CN1237347C - 物质的检测方法和检测仪器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及样品中待检测物质的检测方法，其特征为：作为悬浮于溶液且贯流于在可检测信号A和信号B的信号检测装置中形成信号检测用中空管时，相对于中空管的横断面具有不重复移动形状的载体，借助或不借助间隔臂使对待检测物质有结合能力的物质(以下省略为结合子)结合的带有可识别信号A的载体与含有待检测物质的样品在溶液中混合，使待检测物质与该结合子结合，通过该结合使信号B在载体上形成后，通过与该中空管连通的溶液供应装置使该载体悬浮液在该中空管中贯流，利用该信号检测装置检测信号A和信号B，将信号A和信号B联系起来。

Description

物质的检测方法和检测仪器

技术领域

本发明涉及检测特定物质的方法、检测特定物质的试剂以及检测特定物质的仪器。

背景技术

近年来，人和动物、植物、菌类以及微生物等的基因信息被解读，新的基因一个接一个地被发现。然而新基因编码的蛋白质的功能大部分还没有被阐明，在这些功能被确认之前还需要很长时间和大量劳力。有效的蛋白质功能解析方法的开发成了非常迫切的课题。

作为确认蛋白质功能的方法，是从探索与蛋白质有亲和性的物质开始，然后利用生物，从基因上控制该蛋白质的表达，对蛋白质的作用进行推测而进行的，但重要的是待检测蛋白质和物质的亲和性。这样的方法有将纯化的蛋白质固定于载体上，装到柱子中，使推测与该蛋白质有不同亲和性的物质通过柱子，对它们通过还是吸附于柱子上进行检测的方法。

近年来作为这样有效的方法开发了固定蛋白质的芯片[BioEssays，21，781(1999)]。该芯片使用半导体技术，使特定的蛋白质结合于芯片上的特定部位，然后通过使样品接触该芯片，使物质结合蛋白质，通过标记检测该结合的方法，使用半导体芯片，往往需要微细加工，另外要想检测固定于芯片上的蛋白质是通过什么彼此结合时是不可能的，另外一旦做成芯片，要想很容易地追加其它种类的蛋白质也是不可能的，就需要再制造芯片。

另外芯片目前正被用于检查基因的变异、疾病诊断、药物的效果以及副作用的抑制。然而由于基因的变异是多种多样的，需要准备多种DNA序列，检测各自杂交的DNA。使用DNA芯片的目的是解决这些问题，但存在着与上述相同的问题。

另外至于微珠阵列(ビ一ズァレィ)已知有如下的方法，即使2～3种荧光色素以不同的比例浸渍数μm大小的微珠(ビ一ズ)，该浸渍微珠发出的荧光用2个波长进行解析，将两个波长的荧光强度的比作为各个微珠的判别装置，对应蛋白质、DNA序列等待检测物质在结合或杂交后在微小的空穴捕获颗粒之后，通过荧光强度进行解析的方法[美国专利第5843767号，Analytical Chemistry，70(7)，1242(1998)]等。然而由于该方法使用开有微小空穴的特殊装置，在测定中需要很高的技术，由于通过双波长的荧光强度比的微妙差别进行识别，所以存在着判别能力低，不能适应于各种各样的蛋白质或数万种之多的DNA，以及在微小检测用微孔纳入颗粒时，存在着来自检测样品的灰尘或周边环境掉下的灰尘等混入时成为噪音等问题。就这些方法来说，还存在着借助什么装置或不借助装置蛋白质之间具有的亲和性也不能直接进行检测的缺点。

因此期待着廉价且通用性高的特定物质的检测方法的开发。

发明的公开

本发明的目的在于提供廉价且通用性高的检测特定物质的方法、检测特定物质的试剂以及检测特定物质的仪器。

本发明人发现在微小载体上加上从外部可读取的信号A，准备多种可与载体结合的具有与蛋白质或DNA等待检测物质结合能力的物质(以下称之为结合子)，使它们与载体混合，与检测样品中的物质结合，使新的信号B形成，通过比较简单的装置可大致同时检测信号A和信号B，通过对比进行解析，即使不使用蛋白质或DNA芯片等价格高的装置，也可以检测各种蛋白质和DNA序列等待检测特定物质，使得本发明完成。

就是说，根据本发明方法，通过带有信号A的载体和检测装置，即便没有高度的蛋白质或DNA芯片技术也可以通过使具有与待检测物质结合能力的物质结合于载体，获得与蛋白质或DNA芯片同样的结果。本发明的特征是即使在对很多完全不同的物质进行同样检测的情况下，准备多个带有相当于该物质种类的信号的载体简单，而且信号和序列组合可以由实验者自由地决定。而使用蛋白质或DNA芯片时，当检测样品的种类等改变时，必须要改变蛋白质或DNA芯片，要重新制造，所以无通用性，而本发明的载体可以利用以往方法使所希望的蛋白质或DNA等物质结合于蛋白质或DNA等物质不能结合的载体上来制作，廉价而且简单地对应于很多种物质。

本发明涉及到以下(1)～(36)项。

(1)样品中待检测物质的检测方法，其特征为：

(1)借助或不借助间隔臂使对待检测物质有结合能力的结合子结合的带有可识别数字信号A的载体与含有待检测物质的样品在溶液中混合，其中所述载体的形状使得，当悬浮在溶液中并贯流于信号检测用中空管时，相对于所述中空管的横断面，两个或更多个所述载体不重复移动;

(2)使待检测物质与该结合子结合，使信号B在载体上形成；

(3)使该载体悬浮液在该中空管中贯流；

(4)检测数字信号A和信号B；

(5)将数字信号A、信号B以及待检测物质联系起来；

(6)将与数字信号A和待检测物质联系起来的信号B的检测数据作为待检测物质的检测数据。

(2)上述(1)记载的检测方法，其中待检测物质是具有特定碱基序列的物质，结合子是具有与待检测物质的碱基序列或其部分序列互补的碱基序列的物质。

(3)上述(2)记载的检测方法，其中待检测物质和结合子的结合是通过互补碱基序列的杂交进行的。

(4)上述(3)记载的方法，其中可识别的信号A是与结合子碱基序列有关的信号。

(5)上述(3)记载的方法，其中载体是带有与结合子的碱基序列有关的可相互识别的信号A，含有相互不同的信号A的多个载体的混合物。

(6)上述(2)～(5)任一项记载的方法，其中结合子是碱基数为5～500的DNA、RNA或PNA。

(7)上述(3)～(6)任一项记载的方法，其中载体上信号B的形成是通过使可识别结合子碱基序列与待检测物质碱基序列杂交的带有标记的化合物结合实现的。

(8)上述(7)记载的方法，其中可识别杂交的带有标记的化合物是使具有与待检测物质含有的、与结合子碱基序列相对应的互补序列以外的剩余碱基序列互补的碱基序列的化合物和标记化合物结合的化合物。

(9)上述(8)记载的方法，其中具有与待检测物质含有的与结合子碱基序列相对应的互补序列以外的剩余碱基序列互补的碱基序列的化合物是碱基数为5～500的DNA、RNA或PNA。

(10)上述(7)记载的方法，其中可识别杂交的带有标记的化合物是使识别该杂交的抗体和标记化合物结合的化合物。

(11)上述(7)记载的方法，其中可识别杂交的带有标记的化合物是使识别该杂交的嵌入剂和标记化合物结合的化合物。

(12)上述(11)记载的方法，其中包括将没有与载体结合的带有标记的化合物与载体分离的工序。

(13)上述(7)～(12)任一项记载的方法，其中标记化合物是荧光物质、发光物质、酶或通过酶发荧光或发光的化合物。

(14)上述(13)记载的方法，其中载体是使发荧光物质结合的载体，标记化合物是通过能量转移发荧光的化合物。

(15)上述(7)记载的方法，其中可识别杂交的带有标记的化合物是通过嵌入生成信号B的化合物。

(16)上述(1)记载的方法，其中结合子是具有与待检测物质结合能力的蛋白质。

(17)上述(1)～(16)任一项记载的方法，其中可识别信号A是数字信号。

(18)上述(17)记载的方法，其中数字信号A是磁学或光学上的信号。

(19)上述(17)记载的方法，其中数字信号A是条形码。

(20)上述(1)～(19)任一项记载的方法，其中中空管的形状是圆柱形，而且载体是具有比中空管的内径小的外径、比该中空管的内径大的长度的圆柱形。

(21)上述(1)～(20)任一项记载的方法，其中载体是圆柱形或球形。

(22)上述(21)记载的方法，其中载体内部存在磁性粒子。

(23)上述(1)～(22)任一项记载的方法，其中载体是圆柱形，外径直径为1μm～2mm，长度为10μm～2cm。

(24)上述(1)～(23)任一项记载的方法，其中载体的比重为0.8～2.0。

(25)上述(1)～(24)任一项记载的方法，其中载体的表面是用树脂包被的。

(26)试样中待检测物质的检测仪器，具有信号检测装置、数据输入装置、数据处理装置和数据输出装置，其特征为：

(1)该信号检测装置具备信号检测器A和B，信号检测器A可检测该载体上的数字信号A，信号检测器B可检测该载体上的信号B；

(2)该信号检测器A和B含有使该载体贯流的中空管；

(3)该中空管的直径范围使得一次只有一个载体能通过所述中空管；和

(4)该数据处理装置具备以下功能：通过利用已经被信号检测装置检测出并已经从数据输入装置输入的数字信号A和信号B，使载体上的数字信号A与信号B和特定的待检测物质建立联系，和将该相关数据输出到数据输出装置。

以下对本发明进行详细地说明。

在本发明中作为载体是悬浮于溶液中且贯流于可检测信号A和信号B的信号检测装置中形成的信号检测用中空管时，相对于中空管的横断面没有重复移动的形状的载体，借助或不借助间隔臂与具有与待检测物质结合能力的物质(结合子)结合的带有可识别信号A的载体。

本发明中使用的载体是不溶于溶液的载体。

作为载体上的信号A只要是可分别识别无论什么信号都可以，但优选数字信号。作为数字信号只要是数字化的信号并没有特别限制，如条形码、微小的点、微细的线等的某些组合表示的信号等，优选条形码。

作为使载体带有信号A的方法没有特别限制，例如使用可以印刷微细的条形码、微小的点、微细的线等的印刷机器的方法，通过微细的激光光线使表面的反射率或折射率改变成线或点形状的方法，使用聚焦等使由条形码、或线、点构成的图形缩小到光学角度上的微细程度，使光投向的部分表面的性质发生变化，然后通过化学处理或使调色剂吸附等的物理处理加上条形码的方法，使通过光固化或分解的光敏感的聚合物含有色素或颜料、石墨等，对表面进行覆盖，然后用光照射表示信号的形状，之后进行腐蚀加上信号的方法；整个载体用光敏感树脂做成的方法；使内部存在通过磁记录法记录信号的磁性载体的方法等。

作为载体的形状只要是附带的数字信号从外部可读取的形状，并没有特别限制。特别是在贯流中空管时，相对于该中空管的横断面不是重复移动的形状者优选。从操作性、单位体积的表面积大方面来说微小者优选。特别是作为在后叙的使用中空管的检测方法中使用的具体载体的形状，相对于该中空管的形状，可以是球形、多棱柱形、圆柱形等，其中圆柱形者优选。形状即使是球形也可以使用，例如通过将多个二维条形码等信号A加到球表面上，信号A从哪一个位置都可以读取的那样的场合，或使磁性微粒子存在于载体中检测时，通过短时间用磁力阻止载体的移动，通过磁力使球的特定面朝向检测方向进行检测。

作为载体大小，例如圆柱形时，直径为1μm～2mm左右优选，长度为10μm～2cm左右优选。球状时，直径为1μm～2mm左右优选。

另外载体的比重0.8～2优选，0.85～1.5更优选，0.9～1.1特别优选。载体悬浮液和该载体的比重差在0.1以下优选，在0.05以下更优选，而在0.03以下优选。

使该载体成形的方法有在多棱形、圆柱形的模具中模塑高分子的方法，以及用各种方法切断多棱形、圆柱形纤维状物的方法。另外通过使用高分子的单体的悬浮聚合法、乳液聚合法等也可以制造粒子状载体。在为中空的圆柱形的情况，使遇热向一个方向收缩的原料和收缩少的原料的薄膜层叠，加上信号A后(裁断或不裁断)通过加热使其只有一个面收缩可以形成圆柱形。

作为遇热收缩的原料例如可举出山登理科(株)的2000年塑料科学仪器综合目录、塑料编中记载的TFE收缩管、TOF收缩管、聚四氟乙烯收缩管、FEP收缩管等细或纤维状原料或尼龙收缩管等。

载体或其表面最好是由至少难于吸附蛋白质或含有碱基序列化合物等待检测物质构成的物质。理想的载体是亲水性载体，但即使载体是疏水性的，由于最终对表面进行物理处理或被覆处理之后，也可以使载体表面的吸附减少，所以也可以使用。作为被覆的天然高分子例如有脱乙酰壳多糖、蛋白质、透明质酸等。

作为载体原料没有特别限制，但合成化合物最好，例如聚丙烯酸或其酯类、聚甲基丙烯酸或其酯类、聚醚类、聚碳酸酯、聚酯类、聚酰胺类、聚氨酸酯类、聚酰亚胺类、聚苯乙烯类、聚丁二烯、聚氯丁烯以及它们的共聚物、它们的混合物等。一般来说作为塑料或纤维材料使用的合成高分子价廉故理想。

作为用于载体的合成高分子化合物，例如侧链含有羟基或酯基、羧基、酰胺基、氨基、亚氨基、羟琥珀酸酯基、马来酰亚胺基、缩水甘油基等的合成高分子化合物比较理想。作为构成这些合成高分子的单体有诸如丙烯酸酐、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯(以上聚合后进行水解)、羟苯乙烯、乙二醇(甲基)丙烯酸酯、三乙烯醇(甲基)丙烯酸酯等含有氧化乙烯的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羟甲基酯、(甲基)丙烯酸羟丙酯等含有羟基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯等带有环氧基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯等(甲基)丙烯酸烷基酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、二乙酰丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、乙抱亚胺、丙烯酸羟琥珀酸酯等单乙烯性化合物。

作为该合成高分子化合物如由一种上述单体构成的聚合物以及由2种以上上述单体构成的共聚物。这些合成高分子化合物只要至少形成载体表面层就可以，内部即使是例如聚乙烯、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚乙烯(polyvinyl)等疏水性高分子也可以。借助或不借助间隔臂使结合子结合的表面被制备成含有官能团的表面最好。另外也可以使用通过反应变成亲水的高分子化合物。具体来说作为合适的高分子化合物的例子有甲基丙烯酸缩水甘油酯的聚合物。

该高分子化合物的合成因单体的种类和高分子化合物的种类不同而不同，但都可以通过众所周知的方法合成。

所谓的间隔臂是结合载体和结合子的分子。这样的间隔臂如聚乙二醇二缩水甘油醚链、单链DNA、单链RNA、单链肽核酸(peptidenucleic acid、缩写为PNA)、肽链等。聚乙二醇二缩水甘油醚链的长度以1～10个乙烯单元为优选，1～5个单元更优选。而使用单链DNA以及单链RNA作为间隔臂时该链的碱基序列无论什么样都可以，但碱基中优选末端含有带有氨基的腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)的碱基。这些单链DNA和单链RNA链的长度优选为3～40mer，5～20mer长更优选。肽链数优选1～50mer，2～30mer更优选。

作为结合子只要具有与待检测物质结合的能力的物质就可以，并没有特别限制，例如具有与样品中待检测物质含有的碱基序列或其部分序列互补的物质、具有结合待检测物质能力的蛋白质、多肽等。

作为待检测的碱基序列或其部分序列只要是含有碱基序列，检测上并没有特别限制，但优选来自于与各种性状有关的基因、与疾病有关的基因等的碱基序列。例如HCV基因、抑癌基因序列、wT-1。Klotho基因、GyrB基因、抗药性基因、肥胖基因等都可以。

具有与待检测物质结合能力的蛋白质可以是各种受体、针对各种抗原的抗体、凝集素蛋白质等。或者作为结合子可以使用与该受体或抗体结合的配体或抗原。作为受体如VEGF受体、IL-2受体、Fc受体等。作为抗体如抗HCV抗体、抗HBs抗体、抗HBe抗体、抗GAD抗体、抗CRP抗体、抗CEA抗体、抗C肽抗体、抗胰岛素抗体、抗BNP抗体、抗肌钙蛋白T抗体、抗氧化LDL抗体、抗TBGL抗体、抗MPB64抗体、抗端粒末端转移酶抗体等。

结合子是蛋白质时，可以将从组织提取液、菌体提取液、或从将需要的蛋白质基因导入菌体或细胞使其表达的产物等纯化的蛋白质直接作为结合子或将导入官能团后的蛋白质作为结合子。而当结合子是低分子化合物时，低分子化合物只要是含有官能团的物质可以直接作为结合子，没有官能团的加上官能团后作为结合子也可以。当结合子是DNA、RNA时，可以将在末端导入官能团后的DNA、RNA等作为结合子。

具有与样品中待检测碱基序列或其部分序列互补的碱基序列的物质的碱基数为5～500个碱基，10～300个碱基更优选，15～200个碱基特别优选，是具有与通常进行检测的碱基序列互补的碱基序列的DNA、RNA或PNA等。

结合子是具有碱基序列的物质时，该物质的碱基序列可以根据那些众所周知的序列进行设计。具有该碱基序列的物质如单链DNA链、单链RNA链、单链PNA等。另外作为本发明待检测物质含有的碱基序列如已了解到的使已知序列的内部发生点突变的基因的碱基序列也适用。此时作为与发生变异的碱基互补的结合子中的位点处于结合子的两端的3个碱基以上的内侧比较理想，最优选处于结合子中心部位。

具有与样品中待检测物质含有的碱基序列或其部分序列互补的结合子如果该结合子是DNA时，可以通过使用二氧化硅等载体的固相法使DNA的化学合成反应自动化的DNA合成仪等合成。反应底物使用碱基的氨基和核糖的5’-OH用保护基保护、使核糖的3’-OH结合二异丙基磷酰胺化物的核苷酸衍生物。作为碱基的氨基的保护基如苯甲酰基或异丁基，而作为核糖5’-OH的保护基如二甲氧三苯甲基等。根据碱基序列以氨基以及5’-OH被保护的腺嘌呤、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶、鸟嘌呤的任一个核苷酸通过3’-OH固定于固相载体上的柱子作为初始材料，用酸除去三苯甲基(形成5’-OH)后，将3’末端带有磷酰胺基的上述核苷酸衍生物加到四唑等适当的缩合剂中。通过碘和水将两者的键转变成稳定的磷酸三酯键。反复进行脱三苯甲基和缩合反应循环，最后通过氨处理脱保护基和从固相载体上切下来。通过以上操作可以合成作为结合子的DNA。另外间隔臂是单链DNA时，可以进一步连续合成该序列，其长度优选在3个碱基以上，由此可以合成带有DNA间隔臂的DNA结合子。

以下对借助或不借助间隔臂使结合子结合的带有可识别信号A的载体的制备方法进行说明。

作为使结合子例如使蛋白质结合在载体表面的方法，希望在载体表面存在侧链或末端的羧基或氨基、缩水甘油基、巯基、羟基、酰胺基、亚氨基、羟基琥珀酸酯基、马来酰亚胺基等经反应后可以化学结合的基团，当不存在这样的情况时，也可以使用通过紫外线、放射线等物理或化学处理使可以进行这些反应的基团暴露出来的方法。另外在表面上包被其它的聚合物，制作官能团也是可能的。

作为使蛋白质等结合于该载体的可反应基团的方法有一般都知道的化学方法，例如已知的作为使蛋白质的氨基或羧基结合于载体上的官能团的方法有通过碳化二亚胺等缩合和使羰基变成活性酯之后与氨基反应的方法，或将巯基或马来酰亚胺预先挂到载体上，然后使它与结合子的马来酰亚胺或巯基反应的方法以及将异硫氰酸酯基、缩水甘油基、N-羟基琥珀酰亚胺基等预先挂到载体上，使它与结合子的氨基反应的方法，可以使用上述任一种方法。另外这样做成的载体为抑制非特异性吸附或反应，也可以用BSA等处理之后进行封闭。

间隔臂是聚乙二醇二缩水甘油，结合子是蛋白质、载体表面有环氧基时，蛋白质与载体的结合可以象以下那样进行。向载体粒子中加入氢氧化铵或己二胺盐酸盐，加入的量是环氧基的10～100倍摩尔量，于60～70℃、pH10～12条件下反应0.5～2天，使粒子表面氨基化。反应后，通过离心分离洗净，根据需要通过离子交换水进行透析，除去未反应的氢氧化铵或己二胺盐酸盐。向导入了氨基的载体中加入氨基的50～200倍摩尔量的聚乙二醇二缩水甘油，于pH10～12、温度20～40℃条件下，反应0.5～2天，使间隔臂与载体结合。间隔臂带有的环氧基与蛋白质的结合按照前面方法进行。

使DNA等结合于载体表面而使用的载体可以直接使用在载体表面存在有侧链或末端的羧基或氨基、缩水甘油基、巯基、羟基、酰胺基、羟基琥珀酸酯基、马来酰亚胺基等基团经反应后可以化学结合的载体，当不存在这样的基团时，也可以使用通过放射线等物理或化学处理使可以进行这些反应的基团暴露出来的方法。另外在表面上包被其它的聚合物，形成官能团也是可能的。

使DNA等结合于该载体可反应基团的方法有一般都知道的化学方法，例如作为使DNA等结合于载体表面上的氨基或羧基的方法已知有通过碳化二亚胺等缩合和使羰基变成活性酯之后与氨基反应的方法，或将巯基或马来酰亚胺预先挂到载体上，然后使带有马来酰亚胺或巯基的载体与DNA等反应的方法以及将异硫氰酸酯基、碳化二亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基预先挂在载体上，然后使它与氨基反应的方法，可以使用上述任一种方法。另外也可以使用已知的DNA合成法使核酸的碱基一个一个地聚合在载体表面合成DNA等方法。

具体来说，根据间隔臂的种类、载体的种类和结合子的种类确定载体、间隔臂和结合子的各结合方法。例如结合子是DNA时一般都是通过使DNA结合子末端的碱基带有的氨基与载体或间隔臂的环氧基、羰基、醛基、羟基等结合来使载体和结合子结合。

间隔臂和结合子是单链DNA时，载体表面带有环氧基时，该DNA结合子和载体的结合例如按如下方式进行。

按照上述的DNA合成法合成带有DNA的间隔臂的DNA结合子以及含有与该结合子互补序列的单链DNA且没有间隔臂序列的单链DNA。然后使两者杂交，做成双链，保护含有待检测碱基序列的碱基中的氨基，使游离的间隔臂部分中的碱基中的氨基(根据需要末端可导入氨基)与载体的环氧基结合。与该载体结合后，使含有与结合子互补的序列且不含有间隔臂的单链DNA解离，可以制备目的载体结合DNA结合子。

这样做成的载体为抑制非特异性吸附或反应，所以可以BSA等处理之后进行封闭。

杂交根据需要可以在含有甲酰胺、盐、蛋白质、稳定剂、缓冲剂的水溶液中进行。以下将该溶液称为杂交液。甲酰胺浓度为0～60％。盐可以使用氯化钠、氯化钾等无机盐，柠檬酸钠、草酸钠等有机酸盐，盐浓度为0～2.0M、优选0.15～1.0M。蛋白质可以使用血清白蛋白等。稳定剂可用フィコ-ル。缓冲剂可用磷酸缓冲液，浓度为1～100mM优选。上述互补的2种DNA的杂交是在杂交液中加入分别合成的等摩尔浓度的单链DNA，于50～90℃下加热1分钟～6小时后，慢慢冷却来进行的。

这样一来制备出了带有单链多核苷酸间隔臂的部分双链DNA。

与载体结合的过程如下：用1～100mM磷酸缓冲液洗带有环氧基的载体粒子，使粒子平衡后，在与洗净用缓冲液同样的溶液中将载体和带有用上述方法制作的单链DNA间隔臂的部分双链DNA混合，于20～50℃下保温5～50小时。通过用含有1～3M氯化钠等盐类的水溶液洗，除去未反应的DNA后，对于存在于载体上的未反应的环氧基加Tris-HCl缓冲液于室温下保温50小时使其开环。这样就可制备结合于载体上的双链DNA。

通过将该结合载体双链DNA在杂交用溶液中洗净，可以制备使没有间隔臂的单链DNA解离的结合于载体的单链DNA。使用杂交溶液，于50～90℃下，经千～10万g的离心分离，反复数次进行洗净。

当间隔臂是聚乙二醇二缩水甘油醚链，结合子是DNA链，载体表面含有环氧基时，DNA结合子和载体的结合可以与上述的间隔臂和结合子是单链DNA，载体表面含有环氧基情形一样进行。

除了使用这样的合成高分子的化学固定法以外，也可以利用Haun，M和Wasi，S的方法[Anal.Biochem.，191，337(1990)]将链霉抗生物素固定于载体上后，利用链霉抗生物素和生物素的亲和性固定含有生物素的间隔臂、或末端被生物素标记的结合子本身。另外也可以利用在使载体和间隔臂、或载体与结合子各自分别结合后，利用两者的亲和性使生物学上具有亲和性的两类物质结合的方法。

在使结合子结合于带有上述信号A的载体时，使特定的结合子S1结合于带有信号A的A1载体上。同样可以使其它的结合子S2结合于带有信号A的A2载体上。例如，可以使特定结合子S1结合于分配条形码号01的载体上，其它的特定结合子S2结合于分配条形码号02的载体上。在本发明中，只要可以对应识别特定结合子和信号A，一次反应可检测的结合子的种类的上限就没有特别限定。

在本发明中由于通过使用多个借助或不借助间隔臂使含有特定碱基序列的S1、S2、…Sn的结合子分别与带有信号A的A1、A2…An的载体结合的载体，可以使特定碱基序列与信号A对应识别，所以在一次反应中可检测的碱基序列的种类上限没有特别限制。

以下就待检测物质的制备方法进行说明。用于检测的生物体样品可以是直接来自各种脏器、组织、血液等的未经纯化的样品，或是利用低分子化合物、蛋白质、DNA、RNA等核酸分子的提取、纯化方法制备的样品。

以下就含有待检测碱基序列的样品的制备方法进行说明。

例如当用于检测的样品是DNA或RNA时，可以通过众所周知的DNA或RNA提取方法从各种脏器、组织、血液等制备。分离的DNA或RNA用特定的限制酶进行酶切，制备成含有待检测特定碱基序列为5～500mer长的、优选是10～300mer长的单链DNA片段或单链RNA片段。样品中的DNA等碱基序列也可以使用通过PCR、TMA或NASBA法扩增的产物。在本发明中，在检测生物体样品中的碱基序列时只要将DNA等做成片段就可以。不只是生物体样品、含有通过合成等制造的碱基序列的化合物也可以用作样品。

样品中待检测物质与结合子的结合根据需要可以在含有盐、蛋白质、稳定剂、缓冲剂、表面活性剂等的水溶液中进行。使用的盐有氯化钠、氯化钾等无机盐，柠檬酸钠、草酸钠等有机酸盐，盐浓度为0～2.0M。使用的蛋白质有血清白蛋白等。缓冲剂有磷酸缓冲剂等，浓度优选为1～100mM。作为结合的条件可以于10～70℃下加热1～60分钟后，根据需要进行冷却来进行。

以下叙述将借助或不借助间隔臂使结合子结合的带有可识别信号A的载体与含有待检测物质的样品在溶液中混合，使待检测物质和该载体上的结合子结合，通过结合使得新的信号B在载体上形成的方法。

例如结合子是蛋白质时，可以按以下那样过程进行。信号B只要是由待检测蛋白质等物质和该载体上的蛋白质等物质(无论哪一方都是蛋白质)的结合产生的信号无论什么样的信号都可以，可以利用与振子等振动有关的共振现象直接测定重量增加；使标记化合物结合于识别待检测物质的抗体等，以该标记作为信号B的方法；以及使标记化合物结合于识别结合子的抗体等，待检测物质结合结合子时，该抗体不与结合子结合，将没有结合的抗体的标记作为信号B进行检测也是有可能的。另外结合子之间借助于蛋白等待检测物质连接的那样情况下，可以将一方含有结合子的信号A作为信号B进行检测。

作为使待检测蛋白和结合子结合的条件是在通常水溶液中蛋白不变性的条件下进行的。例如在具有pH3-11左右缓冲能力的水溶液(也可以含有表面活性剂或用于维持蛋白的功能的辅助剂)中，温度为1～90℃，优选5～60℃左右。

然后没有与结合子结合的标记化合物和样品中的残余物质根据需要可以通过离心分离操作或过滤操作等除去。

作为标记化合物如荧光物质、发光物质、酶、或通过酶产生荧光、发光的化合物等。作为荧光物质如荧光素异硫氰酸酯(盐)(以下缩写为FITC)和德克萨斯红(Texas Red)等。

作为荧光标记如吖啶鎓衍生物和钌配位化合物。具体来说，美国专利第4918192号、4946958号、4950613号或Clin.Chem.29(8)，1474-1479(1983)报道的吖啶鎓类优选。而钌配位化合物以Clin.Chem.37(9)，1534-1539(1901)报道的优选，该化合物可作为电子供体的同时，还能进行电化学发光。

以通过酶产生荧光、发光的化合物作为底物例如作为过氧化物酶的底物有氨基苯二酰肼化合物、光泽精(ルミゲニン)化合物等。或者作为碱性磷酸酶的底物如3-(2’-金刚烷基)-4-甲氧基-4-(3”磷酰氧基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷(dioxetane)盐、吖啶鎓的磷酸衍生物APS2，APS3，APS5等[以上为Lumigen Inc的发光化合物，H.Akhavan-Tafti，Z.Arghavan i等，John Wiley and Sons，Chichester，497-500(1997)]。

标记化合物是荧光物质时，使荧光物质也结合于载体上，遇到光时，也可以利用通过来自一方荧光物质的能量转移使结合的另一方荧光物质发荧光的现象进行标记。

在检测信号B时，如果是荧光，将含有载体溶液通过的微小空管部分置于荧光检测仪的检测部位。现在细胞分类器中使用的那样的方法也适用。检测荧光时虽然不需要光源，但如有必要最好加上使发光开始的试剂或提供能量的装置。作为发光的检测装置使用高灵敏度的光子计数仪比较合适，当发光强时荧光检测仪的光学部分也可以使用。

以下就诸如使借助或不借助间隔臂使含有与待检测的碱基序列或与其部分序列互补的结合子结合的带有可识别信号A的载体和含有待检测碱基序列的样品在溶液中混合，使待检测碱基序列和该载体上含有的互补碱基序列的碱基序列杂交，由此在载体上形成的新信号B的方法进行叙述。

信号B只要是通过待检测碱基序列和该载体上含有的互补碱基序列的碱基序列杂交形成的双链产生的信号无论什么样的信号都可以，可以直接测定双链的吸收，但使可识别形成双链的杂交的带有标记的化合物结合的方法比较理想。作为可识别该结合子的碱基序列和样品的碱基序列杂交的带有标记的化合物有诸如使标记化合物和与样品中特定碱基序列除去对应于结合子互补序列以外的其余碱基序列互补的碱基序列结合的化合物(以下缩写为标记结合子)，使标记化合物与识别结合子的碱基序列和样品的碱基序列的杂交的抗体结合的化合物，以及使标记化合物和识别结合子的碱基序列和样品的碱基序列的杂交的嵌入剂结合的化合物等。

杂交是使用上述的杂交溶液在严格条件下进行的。例如，将DNA结合子结合载体和含有DNA片段的样品添加到该杂交溶液中，于50～90℃，最好是在60～75℃下加热1分钟～24小时，最好是加热5～15分钟。

接下来，根据需要通过离心分离或过滤操作对以下化合物进行分离：没有杂交的、含有与样品中结合子互补的碱基序列的化合物，以及没有与带有信号A的载体形成复合物的、与样品中特定碱基序列除去对应于结合子互补序列以外的其余碱基序列互补的碱基序列结合的化合物，使标记化合物和识结合子碱基序列与样品碱基序列的杂交的抗体结合的化合物，以及使标记化合物与识别结合子碱基序列和样品碱基序列的杂交的嵌入剂结合的化合物。

使标记化合物和样品中标记结合子、标记化合物与识别结合子碱基序列和样品碱基序列的杂交的抗体结合的化合物、标记化合物与识别结合子碱基序列和样品碱基序列的杂交的嵌入剂结合的化合物等的检测可以根据该化合物的标记种类进行。

作为标记化合物如上述的荧光物质、发光物质、或通过酶产生荧光、发光的化合物等。

另外由于已杂交的部分变成了双链，如添加嵌入剂，可使其嵌入。此时如果是通过嵌入发荧光的化合物，只有存在已杂交的化合物时发荧光，所以互补碱基序列没有处于载体表面的碱基序列不显荧光，由于不必除去剩余嵌入剂或没有杂交的物质，所以特别理想。

在嵌入剂中有溴化乙锭等化合物或4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐n-水合物(DAPI)SYBR Green 1(Molecular Probe公司生产)、Pico Green(Molecular Probe公司生产)、2-甲基-4，6-双-(4-N，N-二甲氨基苯酚)吡啶鎓(MBP佳能公司生产)、2-甲基-4，6-双-(4-N，N-二甲氨基苯基)硫吡啶鎓(佳能公司生产)等嵌入剂。另外也适用若未杂交则在碱性条件下不分解发光的吖啶鎓酯等发光化合物。

使用标记结合子时，优选另外添加具有与靠近杂交部位附近的部分序列互补序列的DNA标记物之后，使它们杂交，然后除去没有杂交的标记结合子之后，标记结合子形成只与杂交的部位结合的状态。作为除去没有杂交的标记结合子的方法使用离心分离或过滤的方法比较合适。除了除去没有杂交的标记结合子的方法以外，使没有杂交的标记结合子钝化也可以。

标记化合物是荧光物质时，使荧光物质也结合于载体上，遇到光时，也可以利用通过来自一方荧光物质的能量转移而使杂交的另一方的荧光物质发荧光的现象进行标记。此时添加含有与靠近样品中DNA或RNA杂交部位附近序列互补的DNA序列的荧光物质结合的标记物，使其杂交。一遇到光，能量从一方荧光物质转移到另一方荧光物质，由于只有杂交的产物发荧光，所以如果互补的DNA序列或RNA没有在载体上，则荧光弱或没有荧光，而互补的DNA或RNA处于载体上时荧光强或有荧光。

在检测信号B时，如果是用荧光，将含有载体溶液通过的微小空管部分置于荧光检测仪的检测部位。现在细胞分类器中使用的方法也适用。检测荧光时虽然不需要光源，但如有必要加上引起发光的试剂或提供能量的装置也可以。作为发光的检测装置使用高灵敏度的光子计数仪比较好，当发光强时也可以使用荧光检测仪的光学部分。

中空管为由细管形成的圆柱形时，载体能够每次一个通过圆柱长方向的形状的中空管最好。而与中空管连接的溶液供给装置最好是具有逐渐变窄与微小空管连接的中空管。在使载体通过逐渐变窄的溶液供给装置的管中，使载体最终与直径范围被设定为一次不能通过2个载体的中空管连通的方法最好。由于逐渐变窄，可以防止载体彼此堵塞管子。

反应后，可以使与DNA或RNA等杂交后的载体和没有杂交的载体通过中空管，杂交的载体通过时，由于产生荧光或产生发光或者发光或荧光强度相对于背景很强时，与各个载体信号同时或前后对有无荧光或发光，或其强弱进行检测，将检测的信号依次输入计算机，将各个载体的信号与相应的碱基序列联系起来，显示有无检测对象DNA或RNA序列。结果可以检测出存在于检测样品中的相当于带有荧光或发光(或荧光或发光强度强)的载体显示出信号的碱基序列。由于检测部位小，要使整个载体通过需要较长时间时，可使用多个信号和荧光或发光的检测部位，将流路并列设置，将各个检测部位检测的信息汇集到数据处理装置，进行解析。

使该溶液通过具有可使上述载体一个一个通过的那样的微小中空管的管子，通过时载体带有的信号A和样品中存在待检测碱基序列时载体上形成的信号B可大致同时检测出来，信号A和信号B只要是从同一载体发出的，如果可以判别，也可以分别检测。在检测数字信号时，近年来可确切读出数字信号的仪器已经开发了很多，只要具有读出微小信号能力的仪器无论用哪一种都可以。例如作为读出微小数字信号的方法有通过光学扩大，如通过条形码触摸扫描仪那样的原理读出的方法，或通过CCD照相机等以影像一旦获得，通过放大或直接读出的方法，或用微小的激光照射到载体上后，通过反射光或透射光读出的方法等。在通过CD等使用的磁光学记录的情况下，用与通过CD等使用一样的激光进行光学读出的方法优选。

在本发明中通过使用预先已知量的样品DNA等对待检测物质做成标准曲线，也可以对样品中的DNA等待检测物质的浓度进行定量。

本发明有可能有例如以下那样的应用。

以传染病患者的血清作为检测样品，使各种传染病病原的适当抗原结合于载体上，使用作为标记使荧光标记化合物或发光标记化合物结合于抗人免疫球蛋白抗体，无论传染病患者感染什么种类的传染病通过一次操作就可判明。

以过敏患者的血清作为检测样品，使各种过敏原的适当抗原结合于载体上，使用作为标记使荧光标记化合物或发光标记化合物结合于抗人免疫球蛋白抗体，无论患者感染什么种类的过敏原通过一次操作就可判明。

以某一细胞的溶胞产物(ラィゼ-ト)作为样品，使各种蛋白质或低分子化合物结合于载体上，作为标记使用在针对结合于载体上的各种蛋白质或低分子化合物的抗体上结合了荧光标记化合物或发光标记化合物者，如果样品中存在对结合在载体上的各种蛋白质或低分子化合物有亲和性的物质，被标记的抗体就不能反应，那么样品中应该存在与没有结合荧光标记化合物或发光标记化合物的载体相当的结合物有亲和性的物质，细胞中该物质的探索通过一次操作就可判明。这种情况下，在载体上结合DNA的时候，也有可能检出与该DNA有亲和性的蛋白，例如与DNA启动子结合的蛋白质。另外在此情况下，当样品中存在使结合在载体上的蛋白质彼此有结合的物质的时候，2个载体就会在有结合子存在处面对面接合。在可以判定这种结合的检测之时，通过调整条形码的方向或检测时间间隔，可以检测该物质。

另外由于近年来基因克隆、基因序列解析技术的进步，得到了很多新的基因，其中的很多基因它们具有什么样的功能还不清楚。本发明也可以应用于那样功能不清楚的基因序列编码的蛋白质的功能解析中。例如，将该基因片段配置在5’上游之后，在其3’下游连接编码绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)(以下称为GFP)的基因序列，将该基因编码的蛋白质作为与GFP的融合蛋白表达，通过将这样荧光标记的功能未知的基因编码的蛋白质固定于载体上后，与带有固定了各种已知物质的条形码的载体温育，通过监测条形码和荧光信号，监测与功能未知基因编码的蛋白质结合的物质，对与该物质结合的物质进行筛选是有可能的。就是说，通过使用本方法，使对功能未知基因编码的蛋白质的机能很容易地进行解析成为可能。另外如果利用有变异的GFP，由于各种变异基因具有不同的荧光，通过使具有各种不同荧光的GFP结合于希望解析的目的基因的3’下游，对多个功能未知基因的解析同时有效地进行也是有可能的。

而上述例子中使用的标记化合物不一定非得用GFP，只要是有可能通过基因工程技术由基因表达蛋白，其本身带有任何信号都可以利用。例如，水母发光蛋白和虫荧光素酶那样的酶也可以用于检测系统中。

某一蛋白质和与该蛋白结合的蛋白质或低分子物质或启动子等作用于蛋白质的物质在接近生物体内条件的溶液中相互作用、结合。例如将预先该蛋白质挂在载体上，然后添加与它相互作用的物质，通过温育使载体上的该蛋白质和与其相互作用的物质生成复合体。当存在有能力使结合于载体上的蛋白质之间结合的物质时，使两个载体进行结合的面面对面会合。为了阐明生成的复合体是什么样，使结合于复合体上其种类已阐明的标记化合物进一步反应，检测有无标记。这样可以判定某一蛋白质和与该蛋白质其相互作用的物质是否存在。

附图的简单说明

图1表示本发明装置的概图。

图2表示本发明装置的概图。

实施发明的最佳方式

实施例1

(1)带有信号A载体的制作

将三菱丽阳公司生产的直径1.5m、长15cm的聚甲基丙烯酸甲酯纤维于1mol/L的NaOH水溶液中在80℃下温育2小时，对表面进行水解，成为羧基Na盐，洗净后用0.02盐酸溶液又可以将它恢复为羧基。一边使该纤维转动，一边用激光标记CLM-03型印刷机直接印刷编码128的条形码。将印有条形码部分切下，做成长15mm的载体。同样印刷条形码02，切下，做成同样的载体。

(2)载体结合单链DNA(载体结合结合子)的制备

将含有条形码01的载体50条分散于HEPES缓冲液10ml中，添加1μmol的寡DNA，该寡DNA含有由5’末端带有氨基的15个碱基组成的序列号1碱基序列。然后再添加WSC[水溶性碳化二亚胺Watersoluble carbodiimide，化合物名称为1-乙基-3-(-二甲氨基丙基)碳化二亚胺，盐酸盐，同仁化学公司制造]50μmol，将含有序列1碱基序列的寡DNA通过氨基固定于该载体上。结合了含有序列1碱基序列的寡DNA的载体在1％BSA溶液中进行封闭，用蒸馏水洗净，制备出带有结合了含有序列1碱基序列的寡DNA的条形码01的载体。序列1碱基序列中的5’末端的AAA是作为间隔臂插入的。

同样使含有由5’末端带有氨基的15个碱基组成的序列号2碱基序列的寡DNA结合于含有条形码02的载体50条上进行同样处理，制备出带有结合了含有序列2碱基序列的寡DNA的条形码02的载体。

(3)结合荧光的单链DNA(结合荧光的结合子)的制备

使FITC(荧光素异硫氰酸盐)与含有序列3碱基序列的寡DNA的3’末端反应，制备荧光标记的寡DNA 2nmol/ml的溶液。

(4)检测样品DNA的制备

制备含有与序列1碱基序列和序列3碱基序列互补的序列4碱基序列的寡DNA，溶解于TE缓冲液(10mmol/L Tris、1mmol/L EDTA)制备成浓度为1nmol/l的检测溶液。

制备含有与序列1碱基序列和序列3碱基序列不互补的序列5碱基序列的寡DNA，溶解于TE缓冲液制备成浓度为1nmol/ml的检测溶液。

(5)杂交

向含有分别带有上述(2)制备的01和02条形码的载体各5条的0.05mol/L的HEPES缓冲液(pH7、含有1mol/L NaCl)10ml中添加上述(3)制备的结合荧光的单链DNA(结合荧光的结合子)100μL和含有上述(4)制备的序列4碱基序列的检测样品DNA、含有序列5碱基序列的检测样DNA或TE缓冲液100μL，分别于50℃缓慢搅拌下，加热30分钟。

然后用东洋滤纸公司生产的醋酸纤维素的0.8μm滤膜(C080A047A)过滤，用0.05mol/L的HEPES缓冲液(pH7、含有1mol/LNaCl)洗净，再将载体分散于10ml同样的缓冲液中。

(6)检测

制作图1所示的检测装置，一边使上述(5)制备的各个溶液通过信号检测装置中的中空管，一边进行条形码和荧光的检测。条形码读出器使用日荣ィンテツク公司生产的Hand Laser Scanner SL-114型。荧光检测机使用日立F-4000型荧光分光光度计，用激发波长495nm、荧光波长520nm测定荧光强度。中空管是石英玻璃管，内径为2mm、流速为0.6cm/秒。由于条形码的信号和荧光的信号检测的时间差为36秒，按照时间差使含有特定条形码的载体上的荧光信号对应。

荧光强度考虑到噪音，将检测到的荧光强度的最大值作为荧光强度，将碱基序列一样的5个条形码02载体具有的荧光强度的平均值作为1。

表1给出了检测结果。

表1

条形码信号	无DNA	含有序列4碱基序列的DNA	含有序列5碱基序列的DNA
				01	1.3	53.8	1.7
02	1.0	2.5	0.9

结果可以确认对应于条形码01的载体的荧光值明显高。而在含有与条形码01的结合子DNA的碱基序列不互补的序列5碱基序列的DNA检测样品以及只有载体(无DNA)的样品中，与带有任一条形码信号载体对应的荧光值都低，由此表明利用本发明方法可以对特定序列进行特异检测。

实施例2

向含有分别带有实施例1(2)制备的01和02条形码的载体各5条的0.05mol/L的HEPES缓冲液(pH7、含有1mol/L NaCl)10ml中添加含有实施例1(4)制备的碱基序列4碱基序列的检测样品DNA、含有序列5碱基序列的检测样品DNA或TE缓冲液100μL，分别于50℃缓慢搅拌下，加热30分钟。然后添加用TE缓冲液稀释了5000倍的SYBR GreenI溶液10mL，于室温下缓慢搅拌，加热30分钟后，象实施例1那样使用图1的装置进行测定。而在荧光检测中，用激发波长254nm、荧光波长520nm进行测定。

荧光强度与实施例1一样将碱基序列一样的5个条形码02的载体具有的荧光强度的平均值作为1。

表2给出了检测结果。

表2

条形码信号	无DNA	含有序列4碱基序列的DNA	含有序列5碱基序列的DNA
				01	2.3	38.6	3.1
02	1.0	1.5	2.4

结果可以确认对应于条形码01的载体的荧光值明显高。而在含有与条形码01的结合子DNA的碱基序列不互补的序列5碱基序列DNA检测样品以及只有载体(无检测样品)的样品中，与带有任一个条形码信号的载体对应的荧光值都低，由此表明利用本发明方法可以对特定序列进行特异检测。另外利用本发明的方法进行杂交操作后，不需要载体和未结合标记的分离操作就可通过简便操作进行测定。

实施例3

使吖啶鎓-I(同人化学公司制造)与在具有序列3碱基序列的寡DNA的5’末端开始的第6位鸟嘌呤导入氨基的寡DNA结合，制备2nmol/ml的溶液(以下简写为吖啶鎓标记结合子)。

向含有分别带有实施例1(2)制备的01和02条形码的载体各5条的0.1mol/L的琥珀酸锂缓冲液(pH5)、20％月桂基硫酸锂，0.4mol/LLiCl，20mmol/L EGTA、20mmol/L EDTA 500l中添加含有实施例1(4)制备的具有序列4碱基序列的检测样品DNA、含有序列5碱基序列的检测样品DNA或TE缓冲液10μL，再添加上述吖啶鎓标记结合子溶液(终浓度为0.1pmol/L)，分别于60℃下缓慢搅拌，加热30分钟进行杂交反应。然后添加1500μL的0.6mol/L的四硼酸盐缓冲液(pH8.5)、5％ Triton X-100、TETRA溶液，于60℃下加热20分钟，对未反应的吖啶鎓标记结合子进行水解，将加有样品的反应容器浸入水中3分钟进行急剧冷却。

检测是使用图2的装置(由图1的信号检测装置改造的)进行的。使本反应后的样品流过管子，用条形码读出器检测信号后，再通过图2所示的试剂供给装置导入含有0.03％ H₂O₂的2mol/L NaOH溶液，在管中与该样品混合，直接利用光计数器2500发光检测器(マィクロテツク·ニチオン公司制造)的检测部分测定发光计数，在带有01条形码的载体中，只有使含有序列4碱基序列的DNA反应的样品可以检测出明显的化学发光计数。

实施例4

(1)带有信号A的载体的制作

象实施例1(1)那样制作含有信号A的载体。

(2)载体结合蛋白(载体结合抗体)的制备

将含有条形码01的载体50条分散于HEPES缓冲液10ml中，添加100μmol的羟基琥珀酰亚胺(关东化学生产)，然后再添加WSC[水溶性碳化二亚胺 Water  soluble  carbodiimide，化合物名称为1-乙基-3-(-二甲氨基丙基)碳化二亚胺，盐酸盐，同仁化学公司制造]100μmol，使羧基琥珀酰亚胺化，然后用相同缓冲液洗净载体后，立刻添加含有抗人免疫球蛋白γ抗体1μmol/ml的缓冲液10ml，使抗体固定。再于1％BSA溶液中进行封闭，用蒸馏水洗净，制备出带有结合了抗人免疫球蛋白γ链抗体的条形码01的载体。

同样使抗人免疫球蛋白μ链抗体结合于含有条形码02的载体50条上进行同样处理，制备出带有结合了抗人免疫球蛋白μ链抗体的条形码02的载体。

(3)结合荧光的抗原的制备

使FITC(荧光素异硫氰酸盐)与人IgG反应，制备荧光标记的2nmol/ml的溶液A。同样使FITC(荧光素异硫氰酸盐)与人IgA和IgM反应，制备荧光标记的2nmol/ml的溶液(分别称为溶液B、溶液C)。

(4)蛋白的反应

向含有分别带有上述(2)制备的01和02条形码的载体各5条的0.05mol/L的HEPES缓冲液(pH7)10ml中添加上述(3)制备的结合荧光的抗原溶液A 100μL以及溶液B 100μL，分别于37℃缓慢搅拌下，加热30分钟。

然后用0.8μm醋酸纤维素滤膜(东洋滤纸公司生产的C080A047A)过滤，用0.05mol/L的HEPES缓冲液(pH7)洗两次，再将载体分散于10ml同样缓冲液中。将该溶液定为检测样品X。

另外向含有分别带有上述(2)制备的01和02条形码的载体各5条的0.05mol/L的HEPES缓冲液(pH7)10ml中添加上述(3)制备的结合荧光的抗原溶液C 100μL以及溶液B 100μL，分别于37℃缓慢搅拌下，加热30分钟。

然后用0.8μm醋酸纤维素滤膜(东洋滤纸公司生产的C080A047A)过滤，用0.05mol/L的HEPES缓冲液(pH7)洗两次，再将载体分散于10ml同样缓冲液中。将该溶液定为检测样品Y。

(5)检测

制作图1、图2所示的检测装置，一边使上述(4)制备的X、Y溶液通过信号检测装置中的中空管，一边进行条形码和荧光的检测。条形码读出器使用日荣ィンテツク公司生产的Hand Laser Scanner SL-114型，荧光检测机使用日立F-4000型荧光分光光度计，用激发波长495nm、荧光波长520nm测定荧光强度。中空管是石英管玻璃管，内径为2mm、流速为0.6cm/秒。由于条形码的信号和荧光的信号检测的时间差为36秒，按照时间差使含有特定条形码的载体上的荧光信号对应。

表3给出了检测结果。

表3

条形码信号	无检测样品	检测样品X	检测样品Y
				01	2.4	87.0	2.6
02	3.0	3.9	71.3

荧光强度考虑到噪音，将检测到的荧光强度的最大值作为荧光强度，将碱基序列一样的5个条形码02载体具有的荧光强度的平均值作为1。

结果可以确认检测样品为X时，对应于条形码01的载体的荧光值明显高。即在含有与条形码01的抗人IgG反应的人IgG检测样品X中可检测出对应于条形码01的很强荧光，而检测样品为Y时，对应于条形码02的载体的荧光值明显高。即在含有与条形码01的抗人IgM反应的人IgM检测样品Y中可检测出对应于条形码02的很强荧光。由于在无样品时荧光值没有升高，所以可以利用本发明方法检测对特定蛋白质(抗体)具有特异反应的蛋白质(抗原)。

实施例5

(1)带有条形码标记的抗生物素蛋白结合载体以及鼠免疫球蛋白结合载体的制作

使用与实施例1同样的方法以聚甲基丙烯酸甲酯作为材料，向其表面导入羧基，制作带有条形码01、以及条形码02的长15mm的载体。与实施例1一样，将含有条形码01的载体50条分散于HEPES缓冲液10ml中，添加100μmol的羟基琥珀酰亚胺，然后再添加WSC 100μmol，使羧基琥珀酰亚胺化，然后用相同缓冲液洗净载体后，立刻添加含有抗生物素蛋白1μmol/ml的缓冲液10ml，使抗生物素蛋白固定于载体上。再于1％BSA溶液中进行封闭，用蒸馏水洗净，制备出带有结合了抗生素蛋白的条形码01的载体。

同样使含有条形码02的载体50条结合鼠免疫球蛋白G，进行同样处理，制备出带有结合了鼠免疫球蛋白G的条形码02的载体。

(2)检测样品多肽溶液的制备

合成由在氨基末端含有具有FITC的抗生物素蛋白结合特性的肽序列的15个氨基酸构成的序列6氨基酸序列的FITC标记多肽，溶解在含有0.1％BSA的PBS中，浓度为2nmol/ml，制备检测溶液。

另外合成由在氨基末端不含有具有FITC的抗生素蛋白结合特性的肽序列的15个氨基酸构成的序列7氨基酸序列的FITC标记多肽，溶解在0.1％BSA/PBS中，浓度为2nmol/ml，制备检测溶液。

(3)检测样品多肽溶液与载体的反应

向含有分别带有上述(2)制备的01和02条形码的载体各5条的0.05mol/L的HEPES缓冲液(pH7)10ml中添加上述(2)制备的含有序列6氨基酸序列的检测样品、含有序列7氨基酸序列的检测样品，或不含有多肽的0.1％BSA/PBS 100μL，分别于37℃缓慢搅拌下，加热30分钟。

然后用0.8μm醋酸纤维素滤膜(东洋滤纸公司生产的C080A047A)过滤，用0.05mol/L的HEPES缓冲液(pH7)洗两次，再将载体分散于10ml同样缓冲液中。

(4)检测

制作图1、图2所示的检测装置，一边使上述(3)制备的各个溶液通过信号检测装置中的中空管，一边进行条形码和荧光的检测。条形码读出器使用日荣ィンテツク公司生产的Hand Laser Scanner SL-114型。荧光检测机使用日立F-4000型荧光分光光度计，用激发波长495nm、荧光波长520nm测定荧光强度。中空管是石英管玻璃管，内径为2mm、流速为0.6cm/秒。由于条形码的信号和荧光的信号检测的时间差为36秒，按照时间差使含有特定条形码的载体上的荧光信号对应。

表4给出了检测结果。

表4

条形码信号	无DNA	含有序列6氨基酸序列的检测样品	含有序列7氨基酸序列的检测样品
				01	0.9	74.2	1.2
02	1.0	1.3	1.1

荧光强度考虑到噪音，将检测到的荧光强度的最大值作为荧光强度，将碱基序列一样的5个条形码02的载体具有的荧光强度的平均值作为1。

结果，当检测样品为序列1检测样品时，可以确认对应于条形码01的载体的荧光值明显高。即在含有与条形码01的抗生物素蛋白反应的多肽序列的序列1检测样品中可检测出对应于条形码01的很强荧光，而在序列2检测样品、以及无检测样品时，与具有任一个条形码信号的载体相对应的荧光值都没有升高，所以利用本发明方法可以对特定蛋白质(抗生物素蛋白)具有特异反应的多肽序列进行检测。

工业实用性

本发明可以提供应用方便、适用性高的检测特定碱基序列的方法，检测特定碱基序列的试剂和检测特定碱基序列的仪器。

序列表

序列1-人工序列的说明：合成DNA

序列2-人工序列的说明：合成DNA

序列3-人工序列的说明：合成DNA

序列4-人工序列的说明：合成DNA

序列5-人工序列的说明：合成DNA

序列6-人工序列的说明：合成多肽

序列7-人工序列的说明：合成多肽

                             序列表

<110>协和梅迪克斯株式会社

<120>物质的检测方法

<130>11275WO1

<140>

<141>

<150>JP 2000-029830

<151>2000-02-07

<160>7

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>15

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成DNA

<400>1

 aaattgagta gttgc                                               15

<210>2

<211>15

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成DNA

<400>2

aaaaacatct ccggg                                                15

<210>3

<211>14

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成DNA

<400>3

ggtcaggaac aaaa                                                    14

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成DNA

<400>4

ttgttcctga ccgcaactac tcaa                                          24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成DNA

<400>5

tacgatatgg ctccttggaa ctcg                                          24

<210>6

<211>24

<212>peptide

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成多肽

<400>6

Ile Ser Phe Glu Asn Thr Trp Leu Trp His Pro Gln Phe Ser Ser

1               5                  10

<210>7

<211>24

<212>peptide

<213>人工合成序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成多肽

<400>7

Ile Ser Phe Glu Asn Thr Trp Leu Trp Thr Ser Pro Phe Ser Ser

  1               5                  10

Claims (25)

1.样品中待检测物质的检测方法，其特征为：

(1)借助或不借助间隔臂使对待检测物质有结合能力的结合子结合的带有可识别数字信号A的载体与含有待检测物质的样品在溶液中混合，其中所述载体的形状使得，当悬浮在溶液中并贯流于信号检测用中空管时，相对于所述中空管的横断面，两个或更多个所述载体不重复移动；

(2)使待检测物质与该结合子结合，使信号B在载体上形成；

(3)使该载体悬浮液在该中空管中贯流；

(4)检测数字信号A和信号B；

(5)将数字信号A、信号B以及待检测物质联系起来；

(6)将与数字信号A和待检测物质联系起来的信号B的检测数据作为待检测物质的检测数据。

2.权利要求1记载的检测方法，其中待检测物质是具有特定碱基序列的物质，结合子是具有与待检测物质的碱基序列或其部分序列互补的碱基序列的物质。

3.权利要求2记载的检测方法，其中待检测物质和结合子的结合是通过互补碱基序列的杂交进行的。

4.权利要求3记载的方法，其中可识别的数字信号A是与结合子的碱基序列有关的信号。

5.权利要求3记载的方法，其中载体具有与结合子的碱基序列有关的相互识别的数字信号A，是具有相互不同的数字信号A的两个或更多个载体的混合物。

6.权利要求2～5任一项记载的方法，其中结合子是碱基数5～500的DNA、RNA或PNA。

7.权利要求3记载的方法，其中载体上的信号B的形成是通过使可识别结合子的碱基序列和待检测物质的碱基序列杂交的带有标记的化合物结合实现的。

8.权利要求7记载的方法，其中可识别杂交的带有标记的化合物是使具有与待检测物质含有的、与结合子碱基序列相对应的互补序列以外的剩余碱基序列互补的碱基序列的化合物和标记化合物结合的化合物。

9.权利要求8记载的方法，其中具有与待检测物质含有的、与结合子碱基序列相对应的互补序列以外的剩余碱基序列互补的碱基序列的化合物是碱基数为5～500的DNA、RNA或PNA。

10.权利要求7记载的方法，其中可识别杂交的带有标记的化合物是使识别该杂交的抗体和标记化合物结合的化合物。

11.权利要求7记载的方法，其中可识别杂交的带有标记的化合物是使识别该杂交的嵌入剂和标记化合物结合的化合物。

12.权利要求11记载的方法，其中包括将没有与载体结合的带有标记的化合物与载体分离的工序。

13.权利要求7～12任一项记载的方法，其中标记化合物是荧光物质、发光物质、酶或通过酶发荧光或发光的化合物。

14.权利要求13记载的方法，其中载体是使发荧光的物质结合的载体，标记化合物是通过能量转移发荧光的化合物。

15.权利要求7记载的方法，其中可识别杂交的带有标记的化合物是通过嵌入生成信号B的化合物。

16.权利要求1记载的方法，其中结合子是具有与待检测物质结合能力的蛋白质。

17.权利要求1、4和5中任一项记载的方法，其中数字信号A是磁学或光学上的信号。

18.权利要求1、4和5中任一项记载的方法，其中数字信号A是条形码。

19.权利要求1记载的方法，其中中空管的形状是圆柱形，而且载体是具有比该中空管的内径小的外径，比该中空管的内径大的长度的圆柱形。

20.权利要求1记载的方法，其中载体是圆柱形或球形。

21.权利要求1记载的方法，其中载体内部存在磁性粒子。

22.权利要求20记载的方法，其中载体是圆柱形，外径直径为1μm～2mm，长度为10μm～2cm。

23.权利要求1记载的方法，其中载体的比重为0.8～2.0。

24.权利要求1记载的方法，其中载体的表面是用树脂包被的。

25.试样中待检测物质的检测仪器，具有信号检测装置、数据输入装置、数据处理装置和数据输出装置，其特征为：

(1)该信号检测装置具备信号检测器A和B，信号检测器A可检测该载体上的数字信号A，信号检测器B可检测该载体上的信号B；

(2)该信号检测器A和B含有使该载体贯流的中空管；

(3)该中空管的直径范围使得一次只有一个载体能通过所述中空管；和

(4)该数据处理装置具备以下功能：通过利用已经被信号检测装置检测出并已经从数据输入装置输入的数字信号A和信号B，使载体上的数字信号A与信号B和特定的待检测物质建立联系，和将该相关数据输出到数据输出装置。

Images