CN111621570B - 一种ck8基因表达检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CK8基因表达检测试剂盒，其包括针对检测CK8基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括扩增探针H1和扩增探针H2；每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：P1序列、间隔臂序列、特异性P2序列，且特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处有2～8个碱基进行了锁核酸修饰；每条扩增探针H1从5’端到3’端的碱基组成依次为：P3序列、P4序列；每条扩增探针H2从5’端到3’端的碱基组成依次为：P1序列、P5序列。上述试剂盒通过对捕获探针和信号放大系统的优化，可有效提高检测的灵敏度、准确率和检测效率，缩短检测时间，更好地满足CK8基因表达检测的需要。

Description

一种CK8基因表达检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种CK8基因表达检测试剂盒。
背景技术
细胞角蛋白8(CK8)是一种II型碱性中间丝蛋白，属于细胞骨架蛋白家族，其基因定位于人类染色体12q13.13，包含10个外显子。CK8常与CK18结合，在肝细胞、胰腺腺泡和胰岛细胞、近端肾小管上皮细胞等多种上皮细胞中表达，在维持细胞结构完整性和信号转导及细胞分化中发挥作用(Karantza V.Oncogene,2011,30:127)。研究表明，CK8在肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌等多种肿瘤中异常表达，并与肿瘤的发生发展、侵袭、转移以及抗癌药物敏感性/耐药性有关(Karantza V.Oncogene,2011,30:127)。
在循环肿瘤细胞(CTCs)研究中，CK8常被作为上皮型标志物，用于CTCs的分离与鉴定。有研究联合过滤法和CK8抗体免疫染色法富集和计数乳腺癌患者血液中的CTCs，结果发现，远处转移患者CTCs检出率明显高于淋巴结阳性或淋巴结阴性患者，提示CK8阳性CTCs可能作为乳腺癌潜在的预后指标和疾病进展标志物(Kahn H J et al.,Breast CancerResearch&Treatment,2004,86:237-247)。另有研究通过红细胞裂解法、免疫磁珠法结合CA19-9和CK8/18免疫荧光染色法来检测接受5-氟尿嘧啶化疗的晚期胰腺癌患者的CTCs，结果显示，5-氟尿嘧啶化疗一个周期后，患者CTCs检出率和数量明显减少，提示CTCs在胰腺癌中的存在可能作为评价化疗效果的指标(Ren C et al.,Cancer Biology&Therapy,2011,12:700-706)。可见，CK8在CTCs中的表达具有重要的临床价值。
鉴于CK8表达在肿瘤诊断、预后和治疗中的重要临床价值及其在CTCs研究中的重要意义，促使我们开发一种CK8基因表达检测试剂盒，该试剂盒将有助于深入研究CK8基因在各种肿瘤发生发展中的重要作用及其在肿瘤诊断、预后和治疗方面的临床意义，并将为肿瘤的诊断、预后和治疗提供有用的临床辅助信息。
目前常用的CK8表达检测方法主要有免疫组化和实时定量PCR。免疫组化是基于抗原与抗体特异性结合的原理，该方法具有操作简单、耗时短、检测成本低、染色后切片便于存档等优点；但是，其检测灵敏度和特异性有限，检测结果的准确性受诸多因素影响，并且检测所需组织样本取材受限。实时定量PCR主要是用于检测肿瘤组织/细胞样本中CK8mRNA表达水平，具有灵敏度高、序列特异性强等优点；但是，该方法对实验条件要求严格，每一步操作都必须严格避免污染，否则可能造成假阳性结果的产生。针对现有CK8基因表达检测方法存在的不足，中国专利CN201410228511.9提供了一种检测基因表达的RNA原位杂交方法，所述方法的检测探针可实现RNA原位检测的荧光信号放大，提高了检测的灵敏度和准确性，且检测样本可以为体液样本，应用范围广阔。但通过进一步研究发现，在保证甚至提高检测灵敏度和准确性的基础上，上述RNA原位杂交检测方法的杂交效率仍需要进一步优化，最好是能缩短检测时间，提高检测效率，对此，发明人也是做了多种努力和尝试。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种检测时间短且检测效果良好的CK8基因表达检测试剂盒(原位杂交法)，通过原位杂交法检测生物样本中CK8基因的表达水平，提供临床相关辅助信息。
具体技术方案为：
一种CK8基因表达检测试剂盒，包括针对检测CK8基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括末端修饰有荧光基团的扩增探针H1和末端修饰有荧光基团的扩增探针H2；其中，
所述捕获探针用于连接CK8基因mRNA与扩增探针H1，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：P1序列、间隔臂序列、能与CK8基因mRNA结合的特异性P2序列；所述P1序列为长度为24～26bp，不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与特异性P2序列和CK8基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；所述特异性P2序列长度为18～24bp，且特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处有2～8个碱基进行了锁核酸修饰(LNA修饰)；
所述扩增探针H1为双荧光标记的发夹结构，用于连接捕获探针与扩增探针H2，每条扩增探针H1从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与捕获探针P1序列互补配对的P3序列、P4序列；所述P3序列的3’端碱基与P4序列的3’端碱基互补配对形成发夹结构，P3序列的5’端和P4序列的3’端均修饰有相同的荧光基团；所述P4序列为长度为24～26bp，探针内部不形成二聚体、不存在发夹结构、不存在错配，与P1、P2和CK8基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述扩增探针H2为双荧光标记的发夹结构，用于连接扩增探针H1，每条扩增探针H2从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与扩增探针H1的P3序列互补配对的P1序列、能与扩增探针H1的P4序列互补配对的P5序列；所述P1序列与捕获探针的P1序列碱基组成相同；所述P1序列5’端碱基与P5序列的5’端碱基互补配对形成发夹结构，P1序列的5’端和P5序列的3’端均修饰有与扩增探针H1相同的荧光基团。
在其中一些实施例中，优选所述每条捕获探针中特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处有2～4个碱基进行了锁核酸修饰。
在其中一些实施例中，优选所述每条捕获探针中特异性P2序列从3’端到5’端的第2～5个碱基处有2～4个碱基进行了锁核酸修饰。
在其中一些实施例中，针对CK8基因mRNA的捕获探针中，P1序列为SEQ ID NO.1，特异性P2序列选自SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.12中的5条或5条以上；
和/或，针对CK8基因mRNA的扩增探针H1中，P3序列为SEQ ID NO.23，P4序列为SEQID NO.25；
和/或，针对CK8基因mRNA的扩增探针H2中，P5序列为SEQ ID NO.27。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括针对内参基因的mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括末端修饰有荧光基团的扩增探针H1和末端修饰有荧光基团的扩增探针H2；其中，
所述捕获探针用于连接内参基因mRNA与扩增探针H1，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：P1序列、间隔臂序列、能与内参基因mRNA结合的特异性P2序列；所述P1序列为长度为24～26bp，不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与特异性P2序列和内参基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；所述特异性P2序列长度为18～24bp，且特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处有2～8个碱基进行了锁核酸修饰；
所述扩增探针H1为双荧光标记的发夹结构，用于连接捕获探针与扩增探针H2，每条扩增探针H1从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与捕获探针P1序列互补配对的P3序列、P4序列；所述P3序列的3’端碱基与P4序列的3’端碱基互补配对形成发夹结构，P3序列的5’端和P4序列的3’端均修饰有相同的荧光基团；所述P4序列为长度为24～26bp，探针内部不形成二聚体、不存在发夹结构、不存在错配，与P1、P2和内参基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述扩增探针H2为双荧光标记的发夹结构，用于连接扩增探针H1，每条扩增探针H2从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与扩增探针H1的P3序列互补配对的P1序列、能与扩增探针H1的P4序列互补配对的P5序列；所述P1序列与捕获探针的P1序列碱基组成相同；所述P1序列5’端碱基与P5序列的5’端碱基互补配对形成发夹结构，P1序列的5’端和P5序列的3’端均修饰有与扩增探针H1相同的荧光基团，且所述荧光基团与针对CK8基因mRNA扩增探针的荧光基团互不相同。
在其中一些实施例中，所述内参基因为ACTB基因；针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，P1序列为SEQ ID NO.2，特异性P2序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.22中的5条或5条以上；针对ACTB基因mRNA的扩增探针H1中，P3序列为SEQ ID NO.24，P4序列为SEQ IDNO.26；针对ACTB基因mRNA的扩增探针H2中，P5序列为SEQ ID NO.28。
在其中一些实施例中，所述间隔臂序列的长度为5～10个碱基；优选地，所述间隔臂序列为5～10个胸腺嘧啶(T)。
在其中一些实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750。
本发明还提供了一种非疾病诊断目的的CK8基因表达检测方法，包括以下步骤：
对待检测细胞进行处理，使待检测细胞的mRNA暴露，利用上述试剂盒检测CK8基因是否表达：
a)捕获探针杂交，捕获探针特异性P2序列与目标基因mRNA序列特异性结合；
b)扩增杂交，捕获探针的P1序列与扩增探针H1的P3序列特异性结合，扩增探针H1的P4序列与扩增探针H2的P5特异性结合；扩增探针H2的P1序列与扩增探针H1的P3序列特异性结合，如此循环，荧光标记目标基因mRNA序列的同时荧光基团不断累加实现目标信号放大；
c)通过荧光检测仪检测。
在其中一些实施例中，步骤a)所述捕获探针杂交的条件为：40±1℃孵育1～3小时。
在其中一些实施例中，优选步骤a)所述捕获探针杂交的条件为：40±1℃孵育1.5～2小时。
在其中一些实施例中，更优选地，步骤a)所述捕获探针杂交的条件为：40±1℃孵育2小时。
在其中一些实施例中，步骤b)所述扩增杂交的条件为40±1℃避光孵育10～30分钟.。
在其中一些实施例中，优选步骤b)所述扩增杂交的条件为40±1℃避光孵育12～15分钟。
在其中一些实施例中，更优选地，步骤b)所述扩增杂交的条件为40±1℃避光孵育15分钟。
在其中一些实施例中，优选所述捕获探针、扩增探针H1和扩增探针H2的摩尔比为3：0.66：0.66。
在其中一些实施例中，所述检测方法还包括以下前处理步骤：
(1)得到生物样本；
(2)富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述生物样本包括但并不局限于以下来源：人或动物的外周循环血、胸腔积液、腹水、脐带血、羊水、骨髓或培养的人或动物细胞。
本发明的检测原理如下：
当所述捕获探针中的特异性P2序列与目标mRNA完全互补配对时，捕获探针的P1序列会与扩增探针H1的P3序列杂交结合，导致扩增探针H1的发夹结构被打开，并暴露出可以与扩增探针H2的P5序列互补配对的P4序列，P4序列与扩增探针H2的P5序列特异性结合，扩增探针H2的发夹结构被打开，并暴露出可以与扩增探针H1的P3序列互补配对的P1序列，如此循环形成稳定的带有荧光基团的DNA长链，荧光标记目标mRNA序列的同时荧光基团得以累加，实现目标mRNA的信号放大。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过在所设计的捕获探针特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处对2～8个碱基进行锁核酸修饰，可明显提高捕获探针的细胞穿透性、杂交特异性和对CK8基因mRNA的识别能力和亲和力，增加CK8基因mRNA-捕获探针杂交体的稳定性，有效缩短捕获探针与CK8基因mRNA完全杂交需要的时间。以上设计的所述捕获探针能很好地应用于本发明多探针检测体系中，可以在保证所述多探针检测体系检测准确性的同时明显缩短检测时间；尤其是当所述捕获探针的特异性P2序列从3’端到5’端的第2～5个碱基处有2～4个碱基进行了锁核酸修饰时，检测效果更好。同时，本发明还相应地对多探针检测体系中的信号放大系统进行了改进，所述信号放大系统采用双荧光标记的发夹结构扩增探针H1和扩增探针H2，可循环形成稳定的带有荧光基团的DNA长链，从而更好地实现CK8基因mRNA的信号放大；而改进后的信号放大系统由于具有更高效的信号放大功能，又可在保证检测信号强度的同时更进一步缩短扩增杂交的时间。此外，本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高，从而，所述探针组合使得检测试剂盒和检测方法形成一个效果优良的检测系统。
本发明所述试剂盒主要通过优化多探针检测体系捕获探针中经锁核酸修饰的碱基位置和数量，信号放大系统中扩增探针的结构，以及各类探针的碱基组成和长度，可在提高检测灵敏度和准确率的同时进一步缩短检测时间，提高检测效率，从而更好地进行CK8基因表达检测。
附图说明
图1为本发明CK8基因阴性和阳性检测结果示意图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
实施例1一种CK8基因表达检测试剂盒及检测方法
本实施例所述的细胞角蛋白8(CK8)基因表达检测试剂盒(原位杂交法)，主要包括有：
1.捕获探针
每条捕获探针由三部分碱基序列组成，从5’端到3’端依次是能与扩增探针H1的P3序列结合的P1序列、间隔臂序列、能与待检测目标mRNA结合的特异性P2序列。针对同一目标mRNA的捕获探针中的P1序列相同。所述P1序列为长度为24～26bp，不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与特异性P2和CK8基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；所述特异性P2序列长度为18～24bp，且特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处有2～8个碱基进行了锁核酸修饰；所述间隔臂为用于将捕获探针P1序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5～10个T，本实施例优选为5个T。优选地，本实施例所述捕获探针在特异性P2序列从3’端到5’端的第2～5个碱基处有2～4个碱基进行了LNA修饰。针对每个mRNA分别设计10条捕获探针，在保证整个检测系统的稳定性的基础上，再提高检测的特异性(具体使用时，针对每个目标基因，选择5条或5条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的目标mRNA捕获探针的P1序列见表1，特异性P2序列见表2。
表1捕获探针的P1序列
表2捕获探针的特异性P2序列
其中，捕获探针特异性P2序列中下划线标记的碱基经LNA修饰。
2.扩增探针H1
扩增探针H1是连接捕获探针与扩增探针H2之间的序列，扩增探针H1由两部分碱基序列组成，从5’端到3’端的碱基组成依次是能与捕获探针P1序列互补配对的P3序列、P4序列，所述P4序列为长度为24～26bp，探针内部不形成二聚体、不存在发夹结构、不存在错配，与P1、P2和目标mRNA之间均不存在特异性结合的序列。扩增探针H1采用双标记的发夹型探针设计，P3序列的3’端碱基与P4序列的3’端碱基互补配对形成发夹结构，P3序列的5’端和P4序列的3’端均修饰有荧光基团。扩增探针H1的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor750，不同目标mRNA的扩增探针选择的荧光基团互不相同，且选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的目标mRNA。针对相应的目标mRNA的扩增探针H1的P3序列见表3，P4序列见表4。
表3扩增探针H1的P3序列
mRNA 扩增探针H1的P3序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CK8 TCTAGTCGTTGATGCTTTGTATTCGG 23
ACTB GAACACACTTCAGCGCATAGTGCACA 24
表4扩增探针H1的P4序列
mRNA 扩增探针H1的P4序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CK8 CGACAGATAACCGAATACAAAGCATC 25
ACTB CCTTGACAAGTGTGCACTATGCGCTG 26
3.扩增探针H2
扩增探针H2用于连接扩增探针H1，使荧光基团得以累加，实现信号放大。扩增探针H2由两部分碱基序列组成，从5’端到3’端的碱基组成依次是能与扩增探针H1的P3序列互补配对的P1序列、能与扩增探针H1的P4序列互补配对的P5序列，所述P1序列与捕获探针的P1序列碱基组成相同。所述扩增探针H2也是双标记的发夹型探针，P1序列5’端碱基与P5序列的5’端碱基互补配对形成发夹结构，P1序列的5’端和P5序列的3’端均修饰有荧光基团。扩增探针H2的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，同一目标mRNA的扩增探针H2选择的荧光基团与其对应扩增探针H1选择的荧光基团相同，以便荧光基团累加实现信号放大；不同目标mRNA的扩增探针选择的荧光基团互不相同，且选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的目标mRNA。针对相应的目标mRNA的扩增探针H2的P1序列见表1，P5序列见表5。
表5扩增探针H2的P5序列
mRNA 扩增探针H2的P5序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CK8 GATGCTTTGTATTCGGTTATCTGTCG 27
ACTB CAGCGCATAGTGCACACTTGTCAAGG 28
本实施例还涉及利用上述试剂盒进行CK8基因表达的检测方法，主要包括以下步骤：
(1)得到生物样本；
(2)富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(4)使用上述试剂盒检测CK8基因是否表达。
所述步骤(4)中的上述试剂盒检测CK8基因是否表达，包括以下步骤：
a)捕获探针杂交，捕获探针的特异性P2序列与目标基因mRNA序列特异性结合；
b)扩增杂交，捕获探针的P1序列与带有荧光基团修饰的扩增探针H1的P3序列特异性结合，扩增探针H1的P4序列与带有荧光基团修饰的扩增探针H2的P5特异性结合，扩增探针H2的P1序列与扩增探针H1的P3序列特异性结合，如此循环，荧光标记目标mRNA序列的同时荧光基团不断累加实现目标信号放大；
c)通过荧光检测仪检测。
实施例2运用实施例1中试剂盒对样本进行检测
(一)、检测试剂配置
所述各种溶液的配方如表6：
表6
本实施例优选肿瘤患者血液样本，对样本中循环肿瘤细胞CK8基因表达水平进行检测，其中捕获探针混合液、扩增探针混合液H1、扩增探针混合液H2均使用实施例1所述相应列表中的全部探针。
(二)、检测步骤
1、抽取患者静脉中血液5ml于真空采血管中，得到血液样本。
2、样本前处理，待检测细胞过滤至滤膜上。
3、透化处理。
4、消化细胞，暴露mRNA，使其便于与探针杂交。
(1)配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成如下：48.75μL的PBS、1.25μL的消化酶，总体积50μL。
(2)按实验需要配制一定体积的消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μL。
(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，室温静置1小时。
(4)去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
5、捕获探针杂交，探针特异性序列与目标mRNA序列结合。
(1)捕获缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟。
(2)配制捕获工作液：对于每个样本，捕获工作液组成如下：8μl捕获混合液、42μl捕获缓冲液(40℃预热)，总体积50μl。按实验需要配制一定体积的捕获工作液，涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μl。
(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中捕获工作液上，盖上24孔板盖，40±1℃孵育2小时(本实施例捕获探针的杂交时间优选为2小时，可参考实施例6)。
(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
6、扩增杂交，荧光标记目标mRNA的同时荧光基团不断累加实现目标信号放大。
(1)扩增缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；整个扩增杂交操作过程需避光操作。
(2)配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成如下：2μl扩增混合液H1、2μl扩增混合液H2、46μl扩增缓冲液(40℃预热)，总体积50μl。按实验需要配制一定体积的扩增工作液，避光涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μl。
(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，盖上24孔板盖，40±1℃避光孵育15分钟(本实施例扩增探针的杂交时间优选为15分钟，可参考实施例9)。
(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
7、荧光显微镜观察CK8基因的表达。
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
(1)将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于－20℃保存。
(2)通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量。
(3)根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。
(4)重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表7荧光基团的激发波长和发射波长
荧光基团 激发波长(Excitation filter) 发射波长(Emission filter)
DAPI 330～385nm 420nm
Alexa Fluor 488 460～495nm 510～550nm
Cy3 545～580nm 610nm
8、检测结果判断及分析。
(1)CK8基因表达判定标准(即本试剂盒阳性表达判定标准，参见图1)。
a)样本中有1个或1个以上细胞表达CK8基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中有1个或1个以上细胞在Alexa Fluor 488通道下能够显示绿色荧光信号点。
b)样本中所有细胞均表达内参基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中所有细胞在Cy3通道下均显示红色荧光信号点。
本发明所述试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对CK8基因mRNA和内参基因mRNA，通过荧光信号的表达，判断检测的细胞是否为表达CK8基因。
(2)使用上述检测方法，对15例肿瘤患者外周血样本(编号1～15)进行检测，同时选用市售CK8阳性肺癌细胞株NCl-H1975和阴性表达细胞株CCRF-HSB-2淋巴母细胞分别作为阳性对照和阴性对照，＝分别各取约1000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份编号16～20和21～25，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。每个标本重复检测三次。具体结果如表8所示：
表8样本检测结果
检测发现，针对不同肿瘤患者样本，其临床检测结果与本发明试剂盒检测结果均一致；针对不同细胞待检样本，其每次检测结果均相同，且从上述检测结果可知，本发明所述细胞角蛋白8(CK8)基因表达检测试剂盒(原位杂交法)具有良好特异性和灵敏度，能实现临床样本检测。本发明试剂盒与临床检测结果具有100％的吻合率，说明本发明试剂盒设计的探针组成的检测体系能对患者循环肿瘤细胞中CK8基因的表达进行精准检测，具有很高的准确率。
实施例3不同类型捕获探针对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(捕获探针设计)
为了评估不同类型捕获探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-2，实验组1选用本发明实施例1所述试剂盒中的捕获探针；实验2组选用现有的线性寡核苷酸探针，两组除了实验组2线性寡核苷酸探针的碱基不经LNA修饰外，其它组分均相同。具体设计如表9所示。
表9试剂盒捕获探针的选择
实验组 捕获探针类型
实验组1 本发明捕获探针
实验组2 现有的线性寡核苷酸探针
2、样本检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测步骤和方法对10例肿瘤患者血液样本(依次编号为1～10)进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表10试剂盒选用不同捕获探针的检测结果比较
从以上检测结果可知，与现有的线性捕获探针(本实施例实验组2)相比，使用本发明设计的捕获探针(本实施例实验组1)的试剂盒检测准确性具有更高，其检测结果与临床检测结果100％吻合。现有的线性寡核苷酸探针的细胞穿透性及其对靶核酸的识别能力和亲和力不如本发明所述捕获探针，其可能是由于使用实施例2所述检测方法时，杂交时间较短(2h)，从而不能实现现有线性寡核苷酸探针与靶mRNA的完全杂交，所以在探针杂交过程中难以避免探针分子未能与靶核酸结合造成特异性荧光信号丢失，因此现有的线性寡核苷酸探针的灵敏度低于本发明所述捕获探针，导致一些阳性细胞未能检出，甚至产生假阴性结果(如7号样本)。此外，现有的线性寡核苷酸探针由于不能区分正确配对和错误配对序列，故存在一些非特异性杂交，导致一些假阳性结果的产生(如5号样本)。本发明所述捕获探针通过在特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处对2～8个碱基进行LNA修饰，使得所述捕获探针在更短的时间内即可准确实现检测，保证了检测的准确率，提高检测效率。
实施例4捕获探针LNA修饰的碱基数目对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(捕获探针LNA修饰的碱基数目设计)
为了考察捕获探针中LNA修饰的碱基数目对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-4，四组实验组捕获探针的特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处对碱基进行LNA修饰，且修饰的碱基数目分别为0～1个、2～4个、5～8个、9～12个(碱基修饰位置为特异性P2序列从3’端到5’端的第2～13个碱基处)，各实验组除了捕获探针LNA修饰的碱基数目不同之外，其它组分均相同。具体设计如表11所示。
表11捕获探针LNA修饰碱基数目设计
2、样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约4000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为20份，依次编号1～20和21～40。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～40进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表12不同LNA修饰碱基数目的捕获探针的检测结果比较
从上述检测结果可知，当使用特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处2有2～4个碱基或5～8个碱基进行LNA修饰的捕获探针(本实施例实验组2和实验组3)时，所有阳性细胞都能被检出，且检测到的平均荧光点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳。当使用特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处有0～1个碱基进行LNA修饰的捕获探针(本实施例实验组1)时，存在个别阳性细胞未能被检出的现象，且检测到的平均荧光点数相较于实验组2和实验组3明显较少。当使用特异性P2序列从3’端到5’端的第2～13个碱基处有9～12个碱基进行LNA修饰的捕获探针(本实施例实验组4)时，虽然所有阳性细胞均能被检出，但是检测到的平均荧光点数相较于实验组2和实验组3稍有减少。说明当LNA修饰碱基数目过少时无法有效提高捕获探针对靶核酸的识别能力和亲和力，从而不能有效提高捕获探针与靶核酸的结合能力；当捕获探针的LNA修饰碱基数目为2～8个时，才能有效地提高捕获探针对靶核酸的识别能力和亲和力，从而有效提高捕获探针与靶核酸的结合能力，使得捕获探针的检测稳定性和检测效果才都很好；但当LNA修饰碱基数目继续增加至9～12个并不会进一步提高检测效果，可能原因在于随着锁核酸修饰的数目增多，捕获探针与目标mRNA的结合力已达到饱和。因此，本发明针对CK8的检测设计的捕获探针中从3’端到5’端的第2～9个碱基处有2～8个碱基进行了LNA修饰可以很好地提高所述捕获探针的检测效果，本发明优选有2～4个碱基进行了LNA修饰。
实施例5捕获探针LNA修饰的碱基位置对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(捕获探针LNA修饰的碱基位置设计)
为了考察捕获探针LNA修饰的碱基位置对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-4，实验组1选用本发明实施例1所述试剂盒中的捕获探针，其特异性P2序列从3’端到5’端的第2～5个碱基处(以下描述为近3’端)有2～4个碱基进行了LNA修饰；实验组2选用的捕获探针设计为捕获探针P2序列从5’端到3’端的第2～5个碱基处(以下描述为近5’端)有2～4个碱基进行了LNA修饰；实验组3选用的捕获探针设计为捕获探针P1序列从3’端到5’端的第2～5个碱基处(以下描述为近3’端)有2～4个碱基进行了LNA修饰；实验组4选用的捕获探针设计为捕获探针P1序列从5’端到3’端的第2～5个碱基处(以下描述为近5’端)有2～4个碱基进行了LNA修饰；四组除了捕获探针LNA修饰的碱基位置不同之外，LNA修饰的碱基数目相同，其它组分均相同。具体设计如表13所示。
表13捕获探针LNA修饰碱基位置设计
2、样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约4000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为20份，依次编号1～20和21～40。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～40进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表14P2序列和P1序列近3’端或5’端经LNA修饰的捕获探针的检测结果比较
从上述检测结果可知，当使用本发明设计的特异性P2序列近3’端有2～4个碱基进行LNA修饰的捕获探针(本实施例实验组1)或使用P2序列近5’端有2～4个碱基进行LNA修饰的捕获探针(本实施例实验组2)时，所有阳性细胞都能被检出；而当使用P1序列近3’端或5’端有2～4个碱基进行LNA修饰的捕获探针(本实施例实验组3和4)时，存在个别阳性细胞未能被检出的现象；与特异性P2序列近5’端、P1序列近3’端或5’端有2～4个碱基经LNA修饰的捕获探针(本实施例实验组2-4)相比，本发明设计的特异性P2序列近3’端有2～4个碱基经LNA修饰的捕获探针(本实施例实验组1)检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳。说明本发明设计的特异性P2序列近3’端有2～4个碱基经LNA修饰的捕获探针具有更高的灵敏度、稳定性和准确率。
实施例6捕获探针杂交时间对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(捕获探针杂交时间的设计)
为了评估捕获探针杂交时间对试剂盒的检测效果，设计实验组1-3和对照组1-3，杂交时间依次设置为1小时、2小时和3小时，实验组1-3选用本发明试剂盒中的捕获探针，对照组选用现有的线性寡核苷酸探针，即对照组使用的试剂盒除了所述线性寡核苷酸探针的碱基不经LNAx修饰外，其它均与实验组试剂盒相同，使用实施例1所述试剂盒和对照组试剂盒进行检测，对比其检测效果。具体设计如表15所示。
表15试剂盒捕获探针杂交时间的选择
2、样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。采用上述设计的试剂盒捕获探针杂交时间，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组/对照组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表16不同捕获探针不同杂交时间的检测结果比较
从上述检测结果可知，三组实验组捕获探针杂交时间为1小时、2小时和3小时均可完成检测，其特异性和稳定性都很好，同时，与本发明捕获探针杂交1小时相比，当本发明捕获探针杂交时间为2小时或3小时时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；而对照组捕获探针杂交1小时或2小时均存在大量阳性细胞漏检的现象，无法完成准确检测，检出的荧光信号点数也都明显少于三组实验组，只有杂交3小时才能实现准确检测，其检出的细胞数和荧光信号点数与实验组2、实验组3相差不大；说明本发明捕获探针相较于现有线性寡核苷酸探针检测效果更佳，可提高杂交速度。为保障试剂盒检测结果的准确性同时节省时间成本，本发明的捕获探针杂交时间优选为2小时。
实施例7信号放大系统组成对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(信号放大系统组成设计)
本发明试剂盒，针对CK8的检测设计的信号放大系统由末端修饰有荧光基团的扩增探针H1和末端修饰有荧光基团的扩增探针H2组成。当捕获探针中的特异性P2序列与目标mRNA完全互补配对时，捕获探针的P1序列会与扩增探针H1的P3序列杂交结合，导致扩增探针H1的发夹结构被打开，并暴露出可以与扩增探针H2的P5序列互补配对的P4序列，P4序列与扩增探针H2的P5序列特异性结合，扩增探针H2的发夹结构被打开，并暴露出可以与扩增探针H1的P3序列互补配对的P1序列，如此循环形成稳定的带有荧光基团的DNA长链，荧光标记目标mRNA序列的同时荧光基团得以累加，实现目标mRNA的信号放大。因此，相较于由末端不带荧光基团的扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针组成的常规信号放大系统，本发明的信号放大系统的信号放大效果更佳。
为了评估不同组成信号放大系统的试剂盒的检测效果，设计实验组1-2，其中实验组1选用本发明试剂盒中的信号放大系统，其组成包括末端修饰有荧光基团的扩增探针H1和末端修饰有荧光基团的扩增探针H2；实验组2选用常规的信号放大系统，其组成包括末端不带荧光基团的扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针，两个实验组除了信号放大系统组成不同外，其它组分均相同。具体设计如表17所示。
表17信号放大系统组成的选择
2、样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，分别各取约2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。采用上述设计制备的试剂盒，按照实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表18不同组成信号放大系统的检测结果比较
从上述检测结果可知，当使用本发明设计的信号放大系统(本实施例实验组1)时，所有阳性细胞都能被检出；而当使用常规信号放大系统(本实施例实验组2)时，存在个别阳性细胞未能被检出的现象。与常规信号放大系统(本实施例实验组2)相比，本发明设计的信号放大系统(本实施例实验组1)检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；说明本发明设计的信号放大系统具有更高的灵敏度、稳定性和准确率。
实施例8扩增探针结构对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(扩增探针结构设计)
本发明针对CK8的检测设计的扩增探针H1和扩增探针H2均采用双标记的发夹型探针设计，扩增探针H1的P3序列的3’端碱基与P4序列的3’端碱基互补配对形成发夹结构，P3序列的5’端和P4序列的3’端均修饰有荧光基团，扩增探针H2的P1序列5’端碱基与P5序列的5’端碱基互补配对形成发夹结构，P1序列的5’端和P5序列的3’端均修饰有荧光基团。与常规标记线性寡核苷酸探针相比，这种双标记的发夹型探针的使用既可提高扩增探针的杂交特异性又可提高检测荧光信号。
为了评估不同结构扩增探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-4，其中实验组1选用本发明双标记的发夹型探针设计的扩增探针H1和H2，实验组2选用双标记的线性扩增探针设计，实验组3选用单标记的发夹型扩增探针设计，实验组4选用单标记的线性扩增探针设计，四个实验组除了扩增探针结构不同之外，其它组份均相同。具体设计如表19所示。
表19扩增探针结构的选择
上表中所述P1、P3、P4、P5序列和荧光基团均采用实施例1试剂盒相应列表中的相应序列和荧光基团，所述P6序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P3和目标mRNA之间均不存在特异性结合的序列；所述P7序列为能与P6序列互补配对的序列。针对相应的目标mRNA的扩增探针的P6序列见表20，P7序列见表21。
表20线性扩增探针的P6序列
mRNA 线性扩增探针P6序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CK8 CACGTGCTACGTTACGCGGTAACTTG 31
ACTB GCATACGTAAGTGCTGACAGTAGCTC 32
表21线性扩增探针的P7序列
2、样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，分别各取约4000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为20份，依次编号1～20和21～40。采用上述设计制备的试剂盒，按照实施例2所述检测过程和方法对样本1～40进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表22不同结构扩增探针的检测结果比较
从上述检测结果可知，当使用双标记的发夹型探针设计的扩增探针时(本实施例实验组1)，试剂盒检测效果最好，能将样本中阳性细胞完全检出，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定；当使用双标记的线性扩增探针时(本实施例实验组2)，虽然检测到的荧光信号点数较多，但是线性探针由于不能区分两端几个碱基的差异，可能存在一些非特异性杂交，导致个别CK8阴性细胞被检出微弱的CK8阳性信号，导致假阳性结果的产生；当使用单标记的发夹型扩增探针时(本实施例实验组3)，存在个别阳性细胞不能有效被检出，检测到的荧光信号点数也相对较少；当使用单标记的单标记的线性扩增探针时(本实施例实验组4)，不仅存在个别CK8阴性细胞被检出微弱的CK8阳性信号，检测到的荧光信号点数也相对较少。上述结果说明本发明双标记的发夹型探针具有良好的杂交特异性以及良好的荧光信号放大效果。因此，本发明试剂盒的扩增探针均采用双标记的发夹型探针设计。
实施例9扩增探针杂交时间对试剂盒检测效果的影响
为了评估扩增探针杂交时间对试剂盒的检测效果，设计实验组1-3和对照组1-3，扩增杂交时间依次设置为10分钟、15分钟和30分钟，实验组1-3选用本发明试剂盒中的扩增探针，对照组1-3选用现有标记探针，两组除了扩增/标记探针不同之外，其它组份均相同，使用实施例1的试剂盒进行检测，对比其检测效果。具体设计如表23所示。
表23试剂盒扩增探针杂交时间的选择
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。采用上述设计的实验方案设置不同扩增探针杂交时间，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组/对照组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表24扩增探针不同杂交时间的检测结果比较
从上述检测结果可知，三组实验组扩增探针杂交时间为10分钟、15分钟和30分钟均可完成检测，其特异性和稳定性都很好，同时，与本发明扩增探针杂交10分钟相比，当本发明扩增探针杂交时间为15分钟或30分钟时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；而对照组使用现有标记探针杂交10分钟或15分钟均存在大量阳性细胞漏检的现象，无法完成准确检测，检出的荧光信号点数也都明显少于三组实验组，只有杂交30分钟才能实现准确检测，其检出的细胞数和荧光信号点数与实验组2、实验组3相差不大；说明本发明扩增探针相较于现有标记探针检测效果更佳，在短时间内即可实现好的检测。为保障试剂盒检测结果的准确性同时节省时间成本，本发明的扩增探针杂交时间优选为15分钟。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种CK8基因表达检测试剂盒
<130> 2020-06-20
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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<400> 4
accgcgaaag ttgctgctgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tctgctgctc caggaaccgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tgcatgttgc caagctccgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aggcgagact ccagctctac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cagcaatgat gctgtccatg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
catctcagag atctcagtct 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
agctcggaca acttggcgtt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ctccagcagc ttcctgtagg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
agctggagcc cgcgccagag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
agccgttgtc gacgacgagc 20
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
cacataggaa tccttctgac 20
<210> 15
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<212> DNA
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<400> 15
cacgcagctc attgtagaag 20
<210> 16
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<400> 16
gcctggatag caacgtacat 20
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<400> 17
gtccagacgc aggatggcat 20
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ccttaatgtc acgcacgatt 20
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ggcagctcgt agctcttctc 20
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ttcgtggatg ccacaggact 20
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tctgcatcct gtcggcaatg 20
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cagcgaggcc aggatggagc 20
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tctagtcgtt gatgctttgt attcgg 26
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gaacacactt cagcgcatag tgcaca 26
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cgacagataa ccgaatacaa agcatc 26
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ccttgacaag tgtgcactat gcgctg 26
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gatgctttgt attcggttat ctgtcg 26
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cagcgcatag tgcacacttg tcaagg 26

Claims (12)

1.一种CK8基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对检测CK8基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括末端修饰有荧光基团的扩增探针H1和末端修饰有荧光基团的扩增探针H2；其中，
所述捕获探针用于连接CK8基因mRNA与扩增探针H1，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：P1序列、间隔臂序列、能与CK8基因mRNA结合的特异性P2序列；所述P1序列为长度为24～26bp，不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与特异性P2序列和CK8基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；所述特异性P2序列长度为18～24bp，且特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处有2～8个碱基进行了锁核酸修饰；
所述扩增探针H1为双荧光标记的发夹结构，用于连接捕获探针与扩增探针H2，每条扩增探针H1从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与捕获探针P1序列互补配对的P3序列、P4序列；所述P3序列的3’端碱基与P4序列的3’端碱基互补配对形成发夹结构，P3序列的5’端和P4序列的3’端均修饰有相同的荧光基团；所述P4序列为长度为24～26bp，探针内部不形成二聚体、不存在发夹结构、不存在错配，与P1、P2和CK8基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述扩增探针H2为双荧光标记的发夹结构，用于连接扩增探针H1，每条扩增探针H2从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与扩增探针H1的P3序列互补配对的P1序列、能与扩增探针H1的P4序列互补配对的P5序列；所述P1序列与捕获探针的P1序列碱基组成相同；所述P1序列5’端碱基与P5序列的5’端碱基互补配对形成发夹结构，P1序列的5’端和P5序列的3’端均修饰有与扩增探针H1相同的荧光基团；
针对CK8基因mRNA的捕获探针中，P1序列为SEQ ID NO.1，特异性P2序列选自SEQ IDNO.3～SEQ ID NO.12中的5条或5条以上；
针对CK8基因mRNA的扩增探针H1中，P3序列为SEQ ID NO.23，P4序列为SEQ ID NO.25；
针对CK8基因mRNA的扩增探针H2中，P5序列为SEQ ID NO.27。
2.根据权利要求1所述的CK8基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述每条捕获探针中特异性P2序列从3’端到5’端的第2～8个碱基处有2～4个碱基进行了锁核酸修饰。
3.根据权利要求2所述的CK8基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述每条捕获探针中特异性P2序列从3’端到5’端的第2～5个碱基处有2～4个碱基进行了锁核酸修饰。
4.根据权利要求1所述的CK8基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对内参基因的mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括末端修饰有荧光基团的扩增探针H1和末端修饰有荧光基团的扩增探针H2；其中，
所述捕获探针用于连接内参基因mRNA与扩增探针H1，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：P1序列、间隔臂序列、能与内参基因mRNA结合的特异性P2序列；所述P1序列为长度为24～26bp，不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与特异性P2序列和内参基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；所述特异性P2序列长度为18～24bp，且特异性P2序列从3’端到5’端的第2～9个碱基处有2～8个碱基进行了锁核酸修饰；
所述扩增探针H1为双荧光标记的发夹结构，用于连接捕获探针与扩增探针H2，每条扩增探针H1从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与捕获探针P1序列互补配对的P3序列、P4序列；所述P3序列的3’端碱基与P4序列的3’端碱基互补配对形成发夹结构，P3序列的5’端和P4序列的3’端均修饰有相同的荧光基团；所述P4序列为长度为24～26bp，探针内部不形成二聚体、不存在发夹结构、不存在错配，与P1、P2和内参基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述扩增探针H2为双荧光标记的发夹结构，用于连接扩增探针H1，每条扩增探针H2从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与扩增探针H1的P3序列互补配对的P1序列、能与扩增探针H1的P4序列互补配对的P5序列；所述P1序列与捕获探针的P1序列碱基组成相同；所述P1序列5’端碱基与P5序列的5’端碱基互补配对形成发夹结构，P1序列的5’端和P5序列的3’端均修饰有与扩增探针H1相同的荧光基团，且所述荧光基团与针对CK8基因mRNA扩增探针的荧光基团互不相同。
5.根据权利要求4所述的CK8基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB基因；针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，P1序列为SEQ ID NO.2，特异性P2序列选自SEQ IDNO.13～SEQ ID NO.22中的5条或5条以上；针对ACTB基因mRNA的扩增探针H1中，P3序列为SEQ ID NO.24，P4序列为SEQ ID NO.26；针对ACTB基因mRNA的扩增探针H2中，P5序列为SEQID NO.28。
6.根据权利要求1～5任一项所述的CK8基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列的长度为5～10个碱基。
7.根据权利要求6所述的CK8基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列为5～10个胸腺嘧啶。
8.根据权利要求1～5任一项所述的CK8基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、AlexaFluor 488和Alexa Fluor 750。
9.一种非疾病诊断目的的CK8基因表达检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
对待检测细胞进行处理，使待检测细胞的mRNA暴露，利用权利要求1～8任一项所述试剂盒检测CK8基因是否表达：
a)捕获探针杂交，捕获探针特异性P2序列与目标基因mRNA序列特异性结合；
b)扩增杂交，捕获探针的P1序列与扩增探针H1的P3序列特异性结合，扩增探针H1的P4序列与扩增探针H2的P5特异性结合；扩增探针H2的P1序列与扩增探针H1的P3序列特异性结合，如此循环，荧光标记目标基因mRNA序列的同时荧光基团不断累加实现目标信号放大；
c)通过荧光检测仪检测。
10.根据权利要求9所述的CK8基因表达检测方法，其特征在于，步骤a)所述捕获探针杂交的条件为：40±1℃孵育1～3小时；
步骤b)所述扩增杂交的条件为40±1℃避光孵育10～30分钟。
11.根据权利要求10所述的非疾病诊断目的的CK8基因表达检测方法，其特征在于，所述捕获探针杂交的条件为：40±1℃孵育2小时。
12.根据权利要求10所述的非疾病诊断目的的CK8基因表达检测方法，其特征在于，所述扩增杂交的条件为40±1℃避光孵育15分钟。
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