KR20020070471A

KR20020070471A - 물질의 검출방법

Info

Publication number: KR20020070471A
Application number: KR1020027008731A
Authority: KR
Inventors: 미이께아끼라; 모리히데하루
Original assignee: 교와 메덱스 가부시키가이샤
Priority date: 2000-02-07
Filing date: 2001-02-07
Publication date: 2002-09-09
Also published as: CA2398700A1; US20050112564A1; CN1237347C; CN1397020A; EP1258730A1; CN100346163C; AU2001232231A1; EP1258730A4; CN1696693A; WO2001059454A1; MXPA02007576A

Abstract

본원발명은, 용액에 현탁하고, 또한 신호 A 및 신호 B 를 검출 가능한 신호검출수단 중에 형성된 신호검출용 중공관에 관류(貫流)시켰을 때, 이 중공관의 횡단면에 대하여 중복하여 이동하는 일이 없는 형상을 갖는 담체로서, 검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 물질 (이하, 결합자라 약기한다) 을 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 결합시킨 식별 가능한 신호 A 를 갖는 담체와, 검출해야 할 물질을 함유하는 시료를 용액 중에 혼합하고, 검출해야 할 물질과 이 결합자를 결합시켜, 이 결합에 의하여 신호 B 를 담체상에 형성시킨 후, 이 중공관에 연통하는 용액공급수단에 의하여 이 담체현탁액을 이 중공관에 관류시키고, 이 신호검출수단에 의하여 신호 A 및 신호 B 를 검출하고, 신호 A 와 신호 B 를 관련시키는 것을 특징으로 하는 시료 중의 검출해야 할 물질의 검출방법에 관한 것이다.

Description

물질의 검출방법 {METHOD FOR DETECTING SUBSTANCE}

최근, 사람이나 동물, 식물, 균류 및 미생물 등의 유전자 정보가 해독되어, 잇따라 신규한 유전자가 발견되고 있다. 그러나, 그 신규한 유전자가 만드는 단백질의 기능에 대해서는 거의 해명되어 있지 않으며, 이 기능이 확인되기까지는 긴 시간과 노력이 필요하다. 따라서, 효율적인 단백질의 기능해석방법의 개발이 매우 긴급한 과제로 되어 있다.

단백질의 기능을 확인하는 방법으로는, 단백질에 친화성이 있는 물질을 찾는 것부터 시작되어, 그 후 생물을 이용하여 유전자적으로 그 단백질의 발현을 콘트롤하고 단백질의 역할을 추측하는 것이 이루어지고 있는데, 단백질과 물질의 친화성을 검출하는 것이 중요하다. 그 방법으로는, 정제되는 단백질을 담체에 고정화하여 칼럼에 충진시키고, 여기에 다양한 친화성이 있는 것으로 추측된 물질을 통과시켜, 통과하는지 또는 칼럼에 흡착하는지를 검출하는 방법이 있다.

최근, 이 효율적인 방법으로서, 단백질을 고정화한 칩이 개발되어 있다 [BioEssays,21, 781(1999)]. 이 칩은 반도체의 기술을 사용하여, 칩상의 특정장소에 특정 단백질을 결합시켜 두고, 이에 시료를 접촉시켜 단백질에 물질을 결합시키고, 이 결합을 표식에 따라 검출하는 방법인데, 반도체의 칩을 사용하거나, 항상 미세한 가공이 필요하며, 또한 칩에 고정화된 단백질이 무언가에 의하여 서로 결합하는 경우에는 검출이 불가능하였다. 또한, 일단 칩을 작성하면 다른 종류의 단백질 등을 용이하게 추가하는 것도 불가능하여, 칩을 재제조할 필요가 있었다.

또한, 유전자의 변이를 검사하여, 병의 진단이나 약의 효과나 부작용의 억제에 이용하는 것이 행해지고 있다. 그러나, 유전자의 변이는 다종다양하므로, 다종류의 DNA 서열을 준비하여, 각각에 혼성화하는 DNA 를 검출할 필요가 있다. DNA 칩은 이를 해결하려는 목적으로 사용되고 있으나, 상기와 동일한 문제가 있었다.

또한, 비즈 어레이라 하여, 수 ㎛ 크기의 비즈에 2 ~ 3 종의 형광색소를 여러가지 비율로 함침시켜 두고, 이것이 발하는 형광을 2 파장으로 해석하여 그 2 파장에 있어서의 형광강도의 비를 개개의 비즈의 판별수단으로 하여, 단백질, DNA 서열 등 검출해야 할 물질을 대응시키고, 결합 또는 혼성화후, 미소한 포켓에 비즈를 트랩하여 형광강도로 해석을 하는 방법 [미국특허 제 5843767 호, Analytical Chemistry,70(7), 1242 (1998)] 등이 알려져 있다. 그러나, 이 방법은 미소한 구멍이 뚫린 특수한 디바이스를 사용하기 때문에, 측정에는 고도의 테크닉이 필요하며, 또한 2 파장의 형광강도비의 미소한 차이로 식별하므로 판별능력이 낮고, 많은 종류의 단백질 또는 수만 종류의 DNA 에 대응할 수 없으며, 미소한 검출용 마이크로웰에 비즈가 들어갈 때, 검체에서 나오는 오물이나 주위 환경에서 떨어지는 오물 등이 혼입된 경우 노이즈가 되는 등의 문제점을 갖는다. 또한, 이들 방법에서는, 무언가에 의하여 또는 의하지 않고 직접 단백질끼리가 친화성을 갖고 있어도 검출할 수 없다는 결점이 있다.

따라서, 저가이며 범용성 높은, 특정 물질을 검출하는 방법의 개발이 요망되고 있다.

발명의 개시

본원발명의 목적은 저가이며 범용성 높은, 특정 물질을 검출하는 방법, 특정 물질을 검출하는 시약 및 특정 물질을 검출하는 기기를 제공하는 것이다.

본원발명자들은 미소한 담체에 외부로부터 판독 가능한 신호 A 를 부여하고, 이것에 단백질 또는 DNA 등의 검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 물질 (이하, 결합자라 한다) 을 결합시킨 것을 다종류 준비하고, 이를 혼합하여 검체 중의 물질과 결합시켜 새로운 신호 B 를 형성시키고, 비교적 간단한 장치로 이 신호 A 와 B 를 거의 동시에 검출하여 대비시켜 해석하면, 단백질 또는 DNA 칩 등 고가의 것을 사용하지 않더라도 다양한 단백질 및 DNA 서열 등의 검출해야 할 특정 물질을 검출할 수 있음을 발견하여 본원발명을 완성시켰다.

즉, 본원발명 방법에 의하면, 신호 A 가 부여된 담체와 검출장치에 의하여, 고도의 단백질 또는 DNA 칩 기술이 없어도 검출해야 할 물질과 결합능을 갖는 물질을 담체에 결합시킴으로써 단백질 또는 DNA 칩과 동일한 결과를 얻을 수 있다. 본원발명은 다수의 완전히 다른 물질을 동일하게 검출하는 경우에도 그 물질의 종류에 상당하는 신호를 가진 담체를 다수 준비하는 것이 간단하며, 신호와 서열의 조합은 실험자가 자유롭게 결정할 수 있다는 특징을 갖는다. 단백질 또는 DNA 칩의 경우에는 검체의 종류 등을 바꾸는 경우, 단백질 또는 DNA 칩을 다시 작성할 필요가 있어 범용성이 없으나, 본원발명의 담체는 단백질 또는 DNA 등의 물질이 결합되어 있지 않은 담체에 원하는 단백질 또는 DNA 등의 물질을 종래의 방법으로 결합시킴으로써 제작할 수 있어, 저가로 다양한 물질에 간단히 대응할 수 있는 것이다.

본원발명은 이하 (1) ~ (36) 에 관한 것이다.

(1) 용액에 현탁하고, 또한 신호 A 및 신호 B 를 검출 가능한 신호검출수단 중에 형성된 신호검출용 중공관에 관류(貫流)시켰을 때, 이 중공관의 횡단면에 대하여 중복하여 이동하는 일이 없는 형상을 갖는 담체로서, 검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 물질 (이하, 결합자라 약기한다) 을 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 결합시킨 식별 가능한 신호 A 를 갖는 담체와, 검출해야 할 물질을 함유하는 시료를 용액 중에 혼합하고, 검출해야 할 물질과 이 결합자를 결합시켜, 이 결합에 의하여 신호 B 를 담체상에 형성시킨 후, 이 중공관에 연통하는 용액공급수단에 의하여 이 담체현탁액을 이 중공관에 관류시키고, 이 신호검출수단에 의하여 신호 A 및 신호 B 를 검출하고, 신호 A 와 신호 B 를 관련시키는 것을 특징으로 하는 시료 중의 검출해야 할 물질의 검출방법.

(2) 검출해야 할 물질이 특정 염기서열을 갖는 물질이며, 결합자가 검출해야 할 물질의 염기서열 또는 그 부분서열과 상보적 염기서열을 갖는 물질인 상기 (1)에 기재된 검출방법.

(3) 검출해야 할 물질과 결합자의 결합이 상보적 염기서열에 의한 혼성화에 의하여 행해지는 상기 (2) 에 기재된 검출방법.

(4) 식별 가능한 신호 A 가 결합자의 염기서열과 관련된 것인 상기 (3) 에 기재된 방법.

(5) 담체가 결합자의 염기서열과 관련된 상호 식별 가능한 신호 A 를 가지며, 서로 다른 신호 A 를 갖는 복수의 담체의 혼합물인 상기 (3) 에 기재된 방법.

(6) 결합자가 염기수 5 ~ 500 의 DNA, RNA 또는 PNA 인 상기 (2) ~ (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(7) 담체상의 신호 B 의 형성이 결합자의 염기서열과 검출해야 할 물질의 염기서열과의 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물을 결합시킴으로써 행해지는 상기 (3) ~ (6) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(8) 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물이, 검출해야 할 물질이 갖는, 결합자의 염기서열에 대한 상보서열 이외의 잔여 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 화합물과 표식화합물을 결합시킨 화합물인 상기 (7) 에 기재된 방법.

(9) 검출해야 할 물질이 갖는 결합자의 염기서열에 대한 상보서열 이외의 잔여 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 화합물이 염기수 5 ~ 500 의 DNA, RNA 또는 PNA 인 상기 (8) 에 기재된 방법.

(10) 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물이, 이 혼성화를 인식하는 항체와 표식화합물을 결합시킨 화합물인 상기 (7) 에 기재된 방법.

(11) 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물이, 이 혼성화를 인식하는 인터칼레이터와 표식화합물을 결합시킨 화합물인 상기 (7) 에 기재된 방법.

(12) 담체와 결합되어 있지 않은 표식을 갖는 화합물을 담체에서 분리하는 공정을 포함하는 상기 (11) 에 기재된 방법.

(13) 표식화합물이 형광물질, 발광물질, 효소, 또는 효소에 의하여 형광 또는 발광을 발하는 화합물인 상기 (7) ~ (12) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(14) 담체가 형광을 발하는 물질을 결합시킨 것이며, 표식화합물이 에너지 트랜스퍼에 의하여 형광을 발하는 화합물인 상기 (13) 에 기재된 방법.

(15) 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물이, 인터칼레이션에 의하여 신호 B 를 생성하는 화합물인 상기 (7) 에 기재된 방법.

(16) 결합자가 검출해야 할 물질과 결합능을 갖는 단백질인 상기 (1) 에 기재된 방법.

(17) 식별 가능한 신호 A 가 디지털 신호인 상기 (1) ~ (16) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(18) 디지털 신호 A 가 자기적 또는 광학적인 상기 (17) 에 기재된 방법.

(19) 디지털 신호가 바코드인 상기 (17) 에 기재된 방법.

(20) 중공관의 형상이 원주형이며, 또한 담체가 이 중공관의 내경보다 작은 외형을 갖는 원주형이고, 이 원주형의 길이가 이 중공관의 내경보다 큰 것인 상기 (1) ~ (19) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(21) 담체가 원주형 또는 구형인 상기 (1) ~ (20) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(22) 담체가 자성입자를 내재하는 것인 상기 (21) 에 기재된 방법.

(23) 담체가 원주형으로, 외경이 직경 1㎛ ~ 2mm 이며, 길이가 10㎛ ~ 2㎝ 인 상기 (1) ~ (22) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(24) 담체의 비중이 0.8 ~ 2.0 인 상기 (1) ~ (23) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(25) 담체의 표면이 수지로 코팅된 것인 상기 (1) ~ (24) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(26) 검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 결합자를 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 결합시킨 식별 가능한 신호 A 를 갖는 담체.

(27) 결합자가 검출해야 할 염기서열 또는 그 부분서열과 상보적 염기서열을 갖는 것인 상기 (26) 에 기재된 담체.

(28) 결합자가 결합해야 할 물질에 결합능을 갖는 단백질인 상기 (26) 의 담체.

(29) 자성입자를 내재하는 담체인 상기 (26) ~ (28) 중 어느 하나에 기재된 담체.

(30) 신호 A 가 디지털 신호인 상기 (26) ~ (29) 중 어느 하나에 기재된 담체.

(31) 디지털 신호가 바코드인 상기 (30) 에 기재된 담체.

(32) 담체가 원주형 또는 구형인 상기 (26) ~ (31) 중 어느 하나에 기재된담체.

(33) 담체가 원주형으로, 외경이 직경 1㎛ ~ 2mm 이며, 길이가 10㎛ ~ 2㎝ 인 상기 (26) ~ (32) 중 어느 하나에 기재된 담체.

(34) 담체의 비중이 0.8 ~ 2.0 인 상기 (26) ~ (33) 중 어느 하나에 기재된 담체.

(35) 담체의 표면이 수지로 코팅되어 있는 상기 (26) ~ (34) 중 어느 하나에 기재된 담체.

(36) 신호검출수단, 데이터 입력수단, 데이터 처리수단 및 데이터 출력수단을 가지며, 이 신호검출수단은 검출해야 할 염기서열 또는 그 부분서열과 상보적 염기서열을 갖는 결합자를 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 결합시킨 담체상에 있는 적어도 2 종류의 신호 A 및 B 를 검지 가능한 신호검출기 A 및 B 를 구비하고, 이 신호검출기 A 및 B 는 이 담체를 관류시키는 중공관을 가지며, 이 담체는 이 중공관의 횡단면에 대하여 중복하여 이동하지 않는 구조를 가지며, 이 데이터 처리수단은 데이터 입력수단으로부터 입력되는 담체상의 신호 A 와 관련된 검출해야 할 특정 물질을 특정하는 데이터와 신호검출수단에 의하여 검출된 신호 A 및 B 로부터, 담체상의 신호 A 와 이 특정 물질을 관련지어, 이 관련지은 데이터를 데이터 출력수단으로 출력하는 기능을 구비하는 것을 특징으로 하는 특정 물질의 검출장치.

이하, 본원발명에 대하여 상세히 설명한다.

본원발명에서는, 용액에 현탁하고 또한 신호 A 및 신호 B 를 검출 가능한 신호검출수단 중에 형성된 신호검출용 중공관에 관류시켰을 때, 이 중공관의 횡단면에 대하여 중복하여 이동하는 일이 없는 형상을 갖는 담체로서, 검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 물질 (결합자) 을 스페이서에 의하여, 또는 의하지 않고 결합시킨 식별 가능한 신호 A 를 갖는 담체를 사용한다.

본원발명에 있어서 사용하는 담체는 용액에 불용성인 것이다.

담체상의 신호 A 로는, 분별하여 식별 가능하면 어떠한 신호여도 되나, 디지털 신호가 바람직하다. 디지털 신호로는, 디지털화된 신호이면 특별히 제한이 없으며, 바코드, 미소한 도트, 미세한 선 등의 유무의 조합으로 표시된 신호 등을들 수 있으며, 바코드가 바람직하다.

담체에 신호 A 를 부여하는 방법으로는, 특별히 제한이 없으나, 예를 들면 미세한 바코드, 미소한 도트, 미세한 선 등을 인쇄할 수 있는 인쇄기기를 사용하는 방법, 미세한 레이저 광선에 의하여 표면의 반사율이나 굴절율을 선이나 도트 형으로 바꾸는 방법, 렌즈 등을 사용하여 바코드나 선, 도트로 이루어지는 패턴을 광학적으로 미세하게 축소하고, 광이 닿은 부분의 표면의 성질을 변화시키고, 그 후 광학처리나 토너 등을 흡착시키는 등의 물리적 처리로 바코드를 부여하는 방법, 광에 의하여 경화 또는 분해하는 광감수성 폴리머에 색소나 안료, 카본 등을 함유시켜 표면을 코팅한 후 신호를 나타내는 형으로 광을 조사하고, 그 후 에칭하여 신호를 부여하는 방법, 담체 전체를 광감수성 수지로 구성하는 방법, 전자기적인 기록법에 의하여 신호가 기록된 자기담체를 내재시키는 방법 등을 들 수 있다.

담체의 형상으로는, 부여된 디지털 신호가 외부로부터 판독되는 형상이면 특별히 제한이 없다. 특히 중공관에 관류시켰을 때에 이 중공관의 횡단면에 대하여 중복하여 이동하는 형상이 아닌 것이 바람직하다. 조작성, 체적당 표면적이 큰 점에서 미소한 것이 바람직하다. 특히, 후술하는 중공관을 사용하는 검출방법에 사용하는 구체적 담체의 형상으로는, 이 중공관의 형상에 따라서도 달라지나, 구형, 다각주형, 원주형 등을 들 수 있으며, 원주형이 바람직하다. 형상이 구형이더라도, 예를 들면 2 차원의 바코드 등의 신호 A 를 구의 표면에 복수 부여함으로써 신호 A 가 어느 위치로부터도 판독되는 것인 경우, 또는 담체중에 자성미립자를 내재시켜, 검출시 단시간 자력에 의하여 담체의 이동을 멈추고, 자력에 의하여 구의 특정 면을 검출방향을 향하게 하는 등에 의하여 사용할 수 있다.

담체의 크기로는, 예를 들면 원주형인 경우, 직경 1㎛ ~ 2mm 정도가 바람직하며, 원주형의 길이는 10㎛ ~ 2㎝ 정도가 바람직하다. 구형상인 경우, 직경 1㎛ ~ 2mm 정도가 바람직하다.

또한, 담체의 비중은 0.8 ~ 2 정도가 바람직하며, 0.85 ~ 1.5 가 보다 바람직하며, 0.9 ~ 1.1 이 특히 바람직하다. 담체 현탁용액과 이 담체의 비중차는 0.1 이하가 바람직하며, 0.05 이하가 보다 바람직하며, 0.03 이하가 특히 바람직하다.

이 담체의 형을 만드는 방법으로는, 다각형, 원주형의 틀에 고분자를 형성하는 방법, 다각형, 원주형의 섬유형상인 것을 여러 방법으로 절단하는 방법을 들 수 있다. 또한, 고분자의 모노머를 사용하는 현탁중합법, 유화중합법 등에 의하여 입자형상의 담체를 제조할 수도 있다. 중공의 원통형인 경우에는 열에 의하여한 방향으로 수축하는 소재와 수축이 적은 소재의 필름을 적층하고, 신호 A 를 부여한 후 (재단 또는 재단 없이) 가열함으로써 한 면만이 수축함으로써 원통형을 형성할 수 있다.

열에 의하여 수축하는 소재로는, 예를 들면 산도리카(주) 의 2000 년 플라스틱 과학기기 종합 카타로그, 플라스틱편에 기재되어 있는 TFE 수축 튜브, TOF 수축 튜브, 테프론 수축 튜브, FEP 수축 튜브 등을 미세하게 또는 섬유 형상으로 한 것이나, 나일론 슈링커블 튜브 등을 들 수 있다.

특히 담체 또는 그 표면은 적어도 단백질이나 염기서열을 갖는 화합물 등 검출해야 할 물질을 흡착하기 어려운 물질로 이루어지는 것이 바람직하다. 담체는 친수성인 것이 바람직하나, 담체가 소수성인 것이라도 최종적으로 표면을 물리적으로 처리 또는 피복처리하여 담체 표면의 흡착을 적게 하는 것도 가능하므로 사용할 수 있다. 피복하는 천연 고분자로는, 예를 들면 키토산, 단백질, 히알루론산 등을 들 수 있다.

담체의 소재로는, 특별히 제한은 없으나 합성 화합물이 바람직하다. 예를 들면, 폴리아크릴산 또는 그 에스테르류, 폴리메타크릴산 또는 그 에스테르류, 폴리에테르류, 폴리카보네이트류, 폴리에스테르류, 폴리아미드류, 폴리우레탄류, 폴리이미드류, 폴리스티렌류, 폴리부타디엔, 폴리클로로프렌이나 이들의 공중합체, 이들의 혼합물을 들 수 있다. 일반적으로 플라스틱이나 섬유재료로서 사용되고 있는 합성 고분자가 저가로 바람직하다.

담체에 사용하는 합성고분자 화합물로는, 예를 들면 측쇄에 수산기나 에스테르기, 카르복실기, 아미드기, 아미노기, 이미노기, 히드로숙시닐에스테르기, 말레이미드기, 글리시딜기 등을 포함하는 합성고분자 화합물이 바람직하다. 이들 합성고분자 화합물을 구성하는 모노머로는, 예를 들면 아크릴산 무수물, 아크릴산 메틸, 아크릴산 에틸, 메타아크릴산 메틸, 메타아크릴산 에틸 (이상은 중합 후 가수분해한다), 히드록시스티렌, 에틸렌글리콜(메타)아크릴레이트, 트리에틸렌글리콜(메타)아크릴레이트 등의 에틸렌옥사이드 함유(메타)아크릴산에스테르, (메타)아크릴산 히드록시메틸, (메타)아크릴산 히드록시프로필 등의 히드록시기 함유(메타)아크릴산에스테르, 글리시딜(메타)아크릴레이트 등의 에폭시기 함유(메타)아크릴산 에스테르, 메틸(메타)아크릴레이트, 에틸(메타)아크릴레이트 등의 알킬(메타)아크릴산 에스테르, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 디아세트아크릴아미드, N-히드록시메틸아크릴아미드, 에틸렌이민, 아크릴산히드록시숙시닐에스테르 등의 모노에틸렌성 화합물을 들 수 있다.

이 합성고분자 화합물로는, 이들 모노머 1 종으로 이루어지는 폴리머 및 2 종 이상으로 이루어지는 공중합체 폴리머를 들 수 있다. 이들 합성고분자 화합물은 담체의 적어도 표면의 층을 형성하면 되며, 내부는 예를 들면 폴리스티렌, 폴리아크릴산 에스테르, 폴리아미드, 폴리비닐 등의 소수성 고분자이면 된다. 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 결합자를 결합시키는 표면은 관능기를 포함하도록 조제되는 것이 바람직하다. 또한, 이들 폴리머를 반응에 의하여 친수화시킨 고분자 화합물도 사용할 수 있다. 구체적으로 바람직한 고분자 화합물의 예로는, 예를 들면 글리시딜메타크릴레이트의 폴리머를 들 수 있다.

이 고분자 화합물의 합성은 모노머의 종류 및 고분자 화합물의 종류에 따라 달라지는데, 공지의 방법으로 합성할 수 있다.

스페이서란, 담체와 결합자를 결합하는 것이다. 이 스페이서로는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜디글리시딜에테르쇄, 1 가닥 DNA 쇄, 1 가닥 RNA 쇄, 1 가닥 펩티드핵산 (peptide nucleic acid, PNA 라 약칭한다), 펩티드쇄 등을 들 수 있다. 폴리에틸렌글리콜디글리시딜에테르쇄의 길이로는, 에틸렌 단위가 1 ~ 10 이 바람직하며, 1 ~ 5 가 보다 바람직하다. 또한, 1 가닥 DNA 쇄 및 1 가닥 RNA 쇄를 스페이서에 사용하는 경우의 이 쇄의 염기서열은 어떠한 것이라도 상관없으나, 염기에 아미노기를 갖는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 을 말단에 갖는 것이 바람직하다. 이들 1 가닥 DNA 쇄 및 1 가닥 RNA 쇄의 길이로는, 3 ~ 40 머(mer)가 바람직하며, 5 ~ 20 머가 보다 바람직하다. 펩티드쇄 수로는, 1 ~ 50 머의 것이 바람직하며, 2 ~ 30 머의 것이 보다 바람직하다.

결합자로는, 검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 물질이면 특별히 제한이 없으며, 예를 들면 시료 중의 검출해야 할 물질이 갖는 염기서열 또는 그 부분서열과 상보적 염기서열을 갖는 물질, 검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 단백질, 펩티드 등을 들 수 있다.

검출해야 할 염기서열 또는 그 부분서열로는, 염기서열을 갖는 것이면 검출을 위하여 특별히 제한이 없으나, 각종 형질에 관여하는 유전자, 질환에 관여하는 유전자 등에 유래하는 염기서열이 바람직하다. 예를 들면, HCV 유전자, 암억제 유전자서열, WT-1, Klotho 유전자, GyrB 유전자, 약제내성 유전자, 비만유전자 등을 들 수 있다.

검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 단백질로는, 각종 리셉터, 각종 항원에 대한 항체, 렉틴 단백질 등을 들 수 있다. 또한, 결합자로는, 이 리셉터 또는 항체에 결합하는 리간드 또는 항원을 사용할 수 있다. 리셉터로는 예를 들면, VEGF 리셉터, IL-2 리셉터, Fc 리셉터 등을 들 수 있다. 항체로는, 예를 들면 항 HCV 항체, 항 HBs 항체, 항 HBe 항체, 항 GAD 항체, 항 CRP 항체, 항 CEA 항체, 항 C 펩티드항체, 항인슐린 항체, 항 BNP 항체, 항트로포닌 T 항체, 항산화 LDL 항체, 항 TBGL 항체, 항 MPB64 항체, 항텔로메라제 항체 등을 들 수 있다.

결합자는 단백질의 경우에는 조직의 추출액, 균체 추출액, 또는 필요한 단백질의 유전자를 균체나 세포 등에 도입하여 발현시킨 것 등으로부터 정제한 단백질을 그대로 또는 관능기를 도입하여 결합자로 할 수 있다. 또한 결합자가 저분자 화합물인 경우에는 저분자 화합물이 관능기를 갖는 물질이면 그대로 결합자로 할 수 있는데, 관능기를 갖지 않는 것은 관능기를 부여하여 결합자로 할 수 있다. DNA, RNA 의 경우에는 말단에 관능기를 도입한 DNA, RNA 등을 결합자로 할 수 있다.

시료 중의 검출해야 할 염기서열 또는 그 부분서열과 상보적 염기서열을 갖는 물질의 염기수로는, 5 ~ 500 염기, 보다 바람직하게는 10 ~ 300 염기, 특히 바람직하게는 15 ~ 200 염기이다. 통상 검출하는 염기서열에 상보적 염기서열을 갖는 DNA, RNA 또는 PNA 등이다.

결합자가 염기서열을 갖는 물질인 경우, 해당 물질의 염기서열은 이들 공지의 서열에 기초하여 설계할 수 있다. 이 염기서열을 갖는 물질로는, 예를 들면 1 가닥 DNA 쇄, 1 가닥 RNA 쇄, 1 가닥 PNA 등을 들 수 있다. 또한, 본원발명에서 검출해야 할 물질이 갖는 염기서열로는, 기지의 서열 중 점돌연변이를 일으키는 것으로 알려져 있는 유전자의 염기서열도 적응 가능하다. 이 경우, 변이를 일으키고 있는 염기와 상보적인 염기의 결합자 중의 위치로는, 결합자의 양단의 3 염기 이상 내측인 것이 바람직하고, 결합자의 중앙부인 것이 특히 바람직하다.

시료 중의 검출해야 할 물질이 갖는 염기서열 또는 그 부분서열과 상보적 염기서열을 갖는 결합자는 예를 들면, 이 결합자가 DNA 인 경우에는 DNA 의 화학합성반응을 실리카 등의 담체를 이용한 고상법에 의하여 자동화한 DNA 합성기 등을 사용하여 합성할 수 있다. 반응기질에는 염기의 아미노기 및 리보스의 5'-OH 를 보호기로 보호하고, 리보스의 3'-OH 에 디이소프로필포스포아미다이트를 결합시킨 뉴클레오티드 유도체를 사용한다. 염기의 아미노기의 보호기로는, 벤조일기 또는 이소부틸기 등을, 리보스의 5'-OH 보호기로는 디메톡시트리틸기 등을 들 수 있다. 염기서열에 따라서, 아미노기 및 5'-OH 기가 보호된 아데닌, 티미딘 (T), 시토신, 구아닌 중 어느 한 뉴클레오티드를 3'-OH 에 의하여 지지체에 고정시킨 칼럼을 출발원료로 하여, 산에 의한 트리틸기의 제거 (5'-OH 의 형성) 후, 3' 말단에 포스포아미다이트기를 갖는 전술한 뉴클레오티드 유도체를 테트라졸 등 적당한 축합제 하에 부가한다. 또한, 양자의 결합을 요소와 물로 안정된 인산트리에스테르 결합으로 변환한다. 이 탈트리틸화와 축합반응의 사이클을 반복하여, 마지막으로 암모니아 처리에 의하여 탈보호기 및 지지체로부터의 절단을 행한다.이상의 조작으로 목적하는 결합자로서의 DNA 를 합성할 수 있다. 또한, 스페이서가 1 가닥 DNA 인 경우에는 다시 그 서열을 연속하여 합성하면 되며, 그 길이는 바람직하게는 3 염기 이상이며, 이로써 DNA 의 스페이서를 갖는 DNA 결합자를 합성할 수 있다.

결합자를 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 결합시킨 식별 가능한 신호 A 를 갖는 담체의 조제법에 대하여 이하에 설명한다.

담체 표면에 결합자로서 예를 들면 단백질을 결합시키는 방법으로는, 담체 표면에 측쇄나 말단의 카르복실기나 아미노기, 글리시딜기, 티올기, 수산기, 아미드기, 이미노기, 히드록시숙시닐에스테르기, 말레이미드기 등, 반응하여 화학적으로 결합가능한 기가 있는 것이 바람직하나, 이러한 것이 없는 경우에는 UV, 방사선 등 물리적 또는 화학적인 처리에 의하여 이들 반응가능한 기를 노출시키는 방법도 가능하다. 또한, 표면에 다른 폴리머를 코팅하여 관능기를 만드는 것도 가능하다.

이 담체의 반응가능한 기에 단백질 등을 결합시키는 방법으로는, 일반적으로 알려져 있는 화학적인 방법, 예를 들면 단백질의 아미노기나 카르복실기를 담체상의 관능기와 결합시키는 방법으로서 알려져 있는 카르보디이미드 등에 의한 축합이나 카르복실기를 활성 에스테르로 하여 아미노기와 반응시키는 방법, 또한 티올 또는 말레이미드를 담체에 부여해 두고, 이것에 결합자의 말레이미드나 티올기와 반응시키는 방법이나 담체에 이소티오시아나이트기, 글리시딜기, N-히드로숙시이미드기를 부여해 두고, 이것과 결합자의 아미노기와 반응시키는 방법 등, 어느 것이라도 사용할 수 있다. 또한, 이렇게 하여 작성한 담체는 비특이적인 흡착이나 반응을 억제하기 위하여 BSA 등으로 처리하여 블럭킹을 실시해도 된다.

스페이서가 폴리에틸렌글리콜디글리시딜, 결합자가 단백질이며, 담체가 표면에 에폭시기를 갖는 경우, 단백질과 담체의 결합은 예를 들면 이하와 같이 행할 수 있다. 담체 입자에 수산화암모늄 또는 헥사메틸렌디아민 염산염을 에폭시기의 10 ~ 100 배 몰량 첨가하고, 60 ~ 70℃, pH 10 ~ 12 에서 0.5 ~ 2 일간 반응시켜 입자표면을 아미노화한다. 반응 후, 원심분리에 의하여 세척하고, 필요에 따라 이온 교환수에 의하여 투석을 행하여 미반응의 수산화암모늄 또는 헥사메틸렌디아민 염산염을 제거한다. 아미노기를 도입한 담체에 아미노기의 50 ~ 200 배 몰량의 폴리에틸렌글리콜디글리시딜을 첨가하여 pH 10 ~ 12, 온도 20 ~ 40℃ 에서 0.5 ~ 2 일간 반응시킴으로써 스페이서와 담체를 결합시킨다. 스페이서가 갖는 에폭시기와 단백질의 결합은 전술한 방법에 따라 실시한다.

담체표면에 DNA 등을 결합시키기 위하여 사용하는 담체로는, 담체표면에 측쇄나 말단의 카르복실기나 아미노기, 글리시딜기, 티올기, 수산기, 아미드기, 이미노기, 히드록시숙시닐에스테르기, 말레이미드기 등, 반응하여 화학적으로 결합가능한 기가 있는 것은 그대로 사용할 수 있는데, 이러한 기가 없는 것일지라도 UV, 방사선 등 물리적 또는 화학적인 처리에 의하여 이들 반응가능한 기를 노출시키는 방법에 의하여 사용할 수 있다. 또한, 표면에 다른 폴리머를 코팅하여 관능기를 만들 수도 있다.

이 담체의 반응가능한 기에 DNA 등을 결합시키는 방법으로는, 일반적으로 알려져 있는 화학적인 방법, 예를 들면 담체표면의 아미노기나 카르복실기에 DNA 등을 결합시키는 방법으로서 알려져 있는 카르보디이미드 등에 의한 축합이나 카르복실기를 활성 에스테르로 하여 아미노기와 반응시키는 방법, 또는 티올 또는 말레이미드를 담체에 부여해 두고, 말레이미드나 티올기를 가진 DNA 등과 반응시키는 방법이나 담체에 이소티오시아나이트기, 글리시딜기, N-히드로숙시이미드기를 부여해 두고, 이것과 아미노기와 반응시키는 방법 등, 어느 방법이라도 사용할 수 있다. 또한, 담체 표면에 핵산의 염기를 DNA 합성법으로 알려져 있는 방법 등을 사용하여 잇따라 중합시켜 DNA 등을 합성하는 방법도 사용할 수 있다.

구체적으로는, 스페이서의 종류, 담체의 종류 및 결합자의 종류에 따라, 담체, 스페이서 및 결합자의 각 결합방법을 결정할 수 있다. 예를 들면, 결합자가 DNA 인 경우, 일반적으로는 DNA 결합자 말단의 염기가 갖는 아미노기와 담체 또는 스페이서의 에폭시기, 카르복실시, 알데히드기, 수산기 등을 결합시킴으로써 담체와 결합자를 결합시킬 수 있다.

스페이서 및 결합자가 1 가닥 DNA 이며, 담체가 표면에 에폭시기를 갖는 경우, 이 DNA 결합자와 담체의 결합은 예를 들면 이하와 같이 실시한다.

전술한 DNA 합성법에 따라, DNA 의 스페이서를 갖는 DNA 결합자 및 이 결합자와 상보적 서열을 가지며, 스페이서 서열은 갖지 않는 1 가닥 DNA 를 합성한다. 이어서 양자를 혼성화시켜 이줄쇄로 하고, 검출해야 할 염기서열을 갖는 염기 중의 아미노기를 보호하고, 유리 스페이서 부분의 염기 중의 아미노기 (필요에 따라 말단에 아미노기를 도입한다) 와 담체의 에폭시기를 결합시킨다. 담체에 결합시킨 후, 결합자와 상보적 서열을 가지며 스페이서 서열을 갖지 않는 1 가닥 DNA 를 해리시켜, 목적의 담체결합 DNA 결합자를 조제할 수 있다.

또한, 이렇게 하여 작성한 담체는 비특이적인 흡착이나 반응을 억제하기 위하여 BSA 등으로 처리하여 블럭킹을 실시할 수 있다.

혼성화는 필요에 따라 포름아미드, 염, 단백질, 안정제, 완충제 등을 함유하는 수용액 중에서 실시한다. 이하, 이 용액을 혼성화 용액이라 한다. 포름아미드 농도는 0 ~ 60% 이다. 염으로는 염화나트륨, 염화칼륨 등의 무기염, 구연산나트륨, 옥살산나트륨 등의 유기산염을 들 수 있으며, 염농도로는 0 ~ 2.0M, 바람직하게는 0.15 ~ 1.0M 이다. 단백질로는 혈청 알부민 등을 들 수 있다. 안정제로는 피콜 등을 들 수 있다. 완충제로는 인산 완충제 등을 들 수 있으며, 농도로는 1 ~ 100mM 이 바람직하다. 전술한 상보적인 2 종의 DNA 의 혼성화는 혼성화 용액 중에 각각 합성한 1 가닥 DNA 를 동일 몰 농도가 되도록 첨가하고, 50 ~ 90℃ 에서 1 분간 ~ 6 시간 가온한 후 서서히 냉각시킴으로써 가능하다.

이렇게 하여, 1 가닥 폴리뉴클레오티드의 스페이서를 갖는 부분 2 가닥 DNA 가 조제된다.

담체와의 결합은 에폭시기를 갖는 담체 입자를 1 ~ 100mM 의 인산 완충액으로 세척하고, 입자를 평형화한 후, 세척에 사용한 완충액과 동일한 용액 중에서 담체와 전술한 방법으로 작성한 1 가닥 DNA 의 스페이서를 갖는 부분 2 가닥 DNA 를 혼합하여, 5 ~ 50 시간, 20 ~ 50℃ 로 보온함으로써 실시한다. 미반응의 DNA 를 1 ~ 3M 의 염화나트륨 등의 염류를 함유하는 수용액으로 세척하여 제거한 후,담체상에 존재하는 미반응의 에폭시기를 트리스-염산 완충액을 첨가하여 실온에서 5 ~ 50 시간 보온하여 개환시킨다. 이렇게 하여 담체에 결합한 2 가닥 DNA 가 조제된다.

이 담체 결합 2 가닥 DNA 를 혼성화용 용액 중에 세척함으로써, 스페이서 서열을 갖지 않는 1 가닥 DNA 를 해리시켜 담체 결합 1 가닥 DNA 를 조제할 수 있다. 세척은 혼성화 용액을 사용하여, 50 ~ 90℃ 에서 천 ~ 10만g 의 원심분리로 수회 실시하여 세척한다.

스페이서가 폴리에틸렌글리콜디글리시딜, 결합자가 DNA 쇄이며, 담체가 표면에 에폭시기를 갖는 경우, DNA 결합자와 담체의 결합은 전술한 스페이서 및 결합자가 1 가닥 DNA 이며, 담체가 표면에 에폭시기를 갖는 경우와 동일하게 행할 수 있다.

또한, 이러한 합성고분자를 사용한 화학적인 고정법 이외에, 하운 (Haun, M) 과 와시 (Wasi, S) 의 방법 [Anal. Biochem., 191, 337(1990)] 에 의하여 담체에 스트렙토아비딘을 고정화한 후, 비오틴을 함유하는 스페이서, 또는 말단이 비오틴 표식된 결합자 자체를 스트렙토아비딘과 비오틴과의 어피니티를 이용하여 고정할 수도 있다. 나아가서는, 생물학적으로 어피니티를 갖는 2 종류의 물질을 각각 담체와 스페이서, 또는 담체와 결합자 자체에 결합시킨 후, 그 양자의 어피니티를 이용하여 결합시키는 방법도 이용할 수 있다.

전술한 신호 A 가 부여된 담체에 결합자를 결합시킬 때는 특정 결합자 S1 를 신호 A 의 A1 을 갖는 담체에 결합시킨다. 마찬가지로 다른 결합자 S2 를 신호A 의 A2 를 갖는 담체에 결합시킨다. 예를 들면, 특정 결합자 S1 을 바코드 신호 01 를 배정한 담체에 결합시키고, 다른 특정 결합자 S2 를 바코드 번호 02 를 배정한 담체에 결합시킨다. 본원발명에서는 특정 결합자와 신호 A 를 대응시켜 식별할 수 있으면, 1 회의 반응으로 검출 가능한 결합자의 종류의 상한에는 특별히 제한이 없다.

본원발명에서는 특정 염기서열 S1, S2,ㆍㆍㆍ Sn 을 갖는 결합자를 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 신호 A 의 A1, A2,ㆍㆍㆍ An 을 갖는 담체를 각각 결합시킨 담체를 복수 사용함으로써 특정 염기서열 S 과 신호 A 를 대응시켜 식별할 수 있으므로, 1 회의 대응으로 검출할 수 있는 염기서열의 종류의 상한에는 특별히 제한이 없다.

다음으로, 검출해야 할 물질의 조제방법에 대하여 설명한다. 검출에 사용하는 생체검사시료는 각종 장기, 조직, 혈액 등으로부터 그대로 또는 저분자 화합물, 단백질, DNA, RNA 등의 핵산분자의 추출ㆍ정제방법을 이용하여 조제된다.

다음으로 검출해야 할 염기서열을 갖는 시료의 조제방법에 대하여 설명한다.

예를 들면, 검출에 사용하는 시료가 DNA 또는 RNA 인 경우에는 각종 장기, 조직, 혈액 등으로부터 공지의 DNA 또는 RNA 추출방법에 의하여 조제할 수 있다. 단리한 DNA 또는 RNA 는 특정 제한효소 등으로 절단하여 검출해야 할 특정 염기서열을 포함하는 5 ~ 500 머, 바람직하게는 10 ~ 300 머의 길이를 갖는 1 가닥 DNA 단편 또는 1 가닥 RNA 단편으로 조제한다. 시료 중의 DNA 등의 염기서열은 PCR, TMA 또는 NASBA 법에 의하여 증폭된 것을 사용할 수도 있다. 본원발명에있어서는 생체시료 중의 염기서열을 검출하는 경우에는 DNA 등을 단편화하기만 해도 된다. 생체시료뿐만 아니라, 합성 등에 의하여 제조한 염기서열을 갖는 화합물도 시료로 사용할 수 있다.

시료 중의 검출해야 할 물질과 결합자의 결합은 필요에 따라 염, 단백질, 안정제, 완충제, 계면활성제 등을 함유하는 수용액으로 실시한다. 염으로는 염화나트륨, 염화칼륨 등의 무기염, 구연산나트륨, 옥살산나트륨 등의 유기산염을 들 수 있으며, 염 농도는 0 ~ 2.0M 이다. 단백질로는 혈청 알부민 등을 들 수 있다. 완충제로는 인산 완충제 등을 들 수 있으며, 농도로는 1 ~ 100mM 이 바람직하다. 결합 조건으로는, 10 ~ 70℃ 에서 1 ~ 60 분간 가온한 후 필요에 따라 냉각시킴으로써 실시할 수 있다.

결합자를 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 결합시킨 식별 가능한 신호 A 를 갖는 담체와, 검출해야 할 물질을 함유하는 시료를 용액 중에서 혼합하고, 검출해야 할 물질과 이 담체상의 결합자를 결합시켜, 이로써 새로운 신호 B 를 담체상에 형성하는 방법에 대하여 서술한다.

예를 들면, 결합자가 단백질인 경우에는 이하와 같이 하여 실시할 수 있다. 신호 B 는 검출해야 할 단백질 등의 물질과 이 담체상의 단백질 등의 물질 (어느 한쪽은 단백질) 과의 결합에 기인하는 신호이면 어떤 신호여도 좋으며, 진동자 등의 진동과의 공명현상을 이용한 중량의 증가를 직접 측정해도 되나, 검출해야 할 물질을 인식하는 항체 등에 표식화합물을 결합시켜 그 표식을 신호 B 로 하는 방법이나, 결합자를 인식하는 항체 등에 표식화합물을 결합시켜 검출해야 할 물질이 결합자에 결합한 경우, 이 항체가 결합자에 결합할 수 없도록 하여, 결합하지 않은 항체의 표식을 신호 B 로서 검출하는 것도 가능하다. 또한, 결합자끼리가 단백질 등의 검출해야 할 물질에 의하여 연결된 경우에는, 한쪽의 결합자가 갖는 신호 A 를 신호 B 로 하여 검출할 수 있다.

검출해야 할 단백질과 결합자를 결합시키는 조건으로는, 통상 수용액 중에서 단백질의 변성이 없는 조건 하에서 실시한다. 예를 들면, pH 3 ~ 11 정도의 완충능을 갖는 수용액 (계면활성제나 단백질의 기능을 유지하기 위하여 보조제를 함유할 수도 있다) 중에서 온도는 1 ~ 90℃, 바람직하게는 5 ~ 60℃ 정도이다.

이어서 결합자에 결합되어 있지 않은 표식화합물과 시료 중의 잔여 물질은 필요에 따라 원심분리조작 또는 여과조작 등에 의하여 분리제거한다.

표식화합물로는, 예를 들면 형광물질, 발광물질, 효소 또는 효소에 의하여 형광, 발광하는 화합물 등을 들 수 있다. 형광물질로는, 예를 들면 플루오레세인이소티오시아나이트 (이하, FITC 라 약기한다) 나 텍사스 레드 (Texas Red) 등을 들 수 있다.

발광표식으로는, 아크리디늄 유도체나 루테늄 착체화합물을 들 수 있다. 구체적으로는 미국특허 제 4918192 호, 동 4946958 호, 동 4950613 호 또는 Clin. Chem.29(8), 1474-1479(1983) 에 개시되어 있는 아크리디늄류가 바람직하다. 또한 루테늄 착체화합물은 Clin. Chem.37(9), 1534-1539(1991) 에 개시된 것이 바람직하며 본 화합물은 전자공여체와 함께 전기화학적으로 발광한다.

효소에 의하여 형광, 발광하는 화합물의 기질로는, 예를 들면 퍼옥시다아제의 기질로서, 예를 들면 루미놀 화합물, 루시게닌 화합물 등을 들 수 있다. 또는 알칼리포스파타아제의 기질로서, 예를 들면 3-(2'-아다만틸)-4-메톡시-4-(3" 포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄 염, 아크리디늄의 인산유도체인 APS2, APS3, APS5 등 [이상, Lumigen Inc 의 발광화합물, H. Akhavan-Tafti, Z. Arghavani et al John Wiley and Sons, Chichester, 497-500(1997)] 을 들 수 있다.

표식화합물이 형광물질인 경우에는, 담체에도 형광물질을 결합시켜 광을 적용시켰을 때, 한쪽의 형광물질로부터 에너지 트랜스퍼에 의하여 결합되어 있는 다른 한쪽의 형광물질이 형광을 발하는 현상을 이용하여 표식할 수도 있다.

신호 B 의 검출에는 형광의 경우, 담체를 포함하는 용액이 통과하는 미소한 공관의 부분을 형광검출기의 검출부에 둔다. 현재 셀소터에 사용되고 있는 방법도 적합하게 사용할 수 있다. 발광을 검출하는 경우에는 광원이 필요치 않으나, 필요하면 발광을 개시시키는 시약이나 에너지를 추가하는 장치를 장착하는 것이 바람직하다. 발광의 검출장치로는 고감도의 포톤카운터가 적합하나, 발광이 강한 경우에는 형광검출기의 광학부도 사용할 수 있다.

다음으로 예를 들면, 검출해야 할 염기서열 또는 그 부분서열과 상보적 염기서열을 갖는 결합자를 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 결합시킨 식별 가능한 신호 A 를 갖는 담체와, 검출해야 할 염기서열을 함유하는 시료를 용액 중에서 혼합하고, 검출해야 할 염기서열과 이 담체상의 상보적 염기서열을 갖는 염기서열을 혼성화시켜, 이로써 새로운 신호 B 를 담체상에 형성하는 방법에 대하여 이하에 설명한다.

신호 B 는 검출해야 할 염기서열과 이 담체상의 상보적 염기서열을 갖는 염기서열과의 혼성화에 의하여 형성되며 이중쇄에 기인하는 신호이면 어떠한 신호여도 되며, 직접 이중쇄의 흡수를 측정해도 되나, 이중쇄를 형성하는 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물을 결합시키는 방법이 바람직하다. 이 결합자의 염기서열과 시료의 염기서열의 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물로는, 예를 들면 표식화합물과 시료 중의 특정 염기서열의 결합자에 대한 상보서열 이외의 잔여 염기서열에 상보적인 염기서열을 결합한 화합물 (이하, 표식결합자라 약기한다), 표식화합물과 결합자의 염기서열과 시료의 염기서열과의 혼성화를 인식하는 항체를 결합시킨 화합물, 표식화합물과 결합자의 염기서열과 시료의 염기서열의 혼성화를 인식하는 인터칼레이터를 결합시킨 화합물 등을 들 수 있다.

혼성화는 전술한 혼성화 용액을 사용하여 엄격한 조건하에서 실시한다. 예를 들면, DNA 결합자 결합 담체와 DNA 단편을 포함하는 시료를 이 혼성화 용액에 첨가하고, 50 ~ 90℃, 바람직하게는 60 ~ 75℃ 에서 1 분간 ~ 24 시간, 바람직하게는 5 ~ 15 분간 가열한다.

이어서 결합자에 혼성화하지 않은, 시료 중의 결합자와 상보적인 염기서열을 갖는 화합물, 및 신호 A 를 갖는 담체와 복합체를 형성하지 않은 표식화합물과 시료 중의 특정 염기서열의 결합자에 대한 상보서열 이외의 잔여 염기서열에 상보적인 염기서열을 결합한 화합물, 표식화합물과 결합자의 염기서열과 시료의 염기서열의 혼성화를 인식하는 항체를 결합시킨 화합물, 표식화합물과 결합자의 염기서열과 시료의 염기서열의 혼성화를 인식하는 인터칼레이터를 결합시킨 화합물을 필요에따라 원심분리조작 또는 여과조작 등에 의하여 분리한다.

표식화합물과 시료 중의 표식결합자, 표식화합물과 결합자 염기서열과 시료염기서열의 혼성화를 인식하는 항체를 결합시킨 화합물, 표식화합물과 결합자의 염기서열과 시료의 염기서열의 혼성화를 인식하는 인터칼레이터를 결합시킨 화합물 등의 검출은 이 화합물의 표식의 종류에 따라 실시할 수 있다.

표식화합물로는, 전술한 예를 들면 형광물질, 발광물질, 또는 효소에 의하여 형광, 발광하는 화합물 등을 들 수 있다.

또한, 혼성화한 부분은 2 중쇄로 되어 있으므로, 예를 들면 인터칼레이터를 첨가하여 인터칼레이트시킬 수 있다. 이 때, 인터칼레이션에 의하여 형광을 발하는 화합물이면 혼성화한 것이 존재하였을 때만 형광을 발하므로, 상보적인 염기서열이 담체 표면에 없었던 염기서열은 형광을 나타내지 않고, 남은 인터칼레이터나 혼성화하지 않은 것 등을 제거할 필요가 없어 특히 바람직하다.

인터칼레이터에는 에티듐브로미드 등의 화합물이나, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디히드로클로라이드 n-히드레이트 (DAPI) SYBR Green 1 (Molecular Probe 사 제조), Pico Green (Molecular Probe 사 제조), 2-메틸-4,6-비스-(4-N,N-디메틸아미노페닐)피릴륨 (MBP 캐논샤 제조), 2-메틸-4,6-비스-(4-N,N-디메틸아미노페닐)티오피릴륨 (캐논샤 제조) 등의 인터칼레이터를 들 수 있다. 또한, 혼성화하지 않으면 알칼리 조건하에서 분해하여 발광할 수 없게 되는 아크리디늄에스테르 등의 발광화합물도 적합하게 사용할 수 있다.

표식결합자를 사용하는 경우에는, 혼성화 부위에 가까운 부분의 서열에 상보적인 서열을 갖는 DNA 표식체를 별도로 첨가하여 혼성화시키고, 다음으로 혼성화하지 않은 표식결합자를 제거하여 표식결합자가 혼성화한 것에만 결합되어 있는 상태로 하는 것이 바람직하다. 제거하는 방법으로는, 원심분리나 필터를 사용하는 방법이 바람직하다. 혼성화하지 않은 표식결합자를 제거하는 대신, 혼성화하지 않은 표식결합자를 불활성화해도 된다.

표식화합물이 형광물질인 경우, 담체에도 형광물질을 결합시켜 광을 적용하였을 때, 한쪽의 형광물질로부터 에너지 트랜스퍼에 의하여 혼성화하고 있는 다른 한쪽의 형광물질이 형광을 발하는 현상을 이용하여 표식할 수도 있다. 이 경우에는, 검체 중의 DNA 또는 RNA 의 혼성화 부분에 가까운 부분의 서열에 상보적인 서열을 갖는 DNA 의 형광물이 결합한 표식체를 첨가하여 혼성화시킨다. 광을 적용하면 한쪽의 형광물질에서 다른쪽의 형광물질에 에너지가 트랜스퍼되어 혼성화한 것만 형광을 발하기 때문에, 상보적인 DNA 서열 또는 RNA 가 담체상에 없으면 형광이 약하거나 없으며, 상보적인 DNA 또는 RNA 서열이 담체상에 있는 것은 형광이 강하거나 있는 것이 된다.

신호 B 의 검출에는, 형광의 경우, 담체를 포함하는 용액이 통과하는 미소한 중공관의 부분을 형광검출기의 검출부에 둔다. 현재 셀소터에 사용되고 있는 방법도 적합하게 사용할 수 있다. 발광을 검출하는 경우에는 광원이 필요치 않으나, 발광을 개시시키는 시약이나 에너지를 추가하는 장치를 장착하는 것이 바람직하다. 발광의 검출장치로는 고감도의 포톤카운터가 적합하나, 발광이 강한 경우에는 형광검출기의 광학부도 사용할 수 있다.

중공관은 가는 관으로 형성되어 있으며, 원주형인 경우에는 담체가 하나씩 원주형의 길이방향으로 통과할 수 있는 형상의 것이 바람직하다. 또한, 이 중공관에 접속하는 용액공급수단은 약간 좁게 미소공관으로 이어져 있는 중공관부를 갖는 것이 바람직하다. 서서히 좁아져 가는 용액공급수단인 관속을 통과하여 최종적으로는 한번에 2 개의 담체가 통과할 수 없는 범위의 지름으로 설정된 중공관에 담체를 연통시키는 방법이 바람직하다. 천천히 좁힘으로써 담체끼리가 막히는 것을 방지할 수 있다.

반응 후, DNA 또는 RNA 등과 혼성화한 담체나 혼성화하지 않은 담체를 중공관에 통과시키는데, 혼성화한 담체는 형광 또는 발광을 발생시키거나 혹은 형광 또는 발광강도가 백그라운드에 대하여 강한 상태가 되어 있으므로, 통과시 각 담체의 신호와 동시 또는 전후에 형광 또는 발광의 유무 또는 강약을 검출하고, 그 신호를 컴퓨터에 순서대로 입력하여 각 담체의 신호를 상당하는 염기서열에 관련지어, 검출대상으로 하는 DNA 또는 RNA 서열의 유무를 표시한다. 그 결과, 형광 또는 발광을 가진 (또는 형광 또는 발광강도가 강한) 담체에 표시되어 있는 신호에 상당하는 염기서열이 검체 중에 존재함을 검출할 수 있다. 검출부가 작기 때문에 담체 전부가 통과하는데 장시간을 요하는 경우에는, 신호와 형광 또는 발광의 검출부를 복수 사용하여, 유로에 병렬로 배치하고, 각각의 검출부가 검출한 정보를 데이터 처리수단에 집적하여 해석할 수 있다.

이 용액을 상기 담체가 하나씩 통과하는 미소한 중공관을 가진 관을 통과시켜, 통과할 때 담체가 갖는 신호 A 와 시료 중에 검출해야 할 염기서열이 존재하는경우에 담체상에 형성되는 신호 B 를 거의 동시에 검출할 수 있는데, 신호 A 와 신호 B 가 동일한 담체에서 발하는 것까지도 판별할 수 있다면 따로 따로 검출해도 된다. 디지털신호의 검출의 경우에는, 최근 디지털신호를 정확히 판독하는 장치가 많이 개발되어 있는데, 미소한 것을 판독할 수 있는 능력이 있으면 어떠한 것이라도 사용가능하다. 예를 들면, 미소한 디지털신호를 판독하는 방법으로는, 광학적으로 확대하여, 예를 들면 바코드의 터치스캐너와 같은 원리의 것으로 판독하는 방법이나, CCD 카메라 등으로 영상으로서 일단 인식하고, 확대 또는 그대로 판독장치로 판독하는 방법, 또는 미소한 레이저를 담체에 조사하여 반사광이나 투과광으로 판독하는 방법 등을 들 수 있다. CD 등에서 사용되고 있는 자기광학적인 기록의 경우에는, CD 등에서 사용되고 있는 것과 동일한 레이저로 광학적으로 판독하는 방법이 바람직하다.

본원발명에 있어서, 미리 기지량의 시료 DNA 등 검출해야 할 물질을 사용하여 검량선을 작성함으로써, 시료 중의 DNA 등 검출해야 할 물질의 농도를 정량할 수도 있다.

본원발명에 의하여 예를 들면 다음과 같은 응용이 가능하게 된다.

감염증 환자의 혈청을 검체로 하여, 담체에 각종 감염병원의 적당한 항원을 결합시키고, 표식으로서 항인체 이뮤노글로블린 항체에 형광표식 화합물 또는 발광표식 화합물을 결합시킨 것을 사용하면, 감염증 환자가 어떠한 종류의 감염증에 감염되어 있는지 1 회의 조작으로 판명된다.

알러지 환자의 혈청을 검체로 하여, 담체에 각종 알레르겐의 적당한 항원을결합시키고, 표식으로서 항인체 이뮤노글로블린 항체에 형광표식 화합물 또는 발광표식 화합물을 결합시킨 것을 사용하면, 환자가 어떠한 종류의 알레르겐에 감작되어 있는지 1 회의 조작으로 판명된다.

어느 세포의 라이세이트를 시료로 하여, 담체에 각종 단백질 또는 저분자 화합물을 결합시켜, 표식으로서 담체에 결합시킨 각종 단백질 또는 저분자 화합물에 대한 항체에 형광표식 화합물 또는 발광표식 화합물이 결합된 것을 사용하면, 담체에 결합시킨 각종 단백질 또는 저분자 화합물에 친화성이 있는 물질이 시료 중에 존재하면 표식된 항체가 반응하지 못하고, 형광표식 화합물 또는 발광표식 화합물이 결합되어 있지 않은 담체에 상당하는 결합물에 친화성이 있는 물질이 시료 중에 존재하게 되어, 세포 중의 해당 물질의 탐색이 1 회의 조작으로 판명된다. 이 경우에 있어서, 담체에 DNA 를 결합시킨 경우에는 그 DNA 에 친화성이 있는 단백질, 예를 들면 DNA 의 발현 프로모터에 결합하는 단백질 존재의 검출도 가능하다. 또한, 이 경우에 있어서, 담체상에 부여된 단백질끼리를 결합시키는 능력이 있는 물질이 시료 중에 존재하는 경우에는, 2 개의 담체가 결합자가 존재하는 면을 서로 향하여 회합한다. 이 회합도 판정할 수 있도록, 검출시 바코드 등의 방향이나 검출 시간간격을 조정함으로써 해당 물질의 검출을 행할 수 있다.

또한, 최근의 유전자 클로닝, 유전자서열 해석의 기술의 진보로 많은 신규 유전자가 새로이 취득되고 있는데, 그러한 유전자의 대부분은 그것이 어떠한 기능을 갖고 있는지는 불명확한 상태이다. 본원발명은 그러한 기능불명의 유전자서열이 코딩하는 단백질의 기능해명에도 응용이 가능하다. 예를 들면, 해당 유전자 단편을 5' 상류에 배치하고, 그 3' 하류에 녹색 형광 단백질 (이하, GFP 라 한다) 을 코딩하는 유전자서열을 연결시켜, 해당 유전자가 코딩하는 단백질을 GFP 와의 융합단백질로서 발현시킨다. 이러한 형광표식화된 기능 미지의 유전자가 코딩하는 단백질을 담체에 고정화시킨 후, 여러가지 기지 물질을 고정화시킨 바코드를 부여한 담체와 인큐베이트함으로서, 기능 미지의 유전자가 코딩하는 단백질과 결합하는 물질을 바코드와 형광 시그날을 모니터함으로써, 해당 물질과 결합하는 물질을 스크리닝할 수 있다. 즉, 본 방법을 이용함으로써, 기능 미지의 유전자서열이 코딩하는 단백질의 기능을 용이하게 해석할 수 있게 된다. 또한, 변이가 있는 GFP 를 이용하면, 그것들은 각각이 상이한 형광을 가지고 있으므로, 해석하고자 하는 목적유전자의 3' 하류에 각각의 상이한 형광을 갖는 GFP 를 결합시킴으로써, 복수의 기능 미지의 유전자의 해석을 동시에 효율적으로 행할 수도 있다.

또한, 상기예에서 사용하는 표식화합물로는 반드시 GFP 일 필요는 없으며, 유전공학적으로 유전자로부터의 단백질 발현이 가능하여, 그 자체가 어떠한 시그날을 갖고 있는 것이면 모두 이용할 수 있다. 예를 들면, 에크올린이나 루시페라제와 같은 효소도 검출계에 사용할 수 있다.

어느 단백질과 그것과 결합하는 단백질 또는 저분자 물질 또는 프로모터 등의 단백질에 작용하는 물질을 생체중의 조건에 가까운 용액 중에서 상호 작용하고, 결합한다. 예를 들면, 이 단백질을 담체에 부여해 두고 그것에 상호 작용하는 물질을 첨가하여 인큐베이트함으로서, 담체상에 이 단백질과 그에 상호 작용하는 물질의 복합체를 생성시킨다. 담체상에 결합한 단백질끼리를 결합시키는 능력이 있는 물질의 경우에는, 2 개의 담체가 결합하는 면을 서로 향하게 하여 회합한다. 생성된 복합체가 어떠한 것인가를 명확하게 하려면, 복합체에 결합하여 그 종류를 명확히 하는 표식화합물을 다시 반응시켜 표식의 유무를 검출한다. 이렇게 하여 어느 단백질과 해당 단백질과 상호 작용하는 물질이 존재하는지 아닌지를 판정할 수 있다.

본원발명은 특정 물질을 검출하는 방법, 특정 물질을 검출하는 시약 및 특정 물질을 검출하는 기기에 관한 것이다.

도 1 은 본원발명의 장치의 개략도를 나타낸다.

도 2 는 본원발명의 장치의 개략도를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

실시예 1

(1) 신호 A 를 갖는 담체의 작성

미츠비시 레이욘샤 제조, 직경 1.5mm 길이 15cm 의 폴리메틸메타아크릴레이트의 파이버를 1mol/L 의 NaOH 수용액 중에서 80℃ 에서 2 시간 인큐베이트하고, 표면을 가수분해하여 카르복실기의 Na 염으로 하고, 세척 후 그것을 일단 0.02M 염산용액으로 카르복실기로 되돌렸다. 이 파이버를 회전시키면서, TDK 레이저마커 CLM-03 형 인쇄기로 코드 128 의 바코드 01 을 직접 인쇄하였다. 바코드 인쇄부분을 절단하여 꺼내고, 길이 15mm 의 담체를 작성하였다. 마찬가지로 바코드 02 를 인쇄하여 잘라내고, 동일한 담체를 작성하였다.

(2) 담체 결합 1 가닥 DNA (담체 결합 결합자) 의 조제

바코드 01 을 갖는 담체 50 개를 HEPES 완충액 10ml 에 분산시키고, 5' 말단에 아미노기를 갖는 15 염기로 이루어지는 서열번호 1 의 염기서열을 갖는 올리고 DNA 를 1μmol 첨가하고, 다시 WSC [수용성 카르보디이미드, 화합물명 1-에틸-3-(-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 히드로클로라이드, 도진가가쿠샤 제조] 50μmol 을 첨가하여 서열번호 1 의 염기서열을 갖는 올리고 DNA 를 아미노기에 의하여 이 담체에 고정시켰다. 서열번호 1 의 염기서열을 갖는 올리고 DNA 를 결합한 담체는 1% BSA 용액 중에서 블럭킹을 행하고, 증류수로 세척하여, 서열번호 1 의 염기서열을 갖는 올리고 DNA 를 결합한 바코드 01 을 갖는 담체를 조제하였다. 서열번호 1 의 염기서열 중 5' 말단의 AAA 는 스페이서로서 삽입하고 있다.

마찬가지로 바코드 02 를 갖는 담체 50 개에 5' 말단에 아미노기를 갖는 15 염기로 이루어지는 서열번호 2 의 염기서열을 갖는 올리고 DNA 를 결합시켜 동일하게 처리하고, 서열번호 2 의 염기서열을 갖는 올리고 DNA 를 결합한 바코드 02 를 갖는 담체를 조제하였다.

(3) 형광 결합 1 가닥 DNA (형광 결합 결합자) 의 조제

서열번호 3 의 염기서열을 갖는 올리고 DNA 의 3' 말단에 FITC (플루오레세인이소티오시아나이트) 를 반응시켜 형광표식한 올리고 DNA 2nmol/ml 의 용액을 조제하였다.

(4) 검체 DNA 의 조제

서열번호 1 의 염기서열 및 서열번호 3 의 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 서열번호 4 의 염기서열을 갖는 올리고 DNA 를 조제하고, TE 완충액 (10mmol/L 트리스, 1mmol/L EDTA) 에 1nmol/ml 의 농도로 용해하여 검체용액을 조제하였다.

또한, 서열번호 1 의 염기서열 및 서열번호 3 의 염기서열에 상보적이지 않은 서열을 갖는 서열번호 5 의 염기서열을 갖는 올리고 DNA 를 조제하고, TE 완충액에 1nmol/ml 의 농도로 용해하여 검체를 조제하였다.

(5) 혼성화

상기 (2) 에서 조제한 01 과 02 의 바코드를 각각 갖는 담체를 각각 5 개씩 포함하는 0.05mol/L 의 HEPES 완충액 (pH 7, 1mol/L NaCl 을 함유) 10ml 에 상기 (3) 에서 조제한 형광 결합 1 가닥 DNA (형광 결합 결합자) 100㎕ 및 상기 (4) 에서 조제한 서열번호 4 의 염기서열을 갖는 검체 DNA, 서열번호 5 의 염기서열을 갖는 검체 DNA 또는 TE 완충액 100㎕ 을 첨가하여, 각각 50℃ 에서 완만한 교반 하에 30 분간 가온하였다.

이어서 도요로시샤 제조 셀룰로스아세테이트의 0.8㎛ 의 멤브레인필터 (C080A047A) 로 여과하고, 0.05mol/L 의 HEPES 완충액 (pH7, 1mol/L 의 NaCl 을 함유) 으로 세척하고, 다시 동일 완충액 10ml 에 담체를 분산시켰다.

(6) 검출

도 1 에 나타내는 검출장치를 작성하고, 상기 (5) 에서 조제한 각 용액을 신호검출수단 중의 중공관에 통과시키면서 바코드와 형광의 검출을 행하였다. 바코드 리더는 니치에 인텍샤 제조 핸드레이저스캐너 SL-114 형을 사용하였다. 형광검출기는 히타치 F-4000 형 형광분광광도계를 사용하여, 여기광파장 495nm, 형광파장 520nm 로 형광강도를 측정하였다. 중공관은 석영유리관으로, 내경은 2mm, 유속은 0.6cm/초로 하였다. 바코드의 신호와 형광의 신호검출의 시간차가36 초였으므로, 그 시간차에 의하여 특정 바코드를 갖는 담체상의 형광신호를 대응시켰다.

형광강도는 노이즈를 고려하면서 모니터하고 있는 형광강도의 최대값을 형광강도로 하고, 염기서열이 동등한 5 개의 바코드 02 의 담체가 갖는 형광강도의 평균을 1 로 나타내었다.

그 결과를 표 1 에 나타낸다.

바코드 신호	DNA 없음	서열번호 4 의염기서열을 갖는 DNA	서열번호 5 의 염기서열을 갖는 DNA
01	1.3	53.8	1.7
02	1.0	2.5	0.9

그 결과, 바코드 01 의 담체에 대응하는 형광값이 현저히 높은 것으로 나타났다. 바코드 01 의 결합자 DNA 의 염기서열에 상보적이지 않은 서열번호 5 의 염기서열을 갖는 DNA 검체 및 담체만 (DNA 없음) 에서는 어떠한 바코드 신호를 갖는 담체에 대응하는 형광값도 낮기 때문에, 본원발명 방법에 의하여 특이적으로 특정서열을 검출할 수 있는 것으로 나타났다.

실시예 2

실시예 1 의 (2) 에서 제조한 01 과 02 의 바코드를 갖는 담체 각각 5 개씩 포함하는 0.05mol/L 의 HEPES 완충액 (pH 7, 1mol/L 의 NaCl 을 포함한다) 10ml 에 실시예 1 의 (4) 에서 조제한 서열번호 4 의 염기서열을 갖는 검체 DNA, 서열번호 5 의 염기서열을 갖는 검체 DNA 또는 TE 완충액 100㎕ 를 첨가하여, 각각 50℃ 에서 완만한 교반 하에 30 분간 가온하였다. 이어서 SYBR Green Ⅰ 용액을 TE 완충액으로 5000 배 희석한 용액을 10ml 첨가하고, 실온에서 완만한 교반 하에 30 분간 가온한 후, 실시예 1 과 동일하게 도 1 의 장치를 이용하여 측정하였다. 또한, 형광검출에 있어서는 여기광파장 254nm, 형광파장 520nm 로 측정하였다.

형광강도는 실시예 1 과 마찬가지로, 염기서열이 동등한 5 개의 바코드 02 의 담체가 갖는 형광강도의 평균을 1 로 나타내었다.

결과를 표 2 에 나타낸다.

바코드 신호	DNA 없음	서열번호 4 의염기서열을 갖는 DNA	서열번호 5 의 염기서열을 갖는 DNA
01	2.3	38.6	3.1
02	1.0	1.5	2.4

그 결과, 바코드 01 의 담체에 대응하는 형광값이 현저히 높은 것으로 나타났다. 바코드 01 의 결합자 DNA 의 염기서열에 상보적이지 않은 서열번호 5 의 염기서열을 갖는 검체 및 담체만 (DNA 없음) 에서는 어떠한 바코드 신호를 갖는 담체에 대응하는 형광값도 낮기 때문에, 본 방법에 의하여 특이적으로 특정 서열을 검출할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 본원발명 방법에 의하여 혼성화 조작후, 담체와 미결합 표식의 분리조작을 요하지 않고 간편한 조작으로 측정할 수 있는 것으로 나타났다.

실시예 3

서열번호 3 의 염기서열을 갖는 올리고 DNA 의 5' 말단에서 6 번째 구아닌에 아미노기를 도입한 올리고 DNA 에 아크리디늄-Ⅰ (도진가가쿠샤 제조) 를 결합시켜, 2nmol/ml 의 용액을 조제하였다 (이하, 아크리디늄 표식 결합자라 약칭한다).

실시예 1 의 (2) 에서 제조한 01 과 02 의 바코드를 갖는 담체 각각 5 개씩 포함하는 0.1mol/L 의 리튬 숙시네이트 완충액 (pH 5), 20% 리튬 라우릴 술페이트, 0.4mol/L LiCl, 20mmol/L EGTA, 20mmol/L EDTA 의 500㎕ 에 실시예 1 의 (4) 에서 조제한 서열번호 4 의 염기서열을 갖는 검체 DNA, 서열번호 5 의 염기서열을 갖는 검체 DNA 또는 TE 용액 10㎕ 를 첨가하고, 추가로 상기 아크리디늄 표식 결합자 용액을 0.1pmol/L 이 되도록 첨가하여, 각각 60℃ 에서 완만한 교반 하에 30 분간 가온하여 혼성화 반응을 실시하였다. 이어서 0.6mol/L 의 테트라보레이트 완충액 (pH 8.5), 5% TritonX-100, TETRA 용액을 1500 ㎕ 첨가하고, 60℃ 에서 20 분간 가온하여 미반응의 아크리디늄 표식 결합자의 가수분해를 행하여, 시료를 넣은 반응용기를 수중에서 약 3 분간에 걸쳐 급냉시켰다.

검출은 도 1 의 신호검출수단을 도 2 로 바꾼 장치를 이용하여 실시하였다. 본 반응 후의 시료를 튜브에 통과시켜 바코드 리더로 시그널을 검출한 후, 다시 0.03% H₂O₂를 포함하는 2mol/L NaOH 용액을 도 2 에 나타내는 시약공급수단으로부터 도입하여 이 시료에 튜브중에서 혼화시켜, 즉시 루미카운터 2500 발광검출기 (마이크로텍ㆍ니치온샤 제조) 의 검출부를 이용하여 발광카운트를 측정한 결과, 01 의 바코드를 부여한 담체에서 서열번호 4 의 염기서열을 갖는 DNA 를 반응시킨 검체만 명료한 화학발광 카운트를 검출할 수 있었다.

실시예 4

(1) 신호 A 를 갖는 담체의 제조

실시예 1 (1) 과 마찬가지로, 신호 A 를 갖는 담체를 제조하였다.

(2) 담체 결합 단백질 (담체 결합 항체) 의 조제

바코드 01 을 갖는 담체 50 개를 HEPES 완충액 10ml 에 분산시키고, 히드록시숙시이미드 (간토가가쿠 제조) 를 100μmol 첨가하고, 다시 WSC (수용성 카르보디이미드, 화합물명 1-에틸-3-(-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 히드로클로라이드, 도진가가쿠샤 제조) 100μmol 을 첨가하여 카르복실기를 숙시이미드화하고, 일단 동일 완충액으로 담체를 세척 후, 즉시 항인체 이뮤노글로블린 γ쇄 항체를 1μmol/ml 함유하는 완충액 10ml 를 첨가하여 항체를 고정화하였다. 다시, 1% BSA 용액 중에서 블럭킹을 실시하고, 증류수로 세척하여 항인체 이뮤노글로블린 γ쇄 항체가 결합된 바코드 01 을 갖는 담체를 조제하였다.

마찬가지로 바코드 02 를 갖는 담체 50 개에 항인체 이뮤노글로블린 μ쇄 항체를 결합시켜 동일하게 처리하여, 항인체 이뮤노글로블린 μ쇄 항체를 결합시킨 바코드 02 를 갖는 담체를 조제하였다.

(3) 형광 결합 항원의 조제

인체 IgG 에 FITC (플루오로세인이소티오시아나이트) 를 반응시켜 형광표식한 2nmol/ml 의 용액 A 를 조제하였다. 또한 마찬가지로 인체 IgA 및 IgM 에 FITC (플루오로세인이소티오시아나이트) 를 반응시켜 형광표식한 2nmol/ml 의 용액 (각각 용액 B, 용액 C 라 한다) 을 조제하였다.

(4) 단백질의 반응

상기 (2) 에서 제조한 01 과 02 의 바코드를 갖는 담체 각각 5 개씩 포함하는 0.05mol/L 의 HEPES 완충액 (pH 7) 10ml 에 상기 (3) 에서 조제한 형광결합 항원용액 A, 100㎕ 및 용액 B, 100㎕ 를 첨가하여, 각각 37℃ 에서 완만한 교반 하에 30 분간 가온하였다.

이어서 셀룰로스 아세테이트의 0.8㎛ 의 멤브레인필터 (도요로시샤 제조, C080A047A) 로 여과하고, 0.05mol/L 의 HEPES 완충액 (pH 7) 으로 2 회 세척하고, 다시 동일 완충액 10ml 에 담체를 분산시켰다. 이를 검출검체용액 X 로 하였다.

또한, 한편, 상기 (2) 에서 제조한 01 과 02 의 바코드를 갖는 담체 각각 5 개씩 포함하는 0.05mol/L 의 HEPES 완충액 (pH 7) 10ml 에 상기 (3) 에서 조제한 형광 결합 항원 용액 C, 100㎕ 및 용액 B, 100㎕ 를 첨가하여, 각각 37℃ 에서 완만한 교반 하에 30 분간 가온하였다.

이어서 셀룰로스 아세테이트의 0.8㎛ 의 멤브레인필터 (도요로시샤 제조, C080A047A) 로 여과하고, 0.05mol/L 의 HEPES 완충액 (pH 7) 으로 2 회 세척하고, 다시 동일 완충액 10ml 에 담체를 분산시켰다. 이를 검출검체 Y 로 하였다.

(5) 검출

도 1, 도 2 에 나타내는 바와 같은 검출장치를 작성하고, 상기 (4) 에서 조제한 X, Y 각 용액을 검출장치 중의 중공관에 통과시키면서 바코드와 형광의 검출을 실시하였다. 바코드 리더는 니치에 인텍샤 제조 핸드레이저스캐너 SL-114 형을 사용하고, 형광검출기는 히타치 F-4000 형 형광분광 광도계를 사용하여, 여기광파장 495nm, 형광파장 520nm 로 측정하였다. 중공관은 석영유리관으로, 내경은 2mm, 유속은 0.6cm/초였다. 바코드의 신호와 형광의 신호검출차가 36 초였으므로, 그 시간차에 의하여 특정 바코드를 갖는 담체상의 형광신호를 대응시켰다.

그 결과를 표 3 에 나타낸다.

바코드 신호	검체 없음	검체 X	검체 Y
01	2.4	87.0	2.6
02	3.0	3.9	71.3

형광강도는 노이즈를 고려하면서 모니터하고 있는 형광강도의 최대값을 형광강도로 하여, 5 개의 바코드 02 의 담체가 갖는 형광강도의 평균을 1 로 나타내었다.

그 결과, 검체 X 의 경우, 바코드 01 의 담체에 대응하는 형광값이 현저히 높은 것으로 나타났다. 즉, 바코드 01 의 항인체 IgG 에 대응하는 인체 IgG 를 갖는 검체 X 에서는 바코드 01 의 담체에 대응하는 형광이 강하게 검출되며, 또한 검체 Y 의 경우, 바코드 02 담체에 대응하는 형광값이 현저히 높은 것으로 나타났다. 즉 바코드 02 의 항인체 IgM 에 반응하는 인체 IgM 을 갖는 검체 Y 에서는 바코드 02 의 담체에 대응하는 형광이 강하게 검출되었다. 한편, 검체 없음에서는 형광값이 높아지지 않아, 본원발명 방법에 의하여 특이적으로 특정 단백질 (항체) 에 반응하는 단백질 (항원) 을 검출할 수 있었다.

실시예 5

(1) 바코드 표식을 갖는 아비딘 결합 항체 및 마우스 이뮤노글로블린 결합 항체의 조제

실시예 1 과 동일한 방법을 사용하여 폴리메틸메타아크릴레이트의 파이버를 재료로 하여, 표면에 카르복실기를 도입하고, 바코드 01, 및 바코드 02 를 갖는 길이 15mm 의 담체를 작성하였다. 실시예 1 과 마찬가지로, 바코드 01 을 갖는 담체 50 개를 HEPES 완충액 10ml 에 분산시켜, 히드록시숙시이미드를 100μmol 첨가하고, 추가로 WSC 를 100μmol 첨가하여 카르복실기를 숙시이미드화하고, 일단 동일 완충액으로 담체를 세척 후, 즉시 아비딘 1μmol/ml 를 포함하는 완충액 10ml 를 첨가하여 아비딘을 담체에 고정화하였다. 다시, 1% BSA 용액 중에서 블럭킹을 실시하고, 증류수로 세척하여, 아비딘이 결합된 바코드 01 을 갖는 담체를 조제하였다.

마찬가지로, 바코드 02 를 갖는 담체 50 개에 마우스 이뮤노글로블린 G 를 결합시켜 동일하게 처리하여, 마우스 이뮤노글로블린 G 를 결합한 바코드 02 를 갖는 담체를 조제하였다.

(2) 검체 폴리펩티드 용액의 조제

아미노 말단에 FITC 를 갖는 아비딘 결합성 펩티드 서열을 포함하는 15 아미노산으로 이루어지는 서열번호 6 의 염기서열을 갖는 FITC 표식 폴리펩티드를 합성하고, 0.1% BSA 함유 PBS 에 2nmol/ml 의 농도로 용해하여 검체용액을 조제하였다.

또한, 동일하게 아미노 말단에 FITC 를 갖는 아비딘 결합성 펩티드 서열을 포함하지 않는 15 아미노산으로 이루어지는 서열번호 7 의 염기서열을 갖는 FITC 표식 폴리펩티드를 합성하고, 0.1% BSA/PBS 에 2nmol/ml 의 농도로 용해하여 검체를 조제하였다.

(3) 검체 폴리펩티드 용액과 담체와의 반응

상기 (1) 에서 제조한 01 과 02 의 바코드를 갖는 담체 각각 5 개씩 포함하는 0.05mol/L 의 HEPES 완충액 (pH 7) 10ml 에 상기 (2) 에서 조제한 서열번호 6 의 아미노산 서열을 갖는 검체, 서열번호 7 의 아미노산 서열을 갖는 검체, 또는 폴리펩티드를 함유하지 않는 0.1% BSA/PBS 를 100㎕ 첨가하여, 각각 37℃ 에서 완만한 교반 하에 30 분간 가온하였다.

이어서 셀룰로스 아세테이트의 0.8㎛ 의 멤브레인필터 (도요로시샤 제조, C080A047A) 로 여과하고, 0.05mol/L 의 HEPES 완충액 (pH 7) 으로 2 회 세척하고, 다시 동일 완충액 10ml 에 담체를 분산시켰다.

(4) 검출

도 1, 도 2 에 나타내는 검출장치를 작성하고, 상기 (3) 에서 조제한 각 용액을 검출장치 중의 중공관에 통과시키면서 바코드와 형광의 검출을 실시하였다. 바코드 리더는 니치에 인텍샤 제조 핸드레이저스캐너 SL-114 형을 사용하고, 형광검출기는 히타치 F-4000 형 형광분광 광도계를 사용하여, 여기광파장 495nm, 형광파장 520nm 로 측정하였다. 중공관은 석영유리관으로, 내경은 2mm, 유속은 0.6cm/초였다. 바코드의 신호와 형광의 신호검출차가 36초였으므로, 그 시간차에 의하여 특정 바코드를 갖는 담체상의 형광신호를 대응시켰다.

그 결과를 표 4 에 나타낸다.

바코드 신호	검체 없음	서열번호 6 의 아미노산 서열을 갖는 검체	서열번호 7 의 아미노산 서열을 갖는 검체
01	0.9	74.2	1.2
02	1.0	1.3	1.1

형광강도는 노이즈를 고려하면서 모니터하고 있는 형광강도의 최대값을 형광강도로 하고, 검체가 없을 때의 5 개의 바코드 02 의 담체가 갖는 형광강도의 평균을 1 로 나타내었다.

그 결과, 서열번호 1 의 검체의 경우, 바코드 01 의 담체에 대응하는 형광값이 현저히 높은 것으로 나타났다. 즉, 바코드 01 의 아비딘에 대응하는 펩티드 서열을 갖는 서열번호 1 의 검체에서는 바코드 01 의 담체에 대응하는 형광이 강하게 검출되고, 한편 서열번호 2 의 검체 및 검체 없음의 경우, 어떠한 바코드 신호를 갖는 담체의 대응하는 형광값도 높아지지 않아, 본원발명 방법에 의하여 특이적으로 특정 단백질 (아비딘) 에 반응하는 폴리펩티드 서열을 검출할 수 있었다.

본원발명에 의하여, 저가이며 범용성이 높은, 특정 염기서열을 검출하는 방법, 특정 염기서열을 검출하는 시약 및 특정 염기서열을 검출하는 기기가 제공된다.

서열표 프리텍스트

서열번호 1 - 인공서열의 설명 : 합성 DNA

서열번호 2 - 인공서열의 설명 : 합성 DNA

서열번호 3 - 인공서열의 설명 : 합성 DNA

서열번호 4 - 인공서열의 설명 : 합성 DNA

서열번호 5 - 인공서열의 설명 : 합성 DNA

서열번호 6 - 인공서열의 설명 : 합성 펩티드

서열번호 7 - 인공서열의 설명 : 합성 펩티드

Claims

용액에 현탁하고, 또한 신호 A 및 신호 B 를 검출 가능한 신호검출수단 중에 형성된 신호검출용 중공관에 관류시켰을 때, 이 중공관의 횡단면에 대하여 중복하여 이동하는 일이 없는 형상을 갖는 담체로서, 검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 물질 (이하, 결합자라 약기한다) 을 스페이서에 의하여, 또는 의하지 않고 결합시킨 식별 가능한 신호 A 를 갖는 담체와, 검출해야 할 물질을 함유하는 시료를 용액 중에 혼합하고, 검출해야 할 물질과 이 결합자를 결합시켜, 이 결합에 의하여 신호 B 를 담체상에 형성시킨 후, 이 중공관에 연통하는 용액공급수단에 의하여 이 담체현탁액을 이 중공관에 관류시키고, 이 신호검출수단에 의하여 신호 A 및 신호 B 를 검출하고, 신호 A 와 신호 B 를 관련시키는 것을 특징으로 하는 시료 중의 검출해야 할 물질의 검출방법.
제 1 항에 있어서, 검출해야 할 물질이 특정 염기서열을 갖는 물질이며, 결합자가 검출해야 할 물질의 염기서열 또는 그 부분서열과 상보적 염기서열을 갖는 물질인 검출방법.
제 2 항에 있어서, 검출해야 할 물질과 결합자의 결합이 상보적 염기서열에 의한 혼성화에 의하여 행해지는 검출방법.
제 3 항에 있어서, 식별 가능한 신호 A 가 결합자의 염기서열과 관련된 것인 방법.
제 3 항에 있어서, 담체가 결합자의 염기서열과 관련된 상호 식별 가능한 신호 A 를 가지며, 서로 다른 신호 A 를 갖는 복수의 담체의 혼합물인 방법.
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합자가 염기수 5 ~ 500 의 DNA, RNA 또는 PNA 인 방법.
제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체상의 신호 B 의 형성이 결합자의 염기서열과 검출해야 할 물질의 염기서열과의 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물을 결합시킴으로써 행해지는 방법.
제 7 항에 있어서, 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물이, 검출해야 할 물질이 갖는 결합자의 염기서열에 대한 상보서열 이외의 잔여 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 화합물과 표식화합물을 결합시킨 화합물인 방법.
제 8 항에 있어서, 검출해야 할 물질이 갖는 결합자의 염기서열에 대한 상보서열 이외의 잔여 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 화합물이 염기수 5 ~ 500 의 DNA, RNA 또는 PNA 인 방법.
제 7 항에 있어서, 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물이, 이 혼성화를 인식하는 항체와 표식화합물을 결합시킨 화합물인 방법.
제 7 항에 있어서, 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물이, 이 혼성화를 인식하는 인터칼레이터와 표식화합물을 결합시킨 화합물인 방법.
제 11 항에 있어서, 담체와 결합되어 있지 않은 표식을 갖는 화합물을 담체에서 분리하는 공정을 포함하는 방법.
제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 표식화합물이 형광물질, 발광물질, 효소, 또는 효소에 의하여 형광 또는 발광을 발하는 화합물인 방법.
제 13 항에 있어서, 담체가 형광을 발하는 물질을 결합시킨 것이며, 표식화합물이 에너지 트랜스퍼에 의하여 형광을 발하는 화합물인 방법.
제 7 항에 있어서, 혼성화를 인식 가능한 표식을 갖는 화합물이, 인터칼레이션에 의하여 신호 B 를 생성하는 화합물인 방법.
제 1 항에 있어서, 결합자가 검출해야 할 물질과 결합능을 갖는 단백질인 방법.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 가능한 신호 A 가 디지털 신호인 방법.
제 17 항에 있어서, 디지털 신호 A 가 자기적 또는 광학적인 방법.
제 17 항에 있어서, 디지털 신호가 바코드인 방법.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 중공관의 형상이 원주형이며, 또한 담체가 이 중공관의 내경보다 작은 외형을 갖는 원주형이고, 이 원주형의 길이가 이 중공관의 내경보다 큰 것인 방법.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체가 원주형 또는 구형인 방법.
제 21 항에 있어서, 담체가 자성입자를 내재하는 것인 방법.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체가 원주형으로, 외경이 직경 1㎛ ~ 2mm 이며, 길이가 10㎛ ~ 2㎝ 인 방법.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체의 비중이 0.8 ~ 2.0 인 방법.
제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체의 표면이 수지로 코팅된 것인 방법.
검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 결합자를 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 결합시킨 식별 가능한 신호 A 를 갖는 담체.
제 26 항에 있어서, 결합자가 검출해야 할 염기서열 또는 그 부분서열과 상보적 염기서열을 갖는 것인 담체.
제 26 항에 있어서, 결합자가 검출해야 할 물질에 결합능을 갖는 단백질인 담체.
제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 자성입자를 내재하는 담체인 담체.
제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 A 가 디지털 신호인담체.
제 30 항에 있어서, 디지털 신호가 바코드인 담체.
제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체가 원주형 또는 구형인 담체.
제 26 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체가 원주형으로, 외경이 직경 1㎛ ~ 2mm 이며, 길이가 10㎛ ~ 2㎝ 인 담체.
제 26 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체의 비중이 0.8 ~ 2.0 인 담체.
제 26 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 담체의 표면이 수지로 코팅되어 있는 담체.
신호검출수단, 데이터 입력수단, 데이터 처리수단 및 데이터 출력수단을 가지며, 이 신호검출수단은 검출해야 할 염기서열 또는 그 부분서열과 상보적 염기서열을 갖는 결합자를 스페이서에 의하여 또는 의하지 않고 결합시킨 담체상에 있는 적어도 2 종류의 신호 A 및 B 를 검지 가능한 신호검출기 A 및 B 를 구비하고, 이신호검출기 A 및 B 는 이 담체를 관류시키는 중공관을 가지며, 이 담체는 이 중공관의 횡단면에 대하여 중복하여 이동하지 않는 구조를 가지며, 이 데이터 처리수단은 데이터 입력수단으로부터 입력되는 담체상의 신호 A 와 관련된 검출해야 할 특정 물질을 특정하는 데이터와 신호검출수단에 의하여 검출된 신호 A 및 B 로부터, 담체상의 신호 A 와 이 특정 물질을 관련지어, 이 관련지은 데이터를 데이터 출력수단으로 출력하는 기능을 구비하는 것을 특징으로 하는 특정 물질의 검출장치.