CN111635945B - 一种Vimentin基因表达检测试剂盒 - Google Patents

一种Vimentin基因表达检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111635945B
CN111635945B CN202010647621.4A CN202010647621A CN111635945B CN 111635945 B CN111635945 B CN 111635945B CN 202010647621 A CN202010647621 A CN 202010647621A CN 111635945 B CN111635945 B CN 111635945B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
probe
mrna
probes
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010647621.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111635945A (zh
Inventor
许嘉森
吴诗扬
曾杰
刘志明
刘芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Surexam Bio Tech Co Ltd
Original Assignee
Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Surexam Bio Tech Co Ltd filed Critical Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority to CN202010647621.4A priority Critical patent/CN111635945B/zh
Publication of CN111635945A publication Critical patent/CN111635945A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111635945B publication Critical patent/CN111635945B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种Vimentin基因表达检测试剂盒，其包括针对检测Vimentin基因mRNA的捕获探针及信号放大系统；所述信号放大系统包括扩增探针和标记探针；其中，所述捕获探针用于连接Vimentin基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针上修饰有4～6个阳离子精胺单元，且从5’端到3’端的碱基组成依次为：特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，且从5’端到3’端的碱基组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，且具有P5序列，末端修饰有荧光基团。所述试剂盒通过检测探针的优化，有效增加捕获探针与目标mRNA的亲和力，提交杂交效率，使所述试剂盒具有杂交快速，杂交稳定性好、准确性高和检测效率高等优点。

Description

一种Vimentin基因表达检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种Vimentin基因表达检测试剂盒。
背景技术
Vimentin，即波形蛋白，是存在于间充质细胞中的一种主要的中间丝蛋白，是细胞骨架的必需成分之一，其基因定位于人类染色体10p13，包含10个外显子。Vimentin在不同的生理及病理状态下显现出复杂的生物学功能，如维持细胞完整性、调控细胞的黏附、迁移、细胞凋亡、上皮-间质转化(EMT)及血管生成等，并且参与创伤、感染、自身免疫及肿瘤侵袭转移等病理过程。研究表明，Vimentin在肺癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌、恶性黑色素瘤等多种上皮型肿瘤中表达增加，其表达情况在肿瘤诊断和预后方面的研究也越来越多。在循环肿瘤细胞(CTCs)研究中，Vimentin常被作为间质型标志物，用于CTCs的分离与鉴定。有研究发现，转移性胃肠道间质瘤患者Vimentin+巨噬细胞样CTCs数量明显高于局部胃肠道间质瘤患者或无癌志愿者，Vimentin+巨噬细胞样CTCs可能作为预测胃肠道间质瘤患者转移风险的潜在生物标志物。另有研究发现，Vimentin+CTCs可在大多数胰腺导管腺癌患者中被检测到，以2个Vimentin+CTCs作为cut-off值可区分胰腺导管腺癌和健康者，Vimentin+CTCs数量与经切除术的患者的肿瘤负荷变化相关，对治疗有反应的患者在化疗后Vimentin+CTCs数量明显减少，术前较高的Vimentin+CTCs数量与较短的无复发生存期相关；表明Vimentin+CTCs可能是胰腺导管腺癌的潜在生物标志物。由此可见，Vimentin在CTCs中表达具有重要的临床价值。鉴于Vimentin表达在肿瘤发生发展、预后和治疗中的重要临床价值及其在CTCs研究中的重要意义，促使我们开发一种Vimentin基因表达检测试剂盒，有助于深入研究Vimentin基因表达在各种肿瘤发生发展、预后及治疗方面的临床意义。
目前常用的Vimentin表达检测方法是免疫组化法和实时定量PCR法。其中，免疫组化法检测样本为组织样本，需手术获取，同时尚未形成统一的操作技术标准和结果判断标准，限制了该方法的应用；而实时定量PCR法对实验条件的要求很严，每一个步骤都必须严格操作并避免污染，否则难以保证检测结果的准确性和可靠性。针对上述问题，中国专利CN201410228511.9提供了一种检测基因表达的RNA原位杂交方法，所述方法的检测探针可实现RNA原位检测的荧光信号放大，提高了检测的灵敏度和准确性，且检测样本可以为体液样本，应用范围广阔。但是进一步的研究发现，上述RNA原位杂交检测方法中检测探针与目标mRNA特异性结合的亲和力需要进一步提升。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种捕获探针与目标mRNA亲和力强、杂交效率高、准确率高的Vimentin基因表达检测试剂盒，通过原位杂交法检测生物样本中Vimentin基因的表达水平，提供临床相关辅助信息。
具体技术方案为：
一种Vimentin基因表达检测试剂盒，包括针对检测Vimentin基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针用于连接Vimentin基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针上修饰有4～6个阳离子精胺单元，且从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与Vimentin基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述特异性P1序列的长度为18～20bp；所述P2序列的长度为24～26bp，且P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和Vimentin基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列的长度为24～26bp，且P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和Vimentin基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团。
本发明中阳离子精胺单元通过与核苷酸中的磷酸形成磷酸二酯键与所述捕获探针相连接，从而修饰到所述捕获探针上。
在其中一些实施例中，所述针对Vimentin基因mRNA的捕获探针的特异性P1序列的5’末端或3’末端修饰有4～6个阳离子精胺单元。当修饰的阳离子精胺单元位于特异性P1序列的5’末端或3’末端时，能更好地提高捕获探针与Vimentin基因mRNA的杂交亲和力及稳定性。
所述捕获探针的特异性P1序列的5’末端或3’末端是指特异性P1序列的5’端第一个碱基或3’端第一个碱基；所述捕获探针的特异性P1序列的5’末端或3’末端修饰有4～6个阳离子精胺单元是通过以下方式实现的：4～6个阳离子精胺单元通过与特异性P1序列的5’端第一个核苷酸中的磷酸或3’端第一个核苷酸中的磷酸形成磷酸二酯键从而修饰到所述捕获探针特异性P1序列的5’末端或3’末端。
在其中一些实施例中，所述针对Vimentin基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.10中的5条或5条以上，P2序列为SEQ ID NO.21；
和/或，针对Vimentin基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.23，P4序列为SEQ ID NO.25；
和/或，针对Vimentin基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.27。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针用于连接内参基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针上修饰有4～6个阳离子精胺单元，且从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与内参基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述特异性P1序列的长度为18～20bp；所述P2序列的长度为24～26bp，且P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和内参基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列的长度为24～26bp，且P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和内参基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，所述荧光基团与针对Vimentin基因mRNA的标记探针上修饰的荧光基团互不相同。
在其中一些实施例中，所述针对内参基因基因mRNA的捕获探针的特异性P1序列的5’末端或3’末端修饰有4～6个阳离子精胺单元。
在其中一些实施例中，所述为内参基因为ACTB基因；针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的5条或5条以上，P2序列为SEQID NO.22；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.24，P4序列为SEQ IDNO.26；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.28。
在其中一些实施例中，所述间隔臂序列的长度为5～10个碱基；优选地，所述间隔臂序列为5～10个T。
在其中一些实施例中，所述荧光基团为树状荧光基团；优选地，所述树状荧光基团的荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LCRED705、Alexa Fluor488和Alexa Fluor 750。
本发明还提供了一种非疾病诊断目的的Vimentin基因表达检测方法，包括以下步骤：
(1)得到生物样本；
(2)从生物样本中富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(4)使用上述试剂盒检测Vimentin基因是否表达：a)捕获探针杂交，捕获探针的特异性P1序列与目标基因mRNA序列特异性结合；b)扩增杂交，捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合，目标mRNA序列信号放大；c)显色，扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，荧光标记目标信号；d)经荧光检测仪检测。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述捕获探针杂交时间为1.5～2h；优选地，所述捕获探针杂交时间为2h。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述扩增杂交时间为12～15min；优选地，所述扩增杂交时间为15min。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述富集待检测细胞包括：①红细胞裂解液处理生物样本，去除红细胞，获得去除红细胞的细胞悬液；②免疫磁珠处理上述步骤①中获得的细胞悬液，去除白细胞，获得初步细胞悬液；③上述步骤②中获得的细胞悬液经含滤膜的过滤器过滤，进一步去除白细胞，待检测细胞则过滤至滤膜上；④上述步骤③中滤膜使用4％甲醛溶液处理，富集的待检测细胞则固定于滤膜上，得到富集有待检测细胞的滤膜。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明捕获探针上修饰了4～6个阳离子的阳离子精胺单元，通过改进所述捕获探针的长度和整体电荷水平来有效减少捕获探针与Vimentin基因mRNA杂交时阴离子电荷的干扰，显著提高捕获探针与Vimentin基因mRNA的亲和力，提高和加速捕获探针对目标mRNA的识别，从而提高杂交效率，缩短杂交时间；同时捕获探针上修饰的4～6个阳离子精胺单元还能使所述捕获探针具有很好的区分碱基完全匹配和单碱基不匹配互补序列的能力，从而保障了所述捕获探针与目标mRNA的特异性杂交，降低了非特异性杂交，提高了检测准确性。尤其是当所述捕获探针修饰的阳离子精胺单元位于特异性P1序列的5’末端或3’末端时，能更好地提高捕获探针与Vimentin基因mRNA的杂交亲和力及特异性。
本发明通过对多探针检测体系中各类检测探针长度和捕获探针电荷水平的优化，使得所述捕获探针不仅能有效融入本发明多探针检测体系中，成功实现Vimentin基因表达的检测，还能明显提高探针的杂交亲和力、检测效率以及准确率。本发明所选择的各种探针，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析、多种参数的优化组合而得出的，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高，从而使得检测试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
附图说明
图1为本发明Vimentin基因阴性和阳性检测结果示意图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
实施例1一种Vimentin基因表达检测试剂盒及检测方法
本实施例所述的Vimentin基因表达检测试剂盒(原位杂交法)，主要包括有：
1.捕获探针
所述捕获探针用于连接Vimentin基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针上修饰有4～6个阳离子精胺单元(本实施例优选在每条捕获探针的特异性P1序列的5’末端修饰4个阳离子精胺单元)，且探针序列由三部分碱基序列组成，从5’端到3’端依次是能与待检测目标mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、能与扩增探针P3序列结合的P2序列，同一目标mRNA的捕获探针中的P2序列相同。所述特异性P1序列的长度为18～20bp；所述P2序列的长度为24～26bp；所述间隔臂用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5～10个T，本实施例优选为5个T。针对每个mRNA分别设计10条捕获探针，在保证整个检测系统的稳定性的基础上，再提高检测的特异性(具体使用时，针对每个目标基因，选择5条或5条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的目标mRNA捕获探针的特异性P1序列见表1，P2序列见表2。
表1目标mRNA捕获探针的P1序列
其中，捕获探针P1序列中4Z代表4个阳离子精胺单元。
表2捕获探针的P2序列
mRNA 捕获探针P2序列(5’-3’) SEQ ID NO.
Vimentin CTTGATGAGCGTGATATATGATCA 21
ACTB ATTGTAGCATAATCGGGATCCGAG 22
2.扩增探针
扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分碱基序列组成，从5’端到3’端依次是能与捕获探针P2序列互补配对的P3序列、5个T的间隔臂序列(本发明的扩增探针间隔臂优选为5～10个T，本实施例优选为5个T)、能与标记探针互补配对的P4序列。所述目标mRNA的扩增探针的P4序列的长度为24～26bp，且内部不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列。针对相应的目标mRNA的扩增探针的P3序列见表3，P4序列见表4。
表3扩增探针的P3序列
mRNA 扩增探针P3序列(5’-3’) SEQ ID NO.
Vimentin TGATCATATATCACGCTCATCAAG 23
ACTB CTCGGATCCCGATTATGCTACAAT 24
表4扩增探针的P4序列
mRNA 扩增探针P4序列(5’-3’) SEQ ID NO.
Vimentin AAGTCGGATCTGACGGATAGTTCC 25
ACTB TAAGTTCGGATACGCCATCCGTCG 26
3.标记探针
标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针序列P4互补配对的P5序列，3’端带有树状荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。标记探针的树状荧光基团的荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LCRED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，不同类型目标mRNA的标记探针的树状荧光基团选择的荧光染料互不相同，且所选择的荧光染料的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便区分不同类型的目标mRNA。
表5标记探针的P5序列
mRNA 标记探针P5序列(5’-3’) SEQ ID NO. 树状荧光基团的荧光染料
Vimentin GGAACTATCCGTCAGATCCGACTT 27 Alexa Fluor 488(绿色荧光信号)
ACTB CGACGGATGGCGTATCCGAACTTA 28 Cy3(红色荧光信号)
本实施例还涉及一种Vimentin基因表达检测方法，主要包括以下步骤：(1)得到生物样本；(2)富集待检测细胞；(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；(4)使用针对检测目标mRNA的捕获探针及信号放大系统检测Vimentin基因是否表达。
所述步骤(2)所述富集待检测细胞包括以下步骤：①红细胞裂解液处理生物样本，去除红细胞，获得去除红细胞的细胞悬液；②免疫磁珠处理上述步骤①中获得的细胞悬液，去除白细胞，获得细胞悬液；③上述步骤②中获得的细胞悬液经含滤膜的过滤器过滤，进一步去除白细胞，待检测细胞则过滤至滤膜上；④上述步骤③中滤膜使用4％甲醛溶液处理，富集的待检测细胞则固定于滤膜上，得到富集有待检测细胞的滤膜。
所述步骤(4)包括以下步骤：a)捕获探针杂交，捕获探针的特异性序列P1与目标基因mRNA序列特异性结合；b)扩增杂交，捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合，目标mRNA序列信号放大；c)显色，扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，荧光标记目标信号；d)通过荧光检测仪检测。
实施例2运用实施例1中试剂盒对样本进行检测
所述各种溶液的配方如表6：
表6各种溶液的配方
本实施例优选肿瘤患者血液样本，对样本中循环肿瘤细胞Vimentin基因表达水平进行检测，其中捕获探针混合液、扩增探针混合液、显色探针混合液均使用实施例1的Vimentin基因表达检测试剂盒(原位杂交法)相应列表中的全部探针。
1、抽取患者静脉中血液5ml于真空采血管中，得到血液样本
2、样本前处理，待检测细胞过滤至滤膜上：(1)5ml血液样本转移至含有10ml红细胞裂解液的离心管中，充分混匀，放置15分钟，600×g离心5分钟，弃上清液体保留细胞沉淀，用1ml PBS重悬细胞沉淀；(2)向细胞悬液中加入1ml使用浓度为10mg/ml的免疫磁珠，在混合器上反应15分钟，再在磁力架上静置5分钟，将上清液转移到新的离心管中；(3)向上清液中补加PBS至4ml，加入1ml固定剂，涡旋混匀，室温静置8分钟，将其转移至含有滤膜的过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体，再加入4ml PBS，洗涤管壁后抽尽液体；(4)将滤膜转移至24孔板中，加入400μl 4％甲醛溶液，室温固定1小时，再去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
3、透化处理：(1)在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余液体，将滤膜倒扣在透化剂上，室温孵育5min。(2)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤2次，每次浸泡2分钟。
4、消化细胞，暴露mRNA，使其便于与探针杂交：(1)配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成如下：48.75μL的PBS、1.25μL的消化酶，总体积50μL。(2)按实验需要配制一定体积的消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μL。(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，室温静置1小时。(4)去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
5、捕获探针杂交，探针特异性序列与目标mRNA序列结合：(1)捕获缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟。(2)配制捕获工作液：对于每个样本，捕获工作液组成如下：8μl捕获混合液、42μl捕获缓冲液(40℃预热)，总体积50μl。按实验需要配制一定体积，涡旋混匀并分装。(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中捕获工作液上，盖上24孔板盖，40±1℃孵育2小时(本实施例捕获探针的杂交时间优选为2小时，可参考实施例7)。(4)去除液体，每孔加入1mlPBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
6、扩增杂交，目标mRNA序列信号放大：(1)扩增缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟。(2)配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成如下：2μl扩增混合液、48μl扩增缓冲液(40℃预热)，总体积50μl。按实验需要配制一定体积的扩增工作液，涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μl。(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，盖上板盖，40±1℃孵育30分钟。(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
7、显色，荧光标记目标信号：(1)显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；整个显色操作过程需避光操作。(2)配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成如下：2μl显色混合液、48μl显色缓冲液(40℃预热)，总体积50μl。按实验需要配制一定体积的显色工作液，避光涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μl。(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色工作液上，盖上24孔板盖，40±1℃避光孵育15分钟(本实施例标记探针的杂交时间优选为15分钟，可参考实施例9)。(4)去除液体，每孔加入1mlPBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
8、荧光显微镜观察Vimentin基因的表达：本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。(1)将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于－20℃保存。(2)通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量。(3)根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。(4)然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察并记录实验结果。(5)重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表7荧光基团的激发波长和发射波长
荧光基团 激发波长(Excitation filter) 发射波长(Emission filter)
DAPI 330～385nm 420nm
Alexa Fluor 488 460～495nm 510～550nm
Cy3 545～580nm 610nm
9、检测结果判断及分析
(1)Vimentin基因表达判定标准：在滤膜上，富集有待检测细胞，本试剂盒阳性表达判定标准(参见图1)：a)样本中有1个或1个以上细胞表达Vimentin基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中有1个或1个以上细胞在Alexa Fluor 488通道下能够显示绿色荧光信号点。b)样本中所有细胞均表达内参基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中所有细胞在Cy3通道下均显示红色荧光信号点。
本试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对Vimentin基因mRNA和内参基因mRNA，通过荧光信号的表达，判断检测的细胞是否为表达Vimentin。
(2)使用上述检测方法，对15例肿瘤患者外周血样本(编号1～15)进行检测，同时选用市售Vimentin阳性肺癌细胞株NCl-H1975和阴性表达细胞株CCRF-HSB-2淋巴母细胞分别作为阳性对照和阴性对照。分别各取约1000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份编号16～20和21～25，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。每个标本重复检测三次。具体结果如表8所示：
表8样本检测结果
检测发现，每个标本的每次检测结果相同，且从上述检测结果可知，本发明Vimentin基因表达检测试剂盒(原位杂交法)具有很好的特异性和灵敏度，能实现临床样本的检测。本发明试剂盒与临床检测结果具有100％的吻合率，说明本发明试剂盒设计的探针组成的检测体系能对患者循环肿瘤细胞中Vimentin的表达进行精准检测，具有很高的准确率。
实施例3不同类型捕获探针对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(捕获探针设计)
为了评估不同类型捕获探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-2，实验组1选用本发明实施例1所述试剂盒中的捕获探针；实验2组选用现有的线性寡核苷酸探针，其除了没有修饰阳离子精胺单元外，碱基组成与实施例1所述捕获探针相同。
2、样本检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对15例肿瘤患者血液样本(依次编号为1～15)进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表9试剂盒选用不同捕获探针的检测结果比较
从以上检测结果可知，与常规的线性捕获探针(实验组2)相比，本发明设计的捕获探针(实验组1)具有更高的准确度，检测结果与临床检测结果100％吻合。现有的线性寡核苷酸探针对靶核酸的亲和性不如本发明所述捕获探针，在探针杂交过程中难以避免探针分子未能与靶核酸结合而造成特异性荧光信号丢失，因此现有的寡核苷酸探针的灵敏度低于本发明捕获探针，导致一些阳性细胞漏检(如2号、3号、9号和12号样本)，甚至会导致假阴性结果的产生(如11号和14号样本)。同时现有的线性寡核苷酸探针由于不具备区分碱基完全匹配和单碱基不匹配互补序列的能力，故存在一些非特异性杂交，导致一些假阳性结果的产生(如6号和8号样本)。因此，本发明改进的捕获探针具有更好靶mRNA杂交亲和力和稳定性，在更短的杂交时间内即可准确完成检测，检测准确率更高。
实施例4捕获探针修饰的阳离子精胺单元数量对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(捕获探针修饰的阳离子精胺单元数量设计)
为了考察捕获探针修饰的阳离子精胺单元数量对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-8，八个实验组捕获探针特异性P1序列的5’末端(5’端第一个碱基处)修饰的阳离子精胺单元数量分别为0个、2个、4个、6个、8个、10个、15个和20个，各实验组捕获探针除了修饰的阳离子精胺单元数量不同之外，其它组分均相同。
2、样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约8000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为40份，依次编号1～40和41～80。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～80进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表10不同数量阳离子精胺单元修饰的捕获探针的检测结果比较
/>
从上述检测结果可知，当捕获探针修饰有0个阳离子精胺单元(实验组1)时，存在一些阳性细胞未能被检出的现象，无法实现准确检测；当捕获探针修饰有2个阳离子精胺单元(实验组2)时，检测到的荧光信号点数相较于实验1组有所提高，但存在个别阳性细胞未能被检出的现象，仍无法实现准确检测；当捕获探针修饰有4个或6个阳离子精胺单元(实验组3和实验组4)时，所有阳性细胞都能被检出，且检测到的荧光信号点数相较于实验组1、实验组2明显提高，信号更强更稳定，检测效果很好，能实现准确检测；当捕获探针修饰有8个精胺单元(实验组5)时，所有阳性细胞都能被检出，也能实现准确检测，但检测到的荧光信号点数与实验组3、实验组4相差不大；当捕获探针修饰有10个精胺单元(实验组6)时，所有阳性细胞也都能被检出，也能实现准确检测，但检测到的荧光信号点数明显减少；当捕获探针修饰有15个或20个精胺单元(实验组7和实验组8)时，检测到的荧光信号点数持续减少，存在一些阳性细胞未能被检出的现象，无法实现准确检测。说明在一定范围内，随着修饰的阳离子精胺单元数量的增加，捕获探针因其阴离子电荷干扰的减少与靶核酸的亲和力增加，从而提高杂交效果，当捕获探针修饰有4～6个阳离子精胺单元时，其特异性和稳定性才都很好，检测效果达到最佳；捕获探针修饰的阳离子精胺单元数量继续增加至8个或10个也能保证准确检测，但并不会进一步提高检测到的荧光信号；而当捕获探针修饰的阳离子精胺单元数量再继续增加至15个或20个时则会降低捕获探针在检测体系中与靶核酸结合的稳定性，降低目标mRNA-捕获探针复合体在检测体系中的稳定性，从而导致检测效果下降。因此，为确保试剂盒检测结果的准确性同时节约经济成本，本发明针对Vimentin基因的检测设计的捕获探针中修饰有4～6个阳离子精胺单元；进一步地，为确保试剂盒检测结果的准确性同时节约经济成本，本发明实施例1优选每条捕获探针特异性P1序列的5’末端修饰有4个阳离子精胺单元(4Z)。
实施例5捕获探针的阳离子精胺单元修饰位置对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(捕获探针的阳离子精胺单元修饰位置设计)
为了考察捕获探针的阳离子精胺单元修饰位置对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-4，四组实验组捕获探针的阳离子精胺单元修饰位置分别为捕获探针P1序列的5’末端(5’端第一个碱基处)、捕获探针P1序列的3’末端(3’端第一个碱基处)、捕获探针P2序列的5’末端(5’端第一个碱基处)、捕获探针P2序列的3’末端(3’端第一个碱基处)，四组捕获探针修饰的阳离子精胺单元数量均为4个，且除了捕获探针的阳离子精胺单元修饰位置不同之外，其它组分均相同。
2、样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约4000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为20份，依次编号1～20和21～40。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～40进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表11不同阳离子精胺单元修饰位置的捕获探针的检测结果比较
通过四组实验对比可知，使用特异性P1序列的5’末端、特异性P1序列的3’末端、P2序列的5’末端和P2序列的3’末端经4个阳离子精胺单元修饰的捕获探针均可完成检测，但当捕获探针的阳离子精胺单元修饰位置为特异性P1序列的5’末端或3’末端时，其检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳。因此，当本发明所述捕获探针的阳离子精胺单元修饰位置为捕获探针特异性P1序列的的5’末端或3’末端时，所述捕获探针的电荷分布更有利于提高其与靶mRNA的杂交亲和力。
实施例6捕获探针的特异性
1、试剂盒制备的设计(捕获探针特异性P1序列的设计)
为了考察所述捕获探针的特异性，以Vimentin基因mRNA的捕获探针为例，设计实验组1-2，其中实验组1采用实施例1试剂盒相应列表中的全部探针，实验组2采用P1序列具有1-5个替换碱基的捕获探针，具体设计如表12所示，其它检测组份均与实验组1完全一致。
表12捕获探针P1序列设计
2、样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表13不同捕获探针P1序列的检测结果比较
从上述检测结果可知，当实验组2的捕获探针特异性P1序列与Vimentin基因mRNA不能完全互补配对时，在Vimentin阳性表达细胞株NCl-H1975中基本检测不到荧光信号，不能实现检测，说明本发明提供的捕获探针具有很高的特异性，当捕获探针P2序列与扩增探针P3序列完全匹配，但捕获探针的特异性P1序列不能与mRNA完全匹配时，探针因其很好的区分碱基完全匹配和单碱基不匹配互补序列的能力而与其不能完全匹配的mRNA之间无法成功杂交，导致mRNA不能通过捕获探针与信号放大系统相连，从而不产生荧光信号，无法实现检测。同理，当实验组1的捕获探针遇上非Vimentin基因mRNA时，亦不会产生非特异性杂交，即只要序列与Vimentin基因mRNA存在1个或以上碱基的差异，都不能使所述捕获探针与之杂交，不会产生荧光信号。因此，本发明提供的捕获探针具有很高的特异性，保证了检测结果的准确性。
实施例7捕获探针杂交时间对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(捕获探针杂交时间的设计)
为了评估捕获探针杂交时间对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-3和对照组1-3，杂交时间依次设置为1小时、2小时和3小时，实验组1-3选用本发明实施例1试剂盒中的捕获探针，对照组1-3选用现有的线性寡核苷酸探针，实验组和对照组相比，除了对照组试剂盒中捕获探针没有修饰阳离子精胺单元外，其它组份组分均与实验组试剂盒相同。实验组使用实施例1所述的Vimentin基因表达检测试剂盒(原位杂交法)进行检测，对比其检测效果。
2、样本检测
本实施例选用市场上销售的细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组/对照组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表14不同捕获探针不同杂交时间的检测结果比较
/>
从上述检测结果可知，三组实验组捕获探针杂交时间为1小时、2小时和3小时均可完成检测，其特异性和稳定性都很好，同时，与本发明捕获探针杂交1小时相比，当本发明捕获探针杂交时间为2小时或3小时时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；而对照组捕获探针杂交1小时或2小时时均存在大量阳性细胞漏检的现象，无法完成准确检测，检出的荧光信号点数也都明显少于三组实验组，只有杂交3小时才能实现准确检测，其检出的细胞数和荧光信号点数与实验组2、实验组3相差不大；说明本发明捕获探针相较于现有线性寡核苷酸探针检测效果更佳，可提高杂交速度，从而缩短杂交时间。为保障试剂盒检测结果的准确性同时节省时间成本，本发明的捕获探针杂交时间优选为2小时。
实施例8标记探针的荧光基团选择对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(标记探针的荧光基团设计)
为了评估带有不同结构荧光基团的标记探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-2，其中实验组1选用本发明试剂盒中的树状荧光基团修饰的标记探针，实验组2选用常规荧光基团修饰的标记探针，两个实验组除了荧光基团结构不同之外，相应荧光染料及其它组分均相同，其中针对Vimentin基因检测使用的荧光染料为Alexa Fluor 488，针对ACTB基因检测使用的荧光染料为Cy3。
2、样本检测
本实施例选用市场上销售的细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表15不同结构荧光基团修饰的标记探针的检测结果比较
从上述检测结果可知，当使用本发明设计的树状荧光基团修饰的标记探针(实验组1)时，所有阳性细胞都能被检出，而当使用常规荧光基团修饰的标记探针(实验组2)时，存在个别阳性细胞未能被检出的现象；与常规荧光基团修饰的标记探针(实验组2)相比，本发明设计的树状荧光基团修饰的标记探针(实验组1)检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；说明本发明设计的标记探针通过引入树状荧光基团的使用，可使荧光信号更多更明亮更稳定，提高了标记探针的灵敏度，有助于在更短的显色杂交时间内实现荧光标记目标信号，进一步提高检测效率。
实施例9标记探针杂交时间对试剂盒检测效果的影响
为了评估标记探针杂交时间对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-3和对照组1-3，标记探针杂交时间依次设置为10分钟、15分钟和30分钟，实验组1-3选用本发明试剂盒中的标记探针，对照组选用常规标记探针，两组除了标记探针不同之外，其它组分均相同，使用实施例1试剂盒进行检测，对比其检测效果。
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表16不同标记探针不同杂交时间的检测结果比较
从上述检测结果可知，三组实验组标记探针杂交时间为10分钟、15分钟和30分钟均可完成检测，其特异性和稳定性都很好，同时，与本发明标记探针杂交10分钟相比，当本发明标记探针杂交时间为15分钟或30分钟时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；而对照组使用常规标记探针杂交10分钟或15分钟均存在阳性细胞漏检的现象，无法完成准确检测，检出的荧光信号点数也较少，只有杂交30分钟才能实现准确检测，其检出的细胞数和荧光信号点数与实验组2、实验组3相差不大；说明本发明标记探针相较于常规标记探针检测效果更佳，在短时间内即可实现好的检测。为保障试剂盒检测结果的准确性同时节省时间成本，本发明的标记探针杂交时间优选为15分钟。
实施例10检测探针各序列长度对试剂盒检测效果的影响
1、试剂盒制备的设计(检测探针各序列长度的设计)
为了考察检测探针各序列长度对试剂盒检测效果的影响，以Vimentin基因mRNA的检测探针为例，设计实验组1-10，实验组1选用本发明试剂盒的全套检测探针，其特异性P1序列的长度为20bp，P2序列和P4序列的长度均为24bp；实验组2-4选用特异性P1序列长度分别为16bp、18bp和22bp的检测探针，检测探针P2-P5各序列与本发明试剂盒的检测探针的P2-P5各序列相同；实验组5-7选用P2序列长度分别为22bp、26bp和28bp的检测探针，P3序列也随之改变，检测探针P1、P4和P5各序列与本发明试剂盒的检测探针的P1、P4和P5各序列相同；实验组8-10选用P4序列长度分别为22bp、26bp和28bp的检测探针，P5序列也随之改变，检测探针P1-P3各序列与本发明试剂盒的检测探针的P1-P3各序列相同；对比其检测效果。具体设计如表17所示。
表17试剂盒Vimentin的检测探针各序列长度的选择
/>
/>
2、样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组每种细胞株各检3份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表18试剂盒Vimentin的不同序列长度检测探针的检测结果
/>
从上述检测结果可知，当选用的特异性P1序列的长度为18～20bp(实验组1和实验组3)时，所有阳性细胞均能被检出，检测到的荧光信号稳定且荧光信号点数较多，可实现准确检测，试剂盒的特异性和稳定性都很好，检测效果达到最佳；当选用的特异性P1序列长度为16bp(实验组2)时，存在一些非特异性杂交，个别Vimentin阴性细胞被检测为Vimentin阳性，试剂盒的特异性下降，无法实现准确检测；当选用的特异性P1序列长度为22bp(实验组4)时，存在个别阳性细胞未能被检出的现象，且检测到的荧光信号点数有所减少，试剂盒的灵敏度下降，无法实现准确检测。同时，当选用的P2序列的长度为24～26bp(实验组1和实验组6)时，所有阳性细胞均能被检出，检测到的荧光信号稳定且荧光信号点数较多，可实现准确检测，试剂盒的特异性和稳定性都很好，检测效果较好；当选用的P2序列的长度为22bp(实验组5)时，存在一些非特异性杂交，个别Vimentin阴性细胞被检测为Vimentin阳性，试剂盒的特异性下降，无法实现准确检测；当选用的P2序列的长度为28bp(实验组7)时，存在个别阳性细胞未能被检出的现象，且检测到的荧光信号点数减少，试剂盒的灵敏度下降，无法实现准确检测。另外，当选用的P4序列的长度为24～26bp(实验组1和实验组9)时，所有阳性细胞均能被检出，检测到的荧光信号稳定且荧光信号点数较多，可实现准确检测，试剂盒的特异性和稳定性都很好，检测效果较好；当选用的P4序列的长度为22bp(实验组8)时，存在一些非特异性杂交，个别Vimentin阴性细胞被检测为Vimentin阳性，试剂盒的特异性下降，无法实现准确检测；当选用的P4序列的长度为28bp(实验组10)时，存在一些阳性细胞未能被检出的现象，且检测到的荧光信号点数减少，试剂盒的灵敏度下降，无法实现准确检测。因此，本发明针对Vimentin基因的检测设计的检测探针中，特异性P1序列的长度为18～20bp，P2序列的长度为24～26bp，P4序列的长度为24～26bp时可以使试剂盒取得很好的检测效果，保证检测结果的准确性。进一步地，本发明实施例1优选的检测探针中，特异性P1序列的长度为20bp；P2序列和P4序列的长度均为24bp。
针对ACTB基因mRNA的检测探针各序列长度的选择实验结果与上述结果一致，具体数据省略。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种Vimentin基因表达检测试剂盒
<130> 2020-06-20
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aacatcctgc ggtaggagga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agaggagcgc gtggcataca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgcagctcca ccttctcgtt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtcgttggtt agctggtcca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
acgcattgtc aacatcctgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aacatccaca tcgatttgga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
agtggactcc tgctttgcct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gtgtcttggt agttagcagc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ccagcagctt cctgtaggtg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
cgtcttaatc agaagtgtcc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tcagggtgag gatgcctctc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
acacgcagct cattgtagaa 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
aaggtctcaa acatgatctg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gtacagggat agcacagcct 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tcgtagatgg gcacagtgtg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ttcatgaggt agtcagtcag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
cgacgtagca cagcttctcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
aatggtgatg acctggccgt 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
agtgatctcc ttctgcatcc t 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
acacggagta cttgcgctca 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
cttgatgagc gtgatatatg atca 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
attgtagcat aatcgggatc cgag 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
tgatcatata tcacgctcat caag 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
ctcggatccc gattatgcta caat 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
aagtcggatc tgacggatag ttcc 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
taagttcgga tacgccatcc gtcg 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
ggaactatcc gtcagatccg actt 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
cgacggatgg cgtatccgaa ctta 24

Claims (10)

1.一种Vimentin基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对检测Vimentin基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针用于连接Vimentin基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针上修饰有4～6个阳离子精胺单元，且从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与Vimentin基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述特异性P1序列的长度为18～20bp；所述P2序列的长度为24～26bp，且P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和Vimentin基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列的长度为24～26bp，且P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和Vimentin基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团；
所述针对Vimentin基因mRNA的捕获探针的特异性P1序列的5’末端或3’末端修饰有4～6个阳离子精胺单元；
针对Vimentin基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.10中的5条或5条以上，P2序列为SEQ ID NO.21；
针对Vimentin基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.23，P4序列为SEQ IDNO.25；
针对Vimentin基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.27。
2.根据权利要求1所述的Vimentin基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，
所述捕获探针用于连接内参基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针上修饰有4～6个阳离子精胺单元，且从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与内参基因mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述特异性P1序列的长度为18～20bp；所述P2序列的长度为24～26bp，且P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和内参基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列的长度为24～26bp，且P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和内参基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，所述荧光基团与针对Vimentin基因mRNA的标记探针上修饰的荧光基团互不相同。
3.根据权利要求2所述的Vimentin基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述针对内参基因基因mRNA的捕获探针的特异性P1序列的5’末端或3’末端修饰有4～6个阳离子精胺单元。
4.根据权利要求2或3所述的Vimentin基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB基因；针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.11～SEQID NO.20中的5条或5条以上，P2序列为SEQ ID NO.22；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.24，P4序列为SEQ ID NO.26；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.28。
5.根据权利要求1～4任一项所述的Vimentin基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列的长度为5～10个碱基。
6.根据权利要求5所述的Vimentin基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列为5～10个T。
7.根据权利要求1～4任一项所述的Vimentin基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为树状荧光基团。
8.根据权利要求7所述的Vimentin基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述树状荧光基团的荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LCRED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750。
9.一种非疾病诊断目的的Vimentin基因表达检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)得到生物样本；
(2)从生物样本中富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(4)使用权利要求1～8任一项所述试剂盒检测Vimentin基因是否表达：a)捕获探针杂交，捕获探针的特异性P1序列与目标基因mRNA序列特异性结合；b)扩增杂交，捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合，目标mRNA序列信号放大；c)显色，扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，荧光标记目标信号；d)通过荧光检测仪检测。
10.根据权利要求9所述的非疾病诊断目的的Vimentin基因表达检测，其特征在于，步骤(4)所述捕获探针杂交时间为1.5～2h；步骤(4)所述扩增杂交时间为12～15min。
CN202010647621.4A 2020-07-07 2020-07-07 一种Vimentin基因表达检测试剂盒 Active CN111635945B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010647621.4A CN111635945B (zh) 2020-07-07 2020-07-07 一种Vimentin基因表达检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010647621.4A CN111635945B (zh) 2020-07-07 2020-07-07 一种Vimentin基因表达检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111635945A CN111635945A (zh) 2020-09-08
CN111635945B true CN111635945B (zh) 2023-09-19

Family

ID=72328719

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010647621.4A Active CN111635945B (zh) 2020-07-07 2020-07-07 一种Vimentin基因表达检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111635945B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116426610B (zh) * 2023-06-08 2024-01-05 启辰生生物科技(珠海)有限公司 一种LC-MS法准确定量mRNA加帽效率的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101248187A (zh) * 2005-01-26 2008-08-20 迈克尔·W·里德 纳米工程化表面上的dna纯化和分析
CN104031993A (zh) * 2014-05-27 2014-09-10 益善生物技术股份有限公司 循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法
CN106636318A (zh) * 2015-10-30 2017-05-10 益善生物技术股份有限公司 核酸信号放大检测试剂盒
CN106811533A (zh) * 2017-03-06 2017-06-09 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒
CN110904195A (zh) * 2019-12-24 2020-03-24 益善生物技术股份有限公司 一种cd55基因表达检测试剂盒
CN110923323A (zh) * 2019-12-26 2020-03-27 益善生物技术股份有限公司 一种Twist基因表达检测试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101248187A (zh) * 2005-01-26 2008-08-20 迈克尔·W·里德 纳米工程化表面上的dna纯化和分析
CN104031993A (zh) * 2014-05-27 2014-09-10 益善生物技术股份有限公司 循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法
CN106636318A (zh) * 2015-10-30 2017-05-10 益善生物技术股份有限公司 核酸信号放大检测试剂盒
CN106811533A (zh) * 2017-03-06 2017-06-09 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒
CN110904195A (zh) * 2019-12-24 2020-03-24 益善生物技术股份有限公司 一种cd55基因表达检测试剂盒
CN110923323A (zh) * 2019-12-26 2020-03-27 益善生物技术股份有限公司 一种Twist基因表达检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN111635945A (zh) 2020-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210032689A1 (en) Methods of detecting nucleic acids in individual cells and of identifying rare cells from large heterogeneous cell populations
CN108707662B (zh) 一种ar-v7表达检测试剂盒
US10351912B2 (en) Detection of high grade dysplasia in cervical cells
US9315854B2 (en) Ultra sensitive method for in situ detection of nucleic acids
CN111808964B (zh) 一种EpCAM基因表达检测试剂盒
CN110904195B (zh) 一种cd55基因表达检测试剂盒
US10604812B2 (en) Materials and methods for assessing progression of prostate cancer
CN111635945B (zh) 一种Vimentin基因表达检测试剂盒
CN110923323B (zh) 一种Twist基因表达检测试剂盒
JP6284487B2 (ja) 膀胱癌の診断及びその再発のモニタリングのための材料及び方法
CN111621570B (zh) 一种ck8基因表达检测试剂盒
CN113528660A (zh) 前列腺癌的风险评估装置
CN106636316B (zh) 卵巢癌相关microRNA检测试剂盒
WO2017096714A1 (zh) 循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒
CN111621572B (zh) 一种cd45基因表达检测试剂盒
CN115992227A (zh) 一种Hepatocyte检测试剂盒及其制备方法与应用
CA2501792C (en) Detection of high grade dysplasia in cervical cells
CN112538530B (zh) 一种膀胱癌检测试剂盒
CN113234797A (zh) 一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒
CN117106905A (zh) 一种用于检测dtnbp1基因的fish探针及其应用
CN106868102A (zh) 胃癌循环肿瘤细胞鉴定试剂盒
CN118222704A (zh) 用于检测cldn18.2非编码区rna的分子探针及其应用
CN116590421A (zh) 融合基因相关F-circP3F原位表达检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: No. 29, Helix 3 Road, Guangzhou International Biological Island, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province, 510663

Applicant after: SUREXAM BIO-TECH Co.,Ltd.

Address before: 5 / F, area C, Guangzhou innovation base, No. 80, guanyue Road, Science City, Guangzhou, Guangdong Province

Applicant before: SUREXAM BIO-TECH Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant