CN102162006B - 用于检测前列腺癌的检测剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测前列腺癌的检测剂和试剂盒。具体地，所述检测剂为选自如下的三个探针组中的至少一个：1)GLPTMPRSS2/ETV1探针组；2)GLP ERG探针组；和3)GLPTMPRSS2/ETV4探针组。具体地，所述试剂盒包括溶解在TE Buffer中的所述检测剂，其中所包括的探针组的浓度为50～300ng/μl。本发明还涉及所述检测剂和试剂盒在检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合中的用途、以及一种检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合的方法。

Description

用于检测前列腺癌的检测剂及其用途

技术领域

本发明涉及用于检测前列腺癌的检测剂和试剂盒、所述检测剂和试剂盒在检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合中的用途、以及一种检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合的方法。

背景技术

前列腺癌(prostate cancer，下文简称为“PCa”)是一种常见的老年男性泌尿生殖系统恶性肿瘤。在欧美国家，前列腺癌居男性恶性肿瘤的第二位(Jemal A，Murray T，Samuels A，et a1.Cancerstatistics[J].CA Cancer J，2003，53(1)：5-26.)，病死率仅次于肺癌。在我国，前列腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已高居泌尿系肿瘤的第三位，并且发病年龄也日趋年轻化。

早期PCa主要表现为组织结构的改变，细胞病理学的改变并不典型，诊断易受病理检查者的主观影响。目前，PSA筛查、直肠指诊、经直肠超声引导穿刺活检是前列腺癌诊断的标准方法。但这三种方法都有其不足。

关于PSA筛查方法，当PSA＞10ng/ml时患癌的几率在50％以上；当PSA为4～10ng/ml，考虑穿刺活检进一步证实，仅能发现20-40％的PCa患者，漏诊率高；当PSA＜4ng/ml，不主张做穿刺活检，但近年来发现当PSA为2～4ng/ml时，20～30％的患者也发现有PCa。PSA作为PCa血清学标记不能有效地区分早期PCa和前列腺增生，特别是当PSA为2～10ng/ml时有必要研究新的早期PCa诊断方法，有效地筛查出PSA在2～10ng/ml范围内的PCa。

而DRE的诊断价值稍低，DRE发现的前列腺癌只有33％被证实为早期局限性前列腺癌(Thompson IM，Emst JJ，Gangai MP，et a1.Adenocarcinoma of the prostate：results of routine urologicalscreening[J].J Urol，1984，132(4)：690-692.)，该诊断方法也会造成患者的生理不适。

经直肠超声引导穿刺活检是目前临床术前确诊前列腺癌的常用手段，但是比较容易出现一些并发症，例如，出血(如血尿、血便、血精)、疼痛、感染等，并且当检测点数较低时，常出现漏诊的情况。

很多遗传病和一些类型的癌症都与染色体发生易位有关。染色体易位是指两条染色体发生断裂后相互交换无着丝粒断片，形成两条新的衍生染色体的现象。易位是比较常见的染色体结构畸变，在各号染色体间都可发生。染色体易位是由2个没有在正常的基因组里共现的基因相互融合而引起的。某些与染色体异位有关的情况经常发生在相同位置或该位置附近。经常发生断裂的染色体区域称为断裂区。

现已知，大约有80％的前列腺癌患者存在TMPRSS2基因(Genbank登录号为：7113)与ETS基因家族的融合，包括与ERG(21q22)(Genbank登录号为：2078)、ETV1(7p21)(Genbank登录号为：2115)、ETV4(17q21)(Genbank登录号为：2118)基因的融合改变，发生机理为：发生断裂的TMPRSS2基因与发生断裂的ETV1基因相互融合，导致21号染色体与7号染色体发生相互易位；位于21号染色体的ERG基因发生断裂，与TMPRSS2基因发生融合，形成21号染色体重组；发生断裂的TMPRSS2基因与发生断裂的ETV4基因相互融合，导致21号染色体与17号染色体发生相互易位(Recurrent Fusion of TMPRSS2 and ETS Transcription FactorGenes in Prostate Cancer Scott A.Tomlins Daniel R.Rhodes SvenPerner Science 310，644(2005)；以及Maisa Yoshimoto，Anthony M.Joshua，Susan Chilton-MacNeill，et al Neoplasia，June 2006，8(6)：465-469 Three-Color FISH Analysis of TMPRSS2-ERG Fusions inProstate Cancer)。在上述三种基因融合中，TMPRSS2与ERG融合基因可能还可以预测PCa的进展，有报道，缺乏ERG基因改变的PCa患者的8年生存率达90％。

荧光原位杂交技术是一种检测遗传学改变的分子细胞技术，能够在细胞核、染色体水平上显示基因数量、结构的变异。荧光原位杂交技术用荧光染料标记的核酸作为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中目的核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸，在荧光显微镜下观察并记录结果。

荧光原位杂交技术具有操作简单，重复性好、灵敏性及特异性高的特点；比传统方法可更早发现细胞异常，能大幅度降低漏诊率；FISH检测前列腺癌的临床检测敏感性达到80％以上，特异性近100％(Tomlins SA，Mehra R，Rhodes DR，et al..TMPRSS2：ETV4 genefusions define a third molecular subtype of prostate cancer.CancerRes.，2006)，能够为临床提供相比PSA筛查和穿刺活检更为准确、客观的诊断指标，这对于前列腺癌的早期诊断及预后判断有着极其重要的意义。

针对现有技术的上述不足，本发明人通过创造性的构思和不懈的实验努力完成了本发明。本发明通过使包含TMPRSS2、ERG、ETV1、ETV4基因的DNA序列带有荧光标记，成为荧光原位杂交探针，通过与从患者身上取得的组织样本等进行杂交，带有荧光标记的原位杂交探针与样本的TMPRSS2、ERG、ETV1、ETV4基因区依次按照碱基互补的原理结合，从而将患者的TMPRSS2、ERG、ETV1、ETV4基因结构变异以荧光信号改变的方式显示。

本发明的荧光原位杂交探针组的临床检测灵敏度在80％以上，特异性都近100％，并具有取材方便等优势，比起传统的前列腺癌检测技术更具有先进性。

发明内容

本发明的一个方面是提供用于检测前列腺癌的检测剂，所述检测剂为选自如下的三个探针组(GLP TMPRSS2/ETV1探针组、GLPERG探针组、GLP TMPRSS2/ETV4探针组)中的至少一个：

1)GLP TMPRSS2/ETV1探针组

包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、以及第六探针，其中

第一探针、第二探针、和第三探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且这三个探针各自的核酸序列合起来包含TMPRSS2基因(SEQ ID NO：1)的全部核酸序列以及染色体21q22上的TMPRSS2基因5’末端以外70kb～170kb的核酸序列和/或3’末端以外150kb～250kb的核酸序列，

第四探针、第五探针、和第六探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且这三个探针各自的核酸序列合起来包含ETV1基因(SEQID NO：2)的全部核酸序列以及染色体7p21上的ETV1基因5’末端以外100kb～200kb的核酸序列和/或3’末端以外80kb～180kb的核酸序列，

所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。

在本发明的一个实施方案中，第一探针、第二探针、和第三探针合起来的核酸序列(参见附图1A)为大约370kb，这些探针的序列选自购买的BAC clone(购自Children’s Hospital of Oakland ResearchInstitute(CHORI)或invitrogen)RP11-814F13(其插入片断起止位置：chr21：41704419-41876631，SEQ ID NO：5)、RP11-671L10(其插入片断起止位置：chr21：41709062-41876646，SEQ ID NO：6)、AL773578(其插入片断起止位置：chr21：41559315-41716976，SEQID NO：7)、RP11-635F7(其插入片断起止位置：chr21：41570022-41735879，SEQ ID NO：8)、以及CTD-2337B13(其插入片断起止位置：chr21：41896060-41939772，SEQ ID NO：9)中的3个克隆的插入片段，并且优选如下的2组：RP11-814F13、RP11-635F7、CTD-2337B13或者RP11-671L10、AL773578、CTD-2337B13，这2组探针各自的核酸序列合起来约370kb，包含TMPRSS2基因的全部核酸序列和染色体21q22上的TMPRSS2基因5’和/或3’末端以外的部分序列。

在本发明的一个实施方案中，第四探针、第五探针、和第六探针合起来的核酸序列(参见附图1B)为大约350kb，这些探针的序列选自购买的BAC clone(购自Children’s Hospital of Oakland ResearchInstitute(CHORI)或invitrogen)RP11-79G16(其插入片断起止位置：chr7：13785785-13935899，SEQ ID NO：10)、RP11-692G10(其插入片断起止位置：chr7：13782597-13947348，SEQ ID NO：11)、RP4-685A2(其插入片断起止位置：chr7：13887063-13996421，SEQ IDNO：12)、CTD-2134C13(其插入片断起止位置：chr7：13915125-13973529，SEQ ID NO：13)、AC004909(其插入片断起止位置：chr7：13996222-14128271，SEQ ID NO：14)、RP11-313C20(其插入片断起止位置：chr7：13975267-14159425，SEQ ID NO：15)中的3个克隆的插入片段，并且优选如下的2组：RP11-79G16、RP4-685A2、RP11-313C20或者RP11-692G10、CTD-2134C13、AC004909，这两组探针各自的核酸序列合起来约350kb，包含ETV1基因的全部核酸序列和染色体7p21上的ETV1基因5’和/或3’末端以外的部分序列。

在本发明的一个实施方案中，第一探针、第二探针、和第三探针用红色荧光标记，第四探针、第五探针、和第六探针用绿色荧光标记，用于检测TMPRSS2/ETV1基因融合，相对于现有技术，本发明的探针组覆盖范围更大，在荧光显微镜下的肉眼检测效果更为显著，并且由于调换标记的颜色，使用更多克隆的插入片段，能够使探针的信号得到显著增强，更有利于观察结果。

2)GLP ERG探针组

包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针，其中

第一探针、第二探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且这两个探针各自的核酸序列合起来包含ERG基因(SEQ ID NO：3)的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因5’末端以外的160kb～260kb的核酸序列，

第三探针、第四探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且这两个探针各自的核酸序列合起来包含ERG基因的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因3’末端以外的180kb～280kb的核酸序列，

并且所述四个探针各自的核酸序列合起来要包含ERG基因的全部核酸序列，

所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。

在本发明的一个实施方案中，第一探针和第二探针合起来的核酸序列(参见附图2)为大约320kb，这些探针的序列选自购买的BACclone(购自Children’s Hospital of Oakland Research Institute(CHORI)或invitrogen)中的3个克隆RP11-476D17(其插入片断起止位置：chr21：38604838-38785541，SEQ ID NO：16)、CTD-3244I3(其插入片断起止位置：chr21：38468179-38608049，SEQ ID NO：17)、CTD-2341O18(其插入片断起止位置：chr21：38465658-38646411，SEQ ID NO：18)的插入片段，其中优选如下的2组，RP11-476D17、CTD-2341O18或者RP11-476D17、CTD-3244I3，这组探针各自的核酸序列合起来为大约320kb，包含ERG基因的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因靠近着丝粒端的部分序列。

在本发明的一个实施方案中，第三探针和第四探针合起来的核酸序列(参见附图2)为大约320kb，这些探针的序列选自购买的BACclone(购自Children’s Hospital of Oakland Research Institute(CHORI)或invitrogen)中的3个克隆RP11-95I21(其插入片断起止位置：chr21：38821491-39010973，SEQ ID NO：19)、CTD-2506J13(其插入片断起止位置：chr21：38999889-39191869，SEQ ID NO：20)、RP11-259A4(其插入片断起止位置：chr21：39012507-39144422，SEQ ID NO：21)的插入片段，并且优选如下的2组：RP11-95I21、RP11-259A4或者RP11-95I21、CTD-2506J13，这两组探针各自的核酸序列合起来为大约320kb，包含ERG基因的一部分核酸序列和染色体21q22上的ERG基因靠近端粒端的部分序列。

在本发明的一个实施方案中，这4个探针将ERG基因分成两段，靠近着丝粒端的第一探针和第二探针用绿色荧光标记，靠近端粒端的第三探针和第四探针用红色荧光标记，用于检测ERG基因断裂的克隆插入片段覆盖范围大于现有技术，且在仅选用双色标记的情况下，可以检测到更多的范围，不光包括ERG基因与TMPRSS2基因的融合，更包括ERG基因与非TMPRSS2基因融合的情况，用更容易在荧光显微镜下判断的简单的双色搭配，检测更多的异常类型是本探针设计的优势。

3)GLP TMPRSS2/ETV4探针组

包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、第六探针以及第七探针，其中

第一探针、第二探针、第三探针、和第四探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且这四个探针各自的核酸序列合起来TMPRSS2基因的全部核酸序列和染色体21q22上的TMPRSS2基因5’末端以外80kb～180kb的核酸序列和/或3’末端以外的150kb～250kb的核酸序列，

第五探针、第六探针、和第七探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且这三个探针各自的核酸序列合起来包含ETV4基因(SEQID NO：4)的全部核酸序列和染色体17q21上的ETV4基因5’末端以外180kb～280kb的核酸序列和/或3’末端以外150kb～250kb的核酸序列，

所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。

在本发明的一个实施方案中，第一探针、第二探针、第三探针、第四探针合起来的核酸序列(参见附图3A)为大约380kb，这些探针的序列选自购买的BAC clone(购自Children’s Hospital of OaklandResearch Institute(CHORI)或invitrogen)RP11-814F13、RP11-671L10、AL773578、RP11-635F7、CTD-2337B13以及CTD-3095D11(其插入片断起止位置：chr21：41924082-41952283，SEQ ID NO：22)中的4个克隆的插入片段，其中优选如下的2组：RP11-814F13、RP11-635F7、CTD-2337B13、CTD-3095D11或者RP11-671L10、AL773578、CTD-2337B13、CTD-3095D11，这2组探针各自的核酸序列合起来为大约380kb，包含TMPRSS2基因的全部核酸序列和染色体21q22上的TMPRSS2基因5’和/或3’末端以外的部分序列。

在本发明的一个实施方案中，第五探针、第六探针和第七探针合起来的核酸序列为大约350kb(参见附图3B)，这些探针的序列选自购买的BAC clone(购自Children’s Hospital of Oakland ResearchInstitute(CHORI)或invitrogen)CTD-2326M16(其插入片断起止位置：chr17：38879789-38997637，SEQ ID NO：23)、CTD-2321N2(其插入片断起止位置：chr17：38899792-38997630，SEQ ID NO：24)、AC087650(其插入片断起止位置：chr17：38762437-38932045，SEQ ID NO：25)、CTD-3215I16(其插入片断起止位置：chr17：38799094-38869021，SEQ ID NO：26)、CTC-420I11(其插入片断起止位置：chr17：38997631-39134026，SEQ ID NO：27)、AC068675(其插入片断起止位置：chr17：38926965-39091575，SEQ ID NO：28)、RP11-147C10(其插入片断起止位置：chr17：39020689-39205553，SEQID NO：29)中的3个克隆的插入片段，并且优选为如下的2组：CTD-2326M16、CTD-3215I16、CTC-420I11或者CTD-2321N2、AC087650、AC068675、RP11-147C10，这两组探针各自的核酸序列合起来为大约350kb，包含ETV4基因的全部核酸序列和染色体17q21上的ETV4基因5’和/或3’末端以外的部分序列。

需要说明的是，用于检测TMPRSS2/ETV4基因融合的克隆插入片段的覆盖范围超出现有技术，在荧光显微镜下的肉眼检测效果更为显著，使用更多的克隆能够使探针的信号得到显著增强，更有利于观察结果。

在本发明的一个实施方案中，探针组中的探针序列为上述3个探针组中的探针的互补序列，或者选自如下的变体：

1)在高等严紧条件下与上述3个探针组中的探针的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，

2)对上述3个探针组中的探针的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，

3)与上述3个探针组中的探针的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

在本发明中，所述对上述3个探针组中的探针的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与上述3个探针组中的探针的核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在上述3个探针组中的探针的核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。

在本发明中，所述与上述3个探针组中的探针的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括与上述3个探针组中的探针所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

关于探针的标记方法，可以采用现有技术中的方法使DNA序列带有相应的荧光标记。所述方法包括但不限于：采用随机引物法、切口平移法等。

随机引物法利用6个碱基的寡核苷酸作引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段的催化下，沿单链模板起始DNA的合成。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就可在模板的多位点上与模板杂交(所述方法具体可以参见，例如，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)

切口平移法需要用两种不同的酶活性参与反应，限制性内切酶DNA酶I可在双链靶DNA两条链上的随机位点切口磷酸二酯键，大肠杆菌DNA聚合酶I则将脱氧核糖核苷酸加到DNA酶I产生的3’羟基端。DNA聚合酶I除具有聚合酶活性，还具有5’-3’外切核酸酶活性，因而能从切口5’端去除核苷酸。5’端核苷酸的去除与荧光带有荧光标记的核苷酸的掺入同时进行，使切口沿着DNA链移动，产生高活性比的标记DNA(所述方法具体可以参见，例如，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)

所用荧光标记可以是本领域中已知的荧光标记染料，例如下面的表1所示的荧光染料。

表1可选用荧光染料，其激发及发射波长

Fluorescent Dye(荧光染料)	Excitation(激发波长，nm)	Emission(发射波长，nm)
			Calcein	494	517
FITC(Fluorescein-12-dUTP)	494	518
			FluorXTM	494	519
AlexaTM 488	490	520
			Rhodamine 110	496	520
ABI，5-FAM	494	522
			Oregon Green TM 500	503	522
Oregon Green TM 488	496	524
			RlboGreen TM	500	525
Rhodamine Green TM	502	527
			Rhodamine123	507	529
Magnesium Green TM	506	531
			Calcium Green TM	506	533
TO-PRO TM-1	514	533
			Cy3TM	550	570

Magnesium Orange TM	550	575
			Phycoerythrin，R & B	565	575
Rhodamine Phalloidin	550	575
			Calcium Orange TM	549	576
Pyronin Y	555	580
			Rhodamine B	555	580
ABI，TAMRA	560	582
			Tetramthylrhodamine-5-dUTP	551	575
Calcium Crimson TM	590	615
			Texas Red	595	615

在本发明的一个实施方案中，所述第一荧光标记是四甲基罗丹明(Tetramthylrhodamine-5-dUTP)，所述第二荧光标记是异硫氰酸(FITC)。

在本发明的一个实施方案中，

1)对于GLP TMPRSS2/ETV1探针组，第一探针、第二探针、和第三探针带有四甲基罗丹明荧光标记，第四探针、第五探针、和第六探针带有FITC荧光标记。如附图1(A)和附图1(B)所示。

正常的情形：应包括两对正常的7、21号染色体，荧光显微镜下显示2R2G信号。

异常(融合后)的情形：应包括一对正常的7、21号染色体，荧光显微镜下显示1R1G信号；同时，存在附图1(C)所示的融合方式，一对正常的7、21号染色体发生TMPRSS2与ETV1的融合，形成2个融合信号。最终累加起来应是1G1R2Y的信号。

2)对于GLP ERG探针组，其核酸序列自近着丝粒区域至端粒方向被分别带有FITC与四甲基罗丹明两种荧光标记，FITC标记区域长约320kb，四甲基罗丹明标记区域长约320kb。如附图2所示。

正常的情形：应包括两对正常的21号染色体，荧光显微镜下显示2Y信号。

异常的ERG基因融合情形：

①TMPRSS2基因与ERG基因融合：在1个代表ERG基因的黄色信号中，1个红色信号丢失，剩余1个绿色信号；同时另1个ERG黄色信号不变，总的表示为1G1Y；

②ERG基因与其它基因融合：在1个代表ERG基因的黄色信号中红色信号与绿色信号分开；同时另1个ERG黄色信号不变，总的表示为1R1G1Y。

3)对于GLP TMPRSS2/ETV4探针组，第一探针、第二探针、第三探针、和第四探针带有四甲基罗丹明荧光标记，第五探针、第六探针、和第七探针带有FITC荧光标记。如附图3所示。

正常的情形：应包括两对正常的17、21号染色体，荧光显微镜下显示2R2G信号。

异常(融合后)的情形：应包括一对正常的17、21号染色体，荧光显微镜下显示1R1G信号；同时，存在如附图1(C)所示的融合方式，一对正常的17、21号染色体发生TMPRSS2与ETV4的融合，形成2个融合信号。最终累加起来应是1G1R2Y的信号。

本发明中，G表示绿色(green)，R表示红色(red)，Y表示黄色(yellow)。

本发明的另一个方面是提供用于检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括：

上述的检测剂，以及GLP杂交缓冲液。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒包括GLP ERG探针组和GLP杂交缓冲液。所述试剂盒还可以进一步包括GLPTMPRSS2/ETV1探针组和/或GLP TMPRSS2/ETV4探针组。优选地，所述试剂盒包括上述的三个探针组。

对于上述的每个探针组，其用于每人份检测的量为2μl，浓度为50～300ng/μl，所述探针溶解的溶液为TE buffer。所述TE buffer可以参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，第三版，科学出版社)进行配制。

所述GLP杂交缓冲液可以参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，第三版，科学出版社)进行配制，用于每人份检测的GLP杂交缓冲液的量为7μl或更高。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还包括封阻液。所述封阻液用于封阻非特异性杂交。所述封阻液的组成为：cot-1DNA(invitrigen货号15279-011，1mg/ml；在封阻液中的含量为50-500ng/μl)、ssDNA(simga D1626；在封阻液中的含量为100-500ng/μl)、去离子水0.1-1.5μl。用于每人份检测的封阻液量为0.1-1μl或更高。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还包括缓冲液的储存液、缓冲液、变性液、乙醇溶液、甲酰胺洗涤液、洗涤液、快洗洗涤液、30％(w/v)酸性亚硫酸钠溶液、蛋白酶K溶液(包括蛋白酶K储存液和蛋白酶K工作液)、以及甲醛固定液。这些上述溶液的组成和制备方法如下所示：

(1)缓冲液的储存液：20×SSC，pH 5.3

表2缓冲液的储存液配方

氯化钠	88g
		柠檬酸钠	44g
去离子水	400ml

充分溶解，室温下12M HCl调节pH值至5.3，用去离子水定容至500ml。高压灭菌；使用期间2～8℃储存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。

(2)缓冲液：2×SSC，pH 7.0±0.2

表3缓冲液配方

20×SSC(pH 5.3)	100ml
		去离子水	800ml

充分混匀，室温下10M NaOH调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至1L。使用期间2～8℃储存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。

(3)变性液：70％(v/v)甲酰胺/2×SSC，pH 7.0～8.0

表4变性液配方

甲酰胺	35ml
		20×SSC(pH 5.3)	5ml

充分混匀，室温下调节pH值至7.0～8.0，用去离子水定容至50ml。使用期间2～8℃储存。试剂配制7天后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。

(4)乙醇溶液：70％乙醇、85％乙醇

将700ml、850ml无水乙醇，用去离子水分别稀释至1L。使用期间2～8℃储存。试剂配制1个月后或用于20张玻片杂交后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。

(5)甲酰胺洗涤液：50％(v/v)甲酰胺/2×SSC，pH 7.0～8.0

表5甲酰胺洗涤液配方

甲酰胺	75ml
		20×SSC(pH 5.3)	15ml

充分混匀，室温下调节pH值至7.0～8.0，用去离子水定容至150ml。使用期间2～8℃储存。试剂配制7天后或用于20张玻片洗涤后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。

(6)洗涤液：0.1％NP-40/2×SSC溶液，pH 7.0±0.2

表6洗涤液配方

20×SSC(pH5.3)	40ml
		NP-40	0.4ml
去离子水	300ml

充分混匀，室温下10M NaOH调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至400ml。使用期间2～8℃储存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。

(7)快洗洗涤液：0.3％NP-40/0.4×SSC溶液，pH 7.0～7.5

表7快洗洗涤液配方

20×SSC(pH5.3)	20ml
		NP-40	3ml
去离子水	950ml

充分混匀，室温下10M NaOH调节pH值至7.0～7.5，用去离子水定容至1L。使用期间2～8℃储存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，请立即丢弃。

(8)30％(w/v)酸性亚硫酸钠(sodium bisulfite)溶液：

称取15g酸性亚硫酸钠溶于40ml去离子水中，轻轻摇动至完全溶解，加去离子水定容到50ml。每次实验前应使用新鲜配制的溶液。

(9)蛋白酶K溶液：200μg/ml蛋白酶K(Amresco 0706-100 41.4U/mg)：

(a)蛋白酶K储存液(20mg/ml)：称取0.1g蛋白酶K干粉溶于5ml 2×SSC(pH 7.0)溶液中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解，不要涡旋混合。-20℃分装储存，避免多次反复冻融。

(b)蛋白酶K工作液(200μg/ml)：取0.4ml蛋白酶K储存液(20mg/ml)溶于40ml 2×SSC(pH 7.0)溶液中。

(10)甲醛固定液

表8甲醛固定液配方

市售甲醛	1ml
		PBS(pH7.2～7.4)	39ml
MgCl2.6H2O	0.18g

充分混匀，每次实验前应使用新鲜配制的溶液。

本发明还涉及上述的检测剂和试剂盒在检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合中的用途。

本发明的还涉及一种检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合的方法：

使用本发明的检测剂或者本发明的试剂盒，通过荧光原位杂交检测TMPRSS2基因与ETS家族基因的融合状况。

检测所用样本包括但不限于：前列腺石蜡包埋组织切片、穿刺组织、冰冻石蜡组织切片、体液(前列腺分泌液)等。所述样本经预处理后可用于荧光原位杂交检测。

以石蜡包埋组织切片为例，检测步骤包括：将石蜡包埋组织切片的细胞核中的脱氧核糖核酸与TMPRSS2、ETV1、ERG、或ETV4位点特异性荧光原位杂交探针分别在高温下变性成单链脱氧核糖核酸，在42℃环境中，使这些已变性成单链的样本及探针核酸根据碱基互补的原则进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸，洗涤非特异性杂交后，探针上标记的荧光信号即可在荧光显微镜下被检测。

所需荧光显微镜的配置包括：10×目镜、10×物镜、40×物镜、和100×油镜。

当选用四甲基罗丹明和异硫氰酸荧光素进行标记时，优选使用与标记荧光染料相适应的滤片组。

在本发明的一个实施方案中，所述检测方法还包含如下步骤：

收集20位正常人的组织样本与探针组杂交，分别分析100个细胞，计算显示异常信号细胞的百分比的平均值及标准差，将平均值+3倍标准差定义为异常阈值；

观察待测样本杂交后的整张玻片，确定看到异常细胞区域，分别分析100个细胞，计算显示异常信号细胞的百分比，并与异常阈值相比较，当该百分比大于所述阈值时，样本为阳性；反之样本为阴性。

在本发明的一个实施方案中，进一步包括，对于如下的情形不要进行分析：

1)细胞核轮廓不清或有重叠的计数细胞；

2)杂交不均匀的区域；

3)背景深影响信号判断的区域；

4)超过25％的细胞核内信号太弱的区域；

5)超过10％的细胞质内有信号的区域。

发明的有益效果

本发明提供了用于检测前列腺癌的探针组和试剂盒；并且本发明通过FISH方法实现TMPRSS2与ETS家族的融合的检测。

本发明的荧光原位杂交探针组的临床检测灵敏度达到80％以上、特异性近100％，并具有取材方便等优势，比起传统的前列腺癌检测技术具有更先进性。此外，本发明采用两种荧光标记，探针的制备简单，探针组和试剂盒的使用简便，同时也简化了检测结果的判断。尤其是TMPRSS2基因与ERG基因的融合的检测，由于采用2种颜色的荧光标记，能检测出两种变异类型，检测范围广，检测方式方便；并且由于对每个基因采用三个探针进行检测，检测的信号强度高，并显著增强了观察的视觉效果。

附图说明

下面的附图1～3中，“......”称为点化线，“——  ——  ——”称为段化线，“——”称为实线，

称为粗实线。

图1：(A)GLP TMPRSS2/ETV1探针组中覆盖TMPRSS2区域的核酸序列用四甲基罗丹明标记的示意图。其中，粗实线代表TMPRSS2基因，段化线代表探针序列(即标记的克隆插入片段)，总长约350kb，覆盖包含TMPRSS2基因在内的21q22区域，TMPRSS2基因发生断裂时，自箭头所示的断裂点分为区域A与区域B两个部分，该断裂点可以位于TMPRSS2基因的任何部位；

(B)GLP TMPRSS2/ETV1探针组中覆盖ETV1区域的核酸序列用FITC标记的示意图。其中，粗实线代表ETV1基因；点化线代表探针序列(即标记的克隆插入片段)，总长约350kb，覆盖包含ETV1基因在内的7p21区域，ETV1基因发生断裂时，自箭头所示的断裂点分为区域C与区域D两个部分，该断裂点可以位于ETV1基因的任何部位；

(C)用GLP TMPRSS2/ETV1探针组检测时，TMPRSS2基因与ETV1基因融合的示意图。其中，粗实线代表发生融合的TMPRSS2/ETV1基因，段化线、点化线代表反应基因融合信息的探针序列(即标记的克隆插入片段)，在1个发生TMPRSS2/ETV1基因融合的细胞中，产生2个融合信号，荧光显微镜下可见2个红绿紧邻或黄色信号。

图2：GLP ERG探针组中自近着丝粒区域至端粒方向被分别带有FITC与四甲基罗丹明两种荧光标记的示意图。其中，粗实线代表ERG基因，点化线、段化线代表反应分别标记为两种颜色的探针序列(即标记的克隆插入片段)，各长约320kb，ERG基因融合TMPRSS2基因时，1个红色信号丢失，当ERG基因融合其它基因时，1对红绿信号分开。箭头所示为断裂点，该断裂点可以位于ERG基因的任何部位。

图3：(A)粗实线代表TMPRSS2基因，段化线代表探针序列(即标记的克隆插入片段)，总长约370kb，覆盖包含TMPRSS2基因在内的21q22区域，TMPRSS2基因发生断裂时，自箭头所示的断裂点分为区域A与区域B两个部分；

(B)粗实线代表ETV4基因，点化线代表探针序列(即标记的克隆插入片段)，总长约350kb，覆盖包含ETV1基因在内的17q21区域，ETV1基因发生断裂时，自箭头所示的断裂点分为区域C与区域D两个部分；

(C)粗实线代表发生融合的TMPRSS2/ETV4基因，段化线、点化线代表反应基因融合信息的探针序列(即标记的克隆插入片段)，在1个发生TMPRSS2/ETV4基因融合的细胞中，产生2个融合信号，荧光显微镜下可见2个红绿紧邻或黄色信号。

图4：(A)正常样本与TMPRSS2/ETV1探针杂交信号图，2个红色信号与2个绿色信号(2R2G)；

(B)TMPRSS2/ETV1阳性，发生基因融合，形成1R1G2Y信号。

图5：(A)正常样本与ERG探针杂交图片，显示为2个黄色信号；

(B)发生ERG基因与TMPRSS2基因融合，显示为1个黄色信号，1个绿色信号，而红色信号丢失(1G1Y)。

图6：(A)正常样本与TMPRSS2/ETV4探针杂交信号图，2个红色信号与2个绿色信号(2R2G)；

(B)TMPRSS2/ETV4阳性，发生基因融合，形成1R1G2Y信号。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1GLP TMPRSS2/ETV1探针组的制备

TMPRSS2探针制备采用random priming方法，使模版DNA标记为荧光红(Tetramthylrhodamine-5-dUTP，购自Roche)探针制备试剂盒购自Roche(Random Primed DNA Labeling Kit)

1.模版DNA准备(以RP11-814F13为例)：

(1)取适量购买的克隆RP11-814F13(以菌液形式存在)进行扩增培养；

(2)挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml LB(含Amp100μg/ml)液体培养基中，37℃，250rmp振荡培养过夜(约12-14小时)；

(3)取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中，12000rmp离心1-2分钟。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽；

(4)菌体沉淀重悬浮于100μl溶液I中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀)，室温下放置5-10分钟；

(5)加入新配制的溶液II 200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(注意不要振荡)，冰浴5分钟，使细胞膜裂解(溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)；

(6)加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5分钟，12000rmp离心10分钟；溶液III为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K⁺使SDS-蛋白复合物沉淀；

(7)将上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(450μl的苯酚/氯仿/异戊醇)，振荡混匀，12000rmp离心10分钟；

(8)小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5分钟，以12000rmp，离心10分钟；

(9)弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5分钟；

(10)吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥；

(11)将沉淀溶于20μl TE缓冲液中供标记使用，剩余部分储于-20℃冰箱中。

2.dNTP与荧光素mix准备

dNTPmix     数量

dATP        1μl

dGTP        1μl

dCTP        1μl

取各组分按照上述比例混合，制成dNTP mix.

荧光素mix制备

荧光素(3mM)    0.8μl

dTTP           0.8μl

tatal          1.6μl

3.标记混合液配制

试剂名称              数量

dNTP mix              3μl

荧光素mix             1.6μl

Reaction mixture      2μl

Klenow酶              1μl

4.充分混合上述试剂并短暂离心，放入培养箱37℃培养2小时。

5.向溶液中加入2μl 0.2M EDTA(pH8.0)结束反应。

6.将用于TMPRSS2/ETV1探针的所有克隆采用上述方法进行标记，待标记完成后将各克隆的标记液均匀混合。

7.探针纯化：乙醇沉淀

(1)向上述标记液中加入-20℃预冷的无水乙醇150μl，于-20℃沉淀2小时；

(2)取出标记液，12000g，4℃离心15分钟；

(3)弃上清，加入预冷的70％乙醇200μl，12000g、4℃离心15分钟；

(4)弃上清，真空干燥15分钟；

(5)加入20μl TE(pH)8.0，使沉淀充分溶解，即可用于荧光原位杂交检测。

本实施例中其它探针的制备用到的克隆分别是：RP11-635F7、CTD-2337B13、RP11-79G16、RP4-685A2和RP11-313C20，这些探针的制备可以参照所用克隆为RP11-814F13的情形。

实施例2GLP ERG探针组的制备

GLP ERG探针组的制备过程与实施例1中GLP TMPRSS2/ETV1探针组的制备相同，除了所选用的克隆不同(本实施例具体用到的克隆为：RP11-476D17、CTD-2341O18、RP11-95I21、以及RP11-259A4)，均包含DNA制备、探针混合液制备、探针标记、混合、纯化几个步骤。

实施例3GLP TMPRSS2/ETV4探针组的制备

GLP TMPRSS2/ETV4探针组的制备过程与实施例1中GLPTMPRSS2/ETV1探针组的制备相同，除了所选用的克隆不同(本实施例具体用到的克隆为：RP11-671L10、AL773578、CTD-2337B13、CTD-3095D11、CTD-2326M16、CTD-3215I16、以及CTC-420I11)，均包含DNA制备、探针混合液制备、探针标记、混合、纯化几个步骤。

实施例4FISH操作前石蜡包埋组织切片的预处理

1.试剂：

二甲苯、酸性亚硫酸钠(sodium bisulfite)、蛋白酶K、2×SSC、70％乙醇、85％乙醇、100％乙醇、甲醛固定液。

2.实验操作

(1)经10％中性福尔马林固定、石蜡包埋的前列腺组织切片，厚度为3～5μm，置于处理干净后的涂胶玻片上；

(2)将组织切片置于65℃下过夜烘烤，老化玻片；

(3)将组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10分钟，随后浸入100％乙醇中5分钟；

(4)将组织切片依次室温置于100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2分钟复水。将组织切片室温浸入去离子水中3分钟，用无绒纸巾吸取多余的水分；

(5)在50℃下用30％[w/v]酸性亚硫酸钠(sodium bisulfite)处理组织切片20～30分钟；

或者可替代地，在90℃下用水处理组织切片20～30分钟；

(6)室温下在2×SSC溶液中漂洗2次，每次5分钟；

(7)取0.4ml蛋白酶K储存液(20mg/ml)溶于40ml 2×SSC(pH7.0)得到蛋白酶K工作液(200μg/ml)；将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下孵育5～30分钟；

其中，蛋白酶K的作用时间视切片的厚薄而定，达到充分消化蛋白但不影响组织的形态的目的，此外蛋白酶K也具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高，会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核的消失或细胞核辨认不清；蛋白酶K消化不足会影响组织的通透性以及杂交信号的强度和杂交率，显微镜下观察自发荧光过强。

(8)组织切片经蛋白酶K消化后，于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5分钟；

(9)室温下于甲醛固定液中固定5分钟；

(10)室温下将组织切片玻片依次置于70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水；

(11)自然干燥玻片；

(12)加热玻片至56℃；

(13)按照FISH操作步骤进行FISH实验。

实施例5荧光原位杂交(FISH)的操作

FISH操作主要包括变性杂交、玻片洗涤、复染三个步骤。其中变性杂交有甲酰胺变性杂交和杂交仪变性杂交两种方法。前者是样本和探针分别变性，后者是用杂交仪对样本和探针进行共变性，减少了人为因素的影响。

一.变性杂交

1.甲酰胺变性杂交(手工操作)

(1)探针混合物准备及变性

探针混合物配制。室温下将如下样品加入到微量离心管中：

表8探针混合物配制

名称	体积(μl)
		GLP杂交缓冲液	7.0
去离子水	1.0
		实施例1～3制备的三个探针组	每个探针组2.0
总体积	10.0

离心1～3秒，涡旋混匀后再次短暂离心。

将装有以上探针混合物的试管置于78℃水浴箱中变性5分钟之后，迅速置于45～50℃水浴箱中，杂交前取出。

(2)标本准备及变性

为使溶液达到所需温度，使用前将盛有变性液的容器置于78℃水浴箱中约30分钟。

将样本玻片在变性液中浸泡5分钟；

将玻片依次置于-20℃预冷的70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟进行梯度脱水；

室温下将玻片自然干燥，置于45～50℃烤片机上预热3～5分钟后与探针杂交。若探针混合物尚未完成变性，玻片可置于45～50℃烤片机上较长时间预热。

(3)探针与样本杂交

将10μl变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边注意避免盖玻片与玻片之间产生气泡；

将玻片置于预热的湿盒中，42℃保温箱中过夜杂交。

2.杂交仪变性杂交(自动操作)

(1)探针混合物配制。室温下将如下样品加入到微量离心管中：

表9探针混合物配制

名称	体积(μl)
		GLP杂交缓冲液	7.0
去离子水	1.0
		实施例1～3制备的三个探针组	每个探针组2.0
总体积	10.0

(2)离心1～3秒，涡旋混匀后再次短暂离心；

(3)将10μl变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边，注意避免盖玻片与玻片之间产生气泡；

(4)准备杂交仪器，共变性条件：83℃，5分钟，杂交条件：42℃，16小时。

可选地，42℃过夜杂交可在杂交仪中进行，也可在共变性之后将玻片置于湿盒中，42℃温孵箱中过夜杂交。

上文中，所述湿盒通过将浸湿的纸巾置于密封容器中制备。

二.玻片洗涤

注意：杂交后洗涤包括一系列不同浓度、不同温度的盐溶液的漂洗，由于有非特异性的探针片段的结合会增强背景，需要通过杂交后洗涤降低背景。杂交后洗涤有快洗和慢洗两种方案可选，前者用时大约50分钟，后者约5分钟。

1、慢速洗涤方案：

(1)试剂：

50％甲酰胺/2×SSC(3瓶)、2×SSC、0.1％NP-40/2×SSC，70％乙醇。

(2)洗涤程序：

注意：使用前将除70％乙醇外的溶液置于46±1℃水浴箱中至少30分钟，使溶液达到所需温度。

移去盖玻片，立即将玻片置于3瓶50％甲酰胺/2×SSC溶液中各漂洗10分钟，振荡1～3秒；

将玻片置于2×SSC中，漂洗10分钟，振荡1～3秒；

将玻片置于0.1％NP-40/2×SSC中，漂洗5分钟，振荡1～3秒；

将玻片室温浸泡在70％乙醇中，漂洗3分钟。

2、快速洗涤方案：

(1)试剂：

0.3％NP-40/0.4×SSC，0.1％NP-40/2×SSC，70％乙醇。

(2)洗涤程序：

注意：使用前将0.3％NP-40/2×SSC置于67℃左右的水浴箱中至少30分钟，使溶液达到所需温度。

移去盖玻片，将玻片置于0.3％NP-40/0.4×SSC溶液中，振荡1～3秒，漂洗2分钟；

室温下将玻片置于0.1％NP-40/2×SSC洗涤液中，振荡1～3秒，漂洗30秒；

室温下将玻片置于70％乙醇中，漂洗3分钟。

三.复染

(1)暗处自然干燥玻片；

(2)将15μl DAPI复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置10～20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察玻片。

完成杂交的玻片可用中性树胶封片后置于-20℃避光储存。

四.实验结果

结果如附图4～6所示。

按照发明内容部分所述的方法进行结果的判读，其中所建立的阈值为2％。

以附图5为例，在确定出现ERG基因与TMPRSS2基因融合的信号结果前提下，将数出的异常信号比例为80％，大于阈值，说明该样本为阳性，发生了TMPRSS2基因与ERG基因的融合。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (6)

1.用于检测前列腺癌的检测剂，所述检测剂为选自如下的三个探针组中的至少一个：

1)GLP TMPRSS2/ETV1探针组

包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、以及第六探针，其中

第一探针、第二探针、和第三探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且第一探针、第二探针、和第三探针分别以选自BAC cloneRP11-814F13、RP11-635F7、以及CTD-2337B13的插入片段作为探针制备的模板，

第四探针、第五探针、和第六探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且第四探针、第五探针、和第六探针分别以选自BAC cloneRP11-79G16、RP4-685A2、RP11-313C20的插入片段作为探针制备的模板，

所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同；

2)GLP ERG探针组

包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针，其中

第一探针、第二探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且第一探针、第二探针分别选自以BAC clone RP11-476D17、CTD-2341O18的插入片段作为探针制备的模板，

第三探针、第四探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且第三探针、第四探针分别选自以BAC clone RP11-95I21、RP11-259A4的插入片段作为探针制备的模板，

所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同；和

3)GLP TMPRSS2/ETV4探针组

包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、第六探针以及第七探针，其中

第一探针、第二探针、第三探针、和第四探针都是带有第一荧光标记的核酸序列，并且第一探针、第二探针、第三探针、第四探选自以BAC clone RP11-671L10、AL773578、CTD-2337B13以及CTD-3095D11的插入片段作为探针制备的模板，

第五探针、第六探针、和第七探针都是带有第二荧光标记的核酸序列，并且第五探针、第六探针、和第七探针分别选自以BAC cloneCTD-2326M16、CTD-3215I16、CTC-420I11的插入片段作为探针制备的模板，

所述第一荧光标记与所述第二荧光标记不相同。

2.根据权利要求1所述的检测剂，其中，采用随机引物法或切口平移法进行荧光标记。

3.根据权利要求1所述的检测剂，其中，所述三个探针组中的第一荧光标记都是四甲基罗丹明，第二荧光标记都是异硫氰酸。

4.用于检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括溶解在TEBuffer中的权利要求1-3中任一项所述的检测剂，并且所述检测剂中的探针组的浓度为50～300ng/μl。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其还包括GLP杂交缓冲液。

6.权利要求1-3中任一项所述的检测剂、或者权利要求4至5中任一项所述的试剂盒在制备检测TMPRSS2基因与ETS家族基因融合的药物中的用途。

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