CN103555820B - 检测乳腺癌g1/s期调控相关的四色基因探针试剂盒 - Google Patents

检测乳腺癌g1/s期调控相关的四色基因探针试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测乳腺癌G1/S期调控相关的四色基因探针试剂盒，该检测试剂盒，包括即用型杂交液。所述即用型杂交液的组分及浓度为：CCND1基因探针、RB1基因探针、C-myc基因探针和CHEK2基因探针的浓度均为0.04μg/μl。本发明试剂盒建立了一种针对乳腺癌细胞的定量多基因荧光原位杂交探针，采用多色荧光素标记不同的基因，可以在同一时间内定量单个乳腺癌细胞核中多达4个基因，使标本检测效率明显提高，可用于大规模研究临床标本基因拷贝数的变化(等位基因失衡)。

Description

检测乳腺癌G1/S期调控相关的四色基因探针试剂盒
技术领域
本发明涉及一种新型检测乳腺癌细胞基因拷贝数变异情况的四基因探针组合试剂盒，针对细胞周期中G1/S期调控位点相关的四种基因而设计的四色探针组合，利用荧光素标记BAC（细菌人工染色体）探针，利用多色荧光原位杂交技术对标本进行检测。
背景技术
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，严重威胁女性的生命健康。在欧洲发达国家如瑞典，乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤首位。在我国，乳腺癌的发病率也逐年增高，在北京、上海等沿海大城市，已达女性恶性肿瘤的首位。近年来，许多研究表明染色体不稳定性及肿瘤细胞DNA非整倍体是恶性肿瘤特征性标志之一。染色体不稳定性是指癌细胞较之于正常细胞，在细胞分裂时丧失和(或)获得整条染色体或染色体片段频率的升高，可以具体的分为数目改变和结构改变。染色体不稳定是恶性肿瘤的最基本特征，几乎所有人类肿瘤都存在染色体不稳定，对肿瘤恶性生物学行为的判断具有重要价值。在乳腺癌中，非整倍体肿瘤(Aneuploidtumors，A—tumors)较二倍体肿瘤(Diploid tumors，D-tumors)生长迅速，侵袭性强。正常的细胞周期调控和检测对维持细胞基因组稳定性具有重要作用，这一过程的任何缺陷都将导致遗传信息的改变，导致基因组稳定性下降、肿瘤易感性增加，最终导致肿瘤发生。细胞周期的G1/S调控位点的破坏在乳腺癌的发生发展中起着重要作用，因此参与G1/S调控作用的相关基因的检测对于乳腺癌临床及基础研究具有重要价值。
CCND1基因的蛋白产物通过与细胞周期素依赖性激酶4和6（CDK4/6）结合促进G1向S期的转换，这种结合的异二聚体分子具有蛋白激酶活性，能够磷酸化特异底物进而调控G1/S期的转化[1]。RB1基因的蛋白产物通过阻止受损DNA的复制从而使细胞停滞在G1期无法进入S期[2]，Rb1基因缺失的肿瘤细胞能够快速通过G1/S调控节点，迅速分裂。C-myc基因能够通过转录因子促进G1/S期的转化和DNA的复制，加速细胞的分裂再生[3]。CHEK2基因编码的CHEK2蛋白能够抑制CDC25C磷酸化，从而阻止细胞的增殖分裂，同时CHEK2蛋白还能稳定p53蛋白，使细胞停滞在G1期[4]，而CHEK2基因的缺失促进了G1/S期的转化。
1.Abramson,V.G.,et al.,Cyclin D1b in human breast carcinoma and coexpression with cyclin D1a is associatedwith poor outcome.Anticancer Res,2010.30(4):p.1279-85.
2.Das,S.K.,et al.,Fucoxanthin induces cell cycle arrest at G0/G1phase in human colon carcinoma cellsthrough up-regulation of p21WAF1/Cip1.Biochim Biophys Acta,2005.1726(3):p.328-35.
3.Patel,J.H.,et al.,Analysis of genomic targets reveals complex functions of MYC.Nat Rev Cancer,2004.4(7):p.562-8.
4.Chehab,N.H.,et al.,Chk2/hCds1functions as a DNA damage checkpoint in G(1)by stabilizing p53.GenesDev,2000.14(3):p.278-88.
检测和分析肿瘤细胞DNA含量与DNA倍体对肿瘤恶性生物学行为的判断具有重要的价值。过去大批基因表达图谱分析发现了一系列的乳腺癌分子异常和一些对临床诊断治疗有用的基因表达亚型。但是由于分辨率的不足，比较基因组杂交(comparative genomichybridization,CGH)等常用方法确定基因组的DNA拷贝数的能力受到限制。
荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，简称FISH)技术是近几年发展起来的一种分子细胞遗传学技术，其基本原理是利用碱基的互补性，以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针，探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光显微镜收集荧光信号从而对待测核酸进行定性、定量及定位的方法。
目前市场上常用的单色或双色荧光原位杂交检测方法有其高度的敏感性和特异性，但是一次实验只能用1-2种探针来检测1-2种基因的异常，不能同时观察细胞内多个相关基因的变化情况。
本发明克服了现有技术的不足，搭载高分辨定量多色荧光原位杂交法，采用荧光素标记特异的基因探针，能够高分辨地检测同一乳腺癌标本甚至同一克隆乳腺癌细胞中4种G1/S调控相关基因的异常变化。这些基因变异包括基因异位、基因缺失、基因扩增等等。
发明内容
本发明的一个目的是提供CCND1基因探针、RB1基因探针、C-myc基因探针、CHEK2基因探针的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种包括CCND1基因探针、RB1基因探针、C-myc基因探针和CHEK2基因探针的即用型杂交液。
本发明的另一目的是提供一种应用CCND1基因探针、RB1基因探针、C-myc基因探针和CHEK2基因探针制备一种用于辅助检测参与G1/S调控作用的相关基因的检测试剂盒。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种用于辅助检测参与G1/S调控作用的相关基因的即用型杂交液，包括CCND1基因探针、RB1基因探针、C-myc基因探针和CHEK2基因探针。
一种单个基因探针的制备方法，包括如下步骤：
1)、探针制作：在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSCGenome Bioinformatics上定位检索含检测目的基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，沉淀DNA，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针；
2)、探针验证：采用正常人二倍体成纤维细胞的细胞爬片进行探针验证。
本发明还提供了一种包括CCND1基因探针、RB1基因探针、C-myc基因探针和CHEK2基因探针的即用型杂交液的制备方法，包括如下步骤：
1)、探针制作：在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSCGenome Bioinformatics上定位检索分别含检测CCND1、RB1、C-myc、CHEK2基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，对标记好的目的DNA进行组合沉淀，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，制得即用型杂交液；
2)、探针验证：采用正常人二倍体成纤维细胞的细胞爬片进行探针验证。
作为一个优选方案：含CCND1基因最优的克隆，编号为：RP11-825J6(UCSC genomebrowser)，RP11-156B3(UCSC genome browser)或RP11-643C9(UCSC genome browser)中的一种或两种或三种。
作为一个优选方案：含RB1基因最优的克隆，编号为：RP11-951P4(UCSC genomebrowser)，RP11-305D15(UCSC genome browser)或RP11-102I4(UCSC genome browser)一种或两种或三种。
作为一个优选方案：含C-myc基因最优的克隆，编号为：RP11-944J14(UCSC genomebrowser)，RP11-367L7(UCSC genome browser)或RP11-440N18(UCSC genome browser)一种或两种或三种。
作为一个优选方案：含CHEK2基因最优的克隆，编号为：RP11-1001I5(UCSC genomebrowser)，RP11-872I24(UCSC genome browser)或RP11-694G9(UCSC genome browser)一种或两种或三种。
具体地，所述的步骤1)为在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl GenomeBrowser和UCSC Genome Bioinformatics上定位检索分别含检测CCND1、RB1、C-myc、CHEK2基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，用100%的乙醇将连接好的DNA在-20℃进行组合沉淀过夜，次日离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入70%乙醇（4℃），混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟，用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，制得即用型杂交液。
本发明还提供了一种用于辅助检测参与G1/S调控作用的相关基因的检测试剂盒，包括上述即用型杂交液。
优选地，所述即用型杂交液的组分及浓度为：CCND1基因探针、RB1基因探针、C-myc基因探针和CHEK2基因探针的浓度均为0.04μg/μl。
进一步，该检测试剂盒还包括：DAPI复染剂。
本发明还提供了上述试剂盒在辅助检测参与G1/S调控作用的相关基因中的应用，包括如下步骤：
1）杂交：将要检测的标本处理好后，加入即用型杂交液，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，85-90℃变性5分钟，47℃杂交过夜；
2）洗片，荧光显微镜检：标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液（SalineSodium Phosphate EDTA，SSPE）中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果；
3）图像采集与分析：采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，六种滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5（50），PF-415(45)组合，首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法（AxioVision Rel.4.8.2软件）记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD（Charge-Coupled Device，电荷耦合原件）相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像。
4）结果判断：特异的荧光信号应位于细胞核内，通过信号的数目和位置来判断所检测基因的正常或异变。例如，在正常的双倍体细胞中每个基因一般呈现2个清晰的荧光点；如基因缺失，则荧光信号亦呈现缺失；如基因拷贝数增多，则荧光信号点增多；根据荧光信号的颜色来判断基因的种类。如两种基因发生重组，则会发生两种荧光信号的重叠，产生新的颜色。
本发明的有益效果是：
本发明试剂盒建立了一种针对乳腺癌细胞的定量多基因荧光原位杂交探针，采用多色荧光素标记不同的基因，可以在同一时间内定量单个乳腺癌细胞核中多达4个基因，使标本检测效率明显提高，可用于大规模研究临床标本基因拷贝数的变化(等位基因失衡)。
本发明提供了一种在单细胞水平筛选和验证多种基因异变的G1/S期调控相关探针的组合，可以用于乳腺癌不同亚型的基因变异特点的研究，也可用于同一个亚型疾病的进一步分类，此外，此探针组合也可用于探讨研究其他肿瘤细胞周期G1/S期调控相关基因的变异情况。
相较于传统的荧光原位杂交法技术，定量多色荧光原位杂交法技术的信噪比提高了5-10倍，这正是同时定量分析单个细胞核内多个基因的前提条件；能在具有不同形态和免疫组化特征的肿瘤区域准确地识别单个细胞的遗传学异常，检测乳腺癌细胞群体中的克隆变异。
附图说明
图1为用绿色荧光素标记含有CCND1基因的3个BAC克隆，将这三种BAC克隆混合后和正常成纤维双倍体细胞杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示绿色荧光探针同一基因位点结合，细胞核中最后呈现两个荧光素信号点，没有出现信号分散情况。表明这三种含CCND1基因的BAC克隆可联合用作检测CCND1基因的FISH探针。
图2是本发明将成功制作的Green-CCND1（绿色荧光素标记的CCND1探针），PF555-RB1（黄色荧光素标记的RB1探针），PF590-C-myc（红色荧光素标记的C-myc探针），PF415-CHEK2（蓝色荧光素标记的CHEK2探针）四色探针组合（表2所示）混合后和人二倍体成纤维细胞杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示在同一细胞核中，每种探针得到两个清晰的荧光信号，4种探针一共获得8个相应的荧光信号点。获得的图像清晰，信噪比高。
图3是本发明将成功制作的Green-CCND1（绿色荧光素标记的CCND1探针），PF555-RB1（黄色荧光素标记的RB1探针），PF590-C-myc（红色荧光素标记的C-myc探针），PF415-CHEK2（蓝色荧光素标记的CHEK2探针）四色探针组合（表2所示）混合后和乳腺癌印片细胞杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示在同一细胞核中，Green-CCND1绿色荧光信号探针和PF415-CHEK2蓝色荧光信号探针各为2个信号点，PF590-C-myc红色荧光信号探针为4个信号点，PF555-RB1黄色荧光探针为1个信号点。获得的图像清晰，信噪比高。可见在这个乳腺癌细胞中CCND1基因缺失（只有1个荧光亮点），RB1基因缺失（只有1个荧光亮点），C-myc基因扩增（4个荧光亮点），CHEK2基因为二倍体（2个荧光亮点）。
图4是本发明将成功制作的Green-CCND1（绿色荧光素标记的CCND1探针），PF555-RB1（黄色荧光素标记的RB1探针），PF590-C-myc（红色荧光素标记的C-myc探针），PF415-CHEK2（蓝色荧光素标记的CHEK2探针）四色探针组合（表2所示）混合后和乳腺癌石蜡包埋细胞进行杂交得到的图像。结果显示得到的图像清晰，信噪比高。图中蓝染背景为乳腺癌细胞的细胞核，其中的彩色荧光信号点即为检测的基因拷贝，计算其中的荧光信号点的数量就可以得到检测基因拷贝数的变化情况。
具体实施方式
下面结合具体实施对本发明作进一步详细说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1.CCND1基因探针的制备
一、探针DNA的获取
1)划线接种：将3个分别携带有CCND1基因的BAC菌种（克隆编号为RP11-825J6，RP11-156B3，RP11-643C9购于Invitrogen公司）分别按照如下步骤操作，首先将BAC菌种划线接种于含有抗生素（氯霉素）的琼脂平板上，37℃培养过夜（约14小时）。
2)初始培养：次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ml含有抗生素（氯霉素）的LB液体培养基中，放入37℃摇床，设置摇床速度约200rpm，培养6-8小时。
3)过夜培养：每1ml步骤2)所得菌液转移至200ml含有抗生素（氯霉素）的LB液体培养基中，放置于37℃摇床，转速200rpm，培养过夜（约14-16小时）。
4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。
二、探针标记
1.酶切DNA:
1）按照以下反应体系对目的DNA进行酶切
其中CCND1-R1：对应的克隆编号为RP11-825J6、CCND1-R2：对应的克隆编号为RP11-156B3、CCND1-N：对应的克隆编号为RP11-643C9。
10×SH：Restriction Endonuclease Buffer SH。
37℃孵育1小时，加入1μl的0.5M的乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)(PH7.5)终止反应，混匀，瞬时离心。
2）沉淀DNA：加入步骤1）总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
3）再加入步骤2）总液体量2倍体积100%乙醇（-20℃），混匀，瞬时离心，-70℃，沉淀约2小时。
4）离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入100μl70%乙醇（4℃），混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。
5）用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟，用10μl的10mM的Tris-HCl（PH8.5）重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时，转速800rpm，将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
2.连接反应:
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记，对CCND1基因的三个BAC探针用同一种荧光素进行标记。
方法如下：
取避光的EP管，先加入水，最后加入DNaseⅠ(10ng/μl)和DNA polymeraseⅠ（10units/μl，酶始终放在冰盒或冰上）按如下反应体系加液：
混匀，瞬时离心，14℃孵育过夜(9-12小时)。
次日加入5μl的0.5M的EDTA(PH7.5)终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的DNA放在-20℃避光保存。
3.沉淀DNA:
1）按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀：
再加入15μl的3M的乙酸钠，630μl的100%乙醇（-20℃）混匀，瞬时离心，-20℃，沉淀过夜。
2）次日离心14000rpm，4℃，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100μl的70%乙醇（4℃），混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。
3）加入10μl的含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针，转速800rpm，将溶解好的探针放在4℃保存直至后续实验。
4）将步骤3）制作好的探针从4℃中拿出，放入56℃中孵育1小时，室温离心14000rpm，20分钟，将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中，4℃中保存，若长期不用探针应保存于-20℃。
三、杂交反应
1.细胞准备：
1）正常人二倍体成纤维细胞(Human diploid fibroblast cell,HDF)培养于含有20%胎牛血清的MEM与F12（1:1）混合培养基中，当细胞生长融合至90%时，用0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液进行消化，传代；
2）取对数生长期的细胞，进行细胞爬片；
3）将制作好的细胞爬片放入甲醇中室温固定过夜；
4）次日放入1-2%的甲醛溶液中室温固定5分钟，磷酸缓冲液（PBS）中洗涤后放入70%的乙醇中-20℃保存；
5）将保存在70%的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇（70%，85%，2×100%乙醇）中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入制作好的探针，10μl/片，加上18×18mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。
2.杂交：
将玻片放入杂交仪中，85-90℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
3.洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
4.梯度乙醇中脱水（70%，85%，2×100%乙醇），3分钟/梯度。
5.放入己烷：异丙醇（体积比60:40）混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100%的乙醇中5分钟。
6.空气中干燥片子约10分钟后加入8-10μl的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
7.图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD（Charge-Coupled Device，电荷耦合原件）相机在63倍油镜下分别在DAPI（Emission：450-490nm）,Spectrum GreenTM(Emission：512-542nm)两个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像。
8.结果判断：
从获得的Spectrum GreenTM(Emission：512-542nm)-CCND1(绿色)（图1）中可以看出，所挑选的3个含CCND1基因序列的BAC克隆能够很好的结合在同一个基因位点（图1），没有出现信号分散的情况。结果表明，联合使用这3个BAC克隆来制备CCND1探针，可充分保证杂交信号的强度并提高分辨率。
实施例2：Green-CCND1（绿色），PF555-RB1（黄色），PF590-C-myc（红色），PF415-CHEK2（蓝色）四色探针组合物的制备。
一、探针DNA的获取
1)划线接种：将分别携带有C-myc,CHEK2,RB1,CCND1基因的BAC菌种分别划线接种于含有抗生素（氯霉素）的琼脂平板上，37℃培养过夜（约14小时）。
含CCND1基因最优的克隆，编号为：RP11-825J6，RP11-156B3和RP11-643C9。
含RB1基因最优的克隆，编号为：RP11-951P4，RP11-305D15和RP11-102I4。
含C-myc基因最优的克隆，编号为：RP11-944J14，RP11-367L7和RP11-440N18。
含CHEK2基因最优的克隆，编号为：RP11-1001I5，RP11-872I24和RP11-694G9。
均购于Invitrogen公司。
2)初始培养：次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ml含有抗生素（氯霉素）的LB液体培养基中，放入37℃摇床，设置摇床速度约200rpm，培养6-8小时。
3)过夜培养：每1ml步骤2)所得菌液转移至200ml含有抗生素（氯霉素）的LB液体培养基中，放置于37℃摇床，转速200rpm，培养过夜（约14-16小时）。
4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。
二、探针标记
1.酶切DNA:
1）按照以下反应体系对目的DNA进行酶切
37℃孵育1小时，加入1μl的0.5M的乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)(PH7.5)终止反应，混匀，瞬时离心。
2）沉淀DNA：加入步骤1）总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
3）再加入步骤2）总液体量2倍体积100%乙醇（-20℃），混匀，瞬时离心，-70℃，沉淀约2小时。
4）离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入100μl70%乙醇（4℃），混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。
5）用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟，用10μl的10mM的Tris-HCl（PH8.5）重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时，转速800rpm，将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
2.连接反应:
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记，对探针C-myc,CHEK2,RB1,CCND1分别采用PromoFluor-590-aadUTP,PromoFluor-415-aadUTP，PromoFluor-555-aadUTP,GreendUTP,四种荧光素（表1）进行标记，对Green-CCND1（绿色），PF555-RB1（黄色），PF590-C-myc（红色），PF415-CHEK2（蓝色）探针组合标记（如表2）。
方法如下：
取避光的EP管，先加入水，最后加入DNaseⅠ(10ng/μl)和DNA polymeraseⅠ（10units/μl，酶始终放在冰盒或冰上）按如下反应体系加液：
混匀，瞬时离心，14℃孵育过夜(9-12小时)。
次日加入5μl的0.5M的EDTA(PH7.5)终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的DNA放在-20℃避光保存。
3.沉淀DNA:
1）按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀：
cotDNA：即Human Cot-1DNA。
再加入15μl的3M的乙酸钠，630μl的100%乙醇（-20℃）混匀，瞬时离心，-20℃，沉淀过夜。
2）次日离心14000rpm，4℃，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100μl的70%乙醇（4℃），混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。
3）加入10μl的含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针，转速800rpm，将溶解好的探针放在4℃保存直至后续实验。
4）将步骤3）制作好的探针从4℃中拿出，放入56℃中孵育1小时，室温离心14000rpm，20分钟，将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中，4℃中保存，若长期不用探针应保存于-20℃。
三、HDF细胞的杂交反应
1.细胞准备：
1）正常人二倍体成纤维细胞(Human diploid fibroblast cell,HDF)培养于含有20%胎牛血清的MEM与F12（1:1）混合培养基中，当细胞生长融合至90%时，用0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液进行消化，传代；
2）取对数生长期的细胞，进行细胞爬片；
3）将制作好的细胞爬片放入甲醇中室温固定过夜；
4）次日放入1-2%的甲醛溶液中室温固定5分钟，磷酸缓冲液（PBS）中洗涤后放入70%的乙醇中-20℃保存；
5）将保存在70%的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇（70%，85%，2×100%乙醇）中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入制作好的探针，10μl/片，加上18×18mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。
2.杂交：
将玻片放入杂交仪中，85-90℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
3.洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
4.梯度乙醇中脱水（70%，85%，2×100%乙醇），3分钟/梯度。
5.放入己烷：异丙醇（体积比60:40）混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100%的乙醇中5分钟。
6.空气中干燥片子约10分钟后加入8-10μl的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
7.图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5（50），PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD（Charge-Coupled Device，电荷耦合原件）相机在63倍油镜下分别在DAPI（Emission：450-490nm）,SpectrumGreenTM(Emission：512-542nm),Cy3TMv1（Emission：559.5-574.5nm）,Texas Red（Emission：619.5-642.5nm）,PF-415（Emission：460-500nm）五个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得获得清晰、稳定，理想的多色图像。
8.结果判断：
从获得的Green-CCND1（绿色），PF555-RB1（黄色），PF590-C-myc（红色），PF415-CHEK2（蓝色）的多色图像（图2）中可以看出，同时检测的4个不同基因的荧光信号均较强，图像清晰，方法可靠稳定,此四色混合探针制作成功，可用于实验标本的检测。
四、乳腺癌印片细胞的杂交反应
1.乳腺癌印片细胞准备
1).将乳腺癌肿瘤组织剖面用磷酸缓冲液(PBS)冲洗后取红细胞较少处进行印片；
2).将印好的乳腺癌细胞印片标本放入甲醇中室温固定过夜；
3).次日放入2%的甲醛溶液中室温固定5分钟，磷酸缓冲液（PBS）中洗涤后放入70%的乙醇中-20℃保存；
4).将保存在70%的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇（70%，85%，2×100%乙醇）中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入制作好的探针，10μl/片，加上18×18mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。
2.杂交：
将玻片放入杂交仪中，85-90℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
3.洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
4.梯度乙醇中脱水（70%，85%，2×100%乙醇），3分钟/梯度。
5.放入己烷：异丙醇（体积比60:40）混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100%的乙醇中5分钟。
6.空气中干燥片子约10分钟后加入8-10μl的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
7.图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5（50），PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD（Charge-Coupled Device，电荷耦合原件）相机在63倍油镜下分别在DAPI（Emission：450-490nm）,SpectrumGreenTM(Emission：512-542nm),Cy3TMv1（Emission：559.5-574.5nm）,Texas Red（Emission：619.5-642.5nm）,PF-415（Emission：460-500nm）五个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得获得清晰、稳定，理想的多色图像。
8.结果判断：
从获得的Green-CCND1（绿色），PF555-RB1（黄色），PF590-C-myc（红色），PF415-CHEK2（蓝色）的多色图像（图3）中可以看出，同时检测的4个不同基因的荧光信号均较强，图像清晰，方法可靠稳定。
实施例3
一种用于辅助检测参与G1/S调控作用的相关基因的检测试剂盒，10人份/盒，组成如下：
即用型杂交液和DAPI复染剂。
即用型杂交液100μl（其中CCND1基因探针、RB1基因探针、C-myc基因探针和CHEK2基因探针，浓度均为0.04μg/μl）。
DAPI复染液100μl。
实施例4试剂盒的应用：乳腺癌石蜡标本细胞的杂交反应
1.乳腺癌石蜡标本细胞准备
1).乳腺癌石蜡包埋块切片(4μm厚)，石蜡玻片置65℃孵育1h，使石蜡熔化；
2).顺次转移石蜡玻片至三个盛有二甲苯的染缸，每次浸泡15min；
3).无水乙醇洗片2次，每次10min；
4).石蜡玻片再水化：梯度乙醇处理100%EtOH→85%EtOH→70%EtOH→dH2O，每次5min；
5).石蜡玻片置0.2M HCl，室温孵育10min；
6).PBS洗片5min；
7).0.01M citrate buffer（枸橼酸盐缓冲液，PH=6.0）孵育玻片，80℃，1h；
8).2×SSC缓冲液洗片2次，每次5min；
9).dH2O洗片，5min；
10).将0.5mg/ml pepsin及0.02M HCl溶液37℃预热5min，将预热好的两种溶液1:1混合，配制成0.25mg pepsin/ml0.01M HCl溶液；
11).将片子从水中取出后，加300ul pepsin,加上规格为24×50mm的盖玻片，37℃孵育10min；
12).2×SSC洗片2次，每次5min；
13).用0.4%甲醛复固定切片10min（室温）；
14).PBS洗片5min，0.1×PBS洗片5min；
15).梯度乙醇脱水：70%→85%→2×100%EtOH，每次5min；
16).室温，空气干燥石蜡玻片20min；
2.杂交
1).每片加入用于辅助检测参与G1/S调控作用的相关基因的检测的即用型杂交液10ul（避免产生气泡）；
2).加盖玻片18×18mm；
3).封片胶封片；
4).将封好的玻片47℃干燥15-20min；
5).将石蜡玻片放入杂交仪中，85-90℃变性10分钟，47℃杂交48h。
3.洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
4.梯度乙醇中脱水（70%，85%，2×100%乙醇），3分钟/梯度。
5.放入己烷：异丙醇（体积比60:40）混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100%的乙醇中5分钟。
6.空气中干燥片子约10分钟后加入8-10μl的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
7.图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5（50），PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD（Charge-Coupled Device，电荷耦合原件）相机在63倍油镜下分别在DAPI（Emission：450-490nm）,SpectrumGreenTM(Emission：512-542nm),Cy3TMv1（Emission：559.5-574.5nm）,Texas Red（Emission：619.5-642.5nm）,PF-415（Emission：460-500nm）五个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得获得清晰、稳定，理想的多色图像。
8.结果判断：
从获得的Green-CCND1（绿色），PF555-RB1（黄色），PF590-C-myc（红色），PF415-CHEK2（蓝色）的多色图像（图4）中可以看出，同时检测的4个不同基因的荧光信号均较强，图像清晰，方法可靠稳定。
通过本发明，我们建立了一组稳定性良好、操作简易的四色基因探针，一个乳腺癌细胞上可同时检测四种基因的拷贝数变异情况，其费用较为低廉，可以应用到乳腺癌的印片标本或者石蜡标本，应用范围较广泛，敏感性高，特异性强。因荧光原位杂交法BAC探针长度可达到几百KB，能够跨越几个外显子区域，只要是在探针设计范围内发生的各种基因缺失或扩增甚至融合基因都能被检测到。
乳腺癌是一种多基因发生异常的疾病，尤其是细胞周期调控的紊乱在乳腺癌的发生发展过程中发挥着重要作用，本发明选取了细胞周期调控中的G1/S期调控位点的相关基因作为探针组合，利用定量多基因荧光原位杂交技术可同时检测分析这些基因在同一个乳腺癌细胞中的拷贝数变异的情况，有助于深入认识研究乳腺癌肿瘤组织的异质性和癌前病变，此外，针对不同的危险度分层，还可以指导临床采取相应强度的个体化治疗，可以大大改善乳腺癌患者的预后。
表1荧光素标记的dUTP
表2四色基因探针荧光素标记

Claims (4)

1.一种用于辅助检测乳腺癌参与G1/S调控作用的相关基因的即用型杂交液，其特征在于：该即用型杂交液用到的探针为：CCND1基因探针、RB1基因探针、C-myc基因探针和CHEK2基因探针；该即用型杂交液的制备方法，包括如下步骤：
1)、探针制作：在NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Bioinformatics上定位检索分别含检测CCND1、RB1、C-myc、CHEK2基因的BAC克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，对标记好的目的DNA进行组合沉淀，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，制得即用型杂交液； 
2)、探针验证：采用正常人二倍体成纤维细胞的细胞爬片进行探针验证；
其中含CCND1基因的克隆，编号为：RP11-825J6，RP11-156B3或RP11-643C9中的一种或两种或三种；含RB1基因的克隆，编号为：RP11-951P4，RP11-305D15或RP11-102I4一种或两种或三种；含C-myc基因的克隆，编号为：RP11-944J14，RP11-367L7或RP11-440N18一种或两种或三种；含CHEK2基因的克隆，编号为：RP11-1001I5，RP11-872I24或RP11-694G9一种或两种或三种，上述克隆编号来自UCSC genome browser。
2.一种用于辅助检测乳腺癌参与G1/S调控作用的相关基因的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述即用型杂交液。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述即用型杂交液的组分及浓度为：CCND1基因探针、RB1基因探针、C-myc基因探针和CHEK2基因探针的浓度均为0.04μg/μl。
4.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒还包括： DAPI复染剂。
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