CN102517382A

CN102517382A - 一种人染色体p16基因检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN102517382A
Application number: CN2011103827224A
Authority: CN
Inventors: 李明; 何瑰; 陈娟
Original assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Current assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2012-06-27

Abstract

本发明涉及一种人染色体P16基因检测试剂盒。具体地，所述检测试剂盒包括用于P16基因检测的探针和杂交缓冲液。应用本发明的人染色体P16基因检测试剂盒可以对人染色体P16基因异常进行准确、快速的检测。

Description

一种人染色体P16基因检测试剂盒及应用

技术领域

背景技术

P16基因又叫MTS1(multiple tumor suppressor 1，也称多肿瘤抑制基因)或CDKN2A基因，1994年被鉴定，定位于人染色体9p21.3，所编码的产物为一种细胞蛋白依赖性激酶(CDKS)抑制蛋白，它通过p16 INK4αcyclin D1-PRb通路维持机体细胞的有序增殖，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂。P16基因纯合子的缺失往往导致细胞的恶性转化，

在人类约50％肿瘤细胞株中发现P16纯合子缺失、突变异常，提示P16基因可能是9p21区域的候补肿瘤抑制基因，它与肿瘤的发生有着十分密切的关系。P16基因已经在肺癌、乳腺癌、宫颈癌、食管癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、淋巴瘤和黑色素瘤中发现纯合子缺失、蛋白过表达以及无义，错义及移码突变[Kaye FJ.RB and cyclin dependentkinase pathways：defining a distinction between RB and p16 loss in lung cancer[J].Oncogene，2002，21(45)：6908-6914.][Bazan V，ZannaI，Migliavacca M，et al.Prognosticsignificance of p16INK4a alterations and 9p21 loss of heterozygosity in locallyadvanced laryngeal squamous cell carcinoma[J].J Cell Physiol，2002，192(3)：286-293.][Yoshida S，Todoroki T，Ichikawa Y，et al.Mutations ofp16Ink4/CDKN2and p15Ink4B/MTS2 genes in biliary tract cancers[J].Cancer Res，1995，55(13)：2756-2760.][Calero Moreno TM，Gustafsson G，Garwicz S，et al.Deletionof the Ink4-locus(the p16ink4a，p14ARF and p15ink4b genes)predicts relapse inchi ldren with ALL treated according to the Nordic protocols NOPHO 86 and NOPHO 92[J].Leukemia，2002，16(10)：20372045.]，表明P16基因以缺失、扩增、突变等方式广泛参与肿瘤形成，检测P16基因状态有无改变对判断患者肿瘤的易感性、进行高危病例筛选以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。

染色体核型分析可以进行染色体异常分析，目前广泛应用于培养细胞中染色体及基因异常检测。但核型分析需要对细胞进行培养、制备高质量的中期染色体。其检测结果常受培养失败，染色体形态不佳等因素影响。

免疫组化方法利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量研究。目前主要用于组织标本和细胞标本的检测。该方法常用于蛋白表达水平的检测，但该方法易受检测者的主观影响，结果偏差大。

荧光原位杂交方法利用碱基互补原理，通过分子杂交对已知基因或序列的染色体进行定位及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。荧光原位杂交技术因其操作简单，重复性好、灵敏度特异性高、检测时间相对较短、检测靶区域范围广，可同时用于间期和中期细胞检测而被广泛应用于基因异常的检测。

检索后发现，针对检测样本的差异，临床使用方法也存在较大区别。例如，在血液病中P16基因的检测常使用核型分析或/和荧光原位杂交方法；针对实体肿瘤，如宫颈癌、食管癌等中蛋白表达水平检测常使用免疫组化方法；针对脱落细胞，如膀胱癌的检测中常使用荧光原位杂交方法。

用于P16基因检测的商品化荧光原位杂交探针种类少，通过比较部分商品化探针发现，探针长度从100Kb～400Kb不等。众所周知，探针长度会直接影响杂交信号强度，但同样的，探针过长也会造成高背景，影响检测结果的准确性。

克服现有技术的不足，本发明人通过设计、筛选并制备相应区段基因探针，结合大量试验验证，最终完成了本发明检测试剂盒。本发明通过筛选得到包含P16基因的克隆，经荧光物质标记得到双链DNA核酸探针，再与临床样本杂交，在显微镜下直接观察患者P16基因状态。该检测试剂具有快速、无创、敏感度高和特异性强等优点，无需进行细胞培养，就能够在中期和间期细胞中检测人染色体P16基因的异常。

由于本发明提供了人染色体P16基因检测试剂盒的制备方法，具体的说，包括人染色体P16基因探针的筛选和制备方法，以及包括用于杂交体系配制的杂交缓冲液配方，对摆脱对进口试剂的依赖，填补国内该检测领域的空白具有十分重大的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种人染色体P16基因检测的试剂盒，所述检测试剂包括人染色体P16基因探针、内对照CSP9探针及检测试剂盒。

根据本发明一个优选的实施方案人染色体P16基因探针包括探针组：GSP P16。

GSP P16包括第一探针、第二探针、第三探针和第四探针，其中

第一探针核酸序列为P16基因(CDKN2A)5’末端以外的168kb～186kb的核酸序列；第二探针和第三探针核酸序列合起来包含P16基因及周边200kb的核酸序列；第四探针核酸序列为P16基因(CDKN2A)3’末端以外的149kb～152kb的核酸序列。所述4个探针均位于9p21区段。

在本发明的一个实施方案中，所述4个探针合起来的核酸序列长度为517kb。探针购买于Invitrogen RP11BAC克隆库。探针为RP11-70L8(其插入片段起止位置：chr9：21742609-21911258，末端序列登记号：AQ238486和AQ238487)、RP11-149I2(其插入片段起止位置：chr9：21909259-22010413，Genebank登记号：AL449423.14)、RP11-478M20(其插入片段起止位置：chr9：21947304-22110179，末端序列登记号：AQ635040和AQ635041)、RP11-248B1(其插入片段起止位置：chr9：22110297-22259612，末端序列登记号：AQ478441和AQ478442)所包含的插入片段。

在本发明的另一个实施方案中，所述4个探针合起来的核酸序列长度为632kb。探针购买于Invitrogen RP11及CTD BAC克隆库。探针为RP11-1095L22(其插入片段起止位置：chr9：21630655-21816582，末端序列登记号：AQ697252和AQ682531)、CTD-2379A22(其插入片段起止位置：chr9：21810051-21958551，末端序列登记号：AQ109483和AQ109485)、RP11-478M20(其插入片段起止位置：chr9：21947304-22110179，末端序列登记号：AQ635040和AQ635041)、RP11-134B17(其插入片段起止位置：chr9：22110302-22262745，末端序列登记号：AQ387607和AQ3876078)所包含的插入片段。

这两个优选实施方案中，筛选得到的克隆所包含的插入片段所覆盖的范围均超出现有产品，经过检测后发现，使用该长度荧光探针进行杂交检测，在荧光显微镜下的荧光信号明亮，未发现非特异信号或背景干扰情况，且更有利于检测结果判断。

根据本发明一个优选的实施方案，内对照CSP9探针包含人9号染色体9p11-q11区域的重复片段。该探针制备可以利用PCR方法扩增该重复区域制备包含重复序列的片段。

根据本发明一个优选的实施方案，制备CSP9探针可以使用的引物对：上游引物：ACTGATGCCACTTTTCACCCTTA和下游引物GGGGAGATGTTTTCTCTCAGGAT，扩增产物长度为287bps。

在本发明的另一个实施方案中，制备CSP9探针可以使用的引物对：上游引物：GAAATAAGGGCACCTACCCCATA和下游引物CTACACCTTGGCTCCTTTTAGCA，扩增产物长度为336bps。

根据本发明一个优选的实施方案，P16基因探针制备步骤中克隆质粒DNA提取可使用市售的质粒提取试剂盒，包括但不限于，如Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。

根据本发明一个优选的实施方案，CSP9探针制备步骤中PCR扩增、TA克隆、克隆质粒DNA提取均可使用市售的试剂盒或参照《分子克隆实验指南》进行。

根据本发明一个优选的实施方案，探针制备步骤中克隆质粒DNA的定量是将质粒DNA稀释后分别测定260nm和280nm下的吸光度，计算产物浓度。

根据本发明一个优选的实施方案，GSP P16探针和CSP9标记可以采用现有技术中的方法将相应荧光素标记至双链核酸上。所述方法包括但不限于：随机引物法、切口平移等。可以使用市售的缺口平移标记试剂盒和/或随机引物标记试剂盒，优选abbott和/或Roche公司的NickTranslation Kit。

根据本发明一个优选的实施方案，P16基因探针和CSP9标记的荧光素可以选择本领域已知的荧光染料，如：Alexa

488、Alexa

555、pacific

FITC、DEAC、Rhodamine等。CSP9优选异硫氰酸(fluorescein isothiocyanate，FITC，绿色)进行标记，P16基因探针优选罗丹明(Rhodamine，红色)进行标记。

根据本发明一个优选的实施方案，对于GSP P16探针组，当带有罗丹明标记时，在正常情况下，荧光显微镜下应该显示2个红色信号；而对于CSP9探针，当带有异硫氰酸标记时，在正常情况下显示2个绿色信号(2R；2G)。当出现P16基因纯合缺失时，荧光显微镜下不显示红色信号，仅见绿色信号(0R；2G)。当P16基因出现扩增时，荧光显微镜下显示多个红色信号(＞2R；2G)。

本发明的另一个目的是提供一种P16基因检测试剂盒。

为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：

(1)样本处理和制片：按照原位杂交方法对各类型样本进行处理。

(2)杂交：配制杂交液，主要包括标记探针和杂交缓冲液。合适温度下进行8～16小时的杂交，然后以合适的洗液洗去未结合上的和非特异结合的探针；DAPI复染剂复染。

(3)通过荧光显微镜相应滤块观察荧光信号，观察P16基因是否缺失或扩增。

基于以上技术方案发明的试剂盒包括：1)杂交液、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

根据本发明的一个优选实施方案，由杂交缓冲液、荧光标记的P16基因探针和H₂O配制成杂交液，其中每人份杂交液中使用P16基因探针的量为1.5ul～3ul，杂交缓冲液为7ul，用H₂O补至10ul。

根据本发明的一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50％～70％，硫酸葡聚糖浓度为0.1g/ml。

根据本发明的一个优选实施方案，其中DAPI复染剂配制方法为50～250ng DAPI溶于1ml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS，甘油混合液)。

利用本发明的试剂盒，依照常规的荧光原位杂交方法对人的中期和间期细胞进行P16基因检测。

本发明与现有技术相比，具有下列优点：

(1)通过筛选制备包含P16基因的探针组，可以对人P16基因进行准确、快速的检测、且

结果重复性好；内控CSP9探针可以用于杂交情况监控；

(2)无需进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，可用于中期或间期细胞P16基因计数，操作相对简单；

(3)与现有商品化试剂比较，探针长度更长，检测信号更明亮；

(4)通过制备成试剂盒，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学、产前诊断等领域的应用，了解P16基因与肿瘤发生等的联系。

附图说明

图1显示GSP P16探针组位点和CSP9探针位点模式图。

图2显示人类正常分裂中期淋巴细胞P16基因的检测结果。

图3显示膀胱癌尿脱落细胞中P16基因的检测结果。

图4显示宫颈癌组织福尔马林固定石蜡包埋组织切片中P16基因的检测结果。

图5显示急性淋巴细胞白血病中P16基因的检测结果。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：人P16基因探针的制备方法

(1)克隆筛选：P16基因位于人染色体9p21区段，挑选包含有该基因的克隆组合。以RP11-149I2为例。探针组位点模式图参见图1。

(2)克隆培养和鉴定：购买相应克隆Invitrogen RPCI11.C，取50ul添加到500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养24～48小时；菌液使用STS引物对进行克隆鉴定。STS引物对：上游引物5’-ATCCAACATGCCATAGCTCC-3’和下游引物5’-TTTGTCCCATGTCACTGGAA-3’，PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×40循环；72℃10分钟。扩增产物进行电泳验证，结果184bp左右具有明亮的条带。

(3)P16基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/ul)＝OD260×50(ng/ul)计算质粒DNA浓度。采用高压灭菌的超纯水稀释为100ng/ul，采用1.5ml的离心管分装，-20℃密封保存。

通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为FITC-12-dUTP。采用abbott的Nick Translation Kit，按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。

配完后震荡混匀，在16℃标记12小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。取5ul使用2％琼脂糖凝胶做电泳，要求在100-500bp之间存在弥散的带。

对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制：

混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用5ul Human Cot-1DNA(1ug/ul)溶解沉淀，获得P16基因探针，避光、-20℃储存。

(4)P16基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别的染色体或是细胞核。

实施例2：CSP9(内控)探针的制备方法

为了保证杂交效果，避免出现假阳性情况，人P16基因检测试剂盒中包括了CSP9探针。探针组位点模式图参见图1。

(1)引物设计和合成

人9号染色体重复区域PCR扩增引物设计和验证，引物对分别为，F：

5’-GAAATAAGGGCACCTACCCCATA-3’和R：5’-CTACACCTTGGCTCCTTTTAGCA-3’，由中山大学达安基因股份有限公司合成。配制反应体系：

总体积为50ul。使用ABI9700PCR仪或类似反应仪器，设置循环参数为：95℃5分钟；(94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒)×5循环(94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒)×30循环；72℃10分钟。

反应结束后，取5ul产物2％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果在330bp处具有明亮的条带。

(2)克隆质粒制备

将纯化后的目的产物与载体pMD18-T连接，制备出包含目的片段的克隆质粒pMD18-T-C9。

(3)CSP9探针制备

按照《分子克隆实验指南》所述经典方法，加有氨苄青霉素的LB培养基中添加克隆质粒pMD18-T-C9的大肠杆菌菌种，37℃摇床中摇菌过夜；使用TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver.2.0或类似试剂盒，按照说明书要求的操作方法进行质粒DNA提取。计算OD260/OD280，要求结果在在1.6～2.2之间，计算质粒DNA浓度。

(4)依照实施例1中探针标记方法标记CSP9探针。

(5)探针验证

使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证，包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别的染色体或是细胞核。

实施例3：P16基因检测试剂盒制备

以10人份/盒为例。

(1)杂交液配制

取少量P16基因探针稀释成50ng/ul，按下表配制杂交液：

(2)DAPI复染剂配制

抗褪色液：全程操作必须避光，10mg的对苯二胺溶于1ml的PBS中，加入9ml甘油，反复震荡混匀，调节pH为9.0，-20℃储存。终溶液应该为无色或者略带淡黄色，假如呈现黄色或者橙色则需废弃并重新配制。

用去离子水配制1mg/ml DAPI储存液。

取2.5ul的DAPI溶液(1mg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混匀，-20℃避光密闭保存。

(3)成品组装

组分名称	规格	数量
			杂交液(含P16基因探针和CSP9)	100ul/管	1管
DAPI复染剂	100ul/管	1管
			说明书		1份

实施例4：P16基因检测试剂盒的使用方法

以人类正常分裂中期淋巴细胞为例。

(1)人外周血培养及染色体制备

采血：用肝素润湿注射针筒(0.2ml)后，常规取静脉血1～2ml，转动针筒混匀肝素。接种(在超净工作台中无菌操作)：在每个培养瓶中(含20％血清的1640培养液5ml，pH7.2)，加入全血0.25～0.30ml(7号针头13～15滴)、PHA 5mg，盖紧胶塞，轻轻摇匀。培养：将培养瓶放在37℃恒温培养箱内培养72h。终止培养前2～4h，加入0.01％秋水仙素溶液(100μg/ml)1～2滴(7号针头)，使终浓度为0.2μg/ml培养液。轻轻摇匀后，放回培养箱继续培养2～4h。收获：将培养后的血细胞收集在离心管中，平衡后1000r/min离心8min，弃去上清。

(2)样品处理

低渗：向离心管中加入37℃0.075mol/L KCl溶液至8ml，用吸管轻轻吹打混匀细胞，置于37℃水浴箱温育15min。预固定：向离心管中滴加新配制的甲醇-冰醋酸固定液1～2ml，用吸管轻轻吹打混匀后1000r/min离心8min，弃去上清。固定：加入新配制的固定液至8ml，室温静置30min。3000r/min离心8min，弃去上清。可再重复固定1次。制片：根据沉淀细胞的多少，加入适量新鲜固定液(0.5～1ml)，轻轻吹打制成细胞悬液。用滴管吸取少量细胞悬液，滴至载玻片上，镜检。

(3)制片

取干净载玻片，重悬细胞后分别取3ul，10ul和30ul悬液滴加到载玻片上的不同位置，注意不要重叠；室温下晾干；用20×物镜在相差显微镜下观察三个区域的细胞密度，记录细胞没有明显重叠，且数量在100～200个以上所加的细胞悬液量；如果细胞密度及数目合适，另取一张干净的载玻片，滴加适量的细胞悬液；如果滴加30ul悬液的区域仍然细胞数目太少，另取30ul悬液重复滴到该区域，晾干，观察；如果滴加3ul悬液的区域仍然细胞数目太多，用新鲜固定液稀释细胞悬液，重复步骤滴片观察。

(4)玻片乙醇老化

将热台加热到95度；取出盖玻片，擦干备用；一块折叠为方形的4～8层纱布，浸透无水乙醇；在载玻片的杂交区域上各滴加160ul的无水乙醇；轻轻盖上24×24mm的盖玻片，轻压紧；将载玻片置于95℃预热的热台上，盖上浸透了无水乙醇的纱布(完全覆盖载玻片)，再盖上事先准备好的方形盖子(完全覆盖载玻片)，计时2分钟；从热台上去除盖子、纱布，取下载玻片，轻轻去除盖玻片，继续预处理步骤。

(5)玻片预处理

玻片放入37±1℃的1×PBS中孵育5分钟，胃蛋白酶溶液中消化15分钟；1×PBS室温洗涤3分钟；1％多聚甲醛/PBS室温固定10分钟；1×PBS室温洗涤3分钟；70％、85％、100％梯度乙醇脱水各3分钟；室温晾干玻片；继续杂交过程。

(6)样品和探针同时变性

从试剂盒中取出杂交液，震荡混匀，瞬时离心；加8ul的杂交液到杂交区域，迅速盖上盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡；橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；78±1℃的热台上变性2分钟30秒；将玻片放入预热的杂交盒中，避光，37±1℃孵育过夜(约16小时)；继续杂交后洗涤步骤。

(7)杂交后洗涤及复染

一般洗涤方法(推荐使用)：取出孵育过夜的杂交盒，小心去除橡皮胶水和盖玻片；将玻片放入37±1℃的50％甲酰胺/2×SSC洗涤15分钟；再将其放入2×SSC的染色缸中，37±1℃洗涤15分钟；再将其放入盛有0.1％NP40/2×SSC的染色缸中，37±1℃洗涤5分钟；室温70％、85％、100％梯度乙醇依次脱水各3分钟；暗处晾干。

快洗方法：取出孵育过夜的杂交盒，小心去除橡皮胶水和盖玻片；将玻片放入73±1℃的0.3％NP40/0.4×SSC中，洗涤2分钟；再将其放入0.1％NP40/2×SSC中，室温洗涤2分钟；室温70％、85％、100％梯度乙醇依次脱水各3分钟；暗处晾干。

复染：滴加10ul DAPI到载玻片目标区域，盖上盖玻片，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。

(8)结果分析

在Olympus BX51荧光显微镜下，用配套的滤镜组分别观察DAPI复染的分裂相和杂交的荧光信号，用CCD照相记录。在40×物镜下寻找，在100×物镜下计数；调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点因位于细胞内；当细胞外存在荧光信号点时，要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；调整焦距，在核的不同层次找到信号点；记录观察每个细胞中的P16基因数目。

(9)结果判定

按处理方法要求进行操作，记录P16基因数目(参见附图2)。荧光原位杂交结果显示，中期染色体上可见两个红色信号点(P16基因)，两个绿色信号点(9号染色体着丝粒区)，未见其它荧光信号；间期细胞核中仅见两个红色信号和两个绿色点，未见其它荧光信号。检测结果图见图2。

实施例4：P16基因检测试剂盒在膀胱癌尿脱落细胞检测中的应用

(1)样品处理

细胞富集：100ml尿液离心力1500×g离心15～20分钟。洗涤：加入1ml 1×PBS，吹打混匀，使终体积为10ml，1500×g室温离心10分钟；弃上清。低渗：1ml低渗液(0.075mol/LKCl)沿管壁加入，吹打混匀，稍静置加入低渗液使终体积为10ml，37±1oC静置15～20min。固定：加入2ml新鲜配制的固定液(3∶1的甲醇∶冰醋酸)，室温静置(预固定)10min；1500×g离心5分钟，弃上清，加入5ml新鲜固定液，用力吹打2分钟，将团状沉淀吹散至无明显块状物。冰箱中静置至少30分钟；1500×g离心5分钟，去上清。制片：根据沉淀细胞的多少，加入适量新鲜固定液(0.5～1ml)，轻轻吹打制成细胞悬液。用滴管吸取少量细胞悬液，滴至载玻片上，镜检。

(2)制片/老化/预处理/变性/杂交/洗涤及复染

同实施例1。

(3)结果分析

(4)结果判定

按处理方法要求进行操作，记录P16基因数目(参见附图3)。荧光原位杂交结果显示，在细胞核中仅见两个绿色信号点，未见红色荧光信号。提示P16基因缺失。检测结果图见图3。

实施例5：P16基因检测试剂盒在宫颈癌组织检测中的应用

(1)样品处理

预处理：65±5℃恒温箱中烤片过夜；二甲苯中室温脱蜡30分钟；无水乙醇中室温10分钟，去除残留二甲苯；100％、90％、70％梯度乙醇室温脱水各3分钟；灭菌纯化水中室温洗涤3分钟；灭菌纯化水中100±5℃煮片20分钟；37±1℃预热的蛋白酶K反应液中消化8分钟；2×SSC中室温洗涤5分钟；依次放入70％，90％，100％梯度乙醇室温脱水各3分钟；

(2)变性/杂交/洗涤及复染

同实施例1。

(3)结果分析

(4)结果判定

按处理方法要求进行操作，记录P16基因数目(参见附图4)。荧光原位杂交结果显示，在细胞核中仅见两个绿色信号点，见多个红色荧光信号。提示P16基因扩增。检测结果见图4。

实施例6：P16基因检测试剂盒在急性淋巴细胞白血病检测中的应用

(1)样品处理

细胞富集：取外周血或骨髓2～3ml(肝素钠抗凝)2000rpm离心5min，去上清；低渗：1ml细胞加入10ml的0.075M KCl，吹打混匀，静置3min；37±1℃水浴箱低渗30min；固定：加固定液1ml，混匀，预固定10min；混匀，2000rpm离心5min，去上清，加固定液5ml，混匀，室温静置10min；2000rpm离心5min，去上清；制片：根据沉淀细胞的多少，加入适量新鲜固定液(0.5～1ml)，轻轻吹打制成细胞悬液。用滴管吸取少量细胞悬液，滴至载玻片上，镜检。

(2)制片/老化/预处理/变性/杂交/洗涤及复染

同实施例1。

(3)结果分析

(4)结果判定

按处理方法要求进行操作，记录P16基因数目(参见附图5)。荧光原位杂交结果显示，在细胞核中见两个绿色信号点，两个红色荧光信号。提示P16基因未缺失。检测结果见图5。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种P16基因探针检测试剂盒，包括：1)杂交液、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中杂交液由杂交缓冲液、荧光标记的P16基因探针和H₂O配制而成。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于每人份杂交液中使用P16基因探针的量为1.5ul～3ul，杂交缓冲液为7ul，交缓冲液中去离子甲酰胺浓度为50％～70％。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征还在于所述检测剂包括以下探针：

(1)GSP P16探针组

包括第一探针、第二探针、第三探针和第四探针，其中，第一探针核酸序列为P16基因

(CDKN2A)5’末端以外的168kb～186kb的核酸序列；第二探针和第三探针核酸序列合起来包含P16基因及周边200kb的核酸序列；第四探针核酸序列为P16基因(CDKN2A)3’末端以外的149kb～152kb的核酸序列；所述4个探针均位于9p21区段；

(2)CSP 9探针

包括人9号染色体9p11-q11区域的重复片段，该探针制备可以利用PCR方法扩增该重复区域制备包含重复序列的片段；

所述两个探针选择不同的荧光标记。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征还在于所述GSP P16探针以包含P16基因及周边核酸序列的克隆插入片段作为探针制备模板，采用随机引物或切口平移法进行荧光标记。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征还在于GSP P16探针可以选自如下两个克隆组合中的任何一组或某组中的任何一个包含P16基因的克隆：

(1)RP11-70L8、RP11-149I2、RP11-478M20、RP11-248B1；

(2)RP11-1095L22、CTD-2379A22、RP11-478M20、RP11-134B17。

6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征还在于CSP 9探针可以选用如下两个引物对中的任何一组进行扩增：

(1)上游引物：5’-ACTGATGCCACTTTTCACCCTTA-3’和下游引物5’-GGGGAGATGTTTTCTCTCAGGAT-3’，扩增产物长度为287bps；

(2)上游引物：5’-GAAATAAGGGCACCTACCCCATA和下游引物5’-CTACACCTTGGCTCCTTTTAGCA-3’，扩增产物长度为336bps。

7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所述试剂盒在检测实体肿瘤(宫颈癌、膀胱癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、皮肤癌、肾癌、卵巢癌等)和血液病(淋巴瘤、白血病等)中的用途。

8.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所检测样本为组织样本或细胞样本。