CN101248187A - 纳米工程化表面上的dna纯化和分析 - Google Patents

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Abstract

一种用于从人白细胞中分离基因组DNA并同时捕获和测量所述DNA以简化基因分析的微流装置。所述装置包括液体进口、液体出口和与液体进口接触的DNA结合通道，其中将所述DNA结合通道内至少一个表面的至少一部分用结合试剂修饰，从而DNA优先地结合所述表面。

Description

纳米工程化表面上的DNA纯化和分析
政府资助
本发明是在政府SBIR Grant No.GM072178-01资助下做出的。政府对本发明拥有一些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2005年1月26日提交的美国专利申请序列号11/043,561的权益，该申请在此引入作为参考。
发明背景
1.本发明的技术领域
本发明总的来说涉及DNA的纯化，尤其是纳米工程化(nanoengineered)表面在DNA的纯化和分析中的用途。
2.现有技术的描述
便携式医学诊断或者生物防御应用需要简化基因组DNA的分离、处理和测量的技术。从人组织中分离的核酸的品质对于可重复、精确和有益的基因分析数据非常关键。由于DNA分离产品的商业重要性增长，在这个领域已经进行了大量工作。
其中取得巨大进展的一种技术是利用微流(microfluidic)装置来进行基因分析。可利用许多微阵列检定形式，它们均有允许同时检测来自单个样品的大量基因靶标的能力。
利用发荧光的小沟结合分子(MBs)已经开发了用于测量双链DNA(dsDNA)浓度的灵敏的液相检定法。当不存在DNA时，所述分子可以在溶液中自由旋转，这对于其的低荧光背景非常重要。当结合dsDNA时，所述化合物在疏水性小沟中呈现刚性平面构象，这种构象具有增强的荧光。通过小心地改造荧光MBs与表面的附着，当DNA转移穿过微流装置时可以测量其数量。
发明简述
因此，本发明的一个目的是提供一种微流装置，所述装置同时分离基因组DNA、测量纯化的DNA的量和分配特定浓度的标准化DNA溶液用于下游的分析。
本发明的另一个目的是提供一种用于DNA分离和制备的微流装置，其中所述装置的成本和复杂性被最小化。
本发明的另一个目的是提供一种可以同时从生物液体中捕获双链DNA(dsDNA)和测量固定化DNA的量的微流装置。
本发明的另一个目的是合成具有亲电子或亲核连接基团的发荧光的小沟结合剂(MBs)，并在dsDNA存在时证实增强的荧光。
根据下面的描述和附图，本发明的这些以及其他目的将更容易理解。
附图简述
图1描绘了与合成的12-mer DNA双链体结合的Hoechst 33258的结构；
图2显示了为了附着至DNA探针上的连接体而开发的H33258的反应性类似物的结构；
图3描绘了微流装置内流动的两种液体的相互作用；
图4描绘了几种经胺修饰的表面，其具有附着的发荧光的小沟结合剂(MBs)；
图5显示了具有反应性基团的荧光MBs的合成；
图6描绘了在有机溶液中用氰尿酰氯来活化载玻片的经胺修饰的玻璃表面；
图7显示了适合于在本发明中使用的微流装置的可能的室设计；
图8是适合于在本发明中使用的微流卡(microfluidic card)的前视图；
图9是微流卡的部件分解图，具有分开的层；
图10A-E一起描绘了图9的卡片的前视图，显示了在使用时卡的事件的顺序；
图11显示了具有附着的己胺连接体的荧光Hoechst染料的合成；
图12是显示在360nm激发的BB-NH2分子对BB-OH的荧光的图表。
图13是显示四种不同双苯甲亚胺表面在460nm的荧光的图表；和
图14是显示结合的DNA的量对于提供给玻璃和塑料盖片的DNA的量的图表。
优选实施方案的描述
利用发荧光的小沟结合(MB)试剂(Hoechst 33258)已经开发了用于测量dsDNA浓度的灵敏的液相检定法。当不存在DNA时，所述分子可以在溶液中自由旋转；这对于其的低荧光背景非常重要。当结合dsDNA时，所述化合物在疏水性小沟中呈现刚性平面构象，这种构象具有增强的荧光。通过小心地改造荧光MBs与表面的附着，当DNA转移穿过微流装置时可以测量其数量。用缀合化学(conjugation chemistry)方法在大分子结构上放置荧光染料，以便最大化构象的柔韧性和接近靶DNA。
Hoechst 33258分子具有多环结构，可以形成新月形结构，这与B-型DNA的小沟是等螺旋的(isohelical)。图1显示了与合成的12-mer DNA双链体结合的Hoechst 33258的溶液NMR结构(PDB结构ID号：1QSX)。该新月形分子的酚末端是用于在缀合基团(conjugate group)中附着的方便附着点。在水溶液中的结构是有柔韧性的，而且是相对无荧光的。用356nm光激发未结合的分子在492nm处产生微弱的荧光。但是，当结合到dsDNA时，苯并咪唑环定形为平面构象，发展为一种扩展的芳香族体系，其在458nm发出强的荧光。所述分子在小沟中与水分子隔离，这进一步增强荧光。H33258的这些荧光性质导致开发出用于测量dsDNA浓度和作为一种进行细胞计数的简单检定法的灵敏检定法。
对于与DNA结合的H33258的结构存在很大的兴趣。MB是通过疏水相互作用、范德华力和依靠咪唑残基的氢结合的联合作用来固定就位的。H33258的强的小沟结合还可能提供一种直接分离dsDNA的机制。MBs与富含腺嘌呤/胸腺嘧啶(A/T)的序列的小沟结合是优选的，并且DNA结合常数可以比其他小分子量试剂例如嵌入剂大几个数量级。嵌入性荧光试剂也已经被广泛研究。这种类型的DNA结合剂的一个例子是溴化乙锭，它通常在分子生物学中被用于在电泳后染色凝胶中的DNA。已将甲锭染料附着于sepharose颗粒以提供DNA分离产品。嵌入性染料例如甲锭并不与小沟结合剂类型的染料一样地紧密结合。使用阳离子精胺连接体将甲锭附着于sepharose颗粒，这将毫无疑问地改善DNA结合。此外，乙锭在结合dsDNA时只显示量子产量的少量增加。甲锭-sepharose颗粒的荧光性质没有被描述。
花青类型的嵌入性染料比乙锭嵌入剂的发荧光性质强得多。噻唑橙(thiazole orange，TO)是一种非对称的花青染料，其由两个双环芳香族环结构组成。当用509nm光激发时，这两个结构可以彼此自由旋转，并且几乎没有荧光。但是，当dsDNA存在时，TO嵌入到碱基对之间，并迫使环体系变成平面的。形成一种扩展的芳香族体系，其在533nm处发出强的荧光。TO不像小沟结合剂那样紧密地结合dsDNA，但是两个TO分子可以连接在一起从而形成强结合性双嵌入剂(bis-intercalator)。
基于花青类型染料的荧光性质，已经开发出灵敏的DNA结合检定法。当RNA存在时，TO还显示高达3000倍的荧光增强。这个性质是有利的，可以应用于RNA分离装置。
已将这些荧光化合物拴系于寡核苷酸以产生DNA探针，其可以在杂交检定法中监控dsDNA的形成。已经开发出H33258的几种反应性衍生物用于附着至DNA探针。图2显示了为了附着至DNA探针上的连接体而开发的H33258的几种反应性类似物。例如，将H33258的溴乙酰基类似物缀合到经巯基修饰的寡核苷酸。基于花青类型染料的荧光性质，已经开发出灵敏的DNA结合检定法。当RNA存在时，TO还显示高达3000倍的荧光增强。这个性质是有利的，可以应用于RNA分离装置。
已将这些荧光化合物拴系于寡核苷酸以产生DNA探针，其可以在杂交检定法中监控dsDNA的形成。已经开发出H33258的几种反应性衍生物用于附着至DNA探针。图2显示了为了附着至DNA探针上的连接体而开发的H33258的几种反应性类似物。与互补单链DNA靶的杂交导致结合亲和力增加，以及在结合时的荧光增强高达23倍。结合效率(DNA解链温度)的提高是序列特异的。当A/T区域位于配体附着点附近时，TM显著地增加，这表明H33258的强DNA结合效应。类似的合成化学可用于制备这些荧光染料的活性类似物，并将它们缀合到经胺修饰的玻璃或者塑料表面上。
在添加DNA互补链后，寡核苷酸的花青染料缀合物也导致预期的由杂交触发的荧光。荧光随形成的双链体的末端序列而变。TO与DNA双链体的结合已知是序列特异的。花青染料的NHS酯类似物与经胺修饰的寡核苷酸反应从而产生在荧光“实时”PCR检定法中使用的DNA探针。用所述寡核苷酸缀合物观察到高达20倍的荧光增强。因为染料的序列特异性结合，MGB和花青类型荧光寡核苷酸缀合物的DNA探针应用被复杂化。dsDNA结合的测量不应该受结合位点的序列特异性的影响，因为焦点是DNA基因片段的异质群体。
在高浓度离液序列高的盐溶液存在下，核酸对玻璃表面具有非常高的亲和力，现在商购可得大量基于玻璃的DNA分离产品。这些产品使用简单，但是需要大量移液步骤，Eppendorf管或者96孔板，以及使用诸如涡旋振荡器和离心机的设备。操作在开放实验室中进行，并且需要相对较大的样品体积以避免溶液蒸发的问题。DNA浓度通常用UV-vis分光光度计来测量，并且可重复的结果需要良好的技术。尽管如此，已经证明了玻璃表面用于从各种生物样品中分离DNA的用途。
DNA与玻璃的结合早先应用是从琼脂糖凝胶中分离经电泳纯化的DNA。平坦的钠钙玻璃或者硼硅酸盐玻璃表面的DNA结合能力是相当的：每800平方毫米大约300ng DNA。800平方毫米大概是玻璃显微镜载玻片和20×20mm盖玻片之间形成的室的表面积。大多数宏观流体(macrofluidic)DNA分离应用使用来自管或纤维的粉末化玻璃，二氧化硅，或者硅藻的硅石骨架，因为这些支持物具有比平坦表面大得多的表面积。微流装置可以使用更低结合平坦玻璃表面，因为溶液的体积更小(没有蒸发问题)，而且基于PCR的基因组分析所需的捕获的DNA量非常少。可以提供各种组成、尺寸和粗糙度的平坦玻璃，并且如果需要更大的表面积还可以进一步进行刻蚀。
使用在一个末端携带荧光报告基团且在另一个末端携带荧光猝灭分子的DNA寡核苷酸探针，可以在PCR期间完成mRNA或者DNA的液相分析。在一种形式(TaqMan检定法)中，探针是短的单链寡核苷酸，其通过Taq聚合酶的3′核酸外切酶活性进行消化。另一种荧光形式(分子信标检定法)利用发夹状的寡核苷酸，其在茎上具有相邻的荧光染料和猝灭分子。在存在互补DNA链时，发夹打开从而产生荧光信号。这些荧光形式中的每一种均可用于监控PCR的进展，因为每一轮成功的扩增循环均导致荧光信号的增强。这两种基于PCR的形式对于基于微流的平台均是理想的，因为检定法规模的下限是由可用设备的操作问题(小体积的变干)和分辨率决定的。一种常用的(高通量)热循环荧光计是ABI7900HT，其可以分析384孔板，对于每个在PCR期间测量的基因每孔10uL。推荐的是每孔含10pg-10ng基因组DNA，这依赖于PCR体系的效率和DNA的品质。
玻璃显微镜载玻片是DNA微阵列的常用基材。现在可利用许多微阵列检定形式，它们均有允许同时检测来自单个样品的大量基因靶标的能力。合成寡核苷酸的阵列已经直接从玻璃支持物合成，或者通过经修饰的合成探针的端点附着来制备。经胺修饰的玻璃是端点附着常用的基材。γ氨基丙基硅烷(GAPS)是一种可用于官能化玻璃表面的挥发性试剂，并且存在数家GAPS载玻片的制造商。GAPS载玻片的经胺涂覆的表面可以利用双功能连接体来活化，以产生与经胺修饰的寡核苷酸溶液反应的亲电子表面。这种缀合化学的变化形式可以用来附着荧光DNA结合染料。
寡核苷酸附着的密度是杂交性能中的一个重要因素。通过从玻璃直接合成可以得到高密度的寡核苷酸，但是已经显示，当捕获探针过于紧密地充填时，经标记的DNA靶标的杂交实际上降低了。当玻璃附着点和寡核苷酸序列之间的连接体长度延长时，杂交性能也得到改善。长度高达80个原子的聚乙二醇(PEG)连接体仍可改善杂交信号。由此可见，为了模拟溶液相性能，固体支持物和DNA探针之间的长连接体的重要性。
DNA探针通过长聚乙二醇连接体附着到玻璃表面改善了性能。商购可得具有各种官能团的大分子PEG连接体(Quanta，Biodesign，Powell，Ohio)，它们主要用于附着至蛋白药物以改善药物动力学性质。其他的大分子结构已经用于改善固定化的DNA探针的性能。例如，已将经生物素修饰的分子信标附着至用抗生物素蛋白包被的玻璃支持物，以用于序列特异性的DNA分析。利用抗生物素蛋白或者链霉抗生物素蛋白作为用于将DNA远离玻璃表面放置的间隔物对于探针的功能可能是重要的。另一种被考虑的大分子连接体类型是树状聚合体。这些商购可得的(Aldrich Chemical Co，Milwaukee，WI)分子是依靠合成的“生成”在氨基和羧酸酯基团的交替层中合成的。这些分子的三维结构被精确控制，并且性质非常清楚。富含胺的树状结构类似于组蛋白，组蛋白对于细胞内的DNA包装非常重要。它们已经被成功地用于将DNA序列转染入细胞中，以用于潜在的基因治疗应用。据信树状连接体会为将固定的MB分子呈递到富含DNA的溶液中提供了优异的支架。包含树状连接体和荧光DNA检测分子的生物传感膜(Sytox 13，Molecular Probes)用于测量塑料表面上活细菌的水平。这些材料不包含连接体、荧光染料或塑料表面之间的共价连接，但是通过疏水作用力结合在一起。
DNA微阵列技术提供小型化的检定法，这得益于封闭的微流处理。例如，一种以连续流运作的微型机械化的化学扩增仪显示出176个碱基对片段的20个循环聚合酶链式反应(PCR)扩增。在硅-玻璃微芯片中从全血已经证明了基因组DNA靶标的PCR扩增，所述基因组DNA靶标来自在流动室的堰(weirs)后面捕获的白细胞。开发了利用DNA芯片阵列的中等密度阵列方法，用于PCR产物的诊断测序，以降低其使用的成本和复杂性。在PCR扩增后一小时内，在视觉上检测到抗生素抗性的临床分离物。另一种应用是在传统中医学中使用的有毒药用植物的基于DNA序列的鉴定。在2001年，Petrik综述了原来开发用于基因组计划的微阵列装置在就丙型肝炎病毒来群集筛选捐献的血中的应用。通过在一个微芯片上组合双Peltier热电元件与电泳分级和检测，获得了用于PCR分析的集成系统。利用DNA浓度注射方案使得能够在少至十个热循环内检测PCR产物。开发出一种微流药筒(cartridge)，以通过超声处理，添加PCR试剂到裂解的孢子中，并将混合物加入到PCR管中，来制备用于PCR分析的孢子。孢子DNA的处理和检测在20分钟内完成。开发了一种集成的微流装置，它整合了单个DNA模板分子的随机PCR扩增，然后是产物的毛细管电泳分析。来自重复PCR分析的标准化峰面积的直方图显示了反应器中由于单个有活力的模板分子拷贝而造成的量化。开发了一种用于检测通过基于核酸序列的扩增(NASBA)而扩增出的RNA的微流芯片。检测了小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)的样品，并且其可与对照明显地区分而无需从NASBA混合物中分离扩增的RNA。已经开发了一种自动化的微流系统，用于直接从颊细胞中进行纳升DNA分析，所述微流系统包括DNA分析所需的全部步骤：注射，混合，裂解，PCR，分离，分级和检测。确立了使该系统进一步小型化的可能性。已经开发出一种基于集成的微流芯片的系统，用于重组的、腺病毒的基因疗法产品的品质控制测试。病毒身分测试测定DNA片段的大小和数量，并且所需样品的量比琼脂糖凝胶方法少100倍。
希望开发一种DNA分离装置，它能够处理小体积的人血(＜20μL)，并为基因分析提供标准化的基因组DNA样品。可以开发出一种单次使用的微流卡，它可以被插入到由微型泵驱动的设备中，所述设备控制流体流过各种DNA处理室。经固定和定量的DNA或者被释放到溶液中用于立即使用，或者进行储存以用于将来的分析。在所述装置中通过荧光测量固定的DNA的捕获和释放的能力允许对这种新型DNA处理系统进行过程控制。该技术可以发展为一种独立的产品以在分子生物学研究中普遍使用，或者可以整合到更复杂的装置中以简化用于生物医学应用的基因分析。将用所开发的单孔装置分离的、经纯化和变性的DNA的标准化溶液，经由微流通道分配到各种微孔板形式中，以用于通过实时PCR或者DNA微阵列进行基因分析。图3是用来显示开发小型化生物医学装置所需的微尺度物理学，所述装置可以用于从细胞分离基因组DNA。
图3显示了全血和另一种在微流装置的通道内流动的液体之间的相互作用，在所述装置内预计从全血中分离出DNA。预计用于开发小型化生物医学装置的微尺度物理学可用于从细胞中分离基因组DNA。现在参考图3，将包含有在全血54中的小颗粒52的第一液流50和包含有在清液(clear solution)60中的小颗粒58的第二液流56引入公共通道62中，在那里它们形成薄片状流体扩散界面(laminar fluid diffusion interface，LFDI)。依赖它们的扩散系数，颗粒52、58开始扩散穿过LFDI，较小的颗粒58扩散得更快。所述装置可用于从全血中提取小颗粒，或者用于以可预测的连续途径将试剂引入全血中。
来自Hoechst染料研究的初步观察也与该应用相关。当斑点变干时，水或者缓冲溶液中的一小滴Hoechst染料显示出增强的荧光。这涉及荧光染料环境的“水合含量”和对荧光背景的影响。为了低背景值，荧光染料必须被良好地水合，并且强调亲水表面涂层的重要性。
开始的焦点是用于dsDNA的结合和测量的荧光固体支持物的合成和测试。首先利用已知方法的变化形式来制备具有胺反应性官能团的荧光MBs。这些试剂将被固定到经胺修饰的玻璃或者塑料上，并且在用DNA处理之前和之后测量荧光。将就它们测量荧光对DNA浓度的能力来评价各种连接体结构。具有所附着的MBs的荧光表面将被工程化以提供低的荧光背景和良好的DNA结合。图4中显示了待研究的典型表面的示意图。变量例如固体支持物(玻璃或者塑料)，连接体化学和封端基团将被研究。荧光MBs的化学计量(附着密度)将被检查以确定用于DNA测量的具有最佳动态范围的表面。还将检查DNA结合能力。
现在参考图4，装置100具有经胺修饰的表面102，该表面具有附着的小沟结合剂(MB)104。未反应的胺可以被保留，以提供阳离子表面。装置110显示，未反应的胺可以通过琥珀酰化来进行封端以提供阴离子表面112。装置120显示，通过下列过程可以将MBs 104延伸到溶液中：首先将包含聚合胺的连接体(星放射状树状聚合物，二氨基-PEG，多聚-L-赖氨酸)附着到表面122，并进一步与MB衍生物反应。
与所需荧光表面的发展同时，考虑了用于DNA分离的微流装置。将获得各种大小的DNA样品(Sigma)，并且捕获效率将通过利用相同的荧光化合物在固相和液相中进行荧光测量来确定。将监控DNA从装置中的释放以确保DNA纯度和回收是良好的。对于DNA的捕获和释放的条件将在荧光板读数器上进行测量。在完成DNA结合能力和洗涤实验后，可以构建微流装置。在开发出荧光支持物后，可以将装置的DNA捕获和测量功能进行整合。
因为可以得到各种经胺修饰的固体支持物，所以用活性亲电子官能团例如碘乙酸盐基团、氰尿酰氯基团、NHS酯基团以及其他胺反应性部分可以制备衍生物。现在有两种合成方法，它们已经显示给出具有所需的亲电子或者亲核“处理”的H33258类似物，其可以与固体支持物上的互补官能团反应。最直接的途径来自于H33258的完全装配的杂环系统。PEG的溴烷基衍生物已经显示在碱性条件下与H33258反应，从而以高产率得到芳基醚。H33258可从Aldrich ChemicalCo.得到(500mg＝$220.80)。容易地合成叔丁氧羰基保护的己胺连接体，并且已制备了甲苯磺酸盐衍生物。溴代衍生物应当容易接近并与H33258反应，如图5所示。现在参考图5，用烷基化Boc衍生物处理Hoechst 33258。亲核的氨基烷基基团(R＝H)可以被直接固定到亲电子的表面上。备选地，可以将氨基转变成亲电子基团例如氰尿酰氯衍生物，如图5所示，以用于固定化到亲核的表面上。通过用稀释的酸进行处理来除去Boc，然后用碱中和，从而得到伯己胺基团(R＝H)。亲核的伯胺可以选择性地与亲电子试剂在溶液中反应，只有很少的由叔胺进行的竞争性烷基化。这种化学应当可应用于固体表面的修饰，所述表面用亲电子的官能团包被。备选地，H33258己胺类似物可以与留有一个亲电子残基的双功能连接体反应。氰尿酰氯具有类似双功能连接体的性质，以将包含胺的官能团连接在一起。在两个氨基被连接后，剩余的第三个氯基团是不反应的。这种缀合化学可以在以后用于合成经修饰的表面。另一种备选方案是将阳离子的H33258结合到阴离子的表面，如由羧酸基团所形成的。这些表面可以是适当地稳定的和有柔韧性的，以允许所需的与DNA的荧光反应。
像大多数固相化学一样，可以容易地达到试剂的大大过量(相对于可用的表面基团)，并且容易地洗涤所述表面以除去过量试剂。因此，偶联效率可以非常的高(可以实现紧密充填)。玻璃和塑料基材的表面积、固定化化学、连接体类型和“可连接的”荧光化合物(荧光染料)的密度将得到最佳化。商购可得的树状连接体、聚-L-赖氨酸和聚乙二醇二胺应当将荧光染料在溶液中定位于远离表面并朝向dsDNA。目标是最大化固定的荧光染料的构象柔韧性(以最小化背景)，并且最大化对dsDNA的可接近性(以最大化DNA结合和动力学)。
经胺修饰的玻璃和塑料支持物可以作为1×3英寸的显微镜载玻片而获得，并且是用于DNA微阵列的常用基材。大多数载玻片由钠钙玻璃(ErieScientific，Portsmouth，NH)制成，并用(γ)氨基丙基硅烷基团进行修饰从而得到均一密度的伯胺。GAPS载玻片还可以以其他玻璃类型(Corning Glass)获得，或者具有增加的粗糙度(Erie)。经氨基丙基包被的塑料载玻片也是可用的(Nunc，丹麦)。用胺官能化的聚酯薄膜(Mylar)也可用作片(DiagnosticLaminations Engineering，Oceanside，CA，或者Adhesive Research，Inc.，Glen Rock，PA)，并且也将被检查。这些基材将直接用于亲电子MB类似物的固定化，或者将用双功能连接体来“活化”它们以得到亲电子的表面。图6显示了一种可能的缀合化学系统。应当检查氰尿酰氯活化以及其他的脂质双功能连接体(Pierce Chemical Co.)。载玻片可以在无水有机溶剂中用疏水性亲电子试剂例如氰尿酰氯进行活化，以避免试剂的水解，并达到较高密度的亲电子修饰。因此，可以预期PEG胺(或者其他多胺)的高载量。首先尝试进行荧光MB亲电子试剂(例如，图5的氰尿酸酯)的直接偶联，应当表征这种(无连接体)荧光表面并将其用作各种不同表面的荧光研究的对照。
塑料载玻片要求更缓和的水性活化条件以及碳二亚胺偶联或者使用活化的酯连接体。在每个末端包含NHS酯的PEG大分子是商购可得的。可以使用水溶性碳二亚胺(EDC)化学将商购可得的聚羧酸酯树状聚合物偶联到包含胺的支持物。亲水性的第3.5和4.5代PAMAM树状聚合物是特别有吸引力的，因为这些分子分别具有64和128个表面羧酸酯。这些分子不显示密集的“星放射状”群集，所述“星放射状”群集影响更大的树状聚合物。在(用乙酸酐)封闭表面上的残留胺后，可以再次用EDC活化连接体上的羧酸酯，并将其偶联到包含己胺的MB，如图5中所示。在彻底洗涤以后，在板读数器上通过吸光度来测量共价结合到载玻片上的MB的量。Hoechst 33258生色团在356nm处吸光，并且Bio-Tek板读数器可以用合适的过滤器进行设定以直接在显微镜载玻片上测量这个波长。载玻片可以被干燥，并就以后的使用进行评价。应该研究表面上荧光染料单层的稳定性(储藏条件)。
大分子连接体结构将作为支架以在溶液中将荧光MB传感器展示给dsDNA。应该在dsDNA存在或者不存在的条件下检查表面结构的荧光性质。重要的是，当就荧光DNA结合性质进行评估时，表面被完全水化，因为已知H33258衍生物当在玻璃上干燥时会发出荧光。在微流环境中到达平衡的时间更快，这可能是有利的。首先通过将“灌注室(perfusion chamber)”附着到目标载玻片的表面来检测各种连接体结构的荧光背景。这些是被附着到载玻片上的简单橡胶衬垫，然后用具有进口和出口的盖玻片覆盖。在构造好室以后，移入目标分析物溶液，并密封所述口。将使用200μL的室容量。
各种不同大小的DNA样品获自外部来源(Sigma Chemical Co.)。基因组DNA可能需要进行剪切，以避免当其在微流装置所使用的温和流动条件下穿过微通道时发生缠结。通过将溶液数次穿过18号针可以容易地实现基因组DNA的剪切。还应该考虑各种不同长度(40kb，4000bp，400bp，和40bp)的MW标准。首先，将中性缓冲液添加到目标荧光基材上，并在板读数器(激发＝356nm)上测量荧光背景(在458nm和492nm)。当MB涂层被完全水化时，应该得到稳定的背景测量值。然后，将各种不同浓度的dsDNA(通过A260测量，50ug/mL dsDNA＝1 OD单位)导入灌注室中，要确保在每次读数之间完全冲洗所述室。当DNA浓度增加时，458nm荧光(dsDNA结合的特征)应该以线性方式增强。MB的密度可能与测量值的动态范围有关，这应该被考虑。如早先所述，MB充填的密度是由基材的A356决定的。微流装置将处理高度浓缩的DNA溶液，因此荧光的DNA浓度“阈值”就是目标。如果DNA浓度低于荧光阈值，那么分离程序将继续。同样地，如果荧光信号高于阈值，则已经达到所需的最低DNA浓度。要注意的是，利用荧光玻璃支持物的DNA检测将在生理盐浓度下进行检查，这种所述生理盐浓度下玻璃与DNA的结合应该最小。
与荧光表面的进展同时，将使用少量溶液来检查对于dsDNA的有效固定和从玻璃上释放来说所需的参数。通过数学建模来最佳化dsDNA释放入少量缓冲液中。在将DNA结合至玻璃之中的处理步骤依靠生物样品的性质，并且在方法中存在很多变化形式。对于富含DNA的来源和硅石颗粒设计出了下述步骤。首先通过添加2M硫氰酸胍(GuSCN)缓冲质溶液(pH 6.4)来裂解细胞。这种离液序列高的盐溶液还从基因组DNA中除去组蛋白，灭活核酸酶，并且驱动DNA-硅石复合物形成。涡旋振荡和离心固定的DNA-硅石(这可能剪切长的DNA链)，并用更多GuSCN缓冲液冲走细胞碎片。最终，干燥DNA-硅石，和用低盐缓冲液洗脱纯化的DNA，并通过260nm处的吸光度来进行测量。尽管该过程是简单的，但这些步骤要求按件工作(piecework)和人工投料，以确保硅石颗粒在涡旋振荡后是均质的。微流形式应当使所述过程流水线化，如下面表A中所述：
表A
1.裂解细胞，除去组蛋白，并用高GuSCN将DNA结合至玻璃
2.用高GuSCN洗涤结合在玻璃上的DNA
3.用生理盐水从玻璃上释放结合的DNA
4.在具有荧光基材的室内读取释放的DNA的浓度
5.从荧光基材上释放DNA，并进行配制以用于基于PCR的检定法
为评价玻璃基材(显微镜载玻片)的DNA结合能力，只有步骤2、3、4和5将被检查。处理步骤可以在灌注室中用玻璃盖玻片进行。各种大小和浓度的DNA与高GuSCN的混合对于DNA结合是关键性的。目标是接近所公开的在载玻片和盖玻片的玻璃表面之间300ng的DNA结合能力。在结合以后，从室中排出高GuSCN，并用生理盐水充满。在到达平衡以后，结合的DNA应该游离在在溶液中，并从室中收集。利用公开的使用H33258的荧光方法，在释放后测量浓缩的DNA的等分试样。因为DNA最终用于基于PCR的检定法，所以洗脱缓冲液将与该用途一致。
还将检查荧光MB基材的DNA结合能力。相同的灌注室系统将被用于检查各种不同的DNA浓度。利用在最终装置中遇到的各种缓冲液来检查结合能力。特别感兴趣的是dsDNA从经MB包被的基材上的释放条件。结合的DNA双链体可能需要变性才能从基材上释放，就像使用甲锭DNA捕获珠的情况一样。在这种情况下使用稀释的NaOH溶液，并且最后将变性的DNA溶液用乙酸铵中和。备选地，可以采用加热或者非常低浓度的盐来变性DNA。
产生的结合和释放数据将用作多物理学(multiphysics)模型的基础，所述多物理学模型将指引微流装置的设计。这个模型将计算表面结合，扩散，平流，和基于原型几何学、溶剂和溶质性质的所得到的盐和DNA的局部浓度，以及通过所产生的数据进行表征的结合行为。具有最佳预期表现的装置设计将变成所需的原型设计。将综合性能与模型的预测进行比较，这将提供了关于装置内部的不能通过实验获得的局部物理学的认识。
依赖于各种不同表面的性质，数种设计方案是可行的，如图7中所示。例如，荧光MB支持物150可以达到双重目的，即用于DNA结合和类似于使用甲锭颗粒的测量。玻璃表面可能具有更高的结合能力，并且单室设计152可以将玻璃捕获表面与用于DNA测量的荧光MB表面相组合。DNA结合和测量可能需要不同的条件，利用双室的装置154将是最佳设计。初步计算表明，如图8所示的单室设计能够捕获和测量84ng DNA，甚至在用光滑的玻璃表面(粗糙的玻璃表面可以结合显著更多的DNA)时，在所述单室设计中DNA结合在玻璃表面上，和MB测量在相对的塑料表面上。
图8显示了62×40×3.55nm的微流装置160，其包括5μl的DNA结合室162、750μl的废料通道164和用于在该过程结束时接纳释放的DNA的25μl的通道166。通过移液管将液体插入穿过注射口168。依赖于是废料排放口168还是出口170为开放的，液体前进至废料通道164或者释放DNA通道166。通过移液管可以将释放的DNA从卡160中取出，从产物排放口172或者出口170中。图9显示了组成装置的全部5个叠压层的部件分解图。层180由0.125mm的乙烯基组成；层182是0.025mm的粘合层；层184是3.175nm的PMMA；层186是0.100mm的ACA；层188是0.125mm的乙烯基；和层190由适合层180的Pyrex盖玻片插入物组成。每层包括3个对准孔192用于调准用途。层182和186包含胶粘剂，其以防漏方式将所述装置层保持结合在一起。
表A的处理步骤按顺序显示在图10A-E中。图10A显示了在通过移液管注射DNA混合物202之后的微流装置160，所述DNA混合物202在包含裂解的样品细胞的高盐GuSCN中。在用高盐GmSCN 203(冲洗通过结合通道162至废料通道164)进行洗涤(图10B)后，室162用生理盐水205冲洗(图10C)，从玻璃190上释放的DNA通过盐205而附着至发光的MBs，从而可以读出dsDNA浓度209(图10D)。最终，将去离子水(DI)移液穿过结合通道162以使DNA变性，并将其运输到释放DNA通道166以便最终分配从室162纯化的，如图10E中所示。在这点上，可以开放产物排放口132(参见图8)以回收DNA。装置是足够小的以容易地适合96孔板读数器，并被设计成使6孔中心位置在结合通道内以便获得精确的DNA浓度的多重读数。在该过程结束时，固定的荧光MB基团(现在大概是非荧光的)将保留在固体支持物上，并且与装置的其余部分丢弃于实验室废弃物中。
实施例
进行连接有所附己胺的荧光Hoechst染料的合成。现在参考图11，显示了所述合成。除非另作说明，试剂是从Sigma-Adrich获得的。在严密封口的瓶子中获得无水溶剂。从5×7cm的涂覆有硅石的铝片(Merck)上切出7cm长的TLC条，并通常利用手持长波紫外灯照射通过荧光来进行可视化。为进行TLC检定法，测量荧光斑点相对于溶剂前沿的迁移率(Rf)。用于荧光DNA结合检定法的Hoechst 33258标准品(双苯甲亚胺，BB-OH)在由Sigma出售的DNA定量试剂盒中获得。所述试剂盒包含双苯甲亚胺(10mg/mL，在水中)，10×荧光检定法缓冲液(10×FAB＝100mM Tris HCl，10mM EDTA，2M NaCl，pH 7.4)，和DNA标准品(经剪切的小牛胸腺DNA，1mg/mL，在1×FAB中)。这个试剂盒用作用于测量在图12中所示的DNA荧光测量值的标准。
经丁氧基羰基(Boc)保护的氨基己醇起始材料购自Sigma，并根据已经公开的程序(Keller和Haner，Helv.Chim.Acta，76(1993)884-892)将500mg转变为所需的烷基溴。在硅胶上通过柱色谱法来分离产物，从而得到292mg(45％产率)的产物，其为浅黄色液体。因为缺少好的对于烷基溴的TLC指示剂，因而从其他污染物中分离所需产物是困难的。在碘室中的染色以低灵敏度进行。TLC(2∶1己烷/乙酸乙酯)：起始ROH的Rf＝0.17，RBr的Rf＝0.67。
Hoechst 33258染料(双苯甲亚胺，BB-OH)作为三盐酸盐(五水合物)购自Aldrich。在干燥的15mL圆底烧瓶中，将9.5mg染料(15.2微摩尔)溶于5mL无水DMF中。36.5mg(265微摩尔)的碳酸钾和7.1uL(8.5mg，30.4微摩尔)的经Boc保护的溴己胺。于53度将混合物磁力搅拌6小时，并在室温下搅拌2天。当用长波UV灯(365nm)照射时，TLC(10％甲醇，5％N-乙基二异丙基胺，85％二氯甲烷)显示出蓝色荧光斑点的混合物。将起始BB-OH(Rf＝0)转变为所需产物(Rf＝0.3)和一种较高迁移率的副产物(Rf＝0.5)。将上层DMF溶液倒出，并用另外的2mL DMF洗涤残余的碳酸钾。通过在真空中旋转蒸发来浓缩合并的混合物。将残留物溶于2ml 5％甲醇、5％N-乙基二异丙基胺、90％二氯甲烷中，并施加至用相同溶剂填充的2×10cm硅胶柱(230-400目)。在除去50mL前出液后，以～75mL收集较高迁移率的副产物。可以利用手持UV灯追踪该色谱法的进展。洗脱液中的甲醇百分比浓度增加到10％，并且所需产物被分离在90mL溶剂中。在旋转蒸发器上除去溶剂后得到10.5mg黄色固体(理论产率＝9.5mg)。通过TLC，该产物是一条主要的蓝色荧光条带，只有痕量的其他荧光污染物。将产物溶于2mL氘氯仿以用于以后的NMR。1mL份的CDCl3溶液按下述脱保护。
将取自密封玻璃安瓿的三氟乙酸(1mL)添加到溶于1mL CDCl3中的5mLBB-NHBoc。将均质溶液保存于密封的1英钱(dram)的玻璃小瓶中。脱保护后进行TLC(35％甲醇，5％N-乙基二异丙基胺，60％二氯甲烷)。将起始BB-NHBoc(Rf＝0.7)转变为较低迁移率的盐(Rf＝0.5)，其被缓慢脱保护成较低迁移率的产物(Rf＝0)。24小时后，通过下列过程将反应混合物的100uL等分试样转变为游离碱：在旋转蒸发器上除去过量TFA，重新溶解在甲醇中，和添加少量碳酸钾。室温下获得的BB-NH2的游离碱形式显示出单一主要荧光条带(Rf＝0.07)和痕量荧光污染物。如上所述将大量反应混合物转变为游离碱，并溶于3mL 2∶1/甲醇∶氯仿中。产物不进行称重(～1.7mg/mL)，但通过与起始双苯甲亚胺染料(BB-OH)的UV吸光度进行比较来计算产率。
在1×FAB中的10uM BB-OH溶液的UV-vis光谱在340nm处具有最大吸光度(0.18单位)。通过在995.7uL 1×FAB中溶解4.3uL的所述～1.7mg/mL溶液，制备了BB-NH2溶液。最大吸光度在342nm(0.075单位)。假定BB-OH和BB-NH2具有相同的消光系数，并计算BB-NH2的UV-vis样品的浓度(10uM×(0.075/0.18)＝4.4uM)。这给出所述～1.7mg/mL溶液的实测浓度是0.7mg/mL(0.98mM)。BB-NH2的产率(2.1mg，2.9毫摩尔)相当于从起始BB-OH开始的38％产率。这种检定法比称重少量物质能够更精确地测定产率——盐和不可见的(通过NMR)三氟乙酸的存在会增加误差。
在图12中于220处显示的BB-OH分子的荧光，在dsDNA存在时，从492nm处的微弱发射变化到458nm处的强发射。将Sigma的DNA定量试剂盒(基于BB-OH)用于在Bio-Tek FL600荧光板读数器上产生标准曲线。按照提供的方案，在96孔透明底板中进行检定法。0.1ug/mL的BB-OH浓度被用作每种DNA标准品(20-1000ng/mL)的指示缓冲液。结果显示在图12中。
图12显示，于222处所示的BB-NH2保持了双苯甲亚胺染料的荧光DNA检测性质。对于Hoechst 33258分子上的酚的修饰没有改变UV-vis吸光度(λ最大为～340nm)，并且当在360nm激发时(40nm隙缝宽度)经己胺修饰的类似物给出强的荧光信号(在460nm处检测，40nm过滤器隙缝宽度)。己胺连接体改善DNA特异性荧光，着可能是由于DNA与阳离子伯胺的亲和力增强。BB-NH2分子在平面双苯甲亚胺结构的每个末端具有阳离子氨基，因此将其锚定在DNA的小沟结合剂中。其他DNA亲和力试剂(如寡核苷酸)已经证明可以作为溶液中的荧光探针。
考虑了各种用于制备荧光MB表面的固定化化学。dsDNA检测表面的设计中的3个主要成分是：
1.指示剂。只有在dsDNA存在时发荧光；连接体附着至具有很少荧光背景的间隔物分子。
2.基材。在目标光谱区域中是透明的；容易地用间隔物/指示剂分子包被。
3.间隔物。容易地缀合至荧光指示剂和基材；允许荧光MB没有位阻地接近dsDNA。
图12中描述的BB-OH和BB-NH2DNA指示剂具有所需的DNA特异性荧光性质，并且具有可以充当附着点的独特官能团。与亲电子试剂例如活化的酯或者氰尿酰氯的反应可以发生在分子中的多个位置处，这些副反应可以减少所需的DNA特异性荧光。“受损的”在新月形DNA结合区域中的结构可以改变DNA特异性荧光。两种分子在一个末端均有环状叔烷基胺基团，其可以被烷基化。咪唑基团也为烷基化提供了一个可能位点。各种不同的表面结构可以具有所需的DNA特异性荧光，但是有利的是具有均质且可重现的表面结构以提供一致的DNA特异性荧光。BB-NH2连接体包含伯己胺基团，所述基团可以选择性地与亲电子试剂反应。如果需要，连接体臂可以用聚乙二醇连接体进行延伸。QuantumBiodesign出售一种经Boc保护的羧酸，其将为BB荧光染料附着至固体支持物(基材)提供亲水性更高并且构象更具柔韧性的连接体。
当发现在用360nm光照射时于460nm处出现显著的背景荧光时，降低了对塑料(mylar)基材的兴趣。ScotchTM带(用于密封装置上的口)也被发现有显著的460nm荧光。因此，实验集中于玻璃基材。存在用于将寡核苷酸固定至1×3cm载玻片以得到DNA微阵列的丰富文献和数种化学方法。经胺包被的载玻片(氨基丙基硅烷)从Sigma获得，用作用于纳米工程化连接体和指示剂分子的基材。还检查了另一种商购可得的载玻片化学产品(Amersham Biosciences的CodeLinkTM)。这些载玻片具有延伸的连接体结构，所述连接体结构终止于活化的酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)基团。CodeLink载玻片宣称“允许固定化以胺基终止的寡核苷酸并且无需长PEG连接体即可杂交”。因为BB-NH2荧光染料可以与该表面直接反应，所以它首先被检查。
于pH 8.5，在3D-Link载玻片上的盖玻片之下进行BB-NH2的固定化。购买多孔杂交室(Grace Bio-Labs)，其允许同时检查每载玻片高达16个的孔。在反应不同时间后，载玻片用缓冲液漂洗掉过量的BB-NH2，并利用相同的盖玻片方法封端。在评价荧光DNA结合性质前，用1×FAB进行最后的漂洗。
可能可以改善BB-NH2指示剂的性质。460nm处的荧光背景是关键性质，如果存在高背景或者dsDNA释放较弱的问题，则所述性质可以进行优化，然后利用经胺包被的载玻片对其他表面进行研究。将用CodeLink载玻片进行研究的一个关键变量是在BB-NH2的固定化后利用各种不同胺进行封端的效果。这将改变在溶液中在BB荧光分子、间隔物和dsDNA的界面处的分子性质。该界面的性质可能影响荧光染料与dsDNA的结合以及DNA与固体表面的结合动力学。CodeLink推荐用50mM乙醇胺进行封端，并且这应当给出中性的表面涂层。用二胺或者其他多胺进行封端可以使载玻片表面带净正电荷并且不可逆地结合DNA(无释放)。另一方面，这些正电荷可以加速结合速率或者增加dsDNA的局部浓度(更好的信号)。用赖氨酸基团对经活化的酯进行封端将得到两性离子的氨基酸表面，其对于DNA是没有吸附力的，因此“钝化”表面。另一种将羧酸酯基团引至表面上的方法是在BB-NH2的固定化后简单地水解NHS酯。因为固定化在高pH(8.5)下发生，所以将载玻片在这种缓冲液中保持过夜可能会水解载玻片表面上的可得的NHS酯。这将在载玻片表面和DNA的界面处产生净负电荷，并且可能影响荧光信号和背景。这还可以被用作用于固定阳离子荧光指示剂的方法。
CodeLink载玻片从Amersham Biosciences获得，并按照下列方案进行使用。将单个载玻片用于检查16种不同的固定化反应。利用“96孔形式”夹具系统(ProPlateTM Grace Bio-labs)将16孔硅橡胶衬垫附着到板上。在载玻片上形成的方形孔具有高达300uL的体积，并且可以用透明的塑胶粘附密封薄膜(提供的)覆盖。活化的酯载玻片表面面朝上，并且为了定向目的，载玻片上的“CodeLink”名称被置于孔1和2的顶部。如前所述制备BB-OH(1mg/ml，在水中)和BB-NH2(0.7mg/ml，在甲醇中)溶液。将包含3mg/ml氨基乙醇(50mM)的pH 8.5碳酸氢盐(0.1M)用作封端溶液。
将BB-NH2溶液(100uL)与300uL甲醇混合，并用600ml pH 8.5碳酸氢钠(0.1M)进行稀释。该溶液(70ug/mL)用于制备在pH 8.5碳酸氢盐中的7ug/mL BB-NH2和0.7ug/mL的溶液。所述溶液在长波UV(356nm)灯下具有浅绿色荧光。从所述1mg/mL溶液制备在pH 8.5碳酸氢盐中的10ug/mL BB-OH溶液。按下列方法处理CodeLink载玻片表面上的16个孔：孔1-4，0.7ug/mLBB-NH2；孔5-8，7ug/mL BB-NH2；孔9-12，70ug/mL；孔13-16，10ug/mLBB-OH。在注满孔后(每孔0.2ml)，载玻片模块用粘附膜覆盖，并置于室温18小时(在暗处)。除去膜，从每个孔中除去包含BB的溶液，添加0.2ml封端溶液，并重新密封所述孔。7小时后，从每个孔中除去封端溶液，并从载玻片上除去衬垫以进行洗涤。将载玻片浸于在50ml离心管中的40ml 40％甲醇/60％碳酸氢钠(0.1M)之中20分钟，取出载玻片，并浸于1×FAB中20分钟。取出载玻片，并在荧光板读数器上分析。
表征了DNA指示性表面的灵敏度和精确度。通过使用前面所述的dsDNA标准和类似的板读数检定形式来检查对于包含BB-NH2的载玻片表面的评价。
评价先前制备的经BB-NH2处理的孔和经BB-OH处理的孔。在经处理的和CodeLink载玻片顶部重新装配16孔硅氧烷衬垫。通过在Kimwipe上轻叩来从载玻片表面上除去残留的1×FAB缓冲液(保留一些液滴)。用于每种固定混合物的4个孔中每一个孔用下列溶液之一再水化：1000ng/mL DNA，200ng/mL DNA，1×FAB，无液体。按惯例就460nm处的荧光来检查新鲜制备的溶液(底部读数，灵敏度＝115)。在对孔进行读数后，通过用去离子水进行洗涤来除去DNA，并重新测量。
在dsDNA存在下，所有经BB处理的载玻片表面在460nm处显示出荧光增强，如图13中所示。在230处所示的与最高浓度的BB-NH2(70ug/mL)的固定化反应显示最强的荧光信号。但是，该高载量水平也造成高荧光背景(无DNA时具有＞50,000计数)。在232处所示的7ug/mL固定化反应给出最佳性能。在低至200ng/mL DNA观察到剂量应答。在234处所示的固定化反应中最低水平的BB-NH2也在低至200ng/mL DNA给出剂量应答。虽然信号较低，但是即使在236处所示的BB-OH指示剂也随着DNA浓度增加而给出所需的460nm荧光的增强。在用水将DNA从孔中洗涤出后，孔没有显示460nm处的DNA特异性荧光的任何迹象。具有相同水平的固定的荧光染料的所有孔具有类似的荧光。
在图13的数据中在溶液中没有荧光染料——DNA结合检定法利用固定的BB-NH2或者BB-OH。所有表面在BB-NH2固定区域中显示出一些460nm处的荧光信号，即使在DNA不存在时。当将dsDNA引至指示性表面时，460nm荧光增强。载玻片表面的对照区域(无DNA)可用于背景扣除。
固定的BB-NH2荧光染料在dsDNA存在时产生良好的剂量应答。460nm处的荧光信号强度与溶液中的BB-NH2应答大致相同，但是背景较高(参见图13)。固定的BB-NH2的主要优点是所需体积很小。与液相检定法需要200uL孔体积不同，只需足够的DNA溶液来完全润湿固定的BB表面。这将使得能够制备用于DNA纯化的微流装置。
其他人已经公开了玻璃表面用于从复杂生物混合物中纯化DNA的用途，这些结果已经通过使用荧光BB检定法进行了验证。微流装置所需的步骤如下表B中所示。液相BB检定法用于测定未修饰玻璃的DNA结合和释放水平。
表B
1.裂解细胞，除去组蛋白，并用高GuSCN将DNA结合至玻璃
2.用高GuSCN洗涤结合在玻璃上的DNA
3.用生理盐水从玻璃上释放结合的DNA
4.在具有荧光基材的室内读取释放的DNA的浓度
5.从荧光基材上释放DNA，并进行配制以用于基于PCR的检定法
在荧光DNA结合检定法中检查硫氰酸胍(10M)，发现在高浓度时于460nm处产生荧光背景。另一种用于DNA结合至玻璃的常用离液剂是碘化钠(12M)。它具有低背景，但是比高氯酸钠更贵，并且更难于操作(溶液褪色)。因此，选择高氯酸钠(6M)用于显色。在6M高氯酸钠(pH 8 Tris)中制备0.1mL含50、500或者5000ng DNA的溶液。将这些0.1mL体积转移到聚苯乙烯培养皿中，并在上面放置22×22mm盖玻片(玻璃或者塑料)。在室温下1.5小时后，小心地倾斜盖玻片，并除去残液。将盖玻片置于Kimwipes上(DNA侧向下)以除去任何残留液滴。将每个盖玻片转移到在培养皿中的0.1mL体积的1×荧光检定法缓冲液(1×FAB：10mM Tris HCl，1mM EDTA，200mM NaCl，pH 7.4)之中。在室温下4小时后，取出盖玻片，并用0.15mL 1×FAB漂洗DNA侧。用1×FAB将合并的来自各载玻片的缓冲液变成0.27mL，并添加30uL的1ug/mL双苯甲亚胺(BB-OH)溶液(在1×FAB中)。将来自各盖玻片的200微升体积转移到微孔(透明底部)中，并且在Biotek FL-600板读数器上对样品进行读数。在460nm处读取荧光，并根据标准曲线确定DNA浓度。
现在参考图14，显示了盖玻片对DNA捕获和释放的效率。在250处，塑料盖玻片显示没有DNA结合。在252处所示的玻璃盖玻片对DNA捕获和释放的效率对于少量DNA是最大的。在50ng DNA/盖玻片的情况下，回收了7.2ng(14％效率)。在500ng DNA/盖玻片的情况下，回收了68ng(14％效率)。在5000ngDNA/盖玻片的情况下，回收了113ng DNA(2％效率)。这些结果显示，玻璃盖玻片是用于微流DNA纯化的合适表面，从500ng样品中可以有效地回收至少68ng DNA。
原型卡已经就溶液的手持移液添加进行了优化，并且使用经过训练的手和Rainin 200uL Pipettman可以达到100uL/分钟的流速。更低的流速(对于最小化气泡形成来说是非常重要的)是更难达到的，但是200uL移液器被成功用于注满DNA结合通道(20uL)而没有引入气泡。
先前讨论的卡经过一些微小变化也是成功的。在低流速下内部衬有玻璃的通道润湿了孔，并且通过让空气流过通道可以除去液体。将DNA收获孔设计成用于收集所有纯化的DNA，以用于使用荧光板读数器进行分析。利用固定的BB表面，可以将DNA收获孔设计成提供低型(low profile)通道，其可以容易地被配置成用于在荧光分析后将DNA分配到其他通道中。因为荧光BB染料是固定的，所以当转移到下游DNA分析室中时，纯化的DNA不会被指示性荧光染料污染。
尽管本发明已经根据其优选实施方案进行了显示和描述，但是应当理解，本发明不局限于任何特定的实施方案，而且可以进行变化而不背离所附权利要求书中所定义的本发明的真正精神和范围。

Claims (20)

1. 微流系统，包括：
液体进口；
与所述液体进口接触的DNA结合通道；和
液体出口，
其中将所述DNA结合通道内至少一个表面的至少一部分用结合试剂修饰，从而DNA优先地结合所述表面。
2. 权利要求1所述的微流系统，其中所述结合通道具有基本上长方形的横截面，以及一个顶壁、一个底壁和两个侧壁。
3. 权利要求2所述的微流系统，其中所述结合通道在顶壁和底壁间有200微米的距离，并且其中用结合试剂修饰的所述DNA结合通道内的所述表面位于顶壁或底壁，或者位于顶壁和底壁。
4. 权利要求1所述的装置，其中所述液体进口为移液管尖端提供加压密封。
5. 权利要求2所述的装置，其中至少一个壁是由与其他壁不同的材料制成的。
6. 权利要求2所述的装置，其中至少一个所述壁是由玻璃制成的。
7. 权利要求2所述的装置，还包括与所述DNA结合通道相连的废料储存室。
8. 权利要求2所述的装置，还包括与所述DNA结合通道相连的产物孔。
9. 权利要求2所述的装置，还包括与所述DNA结合通道相连的产物孔。
10. 权利要求1所述的装置，其中所述装置由这样的材料制成，所述材料允许透射过用于激发在所述装置内所包含的染料分子的光线，以及从所述染料分子发出的光线。
11. 权利要求1所述的装置，其具有与在96孔板读数器中放置和读取相容的大小和几何形状。
12. 物质的组合物，包括用于测定多聚DNA或RNA的浓度的固定化核酸(NA)指示性荧光分子。
13. 权利要求12所述的组合物，还包括能够结合NA指示性分子的基材，所述NA指示性分子具有对于荧光测量来说所需的光学性质。
14. 权利要求12所述的组合物，其中所述NA指示性分子对于双链DNA或单链DNA是特异的。
15. 权利要求14所述的组合物，其中所述NA指示性分子选自苯并咪唑染料(Hoechst 33258)和DNA靶向性花青染料(双花青染料)。
16. 权利要求14所述的组合物，其中所述NA指示性分子对于RNA是特异的，并且选自噻唑橙。
17. 微流系统，包括：
液体进口；
与所述液体进口接触的DNA结合通道；和
液体出口，
其中将所述DNA结合通道内至少一个表面的至少一部分用结合试剂修饰，从而DNA优先地结合所述表面，所述结合试剂包括用于测定多聚DNA或RNA的浓度的固定化核酸(NA)指示性荧光分子。
18. 权利要求17所述的装置，还包括用于分离和纯化核酸的未修饰的玻璃表面。
19. 权利要求13所述的组合物，其中所述基材选自玻璃、塑料、硝化纤维素、金属或者其他聚合材料。
20. 权利要求13所述的组合物，其中所述基材包括用亲电子基团活化的载玻片，所述亲电子基团例如为能够结合在NA指示性荧光分子中的酰胺基的活化的酯基团或者氰尿酸残基。
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