CN110923323B - 一种Twist基因表达检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种Twist基因表达检测试剂盒，所述试剂盒包括针对检测Twist基因mRNA的假捕获探针、捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和标记探针；其中，所述假捕获探针用于对生物样本进行预杂交，所述捕获探针为自组装聚合分支核酸探针，用于连接目标mRNA和扩增探针，所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，所述标记探针连接扩增探针与荧光基团。上述试剂盒具有灵敏度高、特异性强和准确率高等优点，可用于检测生物样本中Twist基因的表达水平。

Description

一种Twist基因表达检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种Twist基因表达检测试剂盒。
背景技术
Twist基因，是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族成员之一，最初于1987年在果蝇中被发现，其在胚胎发育过程中起关键调控作用(Pei H,et al.,MedChemComm,2017,8,268-275)。迄今为止，脊椎动物中已鉴定出两个Twist基因，分别为Twist 1和Twist 2(又叫Dermo-1)，它们的bHLH和羧基端的功能域有超过90％的相似性；但是，Twist 1的氨基端富含甘氨酸，而Twist 2的氨基端缺少甘氨酸。其中，Twist 1为通常所说的Twist基因。人类Twist基因定位于染色体7p21.1，包含4个外显子。Twist在健康成人组织中很少检测到，但在多种癌症组织如乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、肝癌等中经常高表达。近年来，Twist基因被认为是一种重要的上皮-间质转化(EMT)诱导因子，与肿瘤的侵袭、侵犯和转移有关。
鉴于Twist表达与肿瘤的密切关系，促使我们开发一种Twist基因表达检测试剂盒，该试剂盒将有助于进一步深入研究Twist基因表达在各种肿瘤发生、发展及预后方面的临床意义。
目前Twist表达检测多采用免疫组化和实时定量PCR。免疫组化被认为是检测癌组织样本中Twist蛋白表达的最佳选择(Zeng J et al.,Translational lung cancerresearch,2015,4,236)。但是，该方法是在蛋白水平上检测Twist表达，不同一抗、不同抗体稀释度的使用以及染色方法与评价方法的不同都可能影响免疫组化灵敏度，进而影响检测结果的判读；此外，免疫组化检测Twist蛋白表达的cut-off值标准和cut-off值阈值主观不统一，也将影响检测结果的判读。实时定量PCR是检测Twist基因表达水平常用的方法。该方法具有灵敏度高、序列特异性强等优点；但是，该方法对实验条件的要求较高，从取样开始到最后结果的分析，每一步都必须要严格操作，否则难以确保检测基因表达水平结果的准确和可靠(Bustin S&Nolan T,European journal of clinical investigation,2017,47,756-774)。专利CN102925543A公开了一种白血病病变前期mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用，该专利的试剂盒和检测方法使用以Twist基因为目的基因设计的带标记物的核酸探针通过原位杂交技术可在mRNA水平上检测Twist基因的表达，具有操作方便、简单的特点，但由于不能进行信号放大，因此其灵敏度在一定程度上受到了限制。
为此，有必要开发出一种灵敏度高、特异性强、准确率高的Twist基因检测试剂盒。
发明内容
基于此，本发明提供一种Twist基因表达检测试剂盒，其具有灵敏度高、特异性强和准确率高等优点，可用于生物样本中Twist基因的表达水平。
具体技术方案为：
一种Twist基因表达检测试剂盒，包括针对检测Twist基因mRNA的假捕获探针、捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和标记探针；其中，
(1)假捕获探针：所述假捕获探针用于对生物样本进行预杂交，其为含有逆转录转座子的重复序列的局部序列或含有与所述重复序列各不相同的局部序列的组合，每条假捕获探针的碱基序列长度为20-70bp；所述假捕获探针既不与目标mRNA发生杂交，也不与捕获探针、扩增探针以及标记探针发生杂交；
(2)捕获探针：所述捕获探针为自组装聚合分支核酸探针，用于连接目标mRNA和扩增探针，每条捕获探针由探针结构分别为5’-α1-β1-γ-3’和5’-α2-β2-γ-3’的两种探针共价结合而成，其中，探针序列α1区与α2区互补，β1区与β2区互补，γ区序列从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与待检测目标mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和Twist基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3)扩增探针：所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列，间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和Twist mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(4)标记探针：所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团。
在其中一些实施例中，针对Twist基因mRNA的假捕获探针序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3中至少2条。
在其中一些实施例中，针对Twist基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQID NO.4～SEQ ID NO.13中的5条或5条以上；和/或α1区序列为SEQ ID NO.24，β1区序列为SEQ ID NO.26，α2区序列为SEQ ID NO.28，β2区序列为SEQ ID NO.30，P2序列为SEQ IDNO.32；和/或针对Twist基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.34，P4序列为SEQ IDNO.36；和/或针对Twist基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.38。
在使用捕获探针进行杂交前，以假捕获探针对待检测生物样本进行预杂交处理，可有效防止捕获探针与待检测生物样本中非目标mRNA的非特异性结合，从而提高捕获探针与目标mRNA的特异性结合，进而保证了检测结果的准确性。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括有针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统与针对Twist基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统的结构相同，但标记探针的末端修饰的荧光基团互不相同。使用内参基因，有助于进一步保证检测结果的可靠性。
在其中一些实施例中，所述内参基因为ACTB。
在其中一些实施例中，所述针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.23中的5条或5条以上，α1区序列为SEQ ID NO.25，β1区序列为SEQ ID NO.27，α2区序列为SEQ ID NO.29，β2区序列为SEQ ID NO.31，P2序列为SEQ IDNO.33；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.35，P4序列为SEQ ID NO.37；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.39。
在其中一些实施例中，所述捕获探针的制备方法为：在内表面硅烷化处理的试管中，将探针结构分别为5’-α1-β1-γ-3’和5’-α2-β2-γ-3’的两种探针溶于交联缓冲液中，加热至80℃～94℃变性，然后降温至20℃～25℃，使探针互补形成氢键连接的分支探针链，再采用紫外光处理，使溶液中互补结合的探针间形成共价结合，得到自组装聚合分支核酸探针。
在其中一些实施例中，所述紫外光处理为：波长为254nm、光强为100μJ/cm2的紫外光处理3～4分钟。
在其中一些实施例中，所述5’-α1-β1-γ-3’和5’-α2-β2-γ-3’两种探针的摩尔比为1：1；所述交联缓冲液为含有1.0g/L精氨酸和20g/L聚乙二醇1000的PBS缓冲液。
在其中一些实施例中，所述5’-α1-β1-γ-3’和5’-α2-β2-γ-3’两种探针的摩尔浓度均为10μmol/L。
在其中一些实施例中，所述PBS缓冲液的pH值为7.2、摩尔浓度为0.1mol/L。
在其中一些实施例中，所述间隔臂序列的长度为5～10个碱基；优选所述间隔臂序列的长度为5～10个T。
在其中一些实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750。
本发明还提供了一种非诊断目的的Twist基因表达检测方法。
具体技术方案为：
一种非诊断目的的Twist基因表达的检测方法，包括以下步骤：
(1)得到待检测生物样本；
(2)对样本进行前处理，使mRNA暴露；
(3)检测Twist mRNA是否存在：a)假捕获探针与非目标mRNA序列杂交；b)捕获探针与Twist基因mRNA序列和扩增探针杂交；c)标记探针的P5序列与扩增探针的P4序列杂交，实现目标mRNA信号的级联放大；d)通过荧光检测仪检测。
在其中一些实施例中，所述假捕获探针的使用浓度为捕获探针使用浓度的2～10倍；优选为4～6倍。
在其中一些实施例中，所述假捕获探针的杂交温度为36℃～45℃；更优选地，杂交温度为40±1℃。
在其中一些实施例中，所述假捕获探针的杂交时间为0.5～3h；更优选地，杂交时间为0.5h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明针对目标mRNA捕获探针为自组装聚合分支核酸探针，与常规探针相比，这种自组装聚合分支核酸探针大大提高了探针的空间分布密度，在杂交时，可以提高探针与生物样本中目标mRNA特异性结合的几率，从而提高检测的灵敏度和杂交速度。此外，本发明试剂盒还包含假捕获探针，所述假捕获探针可与待检生物样本中的非目标mRNA结合，在自组装聚合分支核酸探针提高了捕获探针空间分布密度的情况下，降低针对目标mRNA的捕获探针与待检生物样本中的非目标mRNA的非特异性结合的几率，从而提高捕获探针与待检生物样本中目标mRNA特异性结合的几率，进一步提高本发明试剂盒的检测特异性和准确性。发明人经过研究发现，本发明提供的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的假捕获探针可有效降低捕获探针特异性P1序列与待检生物样本中的非Twist基因mRNA的非特异性结合几率。
2、本发明所设计的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的假捕获探针与其他探针能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使检测试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
3、RNA原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本发明采用新型的RNA原位杂交方法，在采用自组装聚合分支核酸探针的基础上，通过由扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针组成的信号放大系统提高荧光信号强度。
附图说明
图1为本发明试剂盒用于检测Twist基因表达的阴性和阳性检测结果示意图；其中，A为Twist基因阴性细胞图，图中细胞带有红色荧光信号点；B为Twist基因阳性细胞图，图中细胞带有红色和绿色荧光信号点。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1Twist基因表达检测试剂盒
本实施例所述的Twist基因表达检测试剂盒，主要包括有：
1.假捕获探针
假捕获探针为含有不同的人转座子的重复序列的局部序列的组合，其既不与目标mRNA发生杂交又不与捕获探针、扩增探针以及末端修饰有荧光基团的标记探针发生杂交。所述假捕获探针用于待检生物样本预杂交处理，可有效防止捕获探针与待检测生物样本中非目标mRNA的非特异性结合，提高检测的特异性(具体使用时，选择至少2条假捕获探针即可达到提高检测的特异性的目的，可参考实施例6和实施例7)。本实施例优选为使用3条假捕获探针，以使检测的特异性达到最好。假捕获探针的序列见表1。
表1假捕获探针的序列
名称 序列(5’-3’) SEQ ID NO.
假捕获探针-1 TAGTCCCAGCTACTCAGGAAGCTGAGGTGGGAGGATGGCT 1
假捕获探针-2 CTTATAAGTGGGAGCTGAACAATGAGAACACATGGACACA 2
假捕获探针-3 GGGAGGGGAACATTGCACACCAGGGCCTGTTGTGGGGGAG 3
2、捕获探针
捕获探针由探针结构分别为5’-α1-β1-γ-3’和5’-α2-β2-γ-3’的两种探针共价结合而成的自组装聚合分支核酸探针，其中，探针序列α1区与α2区互补，β1区与β2区互补，γ区序列从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与待检测目标mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，同一目标mRNA其捕获探针中的α1区、α2区、β1区、β2区以及P2序列均相同。所述间隔臂可将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂，可减少空间位阻，并提高杂交反应效率及特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5～10个T，本实施例优选为5个T。
本发明捕获探针的制备方法如下：在内表面硅烷化处理的Eppendorf管中，将探针结构分别为5’-α1-β1-γ-3’和5’-α2-β2-γ-3’的两种探针各10μmol/L等摩尔浓度溶于交联缓冲液中，加热至80℃～94℃变性1分钟；再自然降温至20℃～25℃，放置5～10分钟，使探针互补形成氢键连接的分支探针链；采用波长为254nm、光强为100μJ/cm2的紫外光处理3～4分钟，使溶液中互补结合的探针间形成共价结合，从而形成稳定的自组装聚合分支核酸探针。这种捕获探针大大提高了探针的空间分布密度，杂交时，可以提高探针与生物样本中靶核酸特异性结合的几率，提高检测的灵敏度和杂交速度。本发明针对每个mRNA分别设计10种捕获探针，在保证整个检测系统的稳定性的基础上，再提高检测的特异性(具体使用时，针对每种目标mRNA，选择5种或5种以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好，可参考实施例4)；本实施例优选为使用10种捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的目标mRNA捕获探针的特异性P1序列见表2，不同类型的mRNA的捕获探针的α1区序列、β1区序列、α2区序列、β2区序列以及P2序列见表3。
表2目标mRNA捕获探针的P1序列
表3捕获探针的α1区、β1区、α2区、β2区以及P2序列
3、扩增探针
扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分组成，5’端是能与捕获探针P2序列互补配对的P3序列，3’端是能与标记探针互补配对的P4序列，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列(本发明的扩增探针间隔臂优选为5～10个T，本实施例优选为5个T)。所述目标mRNA的扩增探针的P4序列内部不存在发夹结构，探针内部和探针间都不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。扩增探针的P3和P4序列见表4。
表4扩增探针的P3和P4序列
mRNA 序列名称 序列(5’-3’) SEQ ID NO.
Twist P3 ATTCCAATATCTTATACTCAATCA 34
ACTB P3 AACATTCATATAACAACATCTTAC 35
Twist P4 GATTGTAAGATTTGATTAAGTGTA 36
ACTB P4 GAATTGTTATTGTTGAGATTAAAG 37
4、标记探针
标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针序列P4互补结合的P5序列，3’端带有荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。标记探针的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LCRED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，不同目标mRNA的标记探针选择的荧光基团互不相同，且选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的目标mRNA。标记探针的P5序列见表5。
表5标记探针的P5序列
mRNA 序列名称 序列(5’-3’) SEQ ID NO. 荧光基团
Twist P5 TACACTTAATCAAATCTTACAATC 38 Alexa Fluor 488(绿色)
ACTB P5 CTTTAATCTCAACAATAACAATTC 39 Cy3(红色)
实施例2运用实施例1中试剂盒对样本进行检测
所述各种溶液的配方如表6：
本实施例优选肿瘤患者血液样本，对样本中循环肿瘤细胞(CTCs)Twist基因表达水平进行检测，其中预捕获混合液、捕获混合液、扩增混合液、显色混合液均使用实施例1的Twist基因表达检测试剂盒相应列表中的全部探针。
1、样本预处理，待检测细胞过滤至滤膜上
(1)收集待检测细胞悬液，600×g水平离心5分钟，弃上清。(2)加入4ml PBS和1ml固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。(3)样本过滤：液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；再加入4ml PBS，洗涤管壁后抽滤液体。(4)将滤膜转移至24孔板中，加入400μl的4％甲醛溶液，室温固定1h。(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次。
2、透化处理
(1)在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余液体，将滤膜倒扣在透化剂上室温孵育5min。(2)去除液体，每孔加入1mlPBS洗涤2次。
3、消化细胞，暴露mRNA，使其便于与探针杂交
(1)配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成如下：48.75μl的PBS、1.25μl的消化酶，总体积50μl。(2)按实验需要配制一定体积的消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，室温静置1小时。(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次。
4、假捕获探针预杂交处理，防止后续目标mRNA捕获探针杂交时的非特异性结合
(1)捕获缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟。(2)配制预捕获工作液：对于每个样本，预捕获工作液组成如下：8μl预捕获混合液、42μl捕获缓冲液(40℃预热)，总体积50μl。按实验需要配制一定体积的预捕获工作液，涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μl。(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中预捕获工作液上。(4)盖上24孔板盖，40±1℃孵育30分钟(本实施例假捕获探针的杂交条件优选为40±1℃孵育30分钟，可参考实施例9和实施例10)。(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次。
5、捕获探针杂交，探针特异性序列与目标mRNA序列结合
(1)捕获缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟。(2)配制捕获工作液：对于每个样本，捕获工作液组成如下：8μl捕获混合液、42μl捕获缓冲液(40℃预热)，即每孔50μl。(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中捕获工作液上。(4)盖上24孔板盖，40±1℃孵育2小时。(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次。
6、扩增杂交，目标mRNA序列信号放大
(1)扩增缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟。(2)配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成如下：2μl扩增混合液、48μl扩增缓冲液(40℃预热)，即每孔50μl。(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上。(4)盖上24孔板盖，40±1℃孵育30分钟。(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次。
7、显色，荧光标记目标信号
(1)显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；整个显色操作过程需避光操作。(2)配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成如下：2μl显色混合液、48μl显色缓冲液(40℃预热)，即每孔50μl。(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色工作液上。(4)盖上24孔板盖，40±1℃避光孵育30分钟。(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次。
8、荧光显微镜观察Twist基因的表达
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
(1)将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于－20℃保存。(2)通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量。(3)根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。(4)再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。(5)重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表7荧光基团的激发波长和发射波长
荧光基团 DAPI Alexa Fluor 488 Cy3
激发波长(Excitation filter) 330～385nm 460～495nm 545～580nm
发射波长(Emission filter) 420nm 510～550nm 610nm
9、检测结果判断及分析
(1)Twist基因表达判定标准
在滤膜上，富集待检测细胞，本试剂盒阳性表达判定标准(参见图1)：
a)样本中有1个或1个以上细胞表达Twist mRNA，在本试剂盒中表现为样本中有1个或1个以上细胞在Alexa Fluor 488通道下能够显示绿色荧光信号点。
b)样本中所有细胞均表达内参基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中所有细胞在Cy3通道下均显示红色荧光信号点。
本试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对Twist mRNA和内参基因mRNA，通过荧光信号的表达，判断检测的细胞是否为表达Twist。
(2)使用上述检测方法，对15例肿瘤患者外周血样本(编号1～15)进行检测，同时选用Twist阳性肺癌细胞株NCl-H1975和阴性表达细胞株CCRF-HSB-2淋巴母细胞作为阴阳性对照，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约1000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份编号16～20和21～25，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。每个标本重复检测三次。
具体结果如表8所示：
表8样本检测结果
检测发现，每个标本的每次检测结果相同，且从上述检测结果可知，本发明Twist基因表达检测试剂盒具有很好的特异性和灵敏度，能有效实现样本的检测。本发明试剂盒与临床检测结果具有100％的吻合率，说明本发明试剂盒设计的探针组成的检测体系能对患者循环肿瘤细胞中Twist的表达进行精准检测，具有很高的准确率。
实施例3捕获探针结构对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(捕获探针结构设计)
为了评估不同结构捕获探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-3，三组除了捕获探针不同之外，其它组分均相同。其中，实验组1选用本发明试剂盒中的自组装聚合分支核酸探针；实验2组选用线性捕获探针，其组成结构从5’端到3’端依次为：α1或α2区序列、β1或β2区序列以及由能与待检测目标mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列组成的γ区序列组成，其α1或α2区序列、β1或β2区序列以及γ区序列的碱基组成与实验组1中的自组装聚合分支核酸探针完全相同；实验3组选用线性捕获探针，其组成结构从从5’端到3’端依次为：能与待检测目标mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，其碱基组成与实验组1中自组装聚合分支核酸探针的γ区序列相同，具体设计如表9所示。
表9试剂盒捕获探针的选择
实验组 捕获探针类型 捕获探针组成(5’-3’)
实验组1 自组装聚合分支核酸探针 探针5’-α1-β1-γ-3’、探针5’-α2-β2-γ-3’经交联共价结合而成
实验组2 线性捕获探针 探针5’-α1-β1-γ-3’、探针5’-α2-β2-γ-3’，未经交联处理，单链
实验组3 线性捕获探针 γ区序列，单链
2、样本检测
本实施例选用细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约5400个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为27份，依次编号1～27和28～54。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～54进行检测；其中，样本1～9和28～36采用的捕获探针杂交时间为1小时，样本10～18和37～45采用的捕获探针杂交时间为2小时，样本19～27和46～54采用的捕获探针杂交时间为3小时，其余操作与实施例2所述相同。读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表10试剂盒选用不同捕获探针在不同杂交时间下的检测结果比较
通过分析检测结果可知，与常规的线性捕获探针(本实施例实验组2和实验组3)相比，本发明设计的自组装聚合分支核酸探针作为捕获探针具有更高的灵敏度、特异性和准确率，检测结果正确率达100％；本发明设计的自组装聚合分支核酸探针杂交时间为1～3小时，为节省时间的同时确保检测结果的准确性，杂交时间优选为2小时。使用自组装聚合分支核酸探针杂交1小时检出的绿色阳性、红色阳性细胞数量就与使用线性捕获探针杂交3小时检出的绿色阳性、红色阳性细胞数量相当；使用线性捕获探针杂交1～2小时，却存在一些绿色阳性、红色阳性细胞未能检出，由此可见，自组装聚合分支核酸探针由于其探针空间分布密度比线性捕获探针高，增加了探针与目标mRNA结合的几率，故检测的灵敏度和杂交速度更高。另外，使用线性捕获探针杂交3小时，个别CCRF-HSB-2细胞却检出绿色阳性信号，由此可见，线性捕获探针分子与滤膜表明接触面积大于自组装聚合分支核酸探针，在探针杂交过程中难以避免探针分子与滤膜本身的结合造成的非特异性荧光背景，因此线性捕获探针的非特异性荧光值高于自组装聚合分支核酸探针，导致一些假阳性结果的产生，故本发明设计的自组装聚合分支核酸探针具有更高的特异性和准确率。
实施例4捕获探针数量的选择
1、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)
为考察捕获探针数量的选择对试剂盒检测效果的影响，以Twist的捕获探针数量选择为例，设计三个实验组，记为实验组1-3，分别选取2条、5条及10条能与待检测目标mRNA结合的特异性序列P1，组成捕获探针，对比其检测效果，试剂盒具体设计参见表11。
表11 Twist捕获探针的选择
实验组 实验组1 实验组2 实验组3
探针数量 2条 5条 10条
捕获探针 SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.8 SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.13
2、样本检测
本实施例选用细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约3000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为15份，依次编号1～15和16～30。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表12 Twist使用不同数量捕获探针的检测结果比较
通过三组实验比对可知，针对Twist的检测，使用2条、5条和10条的捕获探针均可完成检测，但当捕获探针使用5条或以上时，其特异性和稳定性才都很好。其中，当使用全部10条的捕获探针时，Twist检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。
针对ACTB基因mRNA捕获探针的数量的选择实验与上述结果一致，具体数据省略。
实施例5内参基因的运用
1、试剂盒制备的设计(目标检测mRNA的选择)
本发明试剂盒目标检测mRNA包括Twist和ACTB的mRNA，为了检测内参基因的使用对检测效果的影响，设计两组实验组，记为实验组1-2，其中实验组1只检测Twist mRNA，实验组2同时检测Twist和ACTB的mRNA，具体设计如表13所示。
本实施例每组相应目标mRNA的所述捕获探针、扩增探针与标记探针组成和数量、检测方法等如实施例1、2所述。
表13目标检测mRNA选择
实验组 实验组1 实验组2
目标检测mRNA Twist Twist、ACTB
2、样本检测
本实施例选用细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。按照实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。
具体结果如下：
表14试剂盒选用不同检测目标mRNA的检测结果比较
从上述检测结果可知，本发明试剂盒提供的Twist基因mRNA检测系统，既可以单独使用，也可与内参基因ACTB一起联合使用，均能实现Twist基因表达的精确检测，说明本发明提供的检测探针具有很好的特异性，相互之间不产生干扰。使用内参基因，可进一步提高检测结果的可靠性(本实施例实验组2)，实现Twist表达的检测。
实施例6假捕获探针的运用
1、试剂盒制备的设计
为考察假捕获探针的运用对试剂盒检测效果的影响，设计两组实验组，记为实验组1-2，实验组1采用假捕获探针，实验组2不采用假捕获探针，具体设计如表15。
本实施例每组相应目标mRNA的所述捕获探针、扩增探针与标记探针组成和数量、检测方法等如实施例1试剂盒和实施例2所述；实验组1的假捕获探针组成和数量、检测方法等如实施例1试剂盒和实施例2所述；实验组2因未使用假捕获探针，故而按照实施例2所述检测过程和方法进行检测时省略假捕获探针预杂交步骤。
表15试剂盒假捕获探针的运用
实验组 假捕获探针 使用说明
实验组1 SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3 预杂交后捕获探针杂交
实验组2 无 无需预杂交直接捕获探针杂交
2、样本检测
本实施例选用细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。采用上述设计制备的试剂盒，按照实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表16试剂盒使用与不使用假捕获探针的检测结果比较
从上述检测结果可知，针对Twist基因表达的检测，不使用假捕获探针进行预杂交，个别样本可能产生非特异性荧光信号，造成假阳性结果的产生(本实施例实验组2样本17)，但当使用假捕获探针进行预杂交，其特异性和稳定性都很好，检测到的绿色和红色荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳。
实施例7假捕获探针数量的选择
1、试剂盒制备的设计(假捕获探针数量的选择)
本发明Twist基因表达检测试剂盒，针对Twist的检测设计了3条假捕获探针，在实际使用时，可选择至少2条假捕获探针即可达到防止捕获探针与生物样本中其它mRNA的非特异性结合的目的，特异性和稳定性都能达到检测需求。
为考察假捕获探针数量的选择对试剂盒检测效果的影响，设计三个实验组，记为实验组1-3，分别选取1条、2条及3条假捕获探针进行检测，对比其检测效果，试剂盒具体设计参见表17。
表17假捕获探针的选择
实验组 实验组1 实验组2 实验组3
探针数量 1条 2条 3条
假捕获探针 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3
2、样本检测
本实施例选用细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约3000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为15份，依次编号1～15和16～30。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表18使用不同数量假捕获探针的检测结果比较
通过三组实验比对可知，针对Twist的检测，使用1条、2条和3条的假捕获探针均可达到防止捕获探针与生物样本中其它mRNA的非特异性结合的目的，均可达到检测需求；但假捕获探针使用2条或以上时，其特异性和稳定性才都好。其中，当使用全部3条假捕获探针时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。
实施例8假捕获探针使用浓度的选择
1、试剂盒制备的设计(假捕获探针使用浓度的选择)
为考察假捕获探针使用浓度的选择对试剂盒检测效果的影响，设计5个实验组，记为实验组1-5，假捕获探针使用浓度依次设置为捕获探针的2倍、4倍、6倍、8倍、10倍，进行检测，对比其检测效果，试剂盒具体设计参见表19。
表19假捕获探针的使用浓度
实验组 实验组1 实验组2 实验组3 实验组4 实验组5
假捕获探针使用浓度倍数 2倍 4倍 6倍 8倍 10倍
假捕获探针使用浓度 1.5fmol/μl 3fmol/μl 4.5fmol/μl 6fmol/μl 7.5fmol/μl
2、样本检测
本实施例选用细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约3000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为15份，依次编号1～15和16～30。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检3份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表20不同使用浓度假捕获探针的检测结果比较
从上述检测结果可知，假捕获探针的使用浓度为捕获探针的2倍、4倍、6倍、8倍和10倍时均可完成检测，但当假捕获探针的使用浓度达到捕获探针的4倍或以上时，其特异性和稳定性才都很好。其中，假捕获探针的使用浓度为捕获探针的8倍或10倍时的检测结果与假捕获探针的使用浓度为捕获探针的4倍或6倍时的检测结果相当，检测到的荧光信号点数差异不大。因此，为节约试剂成本，本发明假捕获探针的使用浓度优选为捕获探针的4～6倍。
实施例9假捕获探针杂交温度的选择
1、试剂盒制备的设计(假捕获探针杂交温度的选择)
为考察假捕获探针杂交温度的选择对试剂盒检测效果的影响，设计3个实验组，记为实验组1-3，杂交温度依次设置为36±1℃、40±1℃和45±1℃，进行检测，对比其检测效果，具体设计参见表21。
表21假捕获探针的杂交温度
实验组 实验组1 实验组2 实验组3
假捕获探针杂交温度 36±1℃ 40±1℃ 45±1℃
2、样本检测
本实施例选用细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约3000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为15份，依次编号1～15和16～30。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表22假捕获探针不同杂交温度的检测结果比较
通过上述对比可知，假捕获探针杂交温度分别为36±1℃、40±1℃和45±1℃均可完成检测，其特异性和稳定性都很好；故而假捕获探针的杂交温度为36～45℃。为了与捕获探针、扩增探针以及显色探针的杂交温度保持一致，本发明的假捕获探针杂交温度优选为40±1℃。
实施例10假捕获探针杂交时间的选择
1、试剂盒制备的设计(假捕获探针杂交时间的选择)
本发明Twist基因表达检测试剂盒，针对Twist的检测设计了假捕获探针用于预杂交。为考察假捕获探针杂交时间的选择对试剂盒检测效果的影响，设计2个实验组，记为实验组1-2，杂交时间依次设置为30分钟和1小时，进行检测，对比其检测效果，具体设计参见表23。
表23假捕获探针的杂交时间
实验组 实验组1 实验组2
假捕获探针杂交时间 30分钟 1小时
2、样本检测
本实施例选用细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表24假捕获探针不同杂交时间的检测结果比较
/>
从上述检测结果可知，假捕获探针杂交时间分别为30分钟和1小时均可完成检测，两组检测到的荧光信号点数差异不大，其特异性和稳定性都很好。为节省时间成本，本发明的假捕获探针的杂交时间优选为30分钟。
实施例11间隔臂序列碱基数目的选择
1、试剂盒制备的设计(间隔臂序列碱基数目的选择)
为了考察间隔臂长度对试剂盒检测效果的影响，设计了5个实验组，记为实验组1-5，间隔臂序列组成依次为3、5、8、10和15个T，对比其检测效果，具体设计参见表25，试剂盒其它探针序列和组分与实施例1完全一致。
表25间隔臂序列组成的选择
实验组 实验组1 实验组2 实验组3 实验组4 实验组5
间隔臂序列组成 3个T 5个T 8个T 10个T 15个T
2、样本检测
本实施例选用细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约3000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为30份，依次编号1～15和16～30。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检3份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表26试剂盒选用不同间隔臂的检测结果比较
/>
从上述检测结果可知，当间隔臂的组成为5～10个T时(本实施例实验组2-4)，试剂盒检测效果最好，能将样本中细胞完全检出。当间隔臂的组成小于5个T时(本实施例实验组1)，由于间隔臂序列过短而不能将捕获探针P2序列与目标mRNA有效间隔开来，导致空间位阻过大，降低了杂交反应的效率以及荧光信号放大效果，使检测效果不稳定，大量阳性细胞不能有效被检出；当间隔臂组成大于10个T时(本实施例实验组5)，造成了过大的空间位阻，导致目标mRNA-捕获探针-扩增探针复合体形成受阻，从而无法使目标mRNA带上荧光信号，导致检测效果大大降低。因此，当捕获探针和扩增探针的间隔臂序列为5～10个T时，试剂盒检测效果达到最好，小于5个T或大于10个T均会大大降低试剂盒检测性能，导致大量阳性细胞无法检出，导致假阴性结果的产生。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种 Twist基因表达检测试剂盒
<130> 2019-12-22
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atggtgatga cctggccgtc 20
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Claims (9)

1.一种Twist基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对检测Twist基因mRNA的假捕获探针、捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和标记探针；其中，
(1)假捕获探针：所述假捕获探针用于对生物样本进行预杂交，其为含有逆转录转座子的重复序列的局部序列或含有与所述重复序列各不相同的局部序列的组合，每条假捕获探针的碱基序列长度为20-70bp；所述假捕获探针既不与目标mRNA发生杂交，也不与捕获探针、扩增探针以及标记探针发生杂交；
(2)捕获探针：所述捕获探针为自组装聚合分支核酸探针，用于连接目标mRNA和扩增探针，每条捕获探针由探针结构分别为5’-α1-β1-γ-3’和5’-α2-β2-γ-3’的两种探针共价结合而成，其中，探针序列α1区与α2区互补，β1区与β2区互补，γ区序列从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与待检测目标mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和Twist基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3)扩增探针：所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列，间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和Twist mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(4)标记探针：所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团；
针对Twist基因mRNA的假捕获探针序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3中至少2条；
针对Twist基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.13中的5条或5条以上；
α1区序列为SEQ ID NO.24，β1区序列为SEQ ID NO.26，α2区序列为SEQ ID NO.28，β2区序列为SEQ ID NO.30，P2序列为SEQ ID NO.32；
针对Twist基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.34，P4序列为SEQ ID NO.36；
针对Twist基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.38。
2.根据权利要求1所述的Twist基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统与针对Twist基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统的结构相同，但标记探针的末端修饰的荧光基团互不相同。
3.根据权利要求2所述的Twist基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB基因；针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.14～SEQ IDNO.23中的5条或5条以上，α1区序列为SEQ ID NO.25，β1区序列为SEQ ID NO.27，α2区序列为SEQ ID NO.29，β2区序列为SEQ ID NO.31，P2序列为SEQ ID NO.33；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.35，P4序列为SEQ ID NO.37；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.39。
4.根据权利要求1-3任一项所述的Twist基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针的制备方法为：在内表面硅烷化处理的试管中，将探针结构分别为5’-α1-β1-γ-3’和5’-α2-β2-γ-3’的两种探针溶于交联缓冲液中，加热至80℃～94℃变性，然后降温至20℃～25℃，使探针互补形成氢键连接的分支探针链，再采用紫外光处理，使溶液中互补结合的探针间形成共价结合，得到自组装聚合分支核酸探针。
5.根据权利要求4所述的Twist基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述5’-α1-β1-γ-3’和5’-α2-β2-γ-3’两种探针的摩尔比为1：1；所述交联缓冲液为含有1.0g/L精氨酸和20g/L聚乙二醇1000的PBS缓冲液。
6.根据权利要求1-3任一项所述的Twist基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列的长度为5～10个碱基。
7.根据权利要求6所述的Twist基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列的长度为5～10个T。
8.一种非诊断目的的Twist基因表达检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)得到待检测生物样本；
(2)对样本进行前处理，使mRNA暴露；
(3)使用权利要求1～7任一项所述试剂盒检测Twist mRNA是否存在：a)假捕获探针与非目标mRNA序列杂交；b)捕获探针与Twist基因mRNA序列和扩增探针杂交；c)标记探针的P5序列与扩增探针的P4序列杂交，实现目标mRNA信号的级联放大；d)通过荧光检测仪检测。
9.根据权利要求8所述的非诊断目的的Twist基因表达检测方法，其特征在于，所述假捕获探针的使用浓度为捕获探针使用浓度的2～10倍；所述假捕获探针与非目标mRNA序列杂交的温度为36℃～45℃，时间为0.5-3h。
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