CN103114128A - 一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用 - Google Patents
一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103114128A CN103114128A CN 201210369888 CN201210369888A CN103114128A CN 103114128 A CN103114128 A CN 103114128A CN 201210369888 CN201210369888 CN 201210369888 CN 201210369888 A CN201210369888 A CN 201210369888A CN 103114128 A CN103114128 A CN 103114128A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- hybridization
- fluorescence
- heavily
- minutes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用，利用本发明提供的方法选用的荧光素标记BAC(细菌人工染色体)探针，运用连续荧光原位杂交法即探针洗脱重杂交，每次杂交后在荧光显微镜下对DAPI，Spectrum GreenTM，Cy3TM v1，Texas Red，Cy5，PF-415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，采用计算机自动荧光视野重定位法使每张切片所采集图像精确定位于同一视野，因此可以对单个正常或肿瘤细胞同时进行5-20个基因的分析。本发明提供了一种在单细胞水平筛选和验证多种基因异变的方法，可以用于多种疾病不同亚型的区分也可用于同一个亚型疾病的进一步分类。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型高分辨多色荧光检验技术，尤其是建立一种定量多基因荧光原位杂交分析的方法。本发明提供了一种在单细胞水平筛选和验证多种基因异变的方法，可以用于多种疾病不同亚型的区分也可用于同一个亚型疾病的进一步分类。
背景技术
荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，简称FISH)技术是近几年发展起来的一种分子细胞遗传学技术，其基本原理是利用碱基的互补性，以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光显微镜收集荧光信号从而对待测核酸进行定性、定量及定位的方法。常用的荧光原位杂交法探针有染色体单一序列探针，染色体重复序列探针，染色体涂染探针。常用方法有单标记荧光原位杂交法，双标记荧光原位杂交法，光谱核型分析(Spectral Karyotyping，SKY)，种间杂交彩色分带荧光原位杂交技术(Cross-species color banding-FISH，简称Rx-FISH)等。各种荧光原位杂交法探针及方法在研究肿瘤细胞基因组的不稳定性，尤其是染色体不稳定性及数值异常(非整倍体)和结构重排等生物学特性，以及对血液系统恶性肿瘤的诊断，治疗反应监测，预后评估和微小残留病检测中起重要作用。
目前市场上常用的单色或双色荧光原位杂交检测方法有其高度的敏感性和特异性，但是一次实验只能用1-2种探针来检测1-2种基因的异常，不能同时观察细胞内多个相关基因的变化情况。
本发明克服现有技术的不足，建立了一种高分辨定量多色荧光原位杂交法，采用荧光素标记特异的基因探针，能够高分辨地检测同一标本甚至同一克隆的细胞中多达5-20种基因的异常变化。这些基因异变包括基因易位，基因缺失和基因扩增等等。
发明内容
本发明建立了一种定量多基因荧光原位杂交方法，采用多色荧光素标记不同的基因，可以在同一时间内定量单个细胞核中多达5-20个基因，使该法更适用于大规模的临床研究。
本发明采用的技术方案是：
一种定量多基因荧光原位杂交方法，包括如下步骤：
1)、探针制作：在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Bioinformatics上定位检索含检测目的基因的BAC (Bacterial artificialchromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，沉淀DNA，用含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针；
2)杂交：将要检测的标本处理好后，加入步骤1)制作好的探针，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，变性后杂交过夜；
3)洗片，荧光显微镜检：标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(SalineSodium Phosphate EDTA，SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果；
4)图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，六种滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100)，Spectrum GreenTM(MF101)，Cy3TM v1(SP-102)，Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415(45)组合，首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像；
5)检测基因个数n为1≤n≤5时，采用上述步骤1)-4)即可完成检测分析，当检测基因个数n为5＜n≤10，需对第一次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当10＜n≤15，需对第二次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当15＜n≤20，需对第三次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，每次杂交试验设计的检测基因个数最多为5个，当检测基因个数n为5＜n≤10，原探针洗脱和新探针重杂交步骤如下：
第一次杂交实验图像采集后，切片存放于冷室以备下次重杂交使用，重杂交的新探针准备同步骤1)，制得新探针，备用；切片移去盖玻片，置于2×SSC中洗涤，每张切片滴加150μl的70％甲酰胺，70℃变性3分钟，迅速置于-20℃预冷的70％乙醇，洗去陈旧的探针，梯度乙醇中脱水，每张切片滴加10μl新探针，杂交、洗片同步骤2)、3)标本重杂交后图像采集：切片置于多色荧光显微镜下观察，采用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI，Spectrum GreenTM，Cy3TM v1，Texas Red，Cy5，PF-415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因分析。
优选地，上述定量多基因荧光原位杂交方法适用于对同一细胞进行5-20种基因分析。
具体地，该一种定量多基因荧光原位杂交方法，包括如下步骤：
1)、探针制作：在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Bioinformatics上定位检索含检测目的基因的BAC (Bacterial artificialchromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，用100％的乙醇将连接好的DNA在-20℃进行沉淀过夜，次日离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟，用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟，用含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针；
2)杂交：将要检测的标本处理好后，加入步骤1)制作好的探针，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，85-90℃变性5分钟，47℃杂交过夜；
3)洗片，荧光显微镜检：标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(SalineSodium Phosphate EDTA，SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果；
4)图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，六种滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100)，Spectrum GreenTM(MF101)，Cy3TM v1(SP-102)，Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像；
5)检测基因个数n为1≤n≤5时，采用上述步骤1)-4)即可完成检测分析，当检测基因个数n为5＜n≤10，需对第一次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当10＜n≤15，需对第二次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当15＜n≤20，需对第三次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，每次杂交试验设计的检测基因个数最多为5个，当检测基因个数n为5＜n≤10，原探针洗脱和新探针重杂交步骤如下：
第一次杂交实验图像采集后，切片存放于冷室以备下次重杂交使用，重杂交新探针准备同步骤1)，制得新探针，备用；切片移去盖玻片，置于2×SSC中洗涤，每张切片滴加150μl的70％甲酰胺，70℃变性3分钟，迅速置于-20℃预冷的70％乙醇，洗去陈旧的探针，梯度乙醇中脱水，每张切片滴加10μl新探针，杂交、洗片同步骤2)、3)，标本重杂交后图像采集：切片置于多色荧光显微镜下观察，采用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI，Spectrum GreenTM，Cy3TM v1，Texas Red，Cy5，PF-415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因(5-20种基因)分析。
6)结果判断：
特异的荧光信号应位于细胞核内，通过信号的数目和位置来判断所检测基因的正常或异变。例如，在正常的双倍体细胞中每个基因一般呈现2个清晰的荧光点；如基因缺失，则荧光信号亦呈现缺失；如基因拷贝数增多，则荧光信号点增多；根据荧光信号的颜色来判断基因的种类。如两种基因发生重组，则会发生两种荧光信号的重叠，产生新的颜色。
本发明还提供了上述定量多基因荧光原位杂交方法在检测基因异变中的应用。
本发明的有益效果是：相较于传统的荧光原位杂交法技术，定量多色荧光原位杂交法技术的信噪比提高了5-10倍，这正是同时定量分析单个细胞核内多个基因的前提条件；能在具有不同形态和免疫组化特征的肿瘤区域准确地识别单个细胞的遗传学异常，检测肿瘤细胞群体中的克隆变异；可以在同一时间内定量单个肿瘤细胞核的多个基因，使标本检测效率明显提高，可用于大规模研究临床标本基因拷贝数的变化(等位基因失衡)；该定量多色荧光原位杂交法技术是寻找和确认临床标本特异性等位基因失衡极其有效的工具。总之，本发明提供了一种在单细胞水平筛选和验证多种基因异变的方法，可以用于多种疾病不同亚型的区分也可用于同一个亚型疾病的进一步分类。
附图说明
图1为分别用黄色，红色和蓝色荧光素标记含有Cmyc基因的3个BAC克隆(表2所示)，将这三种探针混合后和正常成纤维双倍体细胞杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示黄，红和蓝色探针和同一基因位点结合，细胞核中最后呈现两个荧光素信号点，每个点由黄，红和蓝三种荧光素重叠而成。表明这三种含Cmyc基因的BAC克隆既可单独也可联合用作检测C-myc基因的FISH探针。
图2是本发明将成功制作的Green-C-myc(绿色荧光素标记的C-myc探针)，PF555-P16(黄色荧光素标记的P16探针)，PF590-RB1(红色荧光素标记的RB1探针)，HyPer5-CycD(紫色荧光素标记的CycD探针)，PF415-P53(蓝色荧光素标记的P53探针)5钟探针(表3所示)混合后和人二倍体成纤维细胞杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示在同一细胞核中，每种探针得到两个清晰的荧光信号，5种探针一共获得10个相应的荧光信号点。获得的图像清晰，信噪比高。
图3是本发明成功制备的20个基因探针(表4所示)对人二倍体成纤维细胞进行检测获得的图像。首先用五色Green-C-myc(绿色)，PF555-RB1(黄色)，PF590-MDM2(红色)，HyPer5-CCND1(紫色)，PF415-P53(蓝色)探针组合对人二倍体成纤维细胞进行杂交，第一次杂交实验后照相，DAPI图像下选择视野，定位，记录下图像采集位置，拍照记录。随后对切片进行荧光探针的洗脱，洗脱后再用另外一组五色探针进行重杂交，第二次及以后每次重杂交后，切片置于显微镜下观察并采集图像。DAPI图像下，采用“计算机自动荧光视野重定位法”使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对五种荧光信号进行采集。如此总共洗脱3次，可对同一细胞进行20个基因的分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1：C-myc基因探针的制备
一、探针DNA的获取
1)划线接种：将3个分别携带有C-myc基因的BAC菌种分别按照如下步骤操作，首先将BAC菌种划线接种于含有抗生素(氯霉素)的琼脂平板上，37℃培养过夜(约14小时)。
2)初始培养：次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，放入37℃摇床，设置摇床速度约200rpm，培养6-8小时。
3)过夜培养：每1ml步骤2)所得菌液转移至200ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，放置于37℃摇床，转速200rpm，培养过夜(约14-16小时)。
4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。
二、探针标记
1.酶切DNA：
1)按照以下反应体系对目的DNA进行酶切
37℃孵育1小时，加入1μl的0.5M的乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)(PH 7.5)终止反应，混匀，瞬时离心。
2)沉淀DNA：加入步骤1)总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
3)再加入步骤2)总液体量2倍体积100％乙醇(-20℃)，混匀，瞬时离心，-70℃，沉淀约2小时。
4)离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入100μl70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。
5)用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟，用10μl的10mM的Tris-HCl(PH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时，转速800rpm，将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
2.连接反应：
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记，对C-myc基因的三个BAC探针的荧光素标记按照表2所示进行。
方法如下：
取避光的EP管，先加入水，最后加入DNase I(10ng/μl)和DNA polymerase I(10units/μl，酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液：
混匀，瞬时离心，14℃孵育过夜(9-12小时)。
次日加入5μl的0.5M的EDTA(PH 7.5)终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的DNA放在-20℃避光保存。
3.沉淀DNA：
1)按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀：
再加入15μl的3M的乙酸钠，630μl的100％乙醇(-20℃)混匀，瞬时离心，-20℃，沉淀过夜。
2)次日离心14000rpm，4℃，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100μl的70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。
3)加入10μl的含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针，转速800rpm，将溶解好的探针放在4℃保存直至后续实验。
4)将步骤3)制作好的探针从4℃中拿出，放入56℃中孵育1小时，室温离心14000rpm，20分钟，将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中，4℃中保存，若长期不用探针应保存于-20℃。
三、杂交反应
1.细胞准备：
1)正常人二倍体成纤维细胞(Human diploid fibroblast cell，HDF)培养于含有20％胎牛血清的MEM与F12(1∶1)混合培养基中，当细胞生长融合至90％时，用0.25％胰酶+0.02％EDTA溶液进行消化，传代；
2)取对数生长期的细胞，进行细胞爬片；
3)将制作好的细胞爬片放入甲醇中室温固定过夜；
4)次日放入1-2％的甲醛溶液中室温固定5分钟，磷酸缓冲液(PBS)中洗涤后放入70％的乙醇中-20℃保存；
5)将保存在70％的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入制作好的探针，10μl/片，加上18×18mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。
2.杂交：
将玻片放入杂交仪中，85-90℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
3.洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
4.梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度。
5.放入己烷：异丙醇(体积比60∶40)混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100％的乙醇中5分钟。
6.空气中干燥片子约10分钟后加入8-10μl的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
7.图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100)，Cy3TM v1(SP-102)，Texas Red(SP-107)和Zeiss公司PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission：450-490nm)，Cy3TM v1(Emission：559.5-574.5nm)，Texas Red(Emission：619.5-642.5nm)，PF-415(Emission：460-500nm)四个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像。
8.结果判断：
从获得的PF590-C-myc-R1(红色)，PF555-C-myc-R2(黄色)，PF415-C-myc-N(蓝色)多色图像(图1)中可以看出，所挑选的3个含C-myc基因序列的BAC克隆能够很好的结合在同一个基因位点(图1)。结果表明，联合使用这3个BAC克隆来制备C-myc探针，可充分保证杂交信号的强度并提高分辨率。
实施例2：Green-C-myc(绿色)，PF555-P16(黄色)，PF590-RB1(红色)，HyPer5-CycD((紫色)，PF415-P53(蓝色)探针组合的制备
一、探针DNA的获取
1)划线接种：将分别携带有C-myc，P16，RB1，CycD和P53基因的BAC菌种分别划线接种于含有抗生素(氯霉素)的琼脂平板上，37℃培养过夜(约14小时)。
2)初始培养：次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，放入37℃摇床，设置摇床速度约200rpm，培养6-8小时。
3)过夜培养：每1ml步骤2)所得菌液转移至200ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，放置于37℃摇床，转速200rpm，培养过夜(约14-16小时)。
4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。
二、探针标记
1.酶切DNA：
1)按照以下反应体系对目的DNA进行酶切
37℃孵育1小时，加入1μl的0.5M的乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)(PH 7.5)终止反应，混匀，瞬时离心。
2)沉淀DNA：加入步骤1)总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
3)再加入步骤2)总液体量2倍体积100％乙醇(-20℃)，混匀，瞬时离心，-70℃，沉淀约2小时。
4)离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入100μl70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。
5)用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟，用10μl的10mM的Tris-HCl(PH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时，转速800rpm，将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
2.连接反应：
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记，对探针C-myc、P16、RB1、P53、CycD分别采用Green dUTP，PromoFluor-555-aadUTP，PromoFluor-590-aadUTP，PromoFluor-415-aadUTP，HyPer5dCTP五种荧光素(表1)进行标记，对Green-C-myc(绿色)，PF555-P16(黄色)，PF590-RB1(红色)，HyPer5-CycD(紫色)，PF415-P53(蓝色)探针组合标记如表3
方法如下：
取避光的EP管，先加入水，最后加入DNase I(10ng/μl)和DNA polymerase I(10units/μl，酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液：
混匀，瞬时离心，14℃孵育过夜(9-12小时)。
次日加入5μl的0.5M的EDTA(PH 7.5)终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的DNA放在-20℃避光保存。
3.沉淀DNA：
1)按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀：
再加入15μl的3M的乙酸钠，630μl的100％乙醇(-20℃)混匀，瞬时离心，-20℃，沉淀过夜。
2)次日离心14000rpm，4℃，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100μl的70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。
3)加入10μl的含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针，转速800rpm，将溶解好的探针放在4℃保存直至后续实验。
4)将步骤3)制作好的探针从4℃中拿出，放入56℃中孵育1小时，室温离心14000rpm，20分钟，将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中，4℃中保存，若长期不用探针应保存于-20℃。
三、杂交反应
1.细胞准备：
1)正常人二倍体成纤维细胞(Human diploid fibroblast cell，HDF)培养于含有20％胎牛血清的MEM与F12(1∶1)混合培养基中，当细胞生长融合至90％时，用0.25％胰酶+0.02％EDTA溶液进行消化，传代；
2)取对数生长期的细胞，进行细胞爬片；
3)将制作好的细胞爬片放入甲醇中室温固定过夜；
4)次日放入1-2％的甲醛溶液中室温固定5分钟，磷酸缓冲液(PBS)中洗涤后放入70％的乙醇中-20℃保存；
5)将保存在70％的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入制作好的探针，10μl/片，加上18×18mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。
2.杂交：
将玻片放入杂交仪中，85-90℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
3.洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
4.梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度。
5.放入己烷：异丙醇(体积比60∶40)混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100％的乙醇中5分钟。
6.空气中干燥片子约10分钟后加入8-10μl的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
7.图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100)，Spectrum GreenTM(MF101)，Cy3TM v1(SP-102)，Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD (Charge-CoupledDevice，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission：450-490nm)，SpectrumGreenTM(Emission：512-542nm)，Cy3TM v1(Emission：559.5-574.5nm)，Texas Red(Emission：619.5-642.5nm)，Cy5(Emission：665-715nm)，PF-415(Emission：460-500nm)六个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得获得清晰、稳定，理想的多色图像。
8.结果判断：
从获得的Green-C-myc(绿色)，PF555-P16(黄色)，PF590-RB1(红色)，HyPer5-CycD(紫色)，PF415-P53(蓝色)多色图像(图2)中可以看出，同时检测的5个不同基因的荧光信号均较强，图像清晰，方法可靠稳定。
实施例3：在同一个细胞上检测20个基因
一、探针DNA的获取
1)划线接种：将分别携带有20个基因(表3)的BAC菌种分别划线接种于含有抗生素(氯霉素)的琼脂平板上，37℃培养过夜(约14小时)。
2)初始培养：次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，放入37℃摇床，设置摇床速度约200rpm，培养6-8小时。
3)过夜培养：每1ml步骤2)所得菌液转移至200ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，放置于37℃摇床，转速200rpm，培养过夜(约14-16小时)。
4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。
二、探针标记
1.酶切DNA：
1)按照以下反应体系对目的DNA进行酶切
10×HS：High Salt
37℃孵育1小时，加入1μl的0.5M的乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)(PH 7.5)终止反应，混匀，瞬时离心。
2)沉淀DNA：加入步骤1)总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
3)再加入步骤2)总液体量2倍体积100％乙醇(-20℃)，混匀，瞬时离心，-70℃，沉淀约2小时。
4)离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入100μl70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。
5)用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟，用10μl的10mM的Tris-HCl(PH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时，转速800rpm，将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
2.连接反应：
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记，采用Green dUTP，PromoFluor-555-aadUTP，PromoFluor-590-aadUTP，PromoFluor-415-aadUTP，HyPer5 dCTP五种荧光素(表1)对探针进行标记，探针组合标记如表4
方法如下：
取避光的EP管，先加入水，最后加入DNase I(10ng/μl)和DNA polymerase I(10units/μl，酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液：
混匀，瞬时离心，14℃孵育过夜(9-12小时)。
次日加入5μl的0.5M的EDTA(PH 7.5)终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的DNA放在-20℃避光保存。
3.沉淀DNA：
1)按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀(每5个基因为一组各自沉淀于1个EP管中)：
第一组：
第二组：
第三组：
第四组：
然后针对每组分别进行如下操作：
再加入15μl的3M的乙酸钠，630μl的100％乙醇(-20℃)混匀，瞬时离心，-20℃，沉淀过夜。
2)次日离心14000rpm，4℃，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100μl的70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。
3)加入10μl的含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针，转速800rpm，将溶解好的探针放在4℃保存直至后续实验。
4)将步骤3)制作好的探针从4℃中拿出，放入56℃中孵育1小时，室温离心14000rpm，20分钟，将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中，4℃中保存，若长期不用探针应保存于-20℃。
三、杂交反应
1.细胞准备：
1)正常人二倍体成纤维细胞(Human diploid fibroblast cell，HDF)培养于含有20％胎牛血清的MEM与F12(1∶1)混合培养基中，当细胞生长融合至90％时，用0.25％胰酶+0.02％EDTA溶液进行消化，传代；
2)取对数生长期的细胞，进行细胞爬片；
3)将制作好的细胞爬片放入甲醇中室温固定过夜；
4)次日放入1-2％的甲醛溶液中室温固定5分钟，磷酸缓冲液(PBS)中洗涤后放入70％的乙醇中-20℃保存；
5)将保存在70％的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入第一组制作好的探针，10μl/片，加上18×18mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。
2.杂交：
将玻片放入杂交仪中，85-90℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
3.洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
4.梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度。
5.放入己烷：异丙醇(体积比60∶40)混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100％的乙醇中5分钟。
6.空气中干燥片子约10分钟后加入8-10μl的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
7.连续FISH(对同一标本进行探针洗脱和重杂交)
第一次杂交切片照相后，存放于冷室备供第二次杂交使用。
1)第二组探针准备同前。
2)移去盖玻片。
3)2×SSC中洗涤，2×5分钟。
4)每张切片滴加150μl的70％甲酰胺，70℃变性3分钟。
5)迅速置于-20℃预冷的70％乙醇，洗去探针。
6)梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度。
7)每张切片滴加10μl第二组新探针。
8)加盖玻片，橡胶胶水封片，37℃干燥20分钟。
9)探针与切片置于杂交仪上，80℃变性3分钟。
10)杂交与洗涤同前。
11)DAPI复染，盖玻片、指甲油封片。
第二次杂交切片照相后，存放于冷室备供第三次杂交使用，按照上述步骤进行第二组探针洗脱和第三组探针重杂交，将第三次杂交切片照相后，存放于冷室供第四次杂交使用，按照上述步骤进行第三组探针洗脱和第四组探针重杂交，并将第四次杂交切片照相采集信息。
8.图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100)，Spectrum GreenTM(MF101)，Cy3TM v1(SP-102)，Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415(45)组合。
第一次杂交完成后，切片置于DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission：450-490nm)，SpectrumGreenTM(Emission：512-542nm)，Cy3TM v1(Emission：559.5-574.5nm)，Texas Red(Emission：619.5-642.5nm)，Cy5(Emission：665-715nm)，PF-415(Emission：460-500nm)六个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像。第二次以及以后每次杂交后，切片置于多色荧光显微镜下观察，采用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI(Emission：450-490nm)，SpectrumGreenTM(Emission：512-542nm)，Cy3TM v1(Emission：559.5-574.5nm)，Texas Red(Emission：619.5-642.5nm)，Cy5(Emission：665-715nm)，PF-415(Emission：460-500nm)六个滤光片通路中的荧光信息进行采集。因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因改变的分析。
9.结果判断：
如图3所示，获得的4张具有5色荧光信号的图像清晰，同时检测的20个不同基因的荧光信号均较强。结果还表明采用“连续FISH”即用甲酰胺洗脱探针后进行重杂交的方法可行，稳定。
通过本发明的方法，我们建立了一种稳定性好，操作安全，空间定位精确的多色荧光原位杂交技术。一个细胞上可同时用多种颜色标记，其费用较为低廉，对标本要求相对简单，不受细胞分裂的限制，敏感性高，特异性强。因荧光原位杂交法BAC探针长度可达几百KB，能跨越几个外显子区域，只要是在探针设计范围内发生的各种断裂而形成的融合基因都能被检测到。
染色体异常是真正体现恶性血液病生物学本质的重要指标，在疾病的诊断、分型、预后评估中起到决定性作用。用定量多色荧光原位杂交技术可以方便地检出这些畸变包括相关癌基因和抑癌基因的变化，发现恶性克隆，判断病变克隆的起始阶段，依据不同的危险度分层诊断，采用相应强度的个体化治疗，可以大大增强血液系统肿瘤的治愈率。
目前认为肿瘤是多基因突变积累的结果，定量多基因荧光原位杂交技术可同时检测分析活检肿瘤组织中癌基因、抑癌基因、病毒序列的有无以及拷贝数的变化，不但突破了实体肿瘤基因检测受培养肿瘤细胞困难的限制，还有助于深入认识肿瘤组织的异质性和癌前病变，成功用于乳腺癌非整倍体、膀胱癌癌基因拷贝数、卵巢癌和膀胱癌中的乳头瘤病毒序列检测等研究。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
表1荧光素标记的dUTP
表2实施例1C-myc基因片段标记
表3实施例2五种基因探针荧光素标记
表4实施例3检测20个基因的探针组合
Claims (4)
1.一种定量多基因荧光原位杂交方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)、探针制作：在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Bioinformatics上定位检索含检测目的基因的BAC(Bacterial artificialchromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，沉淀DNA，用含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针；
2)杂交：将要检测的标本处理好后，加入步骤1)制作好的探针，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，变性后杂交过夜；
3)洗片，荧光显微镜检：标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(SalineSodium Phosphate EDTA，SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果；
4)图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，六种滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100)，Spectrum GreenTM(MF101)，Cy3TM v1(SP-102)，Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415(45)组合，首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像；
5)检测基因个数n为1≤n≤5时，采用上述步骤1)-4)即可完成检测分析，当检测基因个数n为5＜n≤10，需对第一次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当10＜n≤15，需对第二次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当15＜n≤20，需对第三次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，每次杂交试验设计的检测基因个数最多为5个，当检测基因个数n为5＜n≤10，原探针洗脱和新探针重杂交步骤如下：
第一次杂交实验图像采集后，切片存放于冷室以备下次重杂交使用，重杂交的新探针准备同步骤1)，制得新探针，备用；切片移去盖玻片，置于2×SSC中洗涤，每张切片滴加150μl的70％甲酰胺，70℃变性3分钟，迅速置于-20℃预冷的70％乙醇，洗去陈旧的探针，梯度乙醇中脱水，每张切片滴加10μl新探针，杂交、洗片同步骤2)、3)标本重杂交后图像采集：切片置于多色荧光显微镜下观察，采用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI，Spectrum GreenTM，Cy3TM v1，Texas Red，Cy5，PF-415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因分析。
2.根据权利要求1所述一种定量多基因荧光原位杂交方法，其特征在于：所述定量多基因荧光原位杂交方法适用于对同一细胞进行5-20种基因分析。
3.根据权利要求1所述一种定量多基因荧光原位杂交方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)、探针制作：在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Bioinformatics上定位检索含检测目的基因的BAC (Bacterial artificialchromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，用100％的乙醇将连接好的DNA在-20℃进行沉淀过夜，次日离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟，用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟，用含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针；
2)杂交：将要检测的标本处理好后，加入步骤1)制作好的探针，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，85-90℃变性5分钟，47℃杂交过夜；
3)洗片，荧光显微镜检：标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(SalineSodium Phosphate EDTA，SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果；
4)图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，六种滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100)，Spectrum GreenTM(MF101)，Cy3TM v1(SP-102)，Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像；
5)检测基因个数n为1≤n≤5时，采用上述步骤1)-4)即可完成检测分析，当检测基因个数n为5＜n≤10，需对第一次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当10＜n≤15，需对第二次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当15＜n≤20，需对第三次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，每次杂交试验设计的检测基因个数最多为5个，当检测基因个数n为5＜n≤10，原探针洗脱和新探针重杂交步骤如下：
第一次杂交实验图像采集后，切片存放于冷室以备下次重杂交使用，重杂交新探针准备同步骤1)，制得新探针，备用；切片移去盖玻片，置于2×SSC中洗涤，每张切片滴加150μl的70％甲酰胺，70℃变性3分钟，迅速置于-20℃预冷的70％乙醇，洗去陈旧的探针，梯度乙醇中脱水，每张切片滴加10μl新探针，杂交、洗片同步骤2)、3)，标本重杂交后图像采集：切片置于多色荧光显微镜下观察，采用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI，Spectrum GreenTM，Cy3TM v1，Texas Red，Cy5，PF-415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因(5-20种基因)分析。
6)结果判断：
特异的荧光信号应位于细胞核内，通过信号的数目和位置来判断所检测基因的正常或异变。
4.权利要求1-3任一项所述的定量多基因荧光原位杂交方法在检测基因异变中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210369888 CN103114128A (zh) | 2012-09-27 | 2012-09-27 | 一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210369888 CN103114128A (zh) | 2012-09-27 | 2012-09-27 | 一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103114128A true CN103114128A (zh) | 2013-05-22 |
Family
ID=48412545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201210369888 Pending CN103114128A (zh) | 2012-09-27 | 2012-09-27 | 一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103114128A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103555820A (zh) * | 2013-08-02 | 2014-02-05 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 检测乳腺癌g1/s期调控相关的四色基因探针试剂盒 |
| WO2017114005A1 (zh) * | 2015-12-30 | 2017-07-06 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | Terc基因和/或myc基因检测探针及其制备方法和试剂盒 |
| CN107858422A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-03-30 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物及试剂盒 |
| CN109682784A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-26 | 广州市锐博生物科技有限公司 | 生成彩色图像的系统及高通量测序仪 |
| CN112921074A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-06-08 | 鲲羽生物科技(江门)有限公司 | 一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法 |
| CN113366118A (zh) * | 2018-10-05 | 2021-09-07 | 马尔提普莱克斯公司 | 用于使用多重荧光和测序诊断疾病的方法 |
| CN116144739A (zh) * | 2023-03-06 | 2023-05-23 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种基于分离探针荧光原位杂交的基因重排信号记录方法 |
-
2012
- 2012-09-27 CN CN 201210369888 patent/CN103114128A/zh active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103555820A (zh) * | 2013-08-02 | 2014-02-05 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 检测乳腺癌g1/s期调控相关的四色基因探针试剂盒 |
| WO2017114005A1 (zh) * | 2015-12-30 | 2017-07-06 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | Terc基因和/或myc基因检测探针及其制备方法和试剂盒 |
| CN107858422A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-03-30 | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） | 检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物及试剂盒 |
| CN113366118A (zh) * | 2018-10-05 | 2021-09-07 | 马尔提普莱克斯公司 | 用于使用多重荧光和测序诊断疾病的方法 |
| CN109682784A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-26 | 广州市锐博生物科技有限公司 | 生成彩色图像的系统及高通量测序仪 |
| CN112921074A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-06-08 | 鲲羽生物科技(江门)有限公司 | 一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法 |
| CN116144739A (zh) * | 2023-03-06 | 2023-05-23 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种基于分离探针荧光原位杂交的基因重排信号记录方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103114128A (zh) | 一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用 | |
| US20220049320A1 (en) | Method for the cytological analysis of cervical cells | |
| Lichter et al. | [22] Detection of chromosomal aberrations by means of molecular cytogenetics: Painting of chromosomes and chromosomal subregions and comparative genomic hybridization | |
| JP4909738B2 (ja) | 頸部細胞における高度異形成の検出 | |
| CN102459631B (zh) | 人乳头瘤病毒(hpv)型检测方法 | |
| US9290814B2 (en) | Materials and methods for diagnosis of bladder cancer and monitoring recurrence thereof | |
| RU2471871C2 (ru) | Способ и устройство для определения строения хромосом | |
| WO2017114007A1 (zh) | Pml基因和rara基因检测探针及其制备方法和试剂盒 | |
| CN107858422A (zh) | 检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物及试剂盒 | |
| CN103627787B (zh) | 一种用于检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒 | |
| CN117448456B (zh) | 用于鉴别涎腺肿瘤良恶性的分子靶标、探针组合、试剂盒及其应用 | |
| CN103276060B (zh) | 一种检测上皮性卵巢癌的基因探针组合物及试剂盒 | |
| CN106574307A (zh) | 用于评估前列腺癌的进展的材料和方法 | |
| Henegariu et al. | Cryptic translocation identification in human and mouse using several telomeric multiplex fish (TM-FISH) strategies | |
| CN103555820B (zh) | 检测乳腺癌g1/s期调控相关的四色基因探针试剂盒 | |
| WO2017114011A1 (zh) | Her-2基因和/或top2a基因检测探针及其制备方法和试剂盒 | |
| CA2235395A1 (en) | Ultrahigh resolution comparative nucleic acid hybridization to combed dna fibers | |
| CN105603087A (zh) | 检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物及试剂盒 | |
| WO2017114005A1 (zh) | Terc基因和/或myc基因检测探针及其制备方法和试剂盒 | |
| CN111635945B (zh) | 一种Vimentin基因表达检测试剂盒 | |
| WO2017114006A1 (zh) | Aml1基因和eto基因检测探针及其制备方法和试剂盒 | |
| WO2017114010A1 (zh) | Top2a基因检测探针及其制备方法和试剂盒 | |
| WO2017114009A1 (zh) | Egfr基因检测探针及其制备方法和试剂盒 | |
| CN104313023B (zh) | 腺泡状软组织肉瘤的基因探针及其试剂盒应用 | |
| CN107312838A (zh) | 细胞荧光原位杂交方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130522 |