CN108642132B - 探针稳定剂和bcr-abl基因融合检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及探针稳定剂，其包括有以下组份：柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris‑HCl EDTA，RNA Carrier、Triton X‑100、以及甜菜碱。通过对上述各组分进行充分配比分析可以得到一个较好的探针稳定剂配方来保护探针，大大降低探针在检测使用前降解的概率，延长其保存期，提高试剂盒的耐存储性和运输稳定性，提高检测结果准确性，避免假阴性结果。本发明还涉及一种BCR‑ABL基因融合检测试剂盒，由于具有所述探针稳定剂，其探针的稳定性大大得到提高，从而可以长期稳定保存，使得检测结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及探针稳定剂和一种BCR-ABL基因融合检测的试剂盒。
背景技术
BCR-ABL融合基因由9号染色体和22号染色体相互易位而成，同时形成一个较短的费城(Ph)染色体。在此易位中，9号染色体上原癌基因ABL(Abelson proto-oncogene)基因断裂可发生在外显子a2之前的任意一点；22号染色体的BCR(Breakpoint Cluster Region)基因的断裂点不恒定，主要有3个不同的断裂点：主要断裂簇区(M-BCR)，次要断裂簇区(minor BCR，m-BCR)，微小断裂簇区(μ-BCR)(Kurzrock R，et al.The BCR Gene andPhiladelphia chromosome-positive leukemogensis.Cancer Res.2001.61(6):2343-2355.)。研究表明，在BCR-ABL发生易位的情况下，BCR-ABL融合蛋白具有持续增强的酪氨酸激酶活性，可通过RAS/MAPK、PIK3CA/AKT等多种信号传导途径活化癌基因和某些细胞因子，使得细胞增殖加快，生长因子依赖性减低，抑制细胞凋亡，最终导致骨髓造血干细胞的恶性增殖(Kurzrok R,et al.Philadelphia chromosome-positive leukemias:from basismechanisms to molecular therapeutics.Ann Intern Med.2003.138(10):819-830.)。
目前BCR-ABL融合基因是公认的慢性髓细胞性白血病重要的诊断因子。《NCCN慢性髓细胞性白血病临床实践指南》已将BCR-ABL阳性作为CML诊断的重要指标之一，并指导临床治疗方案的制定。同时BCR-ABL阳性也是判断ALL预后的负相关指标，对于疾病的诊断鉴别、指导治疗及预后判断均具有重要的临床意义(Yuan-Xin Ye,et al.ClinicalSignificance of BCR-ABL Fusion Gene Subtypes in Chronic Myelogenous and AcuteLymphoblastic Leukemias,APJCP,2014.15.9961.)。甲磺酸伊马替尼(又称格列卫)是BCR-ABL融合基因靶向药物，是一种选择性非受体型酪氨酸激酶抑制剂，该药可以与ATP竞争性结合BCR-ABL酪氨酸激酶催化域上的ATP结合位点，从而阻止ATP向ADP转化，使得底物酪氨酸残基不能进行磷酸化，最终抑制一系列异常细胞增殖信号的转导(Von Bubnoff N,Peschel C,Duyster J.Resistence of Philadelphia-chromosome Positive leukemiatowards the kinase inhibitor imatinib(STl571,Glivee):a targeted oncoprotelnstrikes back.Leukemia,2003,17(5):829-838.)。NCCN临床指南提示BCR-ABL阳性患者可以从格列卫治疗中获益，建议对初诊病人进行BCR-ABL融合基因检测，以便判断格列卫药物疗效。
荧光原位杂交法(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)是目前检测BCR-ABL基因融合最常用的方法。由于BCR-ABL阳性细胞没有典型的表面标志物，因此只能用分裂中期(MP)细胞核型分析、RT-PCR或荧光原位杂交(FISH)的方法进行检测。其中FISH技术是利用携带荧光标记的核酸探针与被检样本中的靶DNA同源互补而进行杂交，在荧光显微镜下直接分析杂交靶序列的彩色探针信号，以获得细胞内基因状态信息。FISH的优点在于可以对分裂间期(IP)细胞进行检测，比常规核型分析更准确，稳定性和重复性较高，并且具有检测隐形易位、复杂核型的能力，能够直观展现出多种信号类型，具有其他检测方法不可及的临床价值。
本发明的申请人之前BCR/ABL基因融检测试剂盒(申请号2016100880937)，但经过一段时间的推广应用，发现在长途运输过程中，由于运输温度不稳定或长期颠簸等原因，该检测试剂盒的稳定性在一定范围内有波动，经研究发现，与探针的稳定性有关。
为了保证试剂盒的稳定性，特别是在长途运输过程中由于环境温度的不稳定和路途颠簸等影响下还能保证良好的稳定性。目前优选开发出一种添加探针稳定剂的预混荧光探针工作液，可以在没有降解或副反应的情况下保存以简化所需操作，极大降低对使用者和使用环境的要求，提供便利，但与此同时，对试剂盒的稳定性提出了更高要求，增加了保证其溶液稳定性的难度，鉴于此，提出发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供探针稳定剂，该稳定剂可以对探针进行保护，使其可以长时间存放，且可以较好地保证检测结果的准确性。
本发明上述目的是这样实现的：
一种探针稳定剂，其包括有以下组份：柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris-HCl、EDTA、RNA Carrier、Triton X-100以及甜菜碱。
在本发明的一些实施方案中，所述探针稳定剂包括：2-10g/L柠檬酸钠、5-15g/LNaCl、80-150g/L硫酸葡聚糖、30％-80％去离子甲酰胺、1-8mmol/L Tris-HCl、0.05-1mmol/L EDTA、0.01±0.005％(v/v)RNA Carrier、0.01-0.1％(v/v)Triton X-100、以及10-20mmol甜菜碱。
在本发明的一些实施方案中，所述探针稳定剂还包括Proclin 300，各组份的含量为：7-8.5g/L柠檬酸钠、11-16g/L NaCl、80-120g/L硫酸葡聚糖、40％-75％去离子甲酰胺、3-6.5mmol/L Tris-HCl、0.05-1mmol/L EDTA、0.01±0.005％(v/v)RNA Carrier、0.01-0.1％(v/v)Triton X-100、10-20mmol甜菜碱以及0.001-0.01％(v/v)Proclin 300。
在本发明的一些实施方案中，所述探针稳定剂包括：7-8g/L柠檬酸钠，13-16g/LNaCl，110-120g/L硫酸葡聚糖、50-75％去离子甲酰胺、4-6.5mmol/L Tris-HCl、0.5-0.75mmol/L EDTA、0.01±0.001％(v/v)RNA Carrier、0.01±0.001％(v/v)Triton X-100、10±1mmol甜菜碱以及0.005±0.001％(v/v)Proclin 300。
在本发明的一些实施方案中，所述探针稳定剂包括：7.5g/L柠檬酸钠、15.5g/LNaCl、115g/L硫酸葡聚糖、68％去离子甲酰胺、5.5mmol/L Tris-HCl 0.65mmol/L EDTA、0.01％(v/v)RNA Carrier、0.01％(v/v)Triton X-100、10mmol甜菜碱以及0.005％(v/v)Proclin 300。
在本发明的一些实施方案中，所述探针稳定剂包括：8g/L柠檬酸钠、12g/L NaCl、90g/L硫酸葡聚糖、45％去离子甲酰胺、3mmol/L Tris-HCl、0.8mmol/L EDTA、0.05％(v/v)RNA Carrier、0.1％(v/v)Triton X-100、20mmol甜菜碱以及0.05％(v/v)Proclin 300。
本发明的另一目的是提供一种BCR-ABL基因融合检测试剂盒，包括有BCR基因探针、ABL基因探针，所述BCR基因探针、ABL基因探针保存在所述探针稳定剂中。
在本发明的一些实施方案中，BCR基因探针在所述探针稳定剂中的浓度为10-100μmol/L；ABL基因探针在所述探针稳定剂中的浓度为10-100μmol/L。
在本发明的一些实施方案中，所述BCR基因探针和ABL探针分别与不同颜色的染料偶联；所述染料包括有绿色荧光染料和红色荧光染料；在本发明的一些实施方案中，绿色荧光染料选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633以及Alexa Fluor 647；
红色荧光染料选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、AlexaFluor 610、Alexa Fluor 633以及Alexa Fluor 647。
本发明所述用于稳定探针、防止探针降解的探针稳定剂，其主要包括如下组分：柠檬酸钠、NaCl、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、Tris-HCl、EDTA、RNA Carrier、Triton X-100以及甜菜碱。发明人研究发现，通过对上述各组分进行充分配比分析可以得到一个较好的探针稳定剂配方来保护探针，防止探针在存放过程中降解，延长其保存期，提高试剂盒的耐存储性，且能确保检测结果的可靠性，避免假阴性结果。
本发明所述“BCR-ABL基因融合检测试剂盒(荧光原位杂交法)”，由于具有探针稳定剂，其探针的稳定性大大得到提高，从而可以长期稳定保存，使得检测结果准确可靠。并具有高灵敏度和特异性。对本试剂盒的性能研究试验表明，本试剂盒检测参考品的分析灵敏度为100％，分析特异度为100％，阴/阳性符合率为100％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的红色信号数量和绿色信号数量的计数方式的参考图；
图2为本发明实验例提供的BCR-ABL信号模式示意图；
图3为本发明实验例3中采用实施例1提供的HER2基因扩增检测试剂盒于-20℃存放不同时间后检测2号样本的荧光检测结果图；
图4为本发明实验例3中对照组1于-20℃存放不同时间后检测2号样本的荧光检测结果图；
图5为本发明实验例3中对照组2于-20℃存放不同时间后检测2号样本的荧光检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的BCR-ABL基因融合检测试剂盒包括：探针溶液、含有DAPI和抗淬灭剂的复染液(
Gold antifade reagent S36939)，胃蛋白缓冲液、乙醇溶液、洗涤缓冲液I以及洗涤缓冲液II。
一、荧光染料标记的探针
所述探针包括有针对ABL基因的第一组探针和针对BCR全基因序列的第二组探针。所述探针以人基因组DNA为模板，利用60对特异性引物对进行PCR扩增反应而得到，其制备方法如下：
1、扩增引物的设计
为了检测9号染色体和22号染色体上ABL和BCR基因的变异情况，分别设计了2组扩增引物：针对ABL基因的第一组扩增引物和针对BCR全基因序列的第二组扩增引物。所述扩增引物组的扩增区域分别为目标检测区域中非重复且高度保守的片段，片段长度大于1000bp。扩增引物相应的扩增产物分别构成了第一组和第二组探针库。扩增引物序列信息及其相应的扩增产物见表1(注：1F/1R为一对引物，分别表示正向引物和反向引物；其他以此类推)。
表1扩增引物
引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的每条序列分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液，并做好标记。
2、探针库构建
利用上述设计的引物对，以人类基因组DNA为模板进行PCR扩增，相应的扩增产物构成了探针库。
(1)人基因组DNA提取：根据本领域现有技术，可参考《分子克隆实验指导-第三版》(科学出版社)或按照市售外周血细胞DNA提取试剂盒产品说明书进行操作。
(2)配置PCR引物工作液：针对探针库，将相应的扩增引物(1F/1R-30F/30R)分为3个扩增引物组，对ABL基因的3个非重复且高度保守区域进展扩增：分别取相应的扩增引物(1F/1R-5F/5R、6F/6R-10F/10R、和11F/11R-15F/15R)储存液50ul置于3支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的3支扩增引物工作液，相应做好标记；针对第二组探针库，将相应的扩增引物(16F/16R-30F/30R)分为3个扩增引物组，对BCR全基因的3个非重复且高度保守区域进行扩增：分别取相应的扩增引物(16F/16R-20F/20R、21F/21R-25F/25R、26F/26R-30F/30R)储存液50ul置于3支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的3支扩增引物工作液，相应做好标记。
(3)配置PCR扩增体系：分别进行上述9个体系的扩增，扩增体系试剂组成如下：
(4)PCR扩增：配置好体系后轻轻混合均匀，瞬时离心5-10s，按如下程序进行扩增：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，从第二步开始30个循环，72℃5min，4℃保持。
(5)产物鉴定和纯化：将针对ABL基因3个非重复且高度保守区域的扩增产物混合均匀，得到第一组探针库；将针对BCR全基因的3个非重复且高度保守区域的扩增产物混合均匀，得到第二组探针库；通过2％琼脂糖凝胶电泳对两组探针库进行鉴定，切割目的条带并对其进行回收，即得到第一组和第二组探针库，相应做好标记。
3、染料标记探针
本实施例优选Cy3(红色荧光)标记第一组探针，优选Alexa Fluor 488(绿色荧光)标记第二组探针。人工合成Cy3标记和Alexa Fluor 488标记的polyA序列，所述polyA序列包含1-30个碱基，优选的是包含10-20个碱基，更优选的是包含2-8个碱基，本实施例中，polyA序列包含含2-8个碱基，polyA序列末端修饰有链霉亲和素。将Cy3标记和Alexa Fluor488标记的polyA序列分别与修饰有生物素的第一组和第二组探针库混合(每100ug探针库加入20uL荧光标记的polyA序列)，于37℃缓慢摇动孵育30min，得到相应荧光标记的探针。探针经纯化和沉淀，溶解在稳定剂(本实施例采用下述稳定剂)中，即获得红色标记的第一组探针和绿色标记的第二组探针，将探针于-20℃避光保存。
二、试剂盒其他组分
探针稳定剂、含有DAPI和抗淬灭剂的复染液(
Gold antifade reagentS36939)，胃蛋白缓冲液、乙醇溶液、洗涤缓冲液I以及洗涤缓冲液II。
其中，探针溶液中含有：BCR基因探针、ABL基因探针以及探针稳定剂。
其中本实施例所述探针稳定剂包括：7.5g/L柠檬酸钠、15.5g/L NaCl、115g/L硫酸葡聚糖、68％去离子甲酰胺、5.5mmol/L Tris-HCl以及0.65mmol/L EDTA、0.01％(v/v)RNACarrier、0.01％(v/v)Triton X-100、10mmol甜菜碱、0.005％(v/v)Proclin 300。
其中，RNA Carrier可特异性吸附低浓度RNA，减少非特异结合的核酸，使得杂交环境免干扰，优化杂交条件；Triton X-100即聚乙二醇辛基苯基醚为非离子型表面活性剂，可增加细胞膜通透性；甜菜碱作为酶保护剂，可有效维持细胞渗透压；Proclin 300的主要成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)，为医用诊断试剂防腐剂。
每组ABL探针溶液的浓度为10μmol/L与红色荧光染料偶联，识别人类9号染色体长臂区域9q34；
每组BCR探针溶液的浓度为10μmol/L与绿色荧光染料偶联，识别人类22号染色体长臂区域22q11。
乙醇溶液通过如下方法配制得到：
1000ml乙醇溶液(70％和85％)的配制方法
柠檬酸钠缓冲贮存液(20×SSC，pH5.3)通过如下方法配制得到：
500ml柠檬酸钠缓冲贮存液的配制方法
洗涤缓冲液I通过如下方法配制得到：
1000ml洗涤缓冲液Ⅰ的配制方法
洗涤缓冲液II通过如下方法配制得到：
1000ml洗涤缓冲液Ⅱ的配制方法
采用本实施例提供的BCR-ABL融合基因检测试剂盒的检测步骤如下：
1样本预处理
1.1样本要求
样本为临床疑似慢性髓细胞性白血病患者血液滴片。
1.2推荐的血液滴片制作工艺：
低渗：1ml新鲜血液抽取下后24小时内离心去上清，加入37℃温浴的75mM KCl低渗液8ml，迅速吹打混匀，37℃水浴20-30min。
固定：固定液(3:1甲醇：冰乙酸)室温固定30min，固定2次。固定时间，固定次数可根据不同实验需求决定。
滴片：加适量固定液重悬细胞，滴片。
1.3样本漂洗：室温下将滴片浸泡在2×SSC中，漂洗2min。
1.4样本脱水：室温下将切片依次浸没在70％、85％、100％乙醇中脱水各2min无水乙醇处理后自然风干滴片。
2 FISH检测
FISH检测包括杂交、杂交后洗涤与DAPI复染三个步骤。因为探针上的荧光基团见强光容易发生淬灭，所以以上三个步骤均需在暗处操作(避光操作)。
2.1准备工作：探针平衡至室温，涡旋混匀后置于微量离心机中离心2-3s；开启并预热杂交仪，将湿条浸入蒸馏水中备用(至少浸泡2h)，杂交时放入杂交仪；使用玻璃刀在切片反面圈出样本杂交区域。
2.2杂交(避光操作)：在滴片样本杂交区域加入10μLBCR-ABL双色探针溶液(每一标准人份探针量，对应检测的样本面积约为20mm×20mm，样本区域较大的样本可根据实际情况增加用量)，盖上盖玻片，确保盖玻片下无气泡、探针的均匀分布。使用封片胶覆盖盖玻片四周位置，形成闭合的密封圈。将滴片放入预热并已安装好湿条的杂交仪中，设置杂交反应程序：75℃(+/-1℃)变性2min，37℃杂交过夜(14h～18h)。
2.3杂交后洗涤(避光操作)：开启水浴锅(72±1℃)，将洗涤缓冲液I置于水浴锅预热。将杂交后的切片从杂交仪中取出，去除封片胶，置于72±1℃的洗涤缓冲液Ⅰ中2min，再置于室温的洗涤缓冲液Ⅱ中30s；最后置于纯水中3-5S漂洗一次，洗涤后将切片直立风干。
2.4DAPI复染(避光操作)：在样本杂交区域加入10μL复染液，盖上盖玻片，室温避光5-10min后即可显微镜下观察荧光信号。DAPI复染后的切片也可置于-25℃至-18℃避光保存(保存时间不超过72h)，需要检测时将切片放至室温后进行观察。
3结果判定
参见图1和图2。样本检测完成后置于荧光显微镜下观察荧光信号，正常情况下，ABL基因为红色信号(Red,R)，BCR基因为绿色信号(Green,G)，红色信号和绿色信号重叠或者接触为黄色融合信号(F)，代表BCR-ABL或者ABL-BCR融合基因。若一个细胞核中出现随机分散的两个红色与两个绿色信号(2R2G)，且无融合信号则该细胞可判断为BCR-ABL融合阴性细胞；若一个细胞核中除单独的红色信号和绿色信号外，出黄色融合信号(F)，则该细胞可判断为BCR-ABL融合阳性细胞。若细胞中出现一个红色与一个绿色信号以及2个融合信号(1R1G2F)，此为典型的Ph染色体易位；其他为不典型易位，在不典型易位中可能出现多种阳性信号类型，如图1所示。
a、每例样本计数200个细胞，若阳性细胞数小于3个(3/100或＜3％)，该样本判定为阴性。
b、每例样本计数200个细胞，若阳性细胞数大于5个(5/100或＞5％)，该样本判定为阳性。
c、每例样本计数200个细胞，若阳性细胞数介于3—5个(3—5％)，需另一阅片人另外计数300个细胞。汇总两位阅片人计数细胞数与阳性细胞数，即总计500个细胞，以判断结果。
实验例2
以新鲜配制的实施例1提供的试剂盒对20份样品进行检测，以TE缓冲液(含25mMTris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)稀释探针制得的探针溶液(探针浓度10μmol/L)作为对照组1，以灭菌双蒸水稀释探针制得的探针溶液(探针浓度10μmol/L)作为对照组2；以广州安必平医药科技股份有限公司生产的BCR/ABL(DF)融合基因检测试剂盒(荧光原位杂交法)作为参比阳性对照，计算本发明实施例1所提供试剂盒、对照组1和对照组2的检测结果吻合率。检测结果见表1。
表1.实施例1提供的试剂盒对20份样品进行检测的结果
(“N”表示阴性结果，“P”表示阳性结果)
| 样本号 | 实施例1 | 对照组1 | 对照组2 | 阳性对照 |
| 1 | N | N | N | N |
| 2 | P | P | P | P |
| 3 | N | N | N | N |
| 4 | N | N | N | N |
| 5 | N | N | N | N |
| 6 | P | P | P | P |
| 7 | N | N | N | N |
| 8 | N | N | N | N |
| 9 | P | P | P | P |
| 10 | N | N | N | N |
| 11 | N | N | N | N |
| 12 | P | P | N | P |
| 13 | P | P | P | P |
| 14 | P | P | P | P |
| 15 | N | N | N | N |
| 16 | N | N | N | N |
| 17 | P | P | N | P |
| 18 | N | N | N | N |
| 19 | N | N | N | N |
| 20 | P | P | P | P |
| 吻合率 | 100％ | 100％ | 90％ | - |
由表1可看出，实施例1提供的试剂盒和对照组1的检测结果与阳性对照的吻合率达100％，对照组2在检测12号样品的结果与其他组不一致，其吻合率为90％，表明用灭菌双蒸水作为稀释液稀释探针可产生假阴性结果。
实验例3
采用于-20℃存放1个月、6个月、12个月、24个月以及36个月的实施例1提供的试剂盒对表1中的2号样品进行检测，以TE缓冲液稀释探针制得的探针溶液作为对照组1，以水稀释探针制得的探针溶液作为对照组2，验证实施例1提供的试剂盒的准确性，结果见图2-图4和表2。
表2.实施例1提供的试剂盒在存放不同时间后对2号样品的检测结果
| 存放时间 | 1个月 | 6个月 | 12个月 | 24个月 | 36个月 | 准确性(阳性数/5) |
| 实施例1 | P | P | P | P | P | 100％ |
| 对照组1 | P | P | N | N | N | 40％ |
| 对照组2 | P | N | N | N | N | 20％ |
由根据图2-图4的结果并结合表2的数据可知，实施例1提供的BCR-ABL融合基因检测试剂盒的在-20℃存放36个月后，其检测结果的准确性可达100％，其准确性明显高于对照组1和对照组2，由此表明，实施例1提供的BCR-ABL融合基因检测试剂盒的稳定剂可以较好地保护碱基序列如SEQ ID NO.1-20所示的混合探针，防止探针降解，避免出现假阴性结果。
实施例4
实验组2-5提供的HER2基因扩增检测试剂盒的成分与实施例1基本相同，不同的是稳定剂中的组分含量和探针浓度不同，具体见表3。实验组1的成份与实施例1相同。
表3实验组2-5提供的BCR-ABL融合基因检测试剂盒中的稳定剂成分含量
| 稳定剂成分 | 实验组2 | 实验组3 | 实验组4 |
| 柠檬酸钠(g/L) | 8 | 6 | 10 |
| NaCl(mol/L) | 12 | 15 | 5 |
| 硫酸葡聚糖(g/L) | 90 | 80 | 150 |
| 去离子甲酰胺(％) | 45 | 80 | 30 |
| Tris-HCl(mmol/L) | 3 | 8 | 1 |
| EDTA(mmol/L) | 0.8 | 1 | 0.05 |
| RNA Carrier(％) | 0.05 | 0.005 | 0.1 |
| Triton X-100(％) | 0.1 | 0.01 | 0.001 |
| 甜菜碱(mmol/L) | 20 | 40 | 5 |
| Proclin 300(％) | 0.05 | 0.001 | 0.1 |
对比例1和2提供的BCR-ABL融合基因检测试剂盒的成分与实施例1基本相同，不同的是稳定剂的成分含量，具体见表4。
采用于-20℃存放1个月、6个月、12个月、24个月以及36个月的实验组2-4提供的试剂盒对表1中的2号样品进行检测，与对比例1和2提供的试剂盒相比较，验证实施例2-4提供的试剂盒的准确性，其结果见表5。
表4对比例1-2提供的BCR-ABL融合基因检测试剂盒中的稳定剂成分含量
| 稳定剂成分 | 对比例1 | 对比例2 |
| 柠檬酸钠(g/L) | 7.5 | 7.5 |
| NaCl(mol/L) | 15.5 | 15.5 |
| 硫酸葡聚糖(g/L) | 115 | 115 |
| 去离子甲酰胺(％) | 68 | 68 |
| Tris-HCl(mmol/L) | 5.5 | 5.5 |
| EDTA(mmol/L) | 0.65 | 0.65 |
| RNA Carrier(％) | 0.01 | 0 |
| Triton X-100(％) | 0.01 | 0.01 |
| 甜菜碱(mmol/L) | 0 | 10 |
| Proclin 300(％) | 0.005 | 0.005 |
表5存放不同时间后实施例2-5提供的试剂盒对2号样品的检测结果
| 存放时间 | 1个月 | 6个月 | 12个月 | 24个月 | 36个月 | 准确性(阳性数/5) |
| 实施例1 | P | P | P | P | P | 100％ |
| 实验组2 | P | P | P | P | P | 100％ |
| 实验组3 | P | P | P | N | P | 80％ |
| 实验组4 | P | P | P | P | N | 80％ |
| 对比例1 | P | P | N | N | P | 60％ |
| 对比例2 | P | P | N | N | N | 40％ |
由表5可以看出，本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因检测试剂盒可以长时间的存放，其检测结果的准确性达80％以上，尤其是实施例1和实验组2提供的BCR-ABL融合基因检测试剂盒在-20℃存放36个月后其检测结果的准确性达100％；此外结合表4可看出，通过设置对比例1和对比例2来对稳定剂中的组分RNA Carrier和甜菜碱进行单因素实验考查，发现对比例1、2探针稳定剂，其准确性最高为60％，与TE缓冲液的效果相当，这进一步表明采用本发明实施例通过合理优化的稳定剂配方可以大大地延长探针的存放时间，本实施例中的组分RNACarrier和甜菜碱对提高检测结果的准确性有显著影响，与其成分配合在一起，从而有效避免假阴性结果。
实施例5运输稳定性研究
经研究证明，泡沫箱内装入泡沫箱体积十分之一量的干冰，封存后存放于自然温度环境中，一周内泡沫箱内温度不会高于8℃。根据产品上市后运输需求，将产品与定量干冰置入泡沫箱内封存后，分别进行实际运输实验(将产品自广州发往哈尔滨，再从哈尔滨发回广州，共6天的运输时间)与模拟运输实验(室温，装有产品与定量干冰的泡沫箱置于实验室运输震动仪上)。将分别在实际运输环境下和模拟运输环境下存放六天的产品进行即时检验与有效期(12个月和13个月)检验，证明模拟运输实验可客观反映实际运输实验。因此，选择模拟运输实验对试生产的三批产品进行运输稳定性研究。
从三批产品中各选取6个试剂盒(10人份/盒，试剂盒组成如实施例1所述)进行模拟运输实验。产品在模拟运输条件下(室温，将产品与定量干冰置入泡沫箱内封存，置于实验室运输震动仪上)存放，分别在存放0天、4天、5天和6天时，各批产品各取出1盒对9份参考品进行检测。其余产品在模拟运输条件下存放4天、5天、6天后，依次各取出1盒对9份参考品进行检测，其余产品在模拟运输条件下存放6天后，按产品标签要求存放(-25℃至-18℃)，分别在存放12个月和13个月时，各批产品各取出1盒对9份参考品进行检测。检测流程参照实施例1进行。
运输稳定性实验结果如表6、表7所示。三批次产品在模拟运输条件下6个实验点的检测结果，各参考品均符合质量控制要求，检测结果描述如下：
1)阴性参考品：结果均为阴性；同一类型参考品经不同阅片人阅片得出的样本检测结果一致。
2)阳性参考品：结果均为阳性；同一类型参考品经不同阅片人阅片得出的样本检测结果一致。
3)特异性参考品：红绿荧光信号均可被肉眼识别，每份统计的20个染色体分散良好的中期分裂相细胞核中，每条染色体上均显示1个ABL基因位点(9q34)标记的红色信号和1个BCR基因位点(22q11)标记的绿色信号。
实验结果显示，三批次产品在模拟运输条件下分别存放0天、4天、5天和6天后即时检测，产品检测结果准确。三批次产品在模拟运输条件下存放6天后，按储存条件存放12个月和13个月后检测，产品检测结果准确。说明产品的运输稳定性良好，能完全满足临床检测应用要求。
表6运输稳定性实验结果(阴/阳性参考品)
表7运输稳定性实验结果(特异性参考品)
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 探针稳定剂和BCR-ABL基因融合检测试剂盒
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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ggctggactc agcagcaaca 20
Claims (6)
1.一种探针稳定剂，其特征在于，其由以下组份组成：
7-8g/L柠檬酸钠，13-16g/L NaCl，110-120g/L硫酸葡聚糖、50-75％去离子甲酰胺、4-6.5mmol/L Tris-HCl、0.5-0.75mmol/L EDTA、0.01±0.001％(v/v)RNA Carrier、0.01±0.001％(v/v)Triton X-100、10±1mmol甜菜碱以及0.005±0.001％(v/v)Proclin 300；或者
8g/L柠檬酸钠、12g/L NaCl、90g/L硫酸葡聚糖、45％去离子甲酰胺、3mmol/L Tris-HCl、0.8mmol/L EDTA，0.05％(v/v)RNA Carrier、0.1％(v/v)Triton X-100、20mmol甜菜碱以及0.05％(v/v)Proclin 300。
2.根据权利要求1所述的探针稳定剂，其特征在于，所述探针稳定剂由以下组份组成：7.5g/L柠檬酸钠、15.5g/L NaCl、115g/L硫酸葡聚糖、68％去离子甲酰胺、5.5mmol/L Tris-HCl、0.65mmol/L EDTA、0.01％(v/v)RNA Carrier、0.01％(v/v)Triton X-100、10mmol甜菜碱以及0.005％(v/v)Proclin 300。
3.一种BCR-ABL基因融合检测试剂盒，其特征在于，包括有BCR基因探针、ABL基因探针，所述BCR基因探针、ABL基因探针保存在权利要求1-2任一所述探针稳定剂中。
4.根据权利要求3所述的BCR-ABL基因融合检测试剂盒，其特征在于，ABL基因探针的碱基组成为由第一组引物扩增得到的序列，BCR基因探针的碱基组成为由第二组引物扩增得到的序列，所述第一组引物为：选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30中的至少一对引物；
所述第二组引物为：选自SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ IDNO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.51和SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56、SEQID NO.57和SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60中的至少一对。
5.根据权利要求4所述的BCR-ABL基因融合检测试剂盒，其特征在于，所述BCR基因探针在所述探针稳定剂中的浓度为10-100μmol/L；所述ABL基因探针在所述探针稳定剂中的浓度为10-100μmol/L。
6.根据权利要求3-5任一项所述的BCR-ABL基因融合检测试剂盒，其特征在于，所述BCR基因探针和ABL探针分别与不同颜色的染料偶联，所述染料包括有绿色荧光染料和红色荧光染料；
所述染料选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor610、Alexa Fluor 633以及Alexa Fluor 647。
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| CN113667751B (zh) * | 2021-08-20 | 2024-05-10 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种bcr-abl基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104109716A (zh) * | 2014-07-15 | 2014-10-22 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 一种人类hla-b27基因分型试剂盒 |
| CN107083419A (zh) * | 2016-02-16 | 2017-08-22 | 益善生物技术股份有限公司 | Bcr/abl基因融合与ass基因缺失检测试剂盒 |
-
2018
- 2018-04-27 CN CN201810394538.3A patent/CN108642132B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104109716A (zh) * | 2014-07-15 | 2014-10-22 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 一种人类hla-b27基因分型试剂盒 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Fluorescent in-situ hybridization (FISH) for BCR/ABL in chronic myeloid leukemia after bone marrow transplantation;Maria de Lourdes Lopes Ferrarid Chauffaille等;《Sao Paulo Med J》;20011231;第119卷(第1期);16-18 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN108642132A (zh) | 2018-10-12 |
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