CN112538530A - 一种膀胱癌检测试剂盒 - Google Patents
一种膀胱癌检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112538530A CN112538530A CN202011432111.1A CN202011432111A CN112538530A CN 112538530 A CN112538530 A CN 112538530A CN 202011432111 A CN202011432111 A CN 202011432111A CN 112538530 A CN112538530 A CN 112538530A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- probe
- seq
- chromosome
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 178
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 59
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 57
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 57
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 395
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 108
- 108700042657 p16 Genes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 68
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 59
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 31
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 30
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 claims description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 claims description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 6
- 101150016096 17 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 5
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 208000035802 chromosome 17 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 3
- 101150111197 76 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150005355 36 gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 53
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 description 36
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 16
- 102100037633 Centrin-3 Human genes 0.000 description 15
- 101000880522 Homo sapiens Centrin-3 Proteins 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 4
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 206010067477 Cytogenetic abnormality Diseases 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 208000006750 hematuria Diseases 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012118 Alexa Fluor 750 Substances 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical group [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100384865 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cot-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000071 abnormal chromosome number Toxicity 0.000 description 1
- 230000006578 abscission Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000002574 cystoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003583 cytomorphological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种膀胱癌检测试剂盒,其包含针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针中的至少一种;所述针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针分别包括A探针、B1探针、B2探针、C探针、D探针和E探针;其中,所述A探针从5’端到3’端的碱基组成为:P1序列、M1、特异性P2序列、M1、P1序列;所述B1探针为P3序列;所述B2探针为P4序列;所述C探针从5’端到3’端的碱基组成为:P5序列、M2、P6序列;所述D探针为P7序列;所述E探针从5’端到3’端的碱基组成为:5’端修饰有荧光基团的P8序列、3’端修饰有可猝灭荧光基团的结构。所述膀胱癌检测试剂盒具有杂交时间短、灵敏度高、特异性强、准确率高和操作步骤简单等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及一种膀胱癌检测试剂盒。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,其中尿路上皮癌约占膀胱癌的90%,75%初诊患者为非浸润性膀胱癌。膀胱癌的术后复发率高达50%~70%,10%~15%复发性非浸润性膀胱癌会进展为浸润性癌或转移性癌(Kaufman D S et al.,Lancet,2009,374:239-249)。因此,膀胱癌早期诊断及预防肿瘤复发至关重要。目前,膀胱镜检查及细胞学形态检查是膀胱癌临床诊断普遍使用的两种手段。但是,膀胱镜属于侵入性检查,会给患者带来一定的痛苦,且不易发现早期肿瘤病变;尿脱落细胞学形态检查虽特异性高但灵敏度低。因此,如何无创的、准确的对膀胱癌做出早期诊断和复发预测,是当前迫切需要解决的问题。
研究表明,在膀胱癌的发生发展过程中,染色体或其片段发生了某些非随机性改变,染色体畸变是膀胱癌发生发展的根本原因,对膀胱癌细胞中的染色体异常进行检测,可以为膀胱癌的临床诊断与治疗提供有价值的依据(Baffa R et al.,Journal ofExperimental&Clinical Cancer Research Cr,2006,25:145-60)。膀胱癌细胞中染色体异常的FISH检测,尤其是3、7、17号染色体数目的异常及p16基因缺失(该基因定位于染色体9p21)的FISH检测,在膀胱癌早期诊断与复发监测的应用中成为近年来研究的热点。膀胱癌的发生发展与3、7、17号染色体数目的异常及p16基因缺失有着重要关联。针对膀胱癌的FISH研究显示,3、7、17号染色体多倍体发生率为27%~76%,13%~76%、12%~47%,p16基因(染色体9p21)缺失率为28%~83%(Veeramachaneni R et al.,DiagnosticCytopathology,2010,28:301-307)。在2001年,美国食品和药物管理局(FDA)批准一种检测尿液中脱落细胞染色体3、7、17号数目和染色体9p21缺失情况的FISH诊断试剂盒——FISH膀胱癌诊断试剂盒,用于膀胱癌患者术后复查的监测,随后,在2005年又批准其用于在无膀胱癌病史的肉眼或镜下血尿患者中诊断膀胱癌。
文献报道,3、7、17号染色体数目的异常及9p21缺失的FISH检测在尿路上皮癌诊断方面的总体诊断性能尤其是灵敏度要优于尿脱落细胞学形态检查(Hajdinjak T.UrologicOncology-seminars and Original Investigations,2008,26:646-651)。3、7、17号染色体数目的异常及9p21缺失的FISH检测联合尿脱落细胞学形态检查可通过早期诊断膀胱癌从而降低膀胱癌发病率和死亡率(Veeramachaneni R et al.,Diagnostic Cytopathology,2010,28:301-307)。即上述基因异常的FISH检测在膀胱癌早期诊断、预后评估及复发监测中具有重要临床应用价值,已成为膀胱癌早期诊断及术后复发监测的无创的有效手段。
FISH是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。其检测效果依赖于制备的探针的质量,而通过细菌人工染色体(BAC)等制备的荧光原位杂交探针因存在很多重复序列导致非特异荧光信号的产生,在一定程度上降低了FISH检测的特异性。并且,现有的FISH检测过程耗费时间长,杂交时间基本都需要十多个小时,导致FISH检测的时间成本高。因此,有必要进一步提升FISH检测探针的特异性,并在保证FISH检测效果的前提下,简化FISH检测过程,提高杂交效率,缩短杂交时间。
发明内容
基于此,本发明的目的在于提供一种操作步骤简单、杂交时间短、准确率高的膀胱癌检测试剂盒,其通过检测尿脱落细胞中3、7、17号染色体非整倍性及染色体9p21上p16基因的缺失等异常情况,提供临床相关辅助信息,适用于快速对膀胱癌进行早期筛查和复发监测。
实现上述目的的技术方案如下。
一种膀胱癌检测试剂盒,包含针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针中的至少一种;所述针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针分别包括A探针、B1探针、B2探针、C探针、D探针和E探针;其中,
所述A探针从5’端到3’端的碱基组成依次为:P1序列、M1、特异性P2序列、M1、P1序列;所述特异性P2序列为能与待检染色体或基因片段互补结合,且长度为40~60bp的序列;所述P1序列为长度为20~30bp,不存在发夹结构,序列内部和序列间不形成二聚体、不存在错配,与特异性P2序列、待检染色体或基因片段之间均不存在特异性结合的序列;所述M1为长度为2~6bp的接头序列;
所述B1探针为长度为16~26bp、能与M1和P1序列从3’端到5’端碱基互补配对的P3序列;
所述B2探针为长度为16~26bp、能与M1和P1序列从5’端到3’端碱基互补配对的P4序列;
所述C探针从5’端到3’端的碱基组成依次为:能与P1序列互补配对的P5序列、M2、P6序列;所述M2为长度为2~6bp的接头序列;所述P6序列为长度为20~30bp,不存在发夹结构,序列内部和序列间不形成二聚体、不存在错配,与P1序列、P3序列、P4序列、特异性P2序列、待检染色体或基因片段之间均不存在特异性结合的序列;
所述D探针为能与P6序列从5’端到3’端的14~20个碱基、M2的碱基以及P5序列从3’端到5’端的14~20个碱基互补的P7序列;
所述E探针从5’端到3’端的碱基组成依次为:能与P6序列互补的P8序列、茎部结构序列;所述P8序列的5’端修饰有荧光基团;所述茎部结构序列可与P8序列5’端的6~10个碱基互补形成茎环结构,且茎部结构序列的3’端修饰有可猝灭荧光基团的结构。
在其中一些实施例中,所述M1为TATA或ACAC。
在其中一些实施例中,所述M2为CACA或TCTC。
在其中一些实施例中,所述荧光基团选自:FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750。
在其中一些实施例中,所述A探针的P1序列、B1探针的P3序列、B2探针的P4序列、C探针的P5和P6序列、D探针的P7序列和E探针的P8序列中对部分碱基进行甲基化修饰。
在其中一些实施例中,所述甲基化的碱基为甲基化的C和/或甲基化的G。
在其中一些实施例中,所述甲基化修饰的碱基的数目为2~6个,其分散分布于所述序列中,可以有效地减少非特异性杂交,提高检测的特异性。
在其中一些实施例中,所述针对3号染色体的检测探针中,A探针的特异性P2序列为SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.10,P1序列为SEQ ID NO.41,M1为TATA;B1探针的P3序列为SEQID NO.45;B2探针的P4序列为SEQ ID NO.49;C探针的P5序列为SEQ ID NO.53,M2为CACA,P6序列为SEQ ID NO.57;D探针的P7序列为SEQ ID NO.61;E探针的P8序列为SEQ ID NO.65,茎部结构序列为SEQ ID NO.69;和/或,
所述针对7号染色体的探针中,A探针的特异性P2序列为SEQ ID NO.11~SEQ IDNO.20,P1序列为SEQ ID NO.42,M1为ACAC;B1探针的P3序列为SEQ ID NO.46;B2探针的P4序列为SEQ ID NO.50;C探针的P5序列为SEQ ID NO.54,M2为TCTC,P6序列为SEQ ID NO.58;D探针的P7序列为SEQ ID NO.62;E探针的P8序列为SEQ ID NO.66,茎部结构序列为SEQ IDNO.70;和/或,
所述针对17号染色体的探针中,A探针的特异性P2序列为SEQ ID NO.21~SEQ IDNO.30,P1序列为SEQ ID NO.43,M1为TATA;B1探针的P3序列为SEQ ID NO.47;B2探针的P4序列为SEQ ID NO.51;C探针的P5序列为SEQ ID NO.55,M2为CACA,P6序列为SEQ ID NO.59;D探针的P7序列为SEQ ID NO.63;E探针的P8序列为SEQ ID NO.67,茎部结构序列为SEQ IDNO.71;和/或,
所述针对p16基因的探针中,A探针的特异性P2序列为SEQ ID NO.31~SEQ IDNO.40,P1序列为SEQ ID NO.44,M1的序列为ACAC;B探针中,P3序列为SEQ ID NO.48;B2探针中,P4序列为SEQ ID NO.52;C探针中,P5序列为SEQ ID NO.56,M2的序列为TCTC,P6序列为SEQ ID NO.60;D探针中,P7序列为SEQ ID NO.64;E探针中,P8序列为SEQ ID NO.68,茎部结构序列为SEQ ID NO.72。
在其中一些实施例中,所述检测试剂盒包含针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针。
在其中一些实施例中,所述检测试剂盒在使用时,所述针对3号染色体和7号染色体的检测探针与同一待检测样本进行杂交;所述针对17号染色体和p16基因的检测探针与同一待检测样本进行杂交;所述针对3号染色体和7号染色体的检测探针中的E探针上修饰的荧光基团互不相同;所述针对17号染色体和p16基因的检测探针中的E探针上修饰的荧光基团互不相同。
在其中一些实施例中,所述茎部结构序列的3’端修饰有巯基并通过金-硫键组装到纳米金颗粒表面,使E探针形成基于茎环结构和纳米金颗粒的纳米荧光探针。
在其中一些实施例中,所述纳米金颗粒的粒径为13±2nm。
在其中一些实施例中,所述针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针中,A探针与B1探针的摩尔比为1:2~6;A探针与B2探针的摩尔比为1:2~6;A探针与C探针的摩尔比为1:2~5;C探针与D探针的摩尔比为1:2~6,C探针与E探针的摩尔比为1:1~4。
在其中一些实施例中,优选所述针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针中,A探针、B1探针、B2探针、C探针、D探针与E探针的摩尔比为1:2:2:2:6:4。
在其中一些实施例中,本发明所述试剂盒的结果判断标准为:每一个样本每种探针组合观察计数相同数量的细胞,统计出现不同异常情况信号点的百分比,以上述百分比的检测值对样本进行阴阳性判断:若检测值大于异常阈值,则判定为阳性结果,小于异常阈值判定为阴性结果,等于异常阈值则需增加观测样本细胞的数量;其中,所述异常阈值的建立方法为:采集正常人尿液标本,使用上述试剂盒进行FISH检测,每组探针计数相同数量的细胞,统计出不同类型异常细胞数的百分比,按照公式“异常阈值=平均值(M)+3×标准差(SD)”计算得到异常阈值。
在其中一些实施例中,3号染色体异常阈值:0个信号点(完全缺失)0%,1个信号点(部分缺失)4.3%,3个及以上信号点(扩增)5.0%,总体异常阈值6.6%;7号染色体异常阈值:0个信号点(完全缺失)0%,1个信号点(部分缺失)3.8%,3个及以上信号点(扩增)4.6%,总体异常阈值5.9%;17号染色体异常阈值:0个信号点(完全缺失)0%,1个信号点(部分缺失)4.1%,3个及以上信号点(扩增)5.8%,总体异常阈值7.1%;p16基因异常阈值:0个信号点(完全缺失)3.2%,1个信号点(部分缺失)3.5%,3个及以上信号点(扩增)5.4%,总体异常阈值6.9%。
本发明还提供了上述膀胱癌检测试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
(1)待检测样品预处理:a)收集待检测样品;b)待检测样品经亲水、烤片、脱水后,使用预处理液进行预处理;c)使用胃蛋白酶溶液进行酶消化处理;
(2)FISH检测:a)使用杂交缓冲液将上述检测探针配制成探针工作液与步骤(1)获得的预处理后的样品同时进行杂交,杂交反应条件为60℃~80℃变性1~5分钟,40℃~50℃杂交30分钟~90分钟;b)DAPI复染;
(3)复染后在显微镜下观察荧光信号。
在其中一些实施例中,所述步骤(1)中待检测样品为尿脱落细胞。
在其中一些实施例中,优选步骤(2)所述杂交反应条件为70±1℃变性5分钟,45±1℃杂交60分钟。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明试剂盒提供了检测与膀胱癌发生发展密切相关的染色体及基因异常的改良型荧光消减检测探针,所述检测探针包括由A探针、B1探针、B2探针、C探针、D探针和E探针组成的多探针体系。在杂交过程中,当存在靶核酸分子时,A探针的特异性P2序列与靶核酸互补结合,A探针两端的P1序列分别与C探针的P5序列互补结合,同时E探针由于杂交过程中茎环结构的打开,使其P8序列得以与C探针的P6序列互补结合,形成稳定的靶核酸-A-C-E探针复合体,同时荧光基团远离猝灭结构,发出荧光,使靶核酸-A-C-E探针复合体带上荧光信号,实现检测;当检测体系中存在未与靶核酸杂交结合的A探针以及未能与靶核酸形成靶核酸-A-C-E探针复合体的C探针和E探针时,A探针会优先与B1、B2探针互补结合,C探针会优先与D探针互补结合,使得A探针、C探针不能与E探针形成复合体,E探针在杂交结束后恢复茎环结构,荧光基团因与猝灭结构表面靠近而处于荧光淬灭状态。通过上述设计可以使本发明试剂盒不需要进行繁琐且不易控制的洗涤步骤就能有效去除非杂交的荧光信号,同时基于茎环结构的荧光探针设计(E探针),尤其是AuNPs纳米荧光探针的设计,不仅可提高检测荧光信号的稳定性、持久性,还可提高检测的灵敏度和特异性。
此外,本发明通过在检测探针中对特定碱基进行甲基化修饰,可有效地提高探针间相互作用的精确度,避免非特异性杂交,进一步提高杂交的特异性。
本发明通过改进各种检测探针的结构、碱基组成和长度,有效地将荧光消减探针技术、信号放大系统(C探针与E探针组成信号放大系统)与基于茎环结构和纳米金颗粒的纳米荧光探针相结合,能明显提高杂交的灵敏度、特异性,缩短杂交时间,进一步提高检测效率。同时,本发明通过优化各种检测探针之间的摩尔比,使得多探针能在同一反应体系和均一的反应条件下同时完成杂交反应,从而使本发明试剂盒形成一个高效、稳定、完好的检测系统。
此外,本发明还优化了所述试剂盒的结果判断标准,即基于异常阈值的判读方法,与常规判读方法相比,能更准确地判读出3、7、17号染色体及p16基因异常情况,减少假阳性判读结果的产生,使判读结果更准确可靠。
本发明所述试剂盒具有操作步骤简单、灵敏度高、特异性好、杂交快速和检测效率高等优点,且无需用Cot-1 DNA试剂进行封闭实验,经济高效,非常适用于快速对膀胱癌进行早期筛查和复发监测。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测结果信号计数指南-典型信号模式图。
图2为本发明试剂盒检测结果信号计数指南-部分典型异常细胞信号模式图。
图3为本发明试剂盒检测结果信号计数指南-正常细胞信号模式图。
图4为实施例2样本检测结果部分正常细胞代表图。
图5为18号样本的3号和7号染色体异常检测结果部分代表细胞图。
图6为8号样本的17号染色体和p16基因异常检测结果部分代表细胞图。
图7为实施例6中实验组2和是实验组3的检测结果部分代表细胞图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形,意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块,而是可选地还包括没有列出的步骤,或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”,描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如,A和/或B,可以表示:单独存在A,同时存在A和B,单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
实施例1膀胱癌检测试剂盒中的探针组成制备
本实施例一种膀胱癌检测试剂盒,包括针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针;所述针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针分别包括A探针、B1探针、B2探针、C探针、D探针和E探针。本实施例所述检测探针在使用时,针对3号染色体和7号染色体的检测探针与同一待检测样本进行杂交,记为CEN3/CEN7探针;针对17号染色体和p16基因的检测探针与同一待检测样本进行杂交,记为CEN17/p16探针。其中,
1.A探针
所述A探针从5’端到3’端的碱基组成依次为:P1序列、M1、特异性P2序列、M1、P1序列。
(1)特异性P2序列
所述特异性P2序列是发明人反复比对挑选后利用最优的BAC克隆为模板,针对相应染色体或基因中的非重复且高度保守的序列设计引物进行扩增并筛选出最优的扩增产物序列,再根据最优的扩增产物序列而设计出来的非重复且高度保守的短片段序列。针对相应的待检染色体和基因的特异性P2序列见表1。
表1特异性P2序列
(2)P1序列
所述P1序列为序列长度为20~30bp、不存在发夹结构,序列内部和序列间不形成二聚体、不存在错配,与特异性P2序列、待检染色体或基因之间均不存在特异性结合的序列。针对相应的待检染色体和基因的A探针的P1序列见表2,其中,引入甲基化的C和甲基化的G(后续相关序列表中均以斜体和阴影部分表示),有助于进一步降低非特异性杂交。
表2A探针的P1序列
(3)M1
所述M1为接头序列,所述M1可以为TATA或ACAC。本实施例中针对3、7、17号染色体及p16基因的A探针的M1的序列分别为TATA、ACAC、TATA、ACAC。
2.B1探针和B2探针
所述B1探针为长度为16~26bp,能与M1和P1序列从3’端到5’端碱基互补配对的P3序列。所述B2探针为长度为16~26bp,能与M1和P1序列从5’端到3’端碱基互补配对的P4序列。针对相应的待检染色体和基因的B1探针的P3序列和B2探针的P4序列见表3。
表3 B1探针P3序列和B2探针P4序列
3.C探针
所述C探针从5’端到3’端的碱基组成依次为:能与P1序列互补配对的P5序列、M2、P6序列;所述M2为接头序列,可以为CACA或TCTC;所述P6序列为长度为20~30bp,不存在发夹结构,序列内部和序列间不形成二聚体、不存在错配,与P1序列、P3序列、P4序列、特异性P2序列、待检染色体或基因片段之间均不存在特异性结合的序列。本实施例中针对3、7、17号染色体及p16基因的C探针的M2的序列分别为CACA、TCTC、CACA、TCTC。针对相应的待检染色体和基因的C探针的P5序列见表4,P6序列见表5。
表4C探针的P5序列
表5C探针的P6序列
4.D探针
所述D探针为能与P6序列从5’端到3’端的14~20个碱基、M2的碱基以及P5序列从3’端到5’端的14~20个碱基互补配对的P7序列。P7序列见表6。
表6D探针的P7序列
5.E探针
所述E探针从5’端到3’端的碱基组成依次为:能与P6序列互补的P8序列、茎部结构序列;所述P8序列的5’端修饰有荧光基团;所述茎部结构序列可与P8序列5’端的6~10个碱基互补形成茎环结构,3’端修饰巯基并通过金-硫键(Au-S)组装到13nm纳米金颗粒(AuNPs)表面,形成基于茎环结构和AuNPs的纳米荧光探针。在本实施例CEN3/CEN7探针和CEN17/p16探针两组探针组中,针对3号染色体的E探针的荧光基团选用Alexa Fluor 488(绿色荧光信号),针对7号染色体的E探针的荧光基团选用Cy3(红色荧光信号);针对17号染色体的E探针的荧光基团选用Alexa Fluor 488(绿色荧光信号),针对p16基因的E探针的荧光基团选用Cy3(红色荧光信号)。在本发明CEN3/CEN7探针和CEN17/p16探针两组探针组中,针对3、7、17号染色体及p16基因的E探针的茎部结构序列通过6个亚甲基单元[-(CH2)6]与巯基(-SH)相连接。P8序列见表7,茎部结构序列见表8。
表7 E探针的P8序列
表8 E探针的茎部结构序列
待检染色体/基因 | 茎部结构序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
3号染色体 | ATGCTGTC-(CH<sub>2</sub>)<sub>6</sub>-SH | 69 |
7号染色体 | GTAAGATG-(CH<sub>2</sub>)<sub>6</sub>-SH | 70 |
17号染色体 | TCACTGAG-(CH<sub>2</sub>)<sub>6</sub>-SH | 71 |
p16基因 | GCATCAAC-(CH<sub>2</sub>)<sub>6</sub>-SH | 72 |
上述探针序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成,合成后的每条探针分别溶解于TE缓冲液配制成100μM的母液储存,使用时每条探针分别取适量母液分别稀释成10μM,再按适当比例混合配制成探针混合液备用。本发明针对3、7、17号染色体及p16基因的相应荧光消减探针中,A探针与B1探针的摩尔比为1:2~6;A探针与B2探针的摩尔比为1:2~6;A探针与C探针的摩尔比为1:2~5;C探针与D探针的摩尔比为1:2~6,C探针与E探针的摩尔比为1:1~4。本实施例所述检测试剂盒和检测方法中CEN3/CEN7探针和CEN17/p16探针两组探针组中,A、B1、B2、C、D与E探针的摩尔比优选为1:2:2:2:6:4。
实施例2运用实施例1中试剂盒对样本进行检测
所述各种溶液的配方如表9所示。
表9各种溶液的配方
本实施例优选膀胱癌患者尿液样本,对样本中脱落细胞3、7、17号染色体及p16基因异常进行检测,其中CEN3/CEN7探针混合液、CEN17/p16探针混合液均使用实施例1的膀胱癌检测试剂盒相应列表中的全部探针。
1、待检测样品预处理
(1)收集待检测样品:收集患者尿液40ml,均等分为两份,每份20ml,分别离心取细胞沉淀,PBS洗涤后,分别加入4ml PBS重悬细胞沉淀,加入1ml固定剂,涡旋混匀,室温静置8分钟,将上述两份细胞悬液分别加到两张滤膜上(滤膜孔径5~8μm),进行抽滤处理后,用镊子小心取出滤膜,置于24孔板中,铁圈上有编码的一面朝上,即得到同一患者的两份含尿液脱落细胞的滤膜样本。
(2)亲水:将滤膜样本分别置于400μl 100%乙醇中静置2min,400μl 70%乙醇中静置2min,400μl 50%乙醇中静置2min。去除液体,每孔加入2ml纯水洗涤三次,每次浸泡2min。
(3)烤片:将滤膜分别放在载玻片上,并将载玻片置于烤片机上,60℃烤膜1.5小时。
(4)脱水:将滤膜置于24孔板中,每孔加入1ml 100%乙醇,浸泡2min后取出,室温风干。
(5)预处理液处理:烤片结束前15min时,将预处理液分装至24孔板中,每孔2ml,盖上板盖,置于80℃水浴锅中备用。将滤膜样本浸入预处理液,80±2℃孵育12min。去除液体,每孔加入2ml纯水洗涤三次,每次浸泡2min。
(6)消化:将胃蛋白酶缓冲液涡旋混匀,分装至24孔板中,每孔50μl。将预处理过的滤膜取出,倒扣至24孔板中的胃蛋白酶缓冲上,37±1℃消化5min。
(7)洗涤:去除液体,每孔加入2ml纯水洗涤三次,每次浸泡2分钟。
2、FISH检测
(1)准备工作:探针混合液平衡至室温,涡旋混匀;预热杂交仪,准备湿条并于杂交时放入杂交仪;使用玻璃刀在切片反面圈出样本杂交区域。
(2)脱水:将70%、85%、100%乙醇依次滴加到装有滤膜的孔中各浸泡1分钟,每孔1ml。置于烤片机上2~5分钟烘干。
(3)配制探针工作液(避光操作):对于同一个患者的两份滤膜样本,分别配制针对CEN3/CEN7检测的探针工作液以及针对CEN17/p16检测的探针工作液,涡旋混匀,备用。针对CEN3/CEN7探针检测的探针工作液组成如下:1μl CEN3/CEN7探针缓混合液、49μl杂交缓冲液,总体积50μl;针对CEN17/p16探针检测的探针工作液组成如下:1μl CEN17/p16探针混合液、49μl杂交缓冲液,总体积50μl。
(4)杂交(避光操作):将滤膜取出,置于载玻片上,对于同一个患者的两份滤膜样本,在载玻片上做好标记以便区分,一份滤膜的中央加入25μl针对CEN3/CEN7检测的探针工作液,另一份滤膜的中央加入25μl针对CEN17/p16检测的探针工作液,分别盖上盖玻片,确保盖玻片下无气泡、探针均匀分布。分别使用封片胶覆盖盖玻片四周位置,形成闭合的密封圈。将载玻片放入杂交仪中,设置杂交反应程序:70±1℃变性5分钟,45±1℃杂交60分钟。
(5)DAPI复染(避光操作):将杂交后的切片从杂交仪中取出,去除封片胶,将膜取下,放在无尘纸上吸干多余水分,将滤膜转移到用酒精擦拭干净的载玻片上,在样本杂交区域加入10μl复染液,盖上盖玻片,轻轻往下压,使DAPI覆盖整张膜,于4℃避光放置20分钟。在DAPI通道用20倍显微镜镜检。
3、荧光显微镜观察3、7、17号染色体数目异常及p16基因缺失情况
(1)在避光条件下,使用荧光显微镜观察载玻片上的样本杂交区域,进行结果判读,荧光显微镜使用通道如下:
表10荧光基团的激发波长和发射波长
荧光基团 | 激发波长(Excitation filter) | 发射波长(Emission filter) |
DAPI | 330~385nm | 420nm |
Alexa Fluor 488 | 460~495nm | 510~550nm |
Cy3 | 545~580nm | 610nm |
(2)选择杂交信号均匀的区域和信号清晰可辨的细胞进行信号计数。CEN3/CEN7探针分别杂交于3号和7号染色体的特异性DNA序列,CEN3荧光信号为绿色,CEN7荧光信号为红色;CEN17/p16探针分别杂交于17号染色体的特异性DNA序列和染色体9p21上p16基因,CEN17荧光信号为绿色,p16荧光信号为红色。每一个样本每种探针组合观察计数50个细胞,单个细胞核中,绿色信号和红色信号各显示2个为正常细胞,出现无信号为完全缺失,1个信号为部分缺失,3个或3个以上扩增。本发明试剂盒检测结果典型信号模式图如图1所示;图2为本发明试剂盒检测结果部分典型异常细胞信号模式图;图3为本发明试剂盒检测结果正常细胞信号模式图。
(3)通过每一个样本每种探针组合观察计数50个细胞,统计出现不同异常情况信号点的百分比,以上述百分比检测值对样本进行阴阳性判断:若检测值大于异常阈值,则判定为阳性结果,小于异常阈值判定为阴性结果,等于异常阈值则需增加观测样本细胞的数量。所述异常阈值的建立可参考实施例3,方法如下:采集20例正常人尿液标本,使用本发明实施例1所述试剂盒进行FISH检测,每组探针观察50个细胞,统计出不同类型异常细胞数的百分比,按照公式“异常阈值=平均值(M)+3×标准差(SD)”计算得到异常阈值。本发明实施例1所述试剂盒3、7、17号染色体及p16基因异常阈值如下:
表11 3、7、17号染色体及p16基因异常阈值(%)
(4)另外,需要评价载玻片上的样本杂交区域的荧光信号强度和背景时,可根据0-3级量表上的分级系统分别进行评分。根据0-3级量表上的分级系统,对荧光信号强度进行评分:0表示无信号可见,1表示信号强度微弱,2表示信号强度中等,3表示信号强度强烈;该评分系统允许使用1/2级。根据0-3级量表上的分级系统,对背景进行评分:0表示无或几乎无背景可见,1表示有些背景,2表示中等背景,3表示高背景;该评分系统允许使用1/2级。
4、样本检测结果与分析
利用本发明试剂盒及检测方法对20例已知3、7、17号染色体和p16基因异常情况的膀胱癌患者尿液样本(编号1~20)进行检测,选用市售人正常膀胱上皮细胞株SV-HUC-1和人膀胱癌细胞株5637,分别各取约400个SV-HUC-1和5637细胞(通过细胞计数器确定),混匀后各均分为2份,分别作为阴、阳性对照样本(分别编号为N、P);读取每个样本有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞,统计其出现不同异常情况绿色/红色荧光信号的百分比及阴阳性判断结果。本发明检测结果与样本已知临床结果作对照,计算本发明所提供的试剂盒及检测方法的检测结果吻合率。具体结果见表12和表13。
表12 3号和7号染色体异常检测结果
表13 17号染色体和p16基因异常检测结果
从上述检测结果可知,本发明试剂盒检测20份样本的3、7、17号染色体及p16基因异常检测结果与样本已知临床结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的FISH检测探针能够准确地检测出3、7、17号染色体及p16基因异常情况,且结果稳定可靠。由此可见,本发明的所提供的FISH具有特异性好,信号强的特点。图4为本实施例样本检测结果部分正常细胞代表图;图5为18号样本的3号和7号染色体异常检测结果部分代表细胞图;图6为8号样本的17号染色体和p16基因异常检测结果部分代表细胞图。另外,将本发明试剂盒FISH检测步骤与市售的膀胱癌FISH产品的FISH检测步骤进行对比发现,市售的膀胱癌FISH产品需要过夜杂交,且杂交后需要进行洗涤,整个检时长约为18个小时;而本发明试剂盒可在70分钟内完成杂交,无需过夜杂交,且杂交后无需进行洗涤操作,整个检时长约为4小时;说明本发明试剂盒缩短了杂交时间,简化了FISH检测操作,实现了快速杂交、短时杂交,大大节约了FISH检测的时间成本。
实施例3本发明试剂盒异常阈值的建立
为了建立本发明试剂盒检测3、7、17号染色体及p16基因异常情况的阈值,设计如下实验:采集20例正常人尿液标本,使用本发明实施例1所述膀胱癌检测试剂盒进行检测。每组探针观察50个细胞,统计出不同类型异常细胞数的百分比,按照公式“异常阈值=平均值(M)+3×标准差(SD)”计算得到异常阈值。
采用上述设计制备的试剂盒,根据上述实验设计,按实施例2所述检测过程和方法对20例正常人尿液标本(依次编号为1~20)进行检测,读取每个样本每组探针中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞,统计不同类型异常细胞数的百分比,得出异常阈值。具体结果见表14-15。
表14 20例正常人尿液样本3号和7号染色体异常检测结果
表15 20例正常人尿液样本17号染色体和p16基因异常检测结果
从上述检测结果可知,3号染色体异常阈值:0个信号点(完全缺失)0%,1个信号点(部分缺失)4.3%,3个及以上信号点(扩增)5.0%,总体异常阈值6.6%;7号染色体异常阈值:0个信号点(完全缺失)0%,1个信号点(部分缺失)3.8%,3个及以上信号点(扩增)4.6%,总体异常阈值5.9%;17号染色体异常阈值:0个信号点(完全缺失)0%,1个信号点(部分缺失)4.1%,3个及以上信号点(扩增)5.8%,总体异常阈值7.1%;p16基因异常阈值:0个信号点(完全缺失)3.2%,1个信号点(部分缺失)3.5%,3个及以上信号点(扩增)5.4%,总体异常阈值6.9%。
实施例4本发明基于异常阈值的判读方法与常规判读方法的比较
为了比较本发明基于异常阈值的判读方法与常规判读方法,以CEN3/CEN7探针为例,设计实验组1-2,具体设计如表16所示。
表16试剂盒检测结果判读方法的选择
本实施例选用20例已知3、7、17号染色体和p16基因异常情况的膀胱癌患者尿液样本(编号1~20)进行实验。使用本发明实施例1所述膀胱癌检测试剂盒,按实施例2所述检测过程和方法对上述样本进行检测,读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞,统计出异常信号细胞数以及不同类型异常细胞数的百分比。根据上述实验设计进行检测结果的判读,将判读结果与样本已知临床结果作对照,比较两种判读方法的检测结果与已知临床结果的吻合率。具体结果见表17和表18。
表17试剂盒选用不同判读方法判读3号染色体检测结果的比较
表18试剂盒选用不同判读方法判读7号染色体检测结果的比较
从上述检测结果可知,试剂盒选用本发明基于异常阈值的判读方法对3号和7号染色体检测结果进行判读时,其判定结果与样本已知临床结果吻合率达到100%,而试剂盒选用常规判读方法对3号和7号染色体检测结果进行判读时,存在个别阴性样本被判定为阳性的现象(样本4、8、13和19),其判定结果与样本已知临床结果吻合率为80%。可见常规判读方法容易造成假阳性结果的产生,而本发明基于异常阈值的判读方法能够更准确地判读出3、7号染色体异常情况,判读结果准确可靠。
针对17号染色体和p16基因异常检测的判读方法的选择实验结果与上述结果一致,具体数据省略。
实施例5杂交时间对试剂盒检测效果的影响
为了评估探针杂交时间对试剂盒检测效果的影响,以CEN3/CEN7探针为例,设计实验组1-8(其中5-8采用市售探针作为对比),具体设计如表19所示。
表19试剂盒检测探针的选择
本实施例选用市售细胞株人正常膀胱上皮细胞株SV-HUC-1和人膀胱癌细胞株5637进行实验。分别各取约4800个SV-HUC-1和5637细胞(通过细胞计数器确定),混匀后将样本各均分为24份;依次编号1~24和25~48。采用上述设计制备的试剂盒,按实施例2所述检测过程和方法对样本1~48进行检测,每个实验组每种细胞株各检3份,读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞,统计出不同类型异常细胞数的百分比,并对每个样本中的荧光信号强度和背景进行评分。具体结果见表21。
表21试剂盒选用不同类型检测探针的检测结果比较
从上述检测结果可知,使用本发明检测探针杂交30分钟、60分钟、90分钟和2小时均可完成准确检测,其特异性和稳定性都很好;并且,检测到的荧光信号强度很强很稳定,背景低,检测效果很好(实验组1-4)。而使用市售探针杂交30分钟、60分钟时存在些微荧光背景,检出的异常信号百分比很低且荧光信号强度稍低,存在大量阳性细胞漏检的现象,无法完成准确检测(实验组5-6);杂交90分钟时存在些微荧光背景,检出的异常信号百分比及荧光信号强度仍低于本发明检测探针,仍存在一些阳性细胞漏检的现象,无法完成准确检测(实验组7);只有杂交2小时才能实现准确检测(实验组8),虽仍存在些微荧光背景,但其检测到的异常信号百分比和荧光信号强度与本发明检测探针相当。以上说明本发明检测探针相较于市售探针检测效果更佳,可进一步提高杂交效率,缩短杂交时间,实现快速杂交;其杂交后无需洗涤步骤也能保证较低的背景荧光,实现了高信噪比检测。
针对17号染色体和p16基因异常检测的CEN17/p16探针的不同类型的选择实验结果与上述结果一致,具体数据省略。
鉴于以上实验结果,为了节省时间成本,本发明试剂盒检测探针杂交时间优选30分钟~90分钟;进一步地;为了节省时间成本的同时保障试剂盒检测结果的准确性,本发明试剂盒检测探针杂交时间优选60分钟。
实施例6探针配比对试剂盒检测效果的影响
为验证探针配比对本发明试剂盒检测效果的影响,以CEN3/CEN7探针中A探针与B1探针的配比、C探针与E探针的配比为例,设计实验组1-8,具体设计如表22所示。
表22检测探针配比的选择
本实施例选用市售细胞株人正常膀胱上皮细胞株SV-HUC-1和人膀胱癌细胞株5637进行实验。分别各取约4800个SV-HUC-1和5637细胞(通过细胞计数器确定),混匀后将样本各均分为24份;依次编号1~24和25~48。采用上述设计制备的试剂盒,按实施例2所述检测过程和方法对样本1~48进行检测,每个实验组每种细胞株各检3份,读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞,统计出不同类型异常细胞数的百分比,并对每个样本中的荧光信号强度和背景进行评分。具体结果见表23。
表23试剂盒选用不同配比探针的检测结果比较
从上述检测结果可知,当A探针与B1探针的摩尔比为1:2~6时(实验组1和实验组3)可实现准确检测,其特异性和稳定性都很好,检测到的荧光信号强度很强很稳定,荧光背景低,检测效果很佳(参见图7中的A,即实验组1条件下针对C3C7阳性样本检测效果图);当A探针与B1探针的摩尔比为1:1时(实验组2),检测到的荧光背景有所升高,且存在个别阴性细胞检出异常信号的现象,可能导致假阳性结果的产生,无法实现准确检测(参见图7中的B,即实验组2条件下针对C3C7阳性样本检测效果图);当A探针与B1探针的摩尔比为1:7时(实验组4),虽然背景噪音低,但存在一些异常信号细胞未能被有效检出的现象,导致检出的异常信号细胞所占比例明显减少,影响检测结果的准确性和稳定性,检测效果较差。当C探针与E探针的摩尔比为1:1~4时(实验组1和实验组6-7)可实现准确检测,其特异性和稳定性都很好,检测到的荧光信号强度很强很稳定,背景低,检测效果很好;当C探针与E探针的摩尔比为1:0.5时,存在一些异常信号细胞未能有效被检出的现象,导致检出的异常信号细胞所占比例有所减少,影响检测结果的准确性和稳定性,检测效果较差;当C探针与E探针的摩尔比为1:5时,检测到的荧光背景有所升高,且存在个别阴性细胞检出异常信号的现象,影响检测结果的准确性和稳定性,检测效果较差(图省略)。
CEN3/CEN7探针中其它探针的配比以及针对17号染色体和p16基因异常检测的CEN17/p16探针中各探针的配比的选择实验结果与上述结果类似,具体数据省略。
鉴于以上实验结果,优选地,本发明试剂盒3、7、17号染色体及p16基因相应的A探针与B1探针的摩尔比为1:2~6,A探针与B2探针的摩尔比为1:2~6,A探针与C探针的摩尔比为1:2~5,C探针与D探针的摩尔比为1:2~6,C探针与E探针的摩尔比为1:1~4;为了节约试剂成本的同时保障试剂盒检测结果的准确性,本发明实施例1所述试剂盒的A探针、B1探针、B2探针、C探针、D探针与E探针的摩尔比优选为1:2:2:2:6:4。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种膀胱癌检测试剂盒
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caatcagaca acagacaaaa tattacttat caaggatgac cattttctgg 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgattaga atataagata ctgattaact ttttattgca taaatcttgg 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccagactct aaattattat tctctcctct ttctcctgga gatcaaaatg 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatgagattc ttttgtagat aaactgtttc ctaatataat caaaagtgga 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggttttca gtgaaacaga aatacctata acctcagatc cttaactgag 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cattggctca atcttttggg ttactgatga tgtgatcttc tttaatgtag 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagtgaattc ctccaactcc tctcaacgca aatctctctg actctccctg 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcttcttcct ttcctggcct ctgttcttgc atctattcct attgccagtc 50
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttaattatt gaacctctct ggccatctgc atacagttta aattttgaga 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagctgactg attcagtcgt cacgtcctga aagcgttgca gtatgctctg 50
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caatatcagg ccacggcttc aaagccaaag tgatggctag atgtaaagtg 50
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gactaaaatg gtaactagta ttaagagctg tgctgattat tagtgtcagg 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cccataatac atgttaatca tacaaggtta ttggatcagg aaattaatag 50
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttggtctat atacacaaac attgtgggaa tgaagctaat ggtgaaggtg 50
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaggtatctg gtgtgtagtg tatggccaga aataaccctg tgaggatctg 50
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagttggagc catagccttg accctgggcc tctggggccc tgaccctaac 50
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cttatgagaa agcagaagag tcagttcaaa acaacccaga aacgccagca 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagaggcttc atctggctgc ctggcatatt tgtggcctgc agatgtattc 50
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctcaggggac accatgaccc ttcctgtgaa ctctccatga tgcaggcaag 50
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctgcatacat agagatttga cacatgtact atacacacac actcatagac 50
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gatagctaag tcatcaaata ttataatgag catatattgt ctgtttctat 50
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccgtggcaga agatcattaa gtatagggtt gttaattaag tagaattgac 50
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctgaggtcgg gtcccgctgg aggaggaggc gtttcgaaac tgtgaggtgg 50
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaactctgag aggagcacag gctctactgc agtgcctgga cggcttcctc 50
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggtgagtggc cctaaatgat atgccagagt catcataagc taactgcagc 50
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gttctcagaa cacagataca gagagacaaa cagagagaca gctgttgtcc 50
<210> 27
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gttctcctca actcgctcag tggaatcacc ttatctgaat cttcagtggg 50
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gcctgttcat ccatgcctgc ctcccacctc ctgggtgctg ttattgacag 50
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gctatgatta tctgacatga tccaagaatc tgcagtgtaa caggctctac 50
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctccccaact gggagcctgg gcgttttcat gagtgggcca ctttcttcag 50
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caccatgaca cagatttaat tctatatgga ctatatacat tctcttgcac 50
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ctctcccttt tcaggccaca tagattctac actgaatggg catctaggct 50
<210> 33
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ccaatccact tcataaatga acagttttgt ctaggttaaa actttcttac 50
<210> 34
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggaaaagtct gggaagttca tccttgtgtg tgacttcctt gaggcataag 50
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cagtgatcca ttgcggtctt tttatatcca ataaggggcc tattagttgg 50
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tgatcacaaa gcaagctgcc actggaactc ctggtggtgt acaagttggg 50
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ggtttgggga atcttggttg atggtggaat tggttttcgg tgtatgttcc 50
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gcctttcact attgcctctg agcttagatt ttgactaaag catacaggtg 50
<210> 39
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gatgacctga aataccattg ccctgtccct ttgtgttgcc aatcaacttg g 51
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cttgatatta gccagggata tactattacc caccttgggg aagataatac 50
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ctgaagcgct tcgcgagcca gttcg 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gtgtgctcca tgagacttct gagtg 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gatacgctct acactgctgc aatgg 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ctcgtatgag tcagtctgca taggc 25
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tatacgaact ggctcgcgaa g 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtgtcactca gaagtctcag t 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tataccattg cagcagtggt a 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gtgtgcctat gcagactgac t 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctcgcgaagc gcttcagtat a 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
agtctcatgg agcacacgtg t 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gcagtgtaga gcgtatctat a 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
agactgactc atacgaggtg t 21
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cgaactggct cgcgaagcgc ttcag 25
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cactcagaag tctcatggag cacac 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ccattgcagc agtgtagagc gtatc 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gcctatgcag actgactcat acgag 25
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cgcatacagt cgcatagatg ctgtc 25
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gtcagtccga ctgttctgta agatg 25
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gattccgtag tgatggatca ctgag 25
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tcgacagtct atgcgtagca tcaac 25
<210> 61
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ctatgcgact gtatgcgtgt gctgaagcgc ttcgcgag 38
<210> 62
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
agaacagtcg gactgacgag agtgtgctcc atgagact 38
<210> 63
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tccatcacta cggaatctgt ggatacgctc tacactgc 38
<210> 64
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tacgcataga ctgtcgagag actcgtatga gtcagtct 38
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gacagcatct atgcgactgt atgcg 25
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
catcttacag aacagtcgga ctgac 25
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ctcagtgatc catcactacg gaatc 25
<210> 68
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gttgatgcta cgcatagact gtcga 25
<210> 69
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
atgctgtc 8
<210> 70
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gtaagatg 8
<210> 71
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
tcactgag 8
<210> 72
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gcatcaac 8
Claims (10)
1.一种膀胱癌检测试剂盒,其特征在于,包含针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针中的至少一种;所述针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针分别包括A探针、B1探针、B2探针、C探针、D探针和E探针;其中,
所述A探针从5’端到3’端的碱基组成依次为:P1序列、M1、特异性P2序列、M1、P1序列;所述特异性P2序列为能与待检染色体或基因片段互补结合,且长度为40~60bp的序列;所述P1序列为长度为20~30bp,不存在发夹结构,序列内部和序列间不形成二聚体、不存在错配,与特异性P2序列、待检染色体或基因片段之间均不存在特异性结合的序列;所述M1为长度为2~6bp的接头序列;
所述B1探针为长度为16~26bp、能与M1和P1序列从3’端到5’端碱基互补配对的P3序列;
所述B2探针为长度为16~26bp、能与M1和P1序列从5’端到3’端碱基互补配对的P4序列;
所述C探针从5’端到3’端的碱基组成依次为:能与P1序列互补配对的P5序列、M2、P6序列;所述M2为长度为2~6bp的接头序列;所述P6序列为长度为20~30bp,不存在发夹结构,序列内部和序列间不形成二聚体、不存在错配,与P1序列、P3序列、P4序列、特异性P2序列、待检染色体或基因片段之间均不存在特异性结合的序列;
所述D探针为能与P6序列从5’端到3’端的14~20个碱基、M2的碱基以及P5序列从3’端到5’端的14~20个碱基互补的P7序列;
所述E探针从5’端到3’端的碱基组成依次为:能与P6序列互补的P8序列、茎部结构序列;所述P8序列的5’端修饰有荧光基团;所述茎部结构序列可与P8序列5’端的6~10个碱基互补形成茎环结构,且茎部结构序列的3’端修饰有可猝灭荧光基团的结构。
2.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒,其特征在于,所述M1为TATA或ACAC;和/或,所述M2为CACA或TCTC。
3.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒,其特征在于,所述A探针的P1序列、B1探针的P3序列、B2探针的P4序列、C探针的P5和P6序列、D探针的P7序列和E探针的P8序列中分散有2~6个甲基化修饰的碱基。
4.根据权利要求3所述的膀胱癌检测试剂盒,其特征在于,所述甲基化的碱基为甲基化的C和/或甲基化的G,所述甲基化修饰位于序列中。
5.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒,其特征在于,所述针对3号染色体的检测探针中,A探针的特异性P2序列为SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.10,P1序列为SEQ ID NO.41,M1为TATA;B1探针的P3序列为SEQ ID NO.45;B2探针的P4序列为SEQ ID NO.49;C探针的P5序列为SEQ ID NO.53,M2为CACA,P6序列为SEQ ID NO.57;D探针的P7序列为SEQ ID NO.61;E探针的P8序列为SEQ ID NO.65,茎部结构序列为SEQ ID NO.69;和/或,
所述针对7号染色体的探针中,A探针的特异性P2序列为SEQ ID NO.11~SEQ IDNO.20,P1序列为SEQ ID NO.42,M1为ACAC;B1探针的P3序列为SEQ ID NO.46;B2探针的P4序列为SEQ ID NO.50;C探针的P5序列为SEQ ID NO.54,M2为TCTC,P6序列为SEQ ID NO.58;D探针的P7序列为SEQ ID NO.62;E探针的P8序列为SEQ ID NO.66,茎部结构序列为SEQ IDNO.70;和/或,
所述针对17号染色体的探针中,A探针的特异性P2序列为SEQ ID NO.21~SEQ IDNO.30,P1序列为SEQ ID NO.43,M1为TATA;B1探针的P3序列为SEQ ID NO.47;B2探针的P4序列为SEQ ID NO.51;C探针的P5序列为SEQ ID NO.55,M2为CACA,P6序列为SEQ ID NO.59;D探针的P7序列为SEQ ID NO.63;E探针的P8序列为SEQ ID NO.67,茎部结构序列为SEQ IDNO.71;和/或,
所述针对p16基因的探针中,A探针的特异性P2序列为SEQ ID NO.31~SEQ ID NO.40,P1序列为SEQ ID NO.44,M1的序列为ACAC;B1探针中,P3序列为SEQ ID NO.48;B2探针中,P4序列为SEQ ID NO.52;C探针中,P5序列为SEQ ID NO.56,M2的序列为TCTC,P6序列为SEQ IDNO.60;D探针中,P7序列为SEQ ID NO.64;E探针中,P8序列为SEQ ID NO.68,茎部结构序列为SEQ ID NO.72。
6.根据权利要求1-5任一项所述的膀胱癌检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包含针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针。
7.根据权利要求6所述的膀胱癌检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒在使用时,所述针对3号染色体和7号染色体的检测探针与同一待检测样本进行杂交;所述针对17号染色体和p16基因的检测探针与同一待检测样本进行杂交;所述针对3号染色体和7号染色体的检测探针中的E探针上修饰的荧光基团互不相同;所述针对17号染色体和p16基因的检测探针中的E探针上修饰的荧光基团互不相同。
8.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒,其特征在于,所述茎部结构序列的3’端修饰有巯基并通过金-硫键组装到纳米金颗粒表面,使E探针形成基于茎环结构和纳米金颗粒的纳米荧光探针。
9.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒,其特征在于,所述针对3、7、17号染色体和p16基因的检测探针中,A探针与B1探针的摩尔比为1:2~6;A探针与B2探针的摩尔比为1:2~6;A探针与C探针的摩尔比为1:2~5;C探针与D探针的摩尔比为1:2~6,C探针与E探针的摩尔比为1:1~4。
10.根据权利要求1~9任一项所述的膀胱癌检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的结果判断标准为:每一个样本每种探针组合观察计数相同数量的细胞,统计出现不同异常情况信号点的百分比,以上述百分比检测值对样本进行阴阳性判断:若检测值大于异常阈值,则判定为阳性结果,小于异常阈值判定为阴性结果,等于异常阈值则需增加观测样本细胞的数量;其中,
3号染色体异常阈值:0个信号点(完全缺失)0%,1个信号点(部分缺失)4.3%,3个及以上信号点(扩增)5.0%,总体异常阈值6.6%;7号染色体异常阈值:0个信号点(完全缺失)0%,1个信号点(部分缺失)3.8%,3个及以上信号点(扩增)4.6%,总体异常阈值5.9%;17号染色体异常阈值:0个信号点(完全缺失)0%,1个信号点(部分缺失)4.1%,3个及以上信号点(扩增)5.8%,总体异常阈值7.1%;p16基因异常阈值:0个信号点(完全缺失)3.2%,1个信号点(部分缺失)3.5%,3个及以上信号点(扩增)5.4%,总体异常阈值6.9%。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011432111.1A CN112538530B (zh) | 2020-12-07 | 2020-12-07 | 一种膀胱癌检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011432111.1A CN112538530B (zh) | 2020-12-07 | 2020-12-07 | 一种膀胱癌检测试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112538530A true CN112538530A (zh) | 2021-03-23 |
CN112538530B CN112538530B (zh) | 2024-02-13 |
Family
ID=75019837
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011432111.1A Active CN112538530B (zh) | 2020-12-07 | 2020-12-07 | 一种膀胱癌检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112538530B (zh) |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102517382A (zh) * | 2009-05-12 | 2012-06-27 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种人染色体p16基因检测试剂盒及应用 |
EP2471950A1 (en) * | 2009-08-24 | 2012-07-04 | National University Corporation Kanazawa University | Detection of digestive system cancer, stomach cancer, colon cancer, pancreatic cancer, and biliary tract cancer by means of gene expression profiling |
US20130172203A1 (en) * | 2010-03-19 | 2013-07-04 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Hybrid model for the classification of carcinoma subtypes |
US20150292030A1 (en) * | 2012-11-27 | 2015-10-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods of characterizing and treating molecular subset of muscle-invasive bladder cancer |
US20160362747A1 (en) * | 2014-02-12 | 2016-12-15 | Leica Biosystems Newcastle Ltd. | Kit and method for detecting bladder cancer |
CN108707662A (zh) * | 2017-04-05 | 2018-10-26 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种ar-v7表达检测试剂盒 |
CN110923322A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-27 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 膀胱癌相关的dna甲基化生物标志物组合和检测试剂盒 |
CN111269983A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-06-12 | 深圳市众循精准医学研究院 | 一种膀胱癌基因扩增的fish检测方法、探针及试剂盒 |
-
2020
- 2020-12-07 CN CN202011432111.1A patent/CN112538530B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102517382A (zh) * | 2009-05-12 | 2012-06-27 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种人染色体p16基因检测试剂盒及应用 |
EP2471950A1 (en) * | 2009-08-24 | 2012-07-04 | National University Corporation Kanazawa University | Detection of digestive system cancer, stomach cancer, colon cancer, pancreatic cancer, and biliary tract cancer by means of gene expression profiling |
US20130172203A1 (en) * | 2010-03-19 | 2013-07-04 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Hybrid model for the classification of carcinoma subtypes |
US20150292030A1 (en) * | 2012-11-27 | 2015-10-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods of characterizing and treating molecular subset of muscle-invasive bladder cancer |
US20160362747A1 (en) * | 2014-02-12 | 2016-12-15 | Leica Biosystems Newcastle Ltd. | Kit and method for detecting bladder cancer |
CN108707662A (zh) * | 2017-04-05 | 2018-10-26 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种ar-v7表达检测试剂盒 |
CN110923322A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-27 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 膀胱癌相关的dna甲基化生物标志物组合和检测试剂盒 |
CN111269983A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-06-12 | 深圳市众循精准医学研究院 | 一种膀胱癌基因扩增的fish检测方法、探针及试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112538530B (zh) | 2024-02-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10351912B2 (en) | Detection of high grade dysplasia in cervical cells | |
CN106636318B (zh) | 核酸信号放大检测试剂盒 | |
US20140030714A1 (en) | Method and means for distinguishing malignant from benign tumor samples, in particular in routine air dried fine needle aspiration biopsy (FNAB) | |
CN110343764B (zh) | 检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒 | |
CN104011227A (zh) | 用于前列腺癌的诊断、预后和评估治疗性/预防性治疗的材料和方法 | |
WO2009047756A2 (en) | Methods and kits for diagnosing lung cancer | |
CN111808964B (zh) | 一种EpCAM基因表达检测试剂盒 | |
CN110904195A (zh) | 一种cd55基因表达检测试剂盒 | |
CN110923323B (zh) | 一种Twist基因表达检测试剂盒 | |
EP3105351B1 (en) | Kit and method for detecting bladder cancer | |
CN107083420B (zh) | PML/RARα融合基因检测试剂盒 | |
CN117448456A (zh) | 用于鉴别涎腺肿瘤良恶性的分子靶标、探针组合、试剂盒及其应用 | |
CN112538530B (zh) | 一种膀胱癌检测试剂盒 | |
CN106574307A (zh) | 用于评估前列腺癌的进展的材料和方法 | |
CN106636316B (zh) | 卵巢癌相关microRNA检测试剂盒 | |
EP2956551A1 (en) | Methods and tools for the diagnosis and prognosis of urogenital cancers | |
CN101711285B (zh) | 用于预测结肠直肠腺癌细胞的存在的方法和工具 | |
CN111635945B (zh) | 一种Vimentin基因表达检测试剂盒 | |
CN107083418B (zh) | PML/RARα融合基因检测试剂盒以及检测方法 | |
CN107083419B (zh) | Bcr/abl基因融合与ass基因缺失检测试剂盒 | |
CN102918164B (zh) | 区分乳腺癌与良性乳腺疾病的方法和试剂盒 | |
CN111621570B (zh) | 一种ck8基因表达检测试剂盒 | |
KR20220026596A (ko) | 대용량 분자 검출 | |
CA2501792C (en) | Detection of high grade dysplasia in cervical cells | |
CN117701721B (zh) | 宫颈癌sox1-septin9-tac1基因甲基化的检测试剂及试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: No. 29, Helix 3 Road, Guangzhou International Biological Island, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province, 510663 Applicant after: SUREXAM BIO-TECH Co.,Ltd. Address before: 5 / F, area C, Guangzhou innovation base, No. 80, guanyue Road, Science City, Guangzhou, Guangdong Province Applicant before: SUREXAM BIO-TECH Co.,Ltd. |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |