CN117106905A - 一种用于检测dtnbp1基因的fish探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测DTNBP1基因的FISH探针及其应用，DTNBP1基因探针的3’端的18bp碱基，用于与预扩增探针结合，通过逐步结合相同的预扩增探针、扩增探针，最终与相同的显色探针结合，可以显示同样颜色的荧光信号。最终与携带紫色荧光染料的显色探针结合，检测结果显示紫色荧光信号。而不同类型的基因，该区域的碱基序列是不同的。DTNBP1杂交探针的5’端的20bp碱基，是与DTNBP1基因mRNA结合特异性序列，从序列上具备特异性。本发明具有安全、快速、检测信号强等特点，探针分子量小，更容易进入细胞，可检测胰腺癌患者组织和细胞中低水平表达的DTNBP1，特异性高、敏感性强，有助于胰腺癌的早期筛查和诊断。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种用于检测DTNBP1基因的FISH探针及其应用。
背景技术
胰腺癌(Pancreat ic carcinoma)为消化系统较常见的恶性肿瘤，其特点为病程短、进展快、病死率高，中位生存期仅为6个月。因胰腺位于腹膜后，位置深，早期又无明显症状，均易被忽略而延误诊断，得不到及时有效的治疗。胰腺癌的主要临床表现为进行性黄疸、食欲减退、消瘦体重减轻、上腹痛或向背部放射、晚期则可扪及腹部包块、腹水、恶病质及远处转移等。随着分子生物学技术的发展，胰腺癌的诊断从传统的表型诊断上升至基因诊断，与多种抑癌基因、原癌基因、DNA错配修复基因等密切相关。
Dysbindin蛋白由位于人类基因组6号染色体(6p22.3)的DTNBP1基因所编码，其全称为dystrobrevin-binding protein(dysbindin或DTNBP1)，它最初是由Benson教授在研究杜氏肌肉营养不良症时通过酵母双杂交实验发现的细胞骨架蛋白dystrobrevin的结合蛋白。DTNBP1基因的序列高度保守，在脊椎动物内序列相对保守，提示其在进化中的相对稳定。新近的研究发现dysbindin在口腔鳞癌组织呈高表达状态，NCBI的生物信息学预测(AceView)也提示dysbindin在多种肿瘤组织内为高表达水平，暗示其在恶性肿瘤组织的发生发展过程中可能扮演重要的角色。越来越多的证据表明，DTNBP1在癌症预后中发挥了功能性的作用，DTNBP1在脑肿瘤、肝癌癌症中发挥作用。我们的前期研究发现DTNBP1在胰腺癌组织和血清中表达显著高于癌旁组织和正常血清，其对于胰腺癌的阳性诊断率高于目前常用的CA-199；相关分子机制研究表明DTNBP1可通过调节多个分子信号通路促进细胞周期和肿瘤转移。因此，DTNBP1有望成为一个潜在的分子标志物用于胰腺癌的监测和检测。
目前检测DTNBP1基因的方法包括:免疫组织化学(IHC)法、荧光原位杂交(FISH)法、酶联免疫吸附试验(ELISA)。临床检测中最实用的方法是IHC和FISH。IHC成本低、操作简单，但易受到组织处理方法、固定时间等影响，且检测敏感性和特异性存在较大的变异。FISH基于基因水平的表达检测具有高度的敏感性和特异性，其结果判定更具客观性，重复性和可靠性强。因此，基于DTNBP1基因水平的检测试剂盒研发可提高胰腺癌等临床检测效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测DTNBP1基因的FISH探针及其应用，解决背景所提出的至少一个技术问题。
第一方面，本发明提供一种用于检测DTNBP1基因的FISH探针，所述探针的核酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示。
第二方面，提供一种检测DTNBP1的试剂在制备胰腺癌诊断和/或预后的试剂和/或试剂盒中的应用。
第三方面，所述的用于检测DTNBP1基因的FISH探针在制备胰腺癌诊断和/预后的试剂和/试剂盒中的应用。
第四方面，提供一种胰腺癌诊断和/或预后的试剂盒，包括针对DTNBP1基因的预扩增探针：捕获探针连接标志基因mRNA与预扩增探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：可以与DTNBP1基因杂交探针的3’端结合的18bp碱基，可以与扩增探针结合的4个重复碱基序列；
所述预扩增探针的核酸序列如SEQ ID NO：9所示。
优选的，包括针对DTNBP1基因的扩增探针：每条扩增探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与预扩增探针重复序列互补配对的序列、显色探针结合的4个重复碱基序列；
所述扩增探针的核酸序列如SEQ ID NO：10所示。
优选的，包括针对DTNBP1基因的显色探针：所述显色探针5’端修饰有荧光基团，并具有与扩增探针重复序列互补配对的结合序列；
所述显色探针的核酸序列如SEQ ID NO：11所示。
技术效果：相对于现有技术，本发明具有安全、快速、检测信号强等特点，本发明探针分子量小，更容易进入细胞，可检测胰腺癌患者组织和细胞中低水平表达的DTNBP1，特异性高、敏感性强，有助于胰腺癌的早期筛查和诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明FISH探针信号放大设计原理示意图；
图2为本发明FISH探针检测胰腺癌CTC细胞中DTNBP1表达强度；
图3为本发明FISH探针检测胰腺癌CTC细胞中DTNBP1表达强度的彩色示意图；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
如图1所示，本发明实施例提供一种用于检测DTNBP1基因的FISH探针及其应用，针对DTNBP1基因的检测试剂盒，包含有标记荧光染料和针对DTNBP1基因mRNA的FISH探针。
查找目的基因核酸片段序列：在NCBI上查找DTNBP1基因的mRNA序列，基因ID及核酸长度，具体为基因ID为NM_032122.5；核酸片段长度的长度为1383bp；探针设计区域为228bp-1261bp。
使用在线Primer5软件设计DTNBP1探针，通过序列比对，选出8条特异性的探针序列。DTNBP1 FISH探针的核酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示。每条探针长度为20bp，通过序列比对和分析，确定探针序列的特异性及二级结构。DTNBP1基因的8条探针的3’端的18bp碱基相同，用于与预扩增探针结合，通过逐步结合相同的预扩增探针、扩增探针，最终与相同的显色探针结合，可以显示同样颜色的荧光信号。即DTNBP1基因杂交探针的3’端的18bp碱基是相同的，最终与携带紫色荧光染料的显色探针结合，检测结果显示紫色荧光信号。而不同类型的基因，该区域的碱基序列是不同的。为了保证探针的特异性，上述序列均与人源基因进行对比，具有高度的特异性。DTNBP1杂交探针的5’端的20bp碱基，是与DTNBP1基因mRNA结合特异性序列，上述序列经过NCBI的Geneblast比对，从序列上具备特异性。
DTNBP1基因检测试剂盒，所提供的针对DTNBP1基因的预扩增探针：捕获探针连接标志基因mRNA与预扩增探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：可以与DTNBP1基因杂交探针的3’端结合的18bp碱基(绿色标注)，可以与扩增探针结合的4个重复碱基序列(灰色标注为其中一个重复)；所述重复区域为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与基因结合区域、显色探针和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；核酸序列如SEQ ID NO：9所示。
DTNBP1基因检测试剂盒，所提供的针对DTNBP1基因的扩增探针：每条扩增探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与预扩增探针重复序列互补配对的序列、显色探针结合的4个重复碱基序列(蓝色标注为其中一个重复)；所述碱基序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与基因结合区域、预扩增重复区域和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；核酸序列如SEQ ID NO：10所示。
DTNBP1基因检测试剂盒，所提供的针对DTNBP1基因的显色探针：所述标记探针5’端修饰有荧光基团，并具有与扩增探针重复序列互补配对的结合序列(蓝绿色标注)。核酸序列如SEQ ID NO：11所示。
DTNBP1用荧光染料Alexa Fluor 647进行标记，标记为紫色。
DTNBP1的检测试剂盒用于胰腺癌诊断和/或预后的试剂和/试剂盒中的应用。
使用上述DTNBP1检测试剂盒胰腺癌CTC中DTNBP1的表达
一、人外周血CTC的分离富集。
a.样本采集：使用8号采血针和EDTA抗凝管采集5mL外周血，室温放置30min。
b.将CTC过滤至滤膜上：样本保存管中使用RI保存液保存血液样本，600×g水平离心5min，弃上清，加入4mL PBS和1mL RI固定剂，混匀，室温静置8min。将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；将滤膜转移至24孔板中，加入400μL4％甲醛溶液，室温固定1h。去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤三次，每次浸泡2min。
二、透化处理。
a.在新的24孔板中每孔加入50μL RI透化剂，将滤膜从PBS中取出，去除多余的液体，将滤膜倒扣在RI透化剂上，室温孵育5min。
b.去除液体，每孔加入1mLPBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
三、消化细胞，暴露mRNA，使其与探针杂交。
a.配制相应浓度的RI消化酶工作液：分装至24孔板中，每孔50μL。
| 试剂组成 | 每个样本用量 |
| RI消化酶 | 1.25μL |
| PBS | 48.75μL |
| 总体积 | 50μL |
b.将滤膜取出，倒扣至24孔板中RI消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡。室温静置1h。
c.去除液体，每孔加入1mlPBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。
四、探针杂交，探针特异性序列与目标mRNA序列结合。
a.RI探针缓冲液、RI扩增缓冲液和RI显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。
b.配制RI探针工作液：涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μL。
| 试剂组成 | 每个样本用量 |
| RI探针混合液 | 8μL |
| RI探针混合液(40℃预热) | 42μL |
| 总体积 | 50.0μL |
c.将滤膜取出，倒扣至24孔板中RI探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡。40℃孵育3小时。
e.去除液体，每孔加入1ml RI洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在RI洗涤液中至下一步实验操作，样本在RI洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
五、扩增杂交，目标mRNA序列信号放大。
a.配制RI扩增工作液：涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μL。
| 试剂组成 | 每个样本用量 |
| RI扩增混合液 | 2μL |
| RI扩增混合液(40℃预热) | 48μL |
| 总体积 | 50.0μL |
b.将滤膜取出，倒扣至24孔板中RI扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡。40℃孵育3min。
d.去除液体，每孔加入1ml RI洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在RI洗涤液中至下一步实验操作，样本在RI洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
六、显色，荧光标记目标信号。
a.配制RI显色工作液：涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μL。
| 试剂组成 | 每个样本用量 |
| RI显色混合液 | 2μL |
| RI显色缓冲液(40℃预热) | 48μL |
| 总体积 | 50.0μL |
b.将滤膜取出，倒扣至24孔板中RI显色工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡。40±1℃孵育30min。
d.去除液体，每孔加入1ml RI洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在RI洗涤液中至下一步实验操作，样本在RI洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
七、荧光显微镜观察CTC。
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基因，以发射蓝色荧光信号。
将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μLRI抗猝灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。
八、阳性CTC鉴定标准及表达分析
如图1-3所示，在滤膜上，富集有少量的循环肿瘤细胞以及残留的数千个白细胞，循环肿瘤细胞阳性的判定标准为：0个信号点是无表达1-2个是低表达3-9个是中表达大于10个是高表达；将无表达和低表达定义为低表达，将中表达和高表达定义为高表达。当高表达CTCs占总CTCs的50％以上，则定义为为阳性，否则定义为阴性。
a.上皮型CTC：细胞内CD45(-)、EpCAM(+)和CK8/18/19(+)时，显微镜下可见红色荧光信号；间质型CTC：细胞内CD45(-)、Vimentin(+)和twist(+)，显微镜下可见绿色荧光信号；混合型CTC：细胞内同时显示红色荧光及绿色荧光信号。
b.DTNBP1基因mRNA表达检测方法同分型检测一致，用荧光染料Alexa Fluor 647进行标记，标记为紫色。
以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (6)
1.一种用于检测DTNBP1基因的FISH探针，其特征在于，所述探针的核酸序列分别如SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8所示。
2.检测DTNBP1的试剂在制备胰腺癌诊断和/预后的试剂和/试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述的用于检测DTNBP1基因的FISH探针在制备胰腺癌诊断和/或预后的试剂和/或试剂盒中的应用。
4.一种胰腺癌诊断和/或预后的试剂盒，其特征在于，包括针对DTNBP1基因的预扩增探针：捕获探针连接标志基因mRNA与预扩增探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：可以与DTNBP1基因杂交探针的3’端结合的18bp碱基，可以与扩增探针结合的4个重复碱基序列；
所述预扩增探针的核酸序列如SEQ ID NO：9所示。
5.权利要求4所述的胰腺癌诊断和/或预后的试剂盒，其特征在于，包括针对DTNBP1基因的扩增探针：每条扩增探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与预扩增探针重复序列互补配对的序列、显色探针结合的4个重复碱基序列；
所述扩增探针的核酸序列如SEQ ID NO：10所示。
6.权利要求4所述的胰腺癌诊断和/或预后的试剂盒，其特征在于，包括针对DTNBP1基因的显色探针：所述显色探针5’端修饰有荧光基团，并具有与扩增探针重复序列互补配对的结合序列；
所述显色探针的核酸序列如SEQ ID NO：11所示。
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| CN202310547375.9A CN117106905A (zh) | 2023-05-16 | 2023-05-16 | 一种用于检测dtnbp1基因的fish探针及其应用 |
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