridarse a una secuencia única localizada en cualquier posición en un cromosoma. Por ejemplo, una sonda de enumeración cromosómica se puede hibridar con ADN repetitivo asociado con el centrómero de un cromosoma. Los centrómeros de los cromosomas de primates contienen una familia compleja de largos tándem repetidos de

55 ADN que comprenden un monómero repetido de una longitud de aproximadamente 171 pares de bases, que se denomina ADN satélite alfa. Un ejemplo no limitante de una sonda de enumeración cromosómica específica es la sonda CEP® 6 SpectrumAquaTM (Abbott Molecular Inc.) para el cromosoma 6. Esta sonda está incluida en el conjunto de sondas LAVysion y se describe en los Ejemplos.

La sonda para enumerar el número de copias del cromosoma 6 se utiliza con sondas específicas de locus para detectar el número de anormalidades de copias en cada cromosoma 5p15, 7p12 y 8q24, por ejemplo para determinar el estado de amplificación y/o polisomía de estos loci. Una sonda específica de locus se hibrida a un locus específico no repetitivo en un cromosoma. Se prefiere que la sonda 7p12 incluya al menos una porción del gen EGFR y que la sonda 8q24 incluya al menos una porción del gen MYC-C. Las sondas específicas de locus 65 preferidas son la Vysis D5S721 LSI, la sonda D5S23 SpectrumGreen (5p15.2), la sonda Vysis EGFR

SpectrumOrange (7p12) y la sonda MYC LSI SpectrumGreen (8q24), disponibles comercialmente en Abbott Molecular Inc.

Las sondas que se hibridan con el ADN centromérico están disponibles comercialmente en Abbott Molecular Inc.

5 (Des Plaines, IL) y Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). De manera alternativa, se pueden producir las sondas no comercialmente utilizando técnicas bien conocidas. Las fuentes de ADN para la construcción de sondas de ADN incluyen, ADN genómico, secuencias de ADN clonadas tales como los cromosomas bacterianos artificiales (BAC) , las células híbridas somáticas que contienen uno o una parte de cromosoma humano junto con el cromosoma normal complemento del hospedador, y cromosomas purificados por citometría de flujo o microdisección. La región de interés se puede aislar por medio de clonación o por amplificación del sitio específico por medio de la reacción de la cadena de la polimerasa (PCR). Véase por ejemplo Nath, y col., Biotechnic Histochem, 1998, 73 (1): 6-22; Wheeless, y col., Cytometry, 1994, 17: 319-327; y la Pat. EE.UU. Nº 5.491.224. El ADN humano iniciador utilizado para fabricar sondas específicas de locus útiles se pueden obtener consiguiendo una secuencia nucleica añadida para el locus a partir de la base de datos de Genoma Humano, tal como el que mantiene la Universidad de California

15 Santa Cruz, y luego utilizando esta secuencia para seleccionar “in silico” una biblioteca de ADN de BAC humanos, tal como el que se mantiene en el Roswell Park Cancer Center o Invitrogen, para identificar clones BAC útiles. También se pueden utilizar las sondas oligoméricas de ADN sintetizadas o las sondas hechas de análogos de ácidos nucleicos, tales como las sondas de ácido nucleico peptídico (PNA).

El tamaño de la región cromosómica detectada por las sondas utilizadas en la invención puede variar, por ejemplo, desde la secuencia de la sonda satélite alfa de 171 pares de bases mencionada anteriormente hasta un gran segmento de 900.000 bases. Las sondas específicas de locus que se marcan directamente tienen preferentemente una complejidad de al menos 100.000 bases, y se utiliza un ácido nucleico bloqueante sin marcar, como se desvela en la Pat. EE.UU. Nº 5.756.696, incorporada en el presente documento como referencia, para evitar la unión no

25 específica de la sonda. También es posible utilizar como ácido nucleico bloqueante, un ácido nucleico oligomérico sintético sin marcar o análogos de ácido nucleico sin marcar, tales como un ácido nucleico peptídico.

Las sondas cromosómicas pueden contener cualquier resto de detección que facilite la detección de la sonda cuando se hibrida con un cromosoma. Los restos de detección eficaces incluyen tanto los marcadores directos e indirectos como se describen en el presente documento. Ejemplos de marcadores detectables incluyen los fluoróforos (es decir, moléculas orgánicas que tienen fluorescencia tras la adsorción de luz), isótopos radioactivos (por ejemplo, 32P, y 3H) y cromóforos (por ejemplo, marcadores enzimáticos que producen un marcador detectable visualmente). Se prefieren los fluoróforos y pueden marcarse directamente a continuación de la unión covalente con un nucleótido incorporando el nucleótido marcado en la sonda con las técnicas de referencia como traducción Nick,

35 sensibilización aleatoria, y marcado por PCR. De manera alternativa, los nucleótidos desoxicitidina en la sonda se pueden transaminar con un conector. El fluoróforo se puede unir entonces covalentemente a los nucleótidos desoxicitidina transaminados. Véase, por ejemplo, Pat. EE.UU. Nº 5.491.224 de Bittner, y col., que se incorpora en el presente documento como referencia. Las técnicas útiles para marcar sondas se describen en Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, Y.-S. Fan, Ed., Cap. 2, "Labeling Fluorescence In Situ Hybridization Probes for Genomic Targets". L. Morrison y col., p. 21-40, Humana Press, © 2002, incorporado en el presente documento como referencia.

Ejemplos de fluoróforos que pueden utilizarse en los procedimientos descritos en el presente documento son: ácido 7-amino-4-metilcumarin-3-acético (AMCA), Texas RedTM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR); 5-(y-6)-carboxi

45 X-rodamina, lisamina rodamina B, 5-(y-6)-carboxifluoresceína; 5-isotiocianato de fluoresceína (FITC); ácido 7dietilaminocumarin-3-carboxílico, 5-(y-6)-isotiocianato de tetrametilrhodamina, 5-(y-6)-carboximetilrhodamina; ácido 7-hidroxicumarin-3-carboxílico; ácido 6-[fluoresceín 5-(y-6)-carboxamido] hexanoico; ácido N-(4, 4difluoro-5, 7-dimetil-4-bora-3a, 4a diaza-3-indacenpropiónico; 5-isotiocianato de eritrosina; 5-(y-6) carboxirhodamina 6G: y acetilazida azul CascadeTM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). En el conjunto de sondas LAVysion, se utilizan fluoróforos de distintos colores de forma que cada sonda cromosómica en el conjunto se puede visualizar de manera distintiva.

Después de la hibridación, las sondas se pueden visualizar con un microscopio de fluorescencia y un filtro adecuado para cada fluoróforo, o utilizando conjuntos de filtros de paso de banda dual o triple para observar múltiples

55 fluoróforos. Véase por ejemplo, la Pat. EE.UU. Nº 5.776.688 de Bittner, y col., que se incorpora en el presente documento como referencia. Se puede utilizar cualquier procedimiento de imagen microscópica para visualizar las sondas hibridadas, incluyendo sistemas de imagen digital automáticos, tales como los que están disponibles en MetaSystems o Applied Imaging. De manera alternativa, se pueden utilizar técnicas tales como la citometría de flujo para examinar el patrón de hibridación de las sondas cromosómicas.

Las sondas también se pueden marcar indirectamente, por ejemplo, con biotina o digoxigenina por medios bien conocidos en la técnica. Sin embargo, se necesitarán moléculas de detección secundaria o más procesos para visualizar las sondas macadas. Por ejemplo, una sonda marcada con biotina se puede detectar por medio de avidina que se conjuga con un marcador detectable, por ejemplo, un fluoróforo. Adicionalmente la avidina se puede conjugar 65 con un marcador enzimático tal como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano rusticano. Tales marcadores enzimáticos se pueden detectar en reacciones colorimétricas de referencia utilizando un sustrato para la enzima. Los

sustratos para la fosfatasa alcalina incluyen 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y nitro tetrazolio azul. La diaminobenzidina se puede utilizar como sustrato para la peroxidasa de rábano rusticano.

Las sondas y los conjuntos de sondas útiles con los procedimientos de la invención se pueden empaquetar con otros 5 reactivos en kits para utilizar los procedimientos de la invención donde se desee.

Conjunto preferido de sondas. Una composición de sondas preferida es el LAVysion Multi-Color Probe Set (Abbott Molecular, Inc.). El LAVysion Multi-Color Probe consiste en una mezcla de cuatro sondas de FISH ADN marcadas directamente. La Sonda EGFR LSI está marcada con SpectrumRed y cubre una región de aproximadamente 300 kb 10 que contiene el gen EGFR completo (7p12). La Sonda MYC-C LSI marcada con SpectrumGold cubre una región de aproximadamente 750 kb que contiene el gen MYC-C completo (8q24.12-q24.13). El LAVysion Multi-Color Probe también contiene D5S23 LSI, D5S271 marcados con SpectrumGreen que cubre una región de 450 kb del 5p15.2. El último componente es la sonda CEP6 marcada con SpectrumAqua que se hibrida con la región de ADN satélite alfa localizada en el centrómero del cromosoma 6 (6p11.1-q11). Este conjunto de sondas está disponible

15 comercialmente premezclado en un tampón de hibridación adecuado. Las sondas individuales del Conjunto LAVysion están disponibles comercialmente como sondas solas ASR marcadas en Abbott Molecular, Inc.

Preparación de las muestras. Una muestra biológica es una muestra que contiene células o material celular, incluyendo extractos de contenido celular de una muestra de un paciente. Por ejemplo, las muestras de pulmón son 20 típicamente células o material celular derivado de estructuras pulmonares, incluyendo pero sin limitarse a parénquima pulmonar, bronquiolos, bronquial, bronquios, y tráquea. Ejemplos no limitantes de muestras biológicas útiles para la detección de cáncer de pulmón incluyen especímenes bronquiales, tejido pulmonar resecado, biopsias de pulmón, y muestras de esputo. Ejemplo de especímenes bronquiales incluyen las secreciones bronquiales, lavados, enjuagues, aspiraciones, y cepillados. Las biopsias pulmonares se pueden obtener por procedimientos que

25 incluyen la cirugía, broncoscopia, aspiración por aguja fina (FNA), y biopsia por aguja transtorácica. En un ejemplo, las preparaciones de interés se pueden hacer de biopsias pulmonares. Los ensayos inventivos también se pueden llevar a cabo en una muestra de células de un tumor circulante derivado de una muestra de sangre de un paciente con NSCLC en estadio temprano. Una muestra de células de tumor circulante se puede preparar utilizando la tecnología de separación inmunomagnética que está disponible en Immunicon.

30 Los tejidos se pueden fijar con un fijador tal como formaldehído y luego embeberlo en parafina. Entonces se cortan las secciones utilizando un microtomo y se aplican en un portaobjetos de microscopio. Los especímenes de citología se pueden preparar a partir de suspensiones celulares derivadas de FNA, lavados bronquiales, enjuagues bronquiales, o esputo, o células tisulares diseminadas. Los especímenes de citología se pueden preparar por fijación

35 de las células en etanol o metanol; ácido acético combinado con citocentrifugación, procedimientos de depósito en lámina delgada (por ejemplo ThinPrep, Cytyc Corp.), frotis o pipeteado sobre los portaobjetos de microscopio. Además, las muestras biológicas pueden incluir derrames, por ejemplo, derrames pleurales, derrames pericárdicos,

o derrames peritoneales.

40 Procedimientos de hibridación. Se puede utilizar cualquier procedimiento de hibridación in situ. Antes de la hibridación in situ, se tienen que desnaturalizar las sondas cromosómicas y el ADN cromosómico que contiene la célula. Si las sondas cromosómicas se preparan como un ácido nucleico de cadena única, entonces no se necesita la desnaturalización de la sonda. La desnaturalización se lleva a cabo típicamente por incubación en presencia de pH alto, calor (por ejemplo, temperaturas desde aproximadamente 70 grados C, a aproximadamente 95 grados C),

45 disolventes orgánicos tales como formamida y hálidos tetraalquilamónicos, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el ADN cromosómico se puede desnaturalizar por una combinación de temperaturas por encima de 70 grados C (por ejemplo, aproximadamente 73 grados C) y un tampón de desnaturalización que contenga un 70% de formamida y SSC 2X (cloruro sódico 0,3 M y citrato sódico 0,03 M). Las condiciones de desnaturalización típicamente se establecen de forma que se preserve la morfología celular. Por ejemplo, las sondas cromosómicas se

50 pueden desnaturalizar por calor, por ejemplo, calentando las sondas a aproximadamente 73 grados C durante aproximadamente cinco minutos.

Después de eliminar los productos químicos de desnaturalización o las condiciones, las sondas se hibridan con el ADN cromosómico bajo condiciones de hibridación. “Condiciones de hibridación” son las condiciones que facilitan la 55 hibridación entre una sonda y un ADN cromosómico diana. Las condiciones de hibridación varían, dependiendo de las concentraciones, las composiciones de base, las complejidades, y las longitudes de las sondas, así como las concentraciones en sales, temperaturas y duración de la incubación. Por ejemplo, las hibridaciones in situ se llevan a cabo típicamente en un tampón de hibridación que contiene SSC 1∀2X, formamida al 50-55%, un acelerante de hibridación (por ejemplo sulfato de dextrano al 10%), y un ADN bloqueante no marcado para suprimir la hibridación

60 no específica. En general, las condiciones de hibridación, como se describieron anteriormente, incluyen temperaturas de aproximadamente 25 grados C a aproximadamente 55 grados C, y duraciones de incubación de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 96 horas. Más particularmente, la hibridación puede llevarse a cabo de aproximadamente 32 grados C a aproximadamente 45 grados C durante aproximadamente 2 a aproximadamente 16 horas.

65 La unión no específica de las sondas cromosómicas al ADN fuera de la región diana se puede eliminar por una serie de lavados con una solución salina. La temperatura y la concentración de la sal en cada lavado dependen de la rigurosidad que se desee. Por ejemplo, para condiciones de alta rigurosidad, los lavados se pueden llevar a cabo de aproximadamente 65 grados C a aproximadamente 80 grados C, utilizando SSC de 0,2X a aproximadamente 2X, y

5 aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 1% de un detergente no iónico tal como el Nonidet P-40 (NP40). La rigurosidad se puede bajar disminuyendo la temperatura de los lavados o aumentando la concentración de sal de los lavados.

Un procedimiento preferido que utiliza una composición de sondas con fluorescencia de las sondas en cuatro colores se describe posteriormente en la sección de los Ejemplos. La hibridación de las sondas a la muestra de tejido se puede llevar a cabo manualmente, o con la ayuda de instrumentos, tales como el horno de hibridación ThermoBrite, el Procesador VP 2000, o el instrumento de proceso XMatrixTM (todos disponibles comercialmente en Abbott Molecular, Inc.).

15 Pre-Selección de Células. Las muestras celulares se pueden evaluar preliminarmente por medio de una variedad de procedimientos y utilizando una variedad de criterios. Las sondas y los procedimientos descritos en el presente documento no están limitados al uso de una metodología de selección particular. Un ejemplo es el “procedimiento de selección” en el que el observador selecciona cientos o miles de células por las anormalidades citológicas, por ejemplo, al verlas con un filtro DAPI. El número de células evaluado dependerá de la celularidad del especimen, que varía de un paciente a otro. Las anormalidades citológicas que se asocian comúnmente pero no invariablemente con células displásicas o neoplásicas incluyen agrandamiento nuclear, irregularidad nuclear, y tinción con DAPI anormal (frecuentemente moteada y con color diluido). En la etapa de selección, el observador preferentemente enfoca la evaluación de las células con anormalidades cromosómicas (que se demuestran por FISH) a aquellas células que también exhiben anormalidades citológicas. Además, una proporción de las células que no tienen anormalidades

25 citológicas obvias se pueden evaluar, puesto que las anormalidades cromosómicas también ocurren en ausencia de anormalidades citológicas. Este procedimiento de selección se describe con más detalles en la Pat. EE.UU. Nº

6.174.681 de Halling y col., que se incorpora en el presente documento como referencia. Las células de cáncer de pulmón pueden seleccionarse por evaluación utilizando el procedimiento descrito en la Pub. de Patente de EE.UU. 2003/0087248 A1 por Morrison y col. que se incorpora en el presente documento como referencia.

Las regiones del espécimen también se pueden seleccionar para su evaluación utilizando tinciones de referencia, tales como las tinciones que contienen hematoxilina y eosina. Por ejemplo, un patólogo puede teñir una sección del espécimen embebido en parafina con una tinción hematoxilina/eosina, identificar una región como probablemente cancerosa por la morfología tisular y el patrón de tinción, y delimitar esa región con un rotulador de tinta o un

35 trazador de cristal. La región marcada se transfiere entonces al lugar correspondiente para la sección en serie del espécimen embebido en parafina con un trazador de cristal, y la FISH se lleva a cabo sobre esa lámina. Se evalúan entonces las señales de FISH en las células de la región trazada.

Detección de los Patrones de Clasificación de Anormalidad Cromosómica. Las células anormales se caracterizan por la presencia de uno o más patrones de anormalidad en el número de copias cromosómicas. La presencia de un patrón de anormalidad del número de copias en una célula de una muestra de un paciente se evalúa examinando el patrón de hibridación de la sonda cromosómica (por ejemplo, el número de señales para cada sonda) en la célula y registrando el número de señales. La aneusomía típicamente se entiende que significa número anormal de copias, sea en todo el cromosoma o en un locus del cromosoma. El número anormal de copias incluye

45 tanto la monosomía (una copia) y la nulisomía (cero copias) de los autosomas, también llamada deleción, y más de dos copias, lo que para un locus cromosómico en particular a veces se llama amplificación génica (de manera alternativa amplificación se reserva para la situación en que el número de copias del gen excede el número de copias del cromosoma en el que está contenido). Sin embargo, la sección de los especímenes embebidos en parafina (típicamente de 4-6 #m) puede resultar que trunque el núcleo de las células, de forma que el número de señales FISH por célula para algunas células puede ser a veces menor que el número normal de copias en un núcleo intacto. En los cuatro clasificadores de la invención, se determina el número absoluto de señales de hibridación de una sonda de FISH en particular para cada sonda y luego se utiliza en varias comparaciones de relaciones.

55 Las muestras de ensayo pueden comprender cualquier número de células que sea suficiente para el diagnóstico clínico, y en una muestra preferida de tejido embebida en parafina, el patrón de hibridación se evalúa típicamente en aproximadamente 20 a aproximadamente 200 células. Se prefiere evaluar el patrón de hibridación en aproximadamente 40 a aproximadamente 120 células por muestra.

Un clasificador de referencia Rango3 determinaba el porcentaje de células que contenían un intervalo de señales de FISH > 3 (es decir, el locus con el mayor número de señales de FISH, menos el locus con el menor número de señales de FISH en una base de célula por célula). El clasificador Rango3 no se basa en una señal de FISH en particular, sino que era una comparación en cada célula del mayor hasta el menor número de señales. El Rango3 que utiliza un límite del 42% de células que muestran en una base de célula por célula una diferencia de más de 3 65 señales entre la sonda con mayor número de señales de hibridación y la sonda con el menor número de señales de hibridación, fue capaz de dividir los pacientes en un grupo de 36 (! 42% de células) en el que 29 de estos pacientes

(80,6%) tenía un pronóstico favorable, y un grupo de 24 (< 42% de células) en los que solamente 11 (45,8%) tenía un pronóstico favorable (p=0,011). Los tiempos medios de progresión en el primer y último grupos fueron 121 y 14,5 meses, respectivamente (p=0,0035). La figura 1 es un gráfico Kaplan-Meyer del tiempo de recurrencia del cáncer de pulmón para los grupos de pacientes con pronósticos favorable y desfavorable, identificados por el clasificador

5 Rango3 de referencia.

El clasificador de patrón de % de pérdida MYC/EGFR examina la relación del número de células que muestra una pérdida relativa de señales de sonda MYC con respecto a las de la sonda EGFR. El % de pérdida MYC/EGFR era el porcentaje de células que mostraban menos señales MYC que señales EGFR. El clasificador de % de pérdida MYC/EGFR, utilizando un límite del 31% de células, fue capaz de dividir los pacientes en un grupo de 25 (! 31% de células) en el que 20 (80,0%) tenía un pronóstico favorable, y un grupo de 35 en el que 20 (57,1%) tenía una pronóstico favorable (p=0,096). Los tiempos medios de progresión en el primero y el último grupos fueron 113 y 53,3 meses respectivamente (p=0,0346). La figura 2 es un gráfico de Kaplan-Meyer del tiempo de recurrencia del cáncer de pulmón para los grupos de pacientes con pronóstico favorable y desfavorable identificados por el clasificador de

15 % de pérdida MYC/EGFR.

Se evaluó la combinación del patrón Rango3 con el patrón de % de pérdida de MYC/CEP6. El % de pérdida MYC/CEP6 era el porcentaje de células que mostraban menos señales MYC que señales CEP6. Cuando el patrón Rango3 está presente en <45% de las células y el patrón de % de pérdida MYC/CEP6 está presente en <13% de las células, entonces se identificó un grupo de 6 pacientes (el 10% de la cohorte) en los que los seis tenían un pronóstico desfavorable (todos progresaron en 15 meses). De los restantes 54 pacientes (en los que el patrón Rango3 estaba en ! 45% de las células o el % de pérdida MYC/CEP6 estaba presente en ! 13% de las células), 40 (74,1%) tenían el pronóstico favorable (p=0,0008). Los tiempos medios de recurrencia de la enfermedad en el primero y último grupos fue de 10,1 y 78,8 meses, respectivamente (p<0,0001). La figura 3 es un gráfico Kaplan

25 Meyer del tiempo de recurrencia del cáncer de pulmón para los grupos de pacientes con pronóstico favorable y desfavorable identificados por la combinación de Rango3 y clasificador de % de pérdida MYC/CEP6, pero utilizando un límite de porcentaje de células más alto con el patrón de % de pérdida MYC/CEP6.

La combinación de la relación total de la señal de MYC/5p15 > 0,8 y la relación total de 5p15/CEP6 > 1,1 también proporciona una clasificación estadísticamente significativa. Las relaciones totales se obtienen sumando las señales de la sonda MYC a lo largo de todas las células enumeradas en el espécimen, y dividiéndola por la suma de las señales de la sonda 5p15 a lo largo de todas las células enumeradas en el espécimen. Este clasificador de combinación identificó un grupo de 28 pacientes en el que 13 (46,4%) tenía el pronóstico favorable. En los restantes 32 pacientes (aquellos con la relación de señal MYC/5p15 menor de 0,80 o aquellos con la relación de señal

35 5p15/CEP6 < 1,1), 27 (84,4%) tenían el pronóstico favorable (p= 0,0026). Los tiempos medios de progresión en los grupos primero y último fue de 22,7 y 121 meses, respectivamente (p=0,0046). La figura 5 es un gráfico Kaplan-Meyer del tiempo de recurrencia de cáncer de pulmón para los grupos de pacientes con pronóstico favorable y desfavorable identificados por el clasificador de combinación MYC/5p15 y 5p15/CEP6.

La combinación del Intervalo Medio de Señal ! 2,5 con el patrón Rango3 presente en menos del 42% de las células evaluadas también proporciona una clasificación pronóstica significativa. En este clasificador de combinación, el Intervalo Medio de Señal se calcula utilizando el número total de células de la muestra de tejido que se evalúa, determinando en cada célula la diferencia entre la sonda con el número más alto de señales de hibridación y la sonda con el número más bajo de señales de sonda, independientemente del locus diana o de la sonda particular

45 que tiene el más alto o el más bajo número de señales, y luego compendiando el número de Rango de Señal y dividiéndolo por el número de células evaluadas para producir el número de Rango Medio de Señal. Un límite en el Intervalo Medio de Señal mayor o igual a 2,5 produjo la mejor clasificación pronóstica en combinación con el patrón de señal Rango3 menor del 42% de las células. Este clasificador de combinación identificó un grupo de 12 pacientes en el que 2 (16,7%) tenía el pronóstico favorable. En los 48 pacientes restantes (aquellos con el Intervalo Medio de Señal < 2,5 y el patrón Rango3 ! 42% de las células), 38 (79,2%) tenían el diagnóstico favorable (p= 0,0001). Los tiempos medios de progresión en el primer y último grupos fueron 9,86 y 83,1 meses, respectivamente (p< 0,0001).

Los detalles de la invención se describen además en los siguientes ejemplos, sin que tengan la intención de limitar el ámbito de la invención que se reivindica. Un experto en la técnica reconocerá que pueden ser evidentes variaciones

55 y modificaciones de la invención revisando la presente especificación. Por tanto es un objetivo prepararse para tales modificaciones y variaciones de las realizaciones descritas en el presente documento, sin alejarse del ámbito del espíritu de la invención.

Ejemplos

Procedimientos experimentales

Especímenes. Se obtuvieron los especímenes de tejido de 60 pacientes de NSCLC de los archivos del Departamento de Patología del Centro Médico Universitario Rush (Chicago, IL). Todos los pacientes habían sido 65 diagnosticados como estadio Ib o estadio II, y fueron tratados por resección quirúrgica sin ningún seguimiento ni quimioterapia coadyuvante. El historial de revisión y los análisis del estudio fueron aprobados por la Oficina de

Revisión Institucional RUMC. El diagnóstico de NSCLC en estadio temprano en el material archivado se obtuvo de los informes patológicos. Los tiempos de recurrencia del cáncer de pulmón se obtuvieron de la historia del paciente. De los 60 pacientes, 16 tuvieron recurrencia del cáncer de pulmón en un año, cuatro tuvieron recurrencia del cáncer de pulmón entre uno y tres años, 16 tuvieron recurrencia del cáncer de pulmón después de 3 años y 24 nunca

5 progresaron (en los 34,5 meses mínimos de seguimiento).

Hibridación in situ. Para los análisis de número de copias por FISH, se hibridó el conjunto de sondas LAVysion con el especimen del paciente. Las portaobjetos con el especimen se prepararon utilizando los kits Vysis Parafin Pretreatment II o III (Abbott Molecular, Inc.). Los portaobjetos con el espécimen se hibridaron con la solución de 10 pruebas de 4 colores en un horno de co-desnaturalización automático HYBriteTM (Abbott Molecular, Inc.). Los portaobjetos se colocaron en la superficie del horno y se depositó sobre ellos una capa de 10 #l de la solución de sondas. Sobre la solución de sondas se aplicó un cubreobjetos y se selló al portaobjetos con un cemento de goma. Después de la desnaturalización a 73 ºC durante 5 minutos, la sonda se hibridó a 37 ºC durante 16-18 h. A continuación de la hibridación y la eliminación del sello de cemento de goma, los portaobjetos se colocaron en SSC

15 2X (SSC= NaCl 0,3 M, citrato sódico 15 mM), de Nonidet P40 (NP40) al 0,3% a temperatura ambiente durante 2-5 minutos para despegar el cubreobjetos. Entonces los portaobjetos se sumergieron en SSC 2X, NP40 al 0,3% a 73 ºC durante 2 minutos para eliminar las uniones de sonda no específicas y luego se dejaron secar en la oscuridad. Se aplicó al especimen una solución anti-desteñido DAPI I (Abbott Molecular, Inc.) para visualizar el núcleo. Algunos especímenes necesitaron un proceso adicional para que produjeran resultados óptimos de la FISH.

20 Las preparaciones de FISH se evaluaron bajo un microscopio de epi-fluorescencia Zeiss Axioscope (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Se visualizaron las señales y se realizó el recuento con un conjunto de filtros de paso de banda única DAPI para visualizar los núcleos, un conjunto de filtro dorado de paso de banda única para visualizar la sonda 8q24 marcada con SpectrumGold, un conjunto de filtro rojo de paso de banda única para visualizar la sonda CEP6

25 marcada con SpectrumAqua un conjunto de filtro dorado de paso de banda única para visualizar la sonda 7p12 marcada con SpectrumRed y un conjunto de filtro verde de paso de banda única para visualizar la sonda 5p15 marcada con SpectrumGreen (todos los conjuntos de filtro de Abbott Molecular Inc.). Solamente los núcleos con características morfológicas de células malignas se contaron. Cuando una preparación se contaba múltiples veces, los recuentos se combinaron y se utilizaron para recalcular las relaciones de señal de hibridación y los patrones de

30 señal, las señales FISH se enumeraron en 40 a 120 células (media= 82 células) por especimen para obtener el número de copias de cada uno de los cuatro loci.

Se analizó un intervalo de puntos límite para generar los primeros límites desde la media menos 2 desviaciones estándar hasta la media más 2 desviaciones estándar, en incrementos de desviación estándar de 0,1, para cada

35 parámetro (relaciones y ganancia en %), utilizando la media y las desviaciones estándar de los pacientes con el pronóstico favorable (pacientes que no recurrieron o recurrieron después de 3 años). Cada relación y % de ganancia de señal o pérdida en cada límite se compararon con el tiempo de recurrencia de la enfermedad (mayor o menor de 3 años para recurrencia) en tablas de contingencia. Los límites de las probabilidades con chi cuadrado más bajo se seleccionaron para posteriores análisis.

40 Procedimientos estadísticos. La asociación entre los clasificadores seleccionados y los resultados se llevó a cabo utilizando el Ensayo Exacto de Fisher. El nivel de significación fue p<0,05 en las estimaciones de dos colas. El procedimiento Kaplan-Meyer se utilizó para determinar el tiempo medio de recurrencia, con la comparación entre los grupos evaluados por el ensayo de rango logarítmico (significación p<0,05).

Resultados

Varias clasificaciones se encontraron asociadas fuertemente con el pronóstico cuando los pacientes que progresaban en los 3 años de la cirugía (el grupo de pronóstico desfavorable) se comparaba con pacientes que no

50 progresaban o que progresaban en más de 3 años después de la cirugía (el grupo de pronóstico favorable), o cuando los tiempos medios de progresión (TTR) se comparaban entre los grupos de pacientes diferenciados por los clasificadores.

Clasificador de referencia Rango3. Este clasificador determinado por el porcentaje de células que contenían un

55 intervalo de señales >3 (es decir, el locus con mayor número de señales de FISH menos el locus con el número más bajo de señales de FISH en una base de célula por célula). El Rango3, que utiliza un límite del 42% de células, era capaz de dividir los pacientes en un grupo de 36 (! 42% de células con diferencia de señales >3) en el que solamente 11 (el 45,8%) tenía pronóstico favorable (p= 0,011). Los tiempos medios de progresión en el primer y último grupos fue de 121 y, 14,5 meses, respectivamente (p= 0,0035). La tabla 1 muestra los datos para este

60 clasificador de referencia. La figura 1 muestra un gráfico Kaplan-Meyer del tiempo de recurrencia (TTR) en los dos grupos.

Tabla 1. Resultado del agrupamiento por el Rango3 de referencia, límite = 42% de células

Estado FISH: No progresión o progresión después de 3 años Progresión en menos de 3 años Total de pacientes

! 42% de células: 29 pts 80,6% 7 pts 19,4% 36 pts

< 42% de células: 11 pts 45,8% 13 pts 54,2% 24 pts

Total de pacientes: 40 pts 20 pts 60 pts

p = 0,011

Clasificador de % de pérdida MYC/EGFR. El porcentaje de células que contenían menos señales MYC que señales EGFR, el % de pérdida MYR/EGFR, utilizando un límite del 31% de células que tienen una pérdida relativa de

5 señales MYC, era capaz de dividir los pacientes en un grupo de 25 (! 31% de las células con pérdida relativa de MYR) en el que 20 (el 80,0%) tenía el pronóstico favorable, y un grupo de 35 (< 31% de células con pérdida relativa de MYC) en el que 20 (el 57,1%) tenía el pronóstico favorable (p= 0,096). Los tiempos medios de progresión en el primer y último grupos fue de 113 y 53,3 meses, respectivamente (p= 0,0346). La figura 2 muestra un gráfico Kaplan-Meyer de tiempo de recurrencia en los dos grupos. La tabla 2 muestra los datos para este clasificador.

10 Tabla 2. Resultado del agrupamiento por % de pérdida MYR/EGFR, límite = 31%

! 31% de células: 20 pts 80,00% 5 pts 20,00% 25 pts

< 31% de células: 20 pts 57,14% 13 pts 42,86% 35 pts

Total de pacientes: 40 pts 20 pts 60 pts

p = 0,096

Clasificador de combinación de Rango3 y % de pérdida MYC/CEP6. Si el patrón Rango3 está presente en < 45% de las células y el % de pérdida MYC/CEP6 está presente en < 13% de las células, entonces se identifica un grupo de 6 pacientes (el 10%) en el que los 6 tienen un pronóstico desfavorable (todos los pacientes recurrieron en 15 meses). 15 De los restantes 54 pacientes (El rango3 estaba presente en > 45% de la células o el % de pérdida MYC/CEP6 estaba presente en ! 13% de células), 40 (el 74,1%) tenía el pronóstico favorable (p= 0,0008). Los tiempos medios de progresión en el primer y último grupos fueron 10,1 y 78,8 meses, respectivamente (p< 0,0001). La tabla 3 muestra los datos del clasificador de combinación que resulta de utilizar un límite de MYC/CEP6 del 13% de células. La figura 3 muestra un gráfico de Kaplan-Meyer del tiempo de recurrencia (TTR) en los dos grupos con el límite del

20 13%.

Tabla 3. Resultado del agrupamiento por Rango3 <45% de células y % de pérdida MYR/CEP6 <13% células contra otros porcentajes de células

Rango3 ! 45% de células o % de pérdida MYC/CEP6 !13% de células: 40 pts 74,07% 14 pts 25,93% 54 pts

Rango3 < 45% de células y % de pérdida MYC/CEP6 <13% de células: 0 pts 0,00% 6 pts 100,0% 6 pts

Total de pacientes: 40 pts 20 pts 60 pts

p = 0,0008

Con propósitos de comparación, también se determinó un gráfico de Kaplan-Meyer de tiempo de recurrencia (TTR) en los dos grupos utilizando el clasificador de combinación, pero con un límite mayor del 24% para el porcentaje de

25 células con % de pérdida de MYC/CEP6. La tabla 4 y la figura 4 muestran los datos y el gráfico de Kaplan-Meyer para el clasificador de combinación con el límite más alto. Aunque no se alcanza una separación espectacular del pronóstico, los límites más altos del % de pérdida de MYC/CEP6 también proporcionan valores de p muy bajos (p= 0,0013 para el pronóstico, p< 0,0001 para el tiempo medio de recurrencia),

Tabla 4. Resultado del agrupamiento por Rango3 <45% de células Y % de pérdida MYR/CEP6 <24% células contra otros porcentajes de células

Rango3 ! 45% de células o % de pérdida MYC/CEP6 !24% de células: 37 pts 77,08% 11pts 22,92% 48 pts

Rango3 < 45% de células y % de pérdida MYC/CEP6 <24% de células: 3 pts 25,00% 9 pts 75,00% 12 pts

Total de pacientes: 40 pts 20 pts 60 pts

p = 0,0013

Clasificador de combinación de MYC/5p15 Y 5p15/CEP6. Utilizando la combinación de la relación de señal MYC/5p15 que sea ! 0,80 y la relación 5p15/CEP6 ! 1,1 de las células, identifica un grupo de 28 pacientes en el que

5 13 (el 46,6%) tiene el pronóstico favorable. De los 32 pacientes restantes (aquellos que la señal de la relación MYC/5p15 < 0,80 o aquellos con la señal de la relación 5p15/CEP6 < 1,1), 27 (el 84,4%) tenían el pronóstico favorable (p= 0,0026). Los tiempos medios de progresión en el primer y último grupos fue de 22,7 y 121 meses, respectivamente (p= 0,0046). La tabla 5 muestra los datos del clasificador de combinación que resultan y la figura 5 muestra un gráfico Kaplan-Meyer del tiempo de recurrencia (TTR) en los dos grupos.

10 Tabla 5. Resultado del agrupamiento por MYC/5p15 ! 0,80 y 5p15/CEP6 ! 1,1 contra otras relaciones

MYC/5p15 ! 0,80 y 5p15/CEP6 ! 1,1: 13 pts 46,43% 15pts 53,57% 28 pts

MYC/5p15 < 0,80 o 5p15/CEP6 < 1,1: 27 pts 84,38% 5 pts 15,63% 32 pts

Total de pacientes: 40 pts 20 pts 60 pts

p = 0,0026

Clasificador de combinación de Intervalo Medio de Señal y Patrón Rango3. El clasificador de combinación (Intervalo Medio de Señal menor de 2,5 o el patrón Rango3 en al menos el 42% de células) identificó un grupo de 48 pacientes en el que 38 (el 79,2%) tenía el pronóstico favorable y 10 (el 20,8%) tenía un pronóstico desfavorable. En los 12 15 pacientes restantes (aquellos en el que el Intervalo Medio de Señal era mayor o igual de 2,5 y el patrón Rango3 era menor del 42% de células) solamente 2 (el 16,7%) tenía el pronóstico favorable (p= 0,0001), mientras que 10 (el 83,3%) tenía el pronóstico desfavorable. Los tiempos medios de progresión en el primer y último grupos fueron de 83,1 y 9,86 meses respectivamente (p<0,0001). La tabla 6 muestra los datos del clasificador de combinación utilizando un límite de Rango3 de menos del 42% de células. La figura 6 muestra un gráfico Kaplan-Meyer del

20 tiempo de recurrencia (TTR) en los dos grupos.

Tabla 6. Resultado del agrupamiento por Rango Med ! 2,5 y Rango3 <42% de células

Rango Med ! 2,5 y Rango3 <42% de células: 2 pts 16,67% 10pts 83,33% 12 pts

MYC/5p15 < 0,80 o 5p15/CEP6 < 1,1: 38 pts 79,17% 10 pts 20,83% 48 pts

Total de pacientes: 40 pts 20 pts 60 pts

p = 0,0001

Discusión de los resultados

25 Estos datos indican que el uso de evaluación del número de copias genómicas de al menos dos de los loci EGFR, MYC, 5p15, y 6 medidos por FISH, y con el uso de un apropiado clasificador, es de importancia pronóstica en NSCLC en estadio temprano. Los cuatro clasificadores ensayados fueron capaces de producir una clasificación significativa estadísticamente de pacientes que habían sido tratados con cirugía sin quimioterapia coadyuvante o posterior, en categorías de recurrencia favorable y desfavorable. Ningún ensayo clínico in vitro presente proporciona

30 esta capacidad. Estos datos son los primeros para clasificar los pacientes con NSCLC en primeros estadios sin metástasis distantes o con diseminación a no más de un ganglio linfático en grupos de pronóstico favorable y desfavorable sobre una base significativa estadísticamente utilizando un ensayo de hibridación molecular. Los ensayos de FISH de dos o más de los loci cromosómicos 5p15, 7p12, 8q24 y centrómero 6 llevados a cabo en especímenes de biopsia de NSCLC en estadios tempranos o tumores resecados parece valioso en las decisiones

35 que se refieren a la cirugía y la terapia adyuvante.

Las asociaciones en cada uno de los clasificadores fueron bastante robustas, en los que la significación estadística podía encontrarse en un intervalo de valores límites de hasta el 10% o más para algunos parámetros. Los límites presentados en los datos para cada clasificador son los que tenían valores de p más bajos. Esto significa que el límite del porcentaje particular de células en el tejido evaluado que tiene un patrón anormal o el límite de la relación particular utilizada en el clasificador se pueden variar.

Se entiende que, aunque la invención se ha descrito en conjunción con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ser ilustrativa y no limitar el ámbito de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para determinar el pronóstico del cáncer de pulmón en un paciente humano, comprendiendo el procedimiento: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente humano clasificado como que

5 tiene un cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio temprano con un conjunto de sondas cromosómicas que comprende al menos dos sondas seleccionadas de entre el grupo que consiste en una sonda específica del locus del cromosoma 5p15, una sonda específica del locus del cromosoma 8q24, una sonda de enumeración del cromosoma 6, y una sonda específica del locus del cromosoma 7p12 bajo condiciones suficientes para que se produzca la hibridación de las sondas del conjunto a los cromosomas en la muestra, si existen; (b) identificación del patrón de hibridación para un pronóstico favorable del conjunto de sondas cromosómicas en la muestra biológica seleccionada a partir del patrón de hibridación que consiste en:

(i) el clasificador de % de pérdida de 8q24/7p12 que utiliza un límite de ! 31% de células,

(ii) el clasificador Rango3 y el patrón de % de pérdida 8q24/CEP6 con límites de ! 45% de células o ! 24% de 15 células respectivamente

(iii) la relación de señal total 8q24/5p15 y la relación total 5p15/CEP6 con límites de < 0,80 o < 1,1 respectivamente

(iv) el Intervalo Medio de Señal y el patrón Rango3 con límites de < 2,5 o ! 42% de células, respectivamente

y (c) determinar el pronóstico de cáncer de pulmón en un sujeto basándose en el patrón de hibridación identificado en la etapa (b), en la que el clasificador Rango3 es el intervalo de células que muestran una diferencia en una base de célula por célula, de al menos tres señales de sonda de FISH en el locus cromosómico con el mayor número de señales de FISH menos las señales de FISH en el locus cromosómico con el número más bajo de señales de FISH y en la que el Intervalo Medio de Señal se calcula determinando en cada célula del número total de células de la

25 muestra que se evalúa, la diferencia entre la sonda con el número más alto de señales de hibridación y la sonda con el menor número de señales de sonda, luego se recopila el número Rango de Señal individual celular y se divide por el número de células evaluadas.
2.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica comprende una biopsia o resección de tejido pulmonar.
3.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que cada sonda cromosómica está directamente marcada con un marcador fluorescente que se puede detectar por separado.

35 4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es de un paciente clasificado como que tiene un cáncer de pulmón de células no pequeñas en Estadio 1b.
5.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es de un paciente clasificado como que tiene un cáncer de pulmón de células no pequeñas en Estadio 2.
6.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de puesta en contacto (a) se lleva a cabo en un instrumento automático.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el patrón de hibridación es la identificación de un número de 45 células en la muestra biológica que muestra la pérdida de señales 8q24 con respecto a las señales 7p12.
8.

El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el número de células es al menos aproximadamente el 31 por ciento de las células evaluadas en la muestra biológica.
9.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el patrón de hibridación es una combinación de (i) identificación de un número de células en la muestra biológica que muestra una diferencia en una base de célula por célula, de al menos tres señales de sonda entre las señales de sonda en el locus cromosómico con el número más alto de señales de sonda menos las señales de sonda en el locus con el número más bajo de señales de sonda y (ii) identificación de un número de células en la muestra biológica que muestra una pérdida en una base de célula por

55 célula de señales 8q24 con respecto a señales del centrómero 6.
10.

El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el número de células que tiene una diferencia de al menos tres señales de sonda está por debajo de aproximadamente el 45 por ciento de las células evaluadas en la muestra biológica y el número de células que muestra una pérdida de señales de 8q24 con respecto a las señales del centrómero 6 es menor de aproximadamente el 24 por ciento de las células evaluadas en la muestra biológica.
11.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el patrón de hibridación es una combinación de (i) identificación de un número de células en la muestra biológica que muestran en una base de célula por célula una relación de las señales de locus 8q24 y 5p15 de ! 0,80 y (ii) identificación de un número de células en la muestra biológica que

65 muestra en una base de célula por célula una relación de las señales de sonda 5p15 con respecto a las señales de sonda centrómero 6 de al menos 1,1.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el patrón de hibridación es una combinación de (i) identificación de un número de células en la muestra biológica que muestra una diferencia en una base de célula por célula, de al menos tres señales de sonda entre las señales de sonda en el locus cromosómico con el mayor número de señales

5 de sonda menos las señales de sonda en el locus cromosómico con el menor número de señales de sonda y (ii) identificación de un número de células en la muestra biológica que muestra una diferencia de señal de sonda media en una base de célula por célula de una diferencia en las señales de sonda en el locus cromosómico con el mayor número de señales de sonda menos las señales de sonda en el locus cromosómico con el número más bajo de señales de sonda.
13.

El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la diferencia de señal de sonda media es igual o mayor de aproximadamente 2,5.
14.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el número de células que tiene una diferencia de al menos tres

15 señales de sonda es menor de aproximadamente el 42% de las células evaluadas en la muestra biológica y el número de células que muestra unas diferencias medias de señal de sonda en al menos aproximadamente el 2,5 por ciento de células evaluadas en la muestra biológica.
15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica comprende una muestra de citología. 20
16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las sondas cromosómicas están cada una marcadas de manera fluorescente.