CN101076603A - 从生物和细胞材料分离核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了从生物或细胞材料的样品分离核酸的方法,该方法使用固相结合材料并避免使用任何裂解溶液或包被层。固相结合材料的使用出人意料地允许细胞的核酸内含物被释放并直接被捕获,而且是在一个步骤中。相对于现有方法,该新方法表现出明显的简化。核酸可以以适于下游工艺的形式在5分钟以内被捕获并释放。用于本发明的方法和组合物的优选的固相材料包括季核酸结合部分。
Description
相关申请的交叉参考
[0001]本申请是申请人的下述共同未决申请的部分继续申请:2004年12月22日提交的临时申请序列第60/638,621号和2004年9月16提交的申请序列第10/942,491号,而所述申请序列第10/942,491号是申请人的下述共同未决申请的部分继续申请:2003年11月17日提交的美国申请序列第10/714,763号和2003年11月17日提交的美国申请序列第10/715,284号。
发明领域
[0002]本发明涉及用于捕获和分离核酸的简化方法,特别地从生物来源,尤其是从血液和细菌培养物的材料捕获和分离总基因组核酸。本发明还涉及用于这些方法的、含有固相结合材料的试剂盒。
背景技术
[0003]分子诊断学和分子生物学中的现代技术(包括反转录、克隆、限制性分析、扩增和序列分析),要求提取核酸。在其中发现有目标核酸的复杂的样品基质使得获取核酸的工艺被复杂化。此类样品包括例如来自组织的细胞、来自体液的细胞、血液、培养中的细菌细胞、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或从目标核酸扩增得到的溶液。样品基质经常含有显著量的污染物,在感兴趣的核酸被用于分子生物学或分子诊断技术之前所述污染物必须从所述核酸去除。
[0004]从上述细胞和组织产生的混合物中获得目标核酸的常规技术,需要使用有害化学品例如酚、氯仿以及溴化乙锭。酚/氯仿提取被用于此类步骤,以从目标核酸和多种污染物的混合物中抽提掉污染物。可选地,根据本领域中熟知的方法,使用氯化铯-溴化乙锭梯度。参见例如Molecular Cloning,由Sambrook等编著(1989),Cold Spring Harbor Press,pp.1.42-1.50。通常,该在后方法之后,通过将乙醇或2-丙醇加入水相以沉淀核酸来沉淀保留在抽提的水相中的核酸物质。通常,通过离心从溶液中移出沉淀物,并且在水或缓冲溶液中重悬以作进一步使用之前,允许干燥所得到的沉淀物小球。
[0005]已经开发出更简单和更快的方法,其采用各种类型的固相,以从细胞裂解液或核酸和污染物的其它混合物中分离核酸。此类固相包括各种形状和形式例如纤维的层析树脂、聚合物和二氧化硅基或玻璃基物质,过滤器以及包被的容器。当为小颗粒的形式时,有时提供磁芯,以帮助实现分离。
[0006]从全血DNA提取DNA是指从血中的白细胞提取。通常,处理血液,以选择性溶解红细胞,并且在沉淀或离心步骤之后,单独裂解完整的白细胞以暴露核酸内容物。消化蛋白质,并且得到的DNA用固相分离,随后用于序列多态性的测定、序列分析、RFLP分析、突变检测或其它类型的诊断试验。EP0796327B1中公开的方法涉及在特定固相支持物存在下,将含有细胞的样品如细菌培养物或全血与裂解去污剂混合。相反地,本方法省略了任何去污剂或裂解液的使用。另一方法涉及用抗体-包被的颗粒从全血选择性地捕获白细胞,接下来的步骤是裂解捕获的白细胞和将释放的核酸捕获在固体支持物上(美国专利申请公布2003/0180754A1)。
[0007]从细菌提取核酸,美国专利5,990,301公开了通过裂解从细菌或病毒分离核酸的方法,然后在阴离子交换剂上分离游离的核酸,用受控离子强度的溶液洗脱,然后用去污剂或层析载体处理,以去除内毒素。已经开发出含有固体结合支持材料的试剂盒,并可以在商业上获得,用于从细菌培养物和从人全血分离基因组的方法中。制造商提供的步骤总是详细说明,在开始核酸的移除和纯化之前必须裂解细胞。在使用固体支持物之前,有时也利用额外的沉淀步骤(例如K.Smith等,J.Clin.Microbiol.,
41(6),2440-3(2003);P.Levison等,J.Chromatography A,
827,337-44(1998))。
[0008]固相材料,在分离核酸中使用的一种类型的固相包括设计用于高效液相色谱(HPLC)的多孔硅胶颗粒。用阴离子交换剂对多孔硅胶颗粒的表面进行官能化,以在某一盐和pH条件下与质粒DNA交换。参见,例如美国专利4,699,717和5,057,426。在含有高浓度盐的水溶液中洗脱结合到这些固相材料的质粒DNA。从那里洗脱的核酸溶液在其被用于下游过程之前必须被进一步处理,以除去盐。
[0009]其它硅基固相材料包括可控孔度玻璃(controlled pore glass,CPG)、包埋有二氧化硅颗粒的滤器、硅胶颗粒、硅藻土、玻璃纤维或上述的混合物。在存在离液剂例如碘化钠(NaI)、硫氰酸胍或氯化胍的情况下,在含有核酸的样品中,每一硅基固相材料可逆地结合核酸。参见例如美国专利5,234,809、6,582,922。此类固相结合并保持核酸物质,同时该固相经受离心或真空过滤以从残余样品成分中分离基质和结合于其上的核酸物质。然后,通过用水或低盐洗脱缓冲液洗脱,从固相释放出该核酸物质。商业上可得的用于核酸分离的硅基固相材料包括例如WizardTM DNA纯化系统产品(Promega,Madison,WI)、QiaPrepTM DNA分离系统(Qiagen,Santa Clarita,CA)、High Pure(Roche)以及GFX Micro Plasmid Kit(Amersham)。
[0010]颗粒形式的聚合树脂也被广泛用于核酸的分离和纯化。羧酸盐改性的聚合颗粒(Bangs,Agencourt)是已知的。在欧洲专利申请公开第EP 1243649A1中公开了含有季铵首基(head group)的聚合物。该聚合物是具有共价连接的线性非交联聚合物的惰性载体颗粒。该类型的聚合固相一般是指触角树脂(tentacle resin)。线型聚合物掺入四烷基季铵基团。该烷基基团被指定为甲基或乙基基团(第4栏,第52-55行)。较长的烷基被认为是不期望的。
[0011]基于阴离子交换原理的其它用于结合核酸的固相材料目前正在使用中。这些包括具有DEAE首基(Qiagen)和二氧化硅-NucleoBond AX(Becton Dickinson,Roche-Genopure)的硅基材料,这基于在EP0496822B1中描述的层析载体。具有聚合的三烷基铵基团的聚合物树脂被描述于EP 1243649(GeneScan)。用于DNA分离的羧基改性聚合物可以从众多的供应商获得。在高盐条件下核酸被吸引,而在低离子强度条件下核酸被释放。
[0012]美国专利5,496,562、5,756,126、6,645,717和6,746,841公开了包括固体基质或基底的材料,所述固体基质或基底如过滤纸或膜,其用含有导致细胞裂解的去污剂、弱碱和螯合剂的组合物包被。包被层作为溶液施用,然后在基质上干燥。该包被层因此是独立加上去的层,并不是该材料的组成部分。此外,核酸通过随后的加热步骤被固定到基质。
[0013]美国6,214,618中描述了具有阳离子三甲胺外部的聚合微载体珠。该珠具有相对大的直径(75-225μm),并可以用作培养中细胞附着和生长的支持物。这些珠并未被报道用于捕获或结合核酸。
[0014]磁响应性颗粒也已经被开发用作核酸分离中的固相。设计用于核酸分离的若干种不同类型的磁响应性颗粒在本领域中是已知的,并且可以从若干来源商业获得。可逆地直接结合核酸材料的磁性颗粒包括MagneSilTM颗粒(Promega)。也已知,磁性颗粒通过共价连接的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白可逆地结合mRNA,其中抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有用于与mRNA的聚腺苷酸尾杂交的连接的寡dT尾。
[0015]已知多种类型的磁响应性硅基颗粒被用作核酸结合分离法中的固相。一个这样的类型是磁响应性玻璃珠,优选具有受控孔尺寸的磁响应性玻璃珠,其作为Magnetic Porous Glass(MPG)颗粒可以从CPG,Inc.(Lincon Park,NJ)获得;或者在美国专利第4,395,271、4,233,169、4,297,337或6,255,477号中描述的多孔磁玻璃颗粒。在核酸的结合和分离中有用的另一类型的磁性颗粒是通过将磁性材料掺入聚合的二氧化硅化合物基质中而产生的,例如德国专利DE4307262A1;美国专利5,945,525;6,027,945和6,296,937。包含包埋在具有季铵基的纤维素基质中的氧化铁纳米颗粒的磁颗粒由Cortex Biochem(San Leandro,CA)作为MagaCell-QTM商业化生产。
[0016]具有可诱导磁性性质的颗粒或珠包括过渡金属的小颗粒,例如铁、镍、铜、钴和锰,以形成金属氧化物,在磁体存在下可以使该金属氧化物具有暂时的磁性。这些颗粒被称为顺磁性的或超顺磁性的。为形成顺磁或超顺磁珠,已用在水中相对稳定的聚合物包被金属氧化物。美国专利4,554,088公开了顺磁颗粒,其包括被高分子硅烷包被层包围的金属氧化物芯。美国专利5,356,713公开了可磁化的微球体,其包括被疏水乙烯基芳族单体外壳包围的可磁化颗粒芯。美国专利5,395,688公开了已经用混合的顺磁金属氧化物-聚合物层包被的聚合物芯。另一种方法采用聚合物芯以吸收金属氧化物,例如诸如在美国专利第4,774,265号中。包含用顺磁金属氧化物层包被的聚合芯的磁性颗粒被公开于美国专利5,091,206中。然后,用另外的聚合层进一步包被该颗粒,以保护金属氧化物层并提供反应性包被层。美国专利5,866,099公开了在用于配位金属盐并包载(entrap)混合的金属氧化物的蛋白存在的情况下,通过两种金属盐的混合物共沉淀制备磁性颗粒。许多示例性金属盐对被描述。美国专利5,411,730描述了相似的方法,其中沉淀的混合的金属氧化物被俘获在葡聚糖——一种寡糖中。
[0017]用于不可逆地捕获DNA和RNA的氧化铝(alumina)(氧化铝(aluminumoxide))颗粒被公开于美国专利6,291,166中。用于固相扩增法例如PCR的结合的核酸是可得的。
[0018]在含有高浓度盐的水溶液中洗脱结合到这些固相材料的DNA。从那里洗脱的核酸溶液在其可以被用在下游过程之前必须被进一步处理以除去盐。相反,通过用水或低盐洗脱缓冲液洗脱,从固相释放结合至硅基材料的核酸。美国专利5,792,651描述了用于核酸的色谱分离的组合物,其增强核酸在细胞中转染的能力。该组合物包括含有2-丙醇和任选地含有盐和缓冲物质的水溶液。
[0019]据报道,还有其它包括含有磁微粒芯的琼脂糖或纤维素颗粒的磁性固相材料在用含有高浓度盐和聚亚烷基二醇的组合物处理后结合并保持核酸(例如美国专利5,898,071,和PCT公开WO02066993)。随后,通过用水或低离子强度缓冲液处理释放核酸。
[0020]申请人的共同未决美国申请序列第10/714,763、10/715,284、10/891,880、10/942,491和60/638,631公开了新颖的固相核酸结合材料,包括可切割的材料,和结合并释放核酸的方法,这些申请并入本文作为参考。
[0021]含有三丁基(tributylphosphonium)首基的聚合珠已经被描述用于三相体系中的相转移催化剂。由交联的聚苯乙烯制备该珠。(J.Chem.Soc.Perkin Trans.II,1827-1830,(1983))。具有通过亚烷基链和亚烷基醚链(alkylene ether chain)连接至交联的聚苯乙烯树脂的侧链三烷基基的聚合物珠也已被描述(Tomoi,et al.,Makromolekulare Chemie,187(2),357-65(1986);Tomoi,et al.,Reactive Polymers,IonExchangers,Sorbents,3(4),341-9(1985))。基于交联的聚苯乙烯树脂的混合季铵/不溶性聚合物作为催化剂和生物杀伤剂被公开(Davidescu,et al.,Chem.Bull.Techn.Univ.Timisoara,40(54),63-72(1995);Parvulescu,et al.,Reactive & FunctionalPolymers,33(2,3),329-36(1997)。
发明概述
[0022]本发明的第一个目标是提供从生物和细胞材料捕获核酸的简化的、快速的方法。
[0023]本发明的另一个目标是提供从生物和细胞材料分离核酸的简化的、快速的方法。
[0024]本发明的另一个目标是提供从生物体的全血或血组分捕获和分离核酸的方法。
[0025]本发明的另一个目标是提供从细胞培养物捕获和分离核酸的方法。
[0026]本发明的另一个目标是提供在5分钟内从生物和细胞材料捕获和分离核酸的方法。
附图简述
[0027]图1示意性地描述了根据本发明的核酸从血样的分离。
[0028]图2A是凝胶图像,显示了使用实施例2的颗粒从人血样分离的DNA。图2B是凝胶图像,显示了如图2A中分离的基因组DNA的区域的扩增。
[0029]图3是凝胶图像,显示了根据本发明方法分离的基因组DNA的区域的扩增,使用实施2或实施例7的颗粒和各种添加剂。
[0030]图4是凝胶图像,显示了使用本发明的各种颗粒从人血样分离的DNA。
[0031]图5A是凝胶图像,显示了使用实施例2或4的颗粒从人血样分离的DNA,用各种浓度的NaOH洗脱。图5B是凝胶图像,显示了如5A显示分离的基因组DNA的区域的扩增。
[0032]图6是凝胶图像,显示了使用本发明的各种颗粒从人血样分离的DNA。
发明详述
[0033]烷基(alkyl)——含有1-20个碳原子的支链、直链或环状烃基团,其可以用除了H以外的1个或多个取代基取代。本文中所使用的低级烷基是指那些含有高达8个碳的烷基基团。
[0034]芳烷基(aralkyl)——用芳基取代的烷基基团。
[0035]芳基(aryl)——含有1至5个碳环芳香环的含芳香环的基团,其可以用除了H以外的1个或多个取代基取代。
[0036]生物材料(biological material)——包括全血、抗凝全血、组织、细胞、细胞内含物、胞外核酸、病毒。
[0037]细胞材料(cellular material)——完整细胞或材料,包括组织,含有动物、植物或细菌来源的完整细胞。
[0038]细胞核酸内含物(cellular nucleic acid content)——指在细胞材料内发现的核酸,可以是基因组DNA和RNA,和其他核酸,诸如来自感染源(infectious agents)的核酸,包括病毒和质粒。
[0039]磁性颗粒(magnetic particle)——微粒或珠,其对外部的磁场有响应。该颗粒本身可以是磁性的、顺磁性的或超顺磁性的。如当使用铁磁材料时,其可以被吸引到外部磁体或被施用磁场。颗粒可以具有固体芯部分,该固体芯部分是磁响应性的,并且被一层或多层非磁响应性层包围。可选地,磁响应性部分可以是周围的层或者可以是布置在非磁响应性芯内的颗粒。
[0040]寡聚物、寡核苷酸(oligomer,oligonucleotide)——如本文所使用的,将是指含有核苷酸间磷酸二酯键(phosphodiester internucleotide linkage)和5′-端单磷酸基团的化合物。核苷酸可以是正常发生的核糖核苷酸A、C、G和U或脱氧核糖核苷酸dA、dC、dG和dT。
[0041]核酸(nucleic acid)——多核苷酸可以是DNA、RNA或合成的DNA类似物,如PNA。任何这三种链的单链化合物和双链杂化物也都在该术语的范围内。
[0042]释放、洗脱(release,elute)——通过与溶液或组合物接触,除去结合至固相材料的表面或孔的大部分材料。
[0043]样品(sample)——有或疑似含有核酸的流体。可以用在本发明的方法中的典型的样品包括体液例如血液——其可以是在收集的血样品中常见的抗凝血、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞培养物、组织提取液和类似物。其它类型的样品包括溶剂、海水、工业水样、食物样品和环境样品例如土壤或水、植物材料、原核生物来源的细胞、真核生物、细菌、质粒和病毒。
[0044]固相材料(solid phase material)——具有可以将核酸分子吸引至其上的表面的材料。材料可以是微粒、纤维、珠、膜以及其它支持物例如试管和微孔的形式。
[0045]取代的(substituted)——是指用非氢原子置换基团上的至少一个氢原子。应该注意到的是,关于取代的基团,其意图是可以存在多点取代,除非明确另外指出。
[0046]常规地,通过各种技术,从不同的样品类型提取、分离并另外纯化核酸。这些技术的许多依赖于选择性吸附到对核酸具有一些亲和力的材料的表面上。在除去其它较弱结合的成分的洗涤步骤之后,用溶液处理固相,以除去或洗脱结合的核酸(多种核酸)。
[0047]从细胞材料的一部分提取和分离基因组核酸常常是必需的。如此获得的核酸被用于随后的过程中,包括扩增、诊断试验、突变分析、基因表达型分析和克隆。通过本发明的方法从其可以分离出核酸的样品包括细菌培养物、体液、全血和血液组分、组织提取物、植物材料以及含有细胞材料的环境样品。
[0048]通过已知的方法,细胞核酸内含物的去除需要破裂或穿透细胞膜或细胞壁,以便进入细胞内部。对于该目的,现有的方法利用细胞裂解步骤。这些方法中的一种使用导致裂解的试剂。根据使用的裂解方法,有两类裂解溶液。一类是高pH的含水溶液,用于碱裂解。另一类利用一种或多种表面活性剂或去污剂来破坏细胞膜。裂解溶液也可以含有消化酶如蛋白酶,以便帮助将细胞的核酸内含物释放出来。其他方法在捕获步骤之前采用机械破坏细胞的初步步骤,以破坏细胞完整性,所述机械方法是用超声波破坏或用坚硬颗粒(hard particle)进行受控的振动来破坏细胞。
[0049]申请人已经开发出新的方法和新的固相结合材料,该新的方法和新的固相结合材料可以用于从生物和细胞材料的样品快速捕获和分离核酸,所述生物和细胞材料如病毒、质粒、胞外DNA或RNA、全血、抗凝血或细菌,该新的方法和新的固相结合材料不需要任何初步的裂解步骤。固相结合材料意料不到地允许细胞的核酸内含物在一个步骤中被捕获。因为免除了对裂解液的使用,该新方法在速度、简单性、便利和易于自动化方面表现出显著的提高。
[0050]在本发明的一个方面,提供了从生物或细胞材料的样品捕获核酸的方法,包括:
a)提供固相结合材料;和
b)将所述固相结合材料与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相结合材料。
[0051]在本发明的另一个方面,提供了从生物或细胞材料的样品分离核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相结合材料;
b)将所述固相结合材料与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相结合材料;
c)从所述固相结合材料分离所述样品;
d)任选地,洗涤所述固相结合材料;和
e)从所述固相结合材料释放结合的核酸。
[0052]不像现有的从生物样品捕获或分离核酸的方法,不使用裂解细胞的初步步骤。此外,在将样品与固相结合材料接触之前、之时或之后,不使用或不需要裂解剂、去污剂、表面活性剂或离液剂。所需要的只是将细胞材料的样品与固相接触一段短暂的时间。如下面实施例中所证明地,为了捕获显著数量的核酸,接触时间可以是3分钟或更短时间,在一些情况下少至30秒钟。从固相释放之后,捕获的数量可以容易地用常用的技术如凝胶电泳、荧光染色和PCR扩增进行检测。
[0053]为了方便起见,固相结合材料可以在水或溶液或已知不引起裂解或细胞降解的缓冲液中加入样品。然而,固相结合材料可以作为干固体直接加入到样品。
[0054]在本发明的优选方面,提供了从生物体的全血捕获核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相结合材料;和
b)将所述固相结合材料与全血的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相结合材料。
[0055]在本发明的另一优选方面,提供了捕获包含在生物体的全血的白细胞中的核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相结合材料;和
b)将所述固相结合材料与全血的样品混合一段时间,所述时间足以将来自白细胞的核酸结合至所述固相结合材料。
通过进行下面额外的步骤,上述方法可以用于分离捕获的核酸:
c)从所述固相结合材料分离所述样品;
d)任选地,洗涤所述固相结合材料;和
e)从所述固相结合材料释放结合的核酸。
[0056]与本发明的方法一起使用的、用于结合核酸的固相材料包括基质,该基质限定了它的尺寸、形状、孔隙度和机械性能,并可以是颗粒、微粒、纤维、珠、膜以及其它支持物例如试管和微孔的形式。尽管不希望受到任何特定操作理论的限制,但其可以是这样一种情形:固体支持物的表面在本方法中有效地用于将核酸直接固定出样品。本文中使用的术语“捕获核酸(capturing nucleic acid)”通常涵盖在使用条件下有效地将核酸与固相连接起来的任何方式,并且也考虑固相结合完整细胞的情形。
[0057]固相材料可以是任何合适的物质,具有从细胞材料样品如全血、细菌培养物将核酸直接结合出来的期望特性。优选的固相材料包括二氧化硅、玻璃、烧结玻璃、可控孔度玻璃、烧结玻璃、氧化铝、氧化锆、氧化钛、不溶的合成聚合物、不溶的多糖、和选自金属、金属氧化物和金属硫化物的金属材料,以及用二氧化硅、玻璃、合成的聚合物或不溶性多糖包被的磁响应性材料。示例性的材料包括用共价结合的表面官能团涂覆或官能化的二氧化硅基材料,所述共价结合的表面官能团用于破坏细胞并吸引核酸。也包括被合适地表面官能化的碳水化合物基材料,和具有该表面官能度的聚合材料。申请人的共同在审美国申请序列第10/714,763、10/715,284、10/891,880、10/942,491和60/638,631描述了众多具体的材料和它们的制备。
[0058]在一个实施方案中,所述材料在表面或表面附近还包括共价连接的核酸结合部分,其允许捕获和结合变化长度的核酸分子。表面不仅指固相结合材料的外周,而且指固相结合材料内任何可及的有孔区域的表面。申请人的共同在审美国申请序列第10/714,763、10/715,284、10/891,880、10/942,491和60/638,631描述了许多具体的材料和它们的制备。
[0059]在本发明的另一方面,提供了从生物或细胞材料的样品捕获核酸的方法,由下述组成:
a)提供固相:包括连接到核酸结合部分的基质;
b)将所述固相与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相。
[0060]在本发明的另一方面,提供了从生物或细胞材料的样品分离核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相,包括:连接到核酸结合部分的基质;
b)将所述固相与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相结合材料;
c)从所述固相分离所述样品;
d)任选地,洗涤所述固相;和
e)从所述固相释放结合的核酸。
[0061]在另一个实施方案中,所述材料还包括在表面上或表面附近的非共价缔合的核酸结合部分,其允许捕获并结合变化长度的核酸分子。该非共价缔合的核酸结合部分通过静电吸引到表面上带相反电荷的残基而与固体基质缔合,或通过与表面的疏水引力而与固体基质缔合。
[0062]这些携带共价或非共价连接的核酸结合基团的材料的基质材料可以是任何合适的物质。优选的基质材料选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物、不溶的多糖、和选自金属、金属氧化物和金属硫化物的金属材料,以及用二氧化硅、玻璃、合成的聚合物或不溶性多糖包被的磁响应性材料。示例性的材料包括用共价结合的表面官能团包被或官能化的二氧化硅基材料,所述共价结合的表面官能团用于破坏细胞并吸引核酸。也包括被合适地表面官能化的碳水化合物基材料,和具有该表面官能度的聚合材料。申请人的共同在审美国申请序列第10/714,763、10/715,284、10/891,880、10/942,491和60/638,631描述了众多具体的材料和它们的制备。充当核酸结合基团的表面官能团包括能够破坏细胞的结构完整性并使核酸吸引到固体支持物上的任何基团。此类基团不受限制地包括羟基、硅烷醇、羧基、氨基、铵、季铵盐和季盐和三元锍盐类材料,如下所述。掺入氨基基团的固相材料在第一低pH中被质子化以结合核酸,在第二较高pH中、在释放结合的核酸期间被去质子化,例如在欧洲专利说明书EP01036082B1中公开的材料,被认为在本发明中有用的固相材料的范围内。
[0063]对于许多应用而言,优选地是,固相材料是颗粒形式。优选地,颗粒的尺寸小于约50μm,更优选地,少于约10μm。小颗粒更容易分散在溶液中并具有较高的表面/体积比。较大的颗粒和珠在利用重力沉降或离心的方法中也是有用的。固相优选还可以包括磁响应部分,其通常将是磁微颗粒的形式——可以被磁场吸引并操作的颗粒。此类磁微颗粒包括磁金属氧化物或金属硫化物芯,其通常被吸附性或共价性结合的层包围,该吸附性或共价性结合的层共价结合核酸结合基团,从而包覆表面。磁金属氧化物芯优选是氧化铁或硫化铁,其中铁是Fe2+或Fe3+或两者。如美国4,654,267所述,磁性颗粒也可以通过在多孔聚合物存在下沉淀金属颗粒以包载磁响应性金属颗粒而形成。可制备的磁性金属氧化物从而包括Fe3O4、MnFe2O4、NiFe2O4和CoFe2O4。其它磁性颗粒也可以如美国5,411,730所述通过在寡糖葡聚糖存在下沉淀金属氧化物颗粒以包载磁响应性金属颗粒而形成。前述的美国专利5,091,206公开了另一种磁性颗粒。该颗粒包括用顺磁性金属氧化物层包被的聚合芯颗粒以及另外的聚合层,以保护金属氧化物层并提供反应性包被层。含有氯甲基化的Merrifield树脂的磁铁矿(四氧化三铁,magnetite)的制备被描述于出版物(Tetrahedron Lett.,40(1999),8137-8140)中。
[0064]商业可得的磁性二氧化硅或磁性聚合颗粒可以被用作制备在本发明中有用的磁固相结合材料的原材料。具有表面羧基基团的聚合颗粒的合适类型已知为商品名SeraMagTM(Seradyn)和BioMagTM(Polysciences and Bangs Laboratories)。二氧化硅磁性颗粒的合适类型已知为商品名MagneSilTM(Promega)。在表面上具有羧基或氨基的二氧化硅磁性颗粒可以从Chemiceil GmbH(Berlin)获得。
[0065]根据本发明,通过将裸露的或包被的金属芯与有机连接体基团连接,申请人已经制备了磁响应性颗粒结合材料,所述有机连接体基团连接着核酸结合(nucleic acid binding,NAB)部分。当使用包被的金属芯时,方便的包被的芯的是硅包被的磁芯或玻璃包被的磁芯。优选的磁响应性金属芯由磁铁矿Fe3O4提供。磁铁矿可以在商业上获得,或根据普遍已知的方法通过铁(II)和铁(III)盐在碱溶液中的反应制备而得。
[0066]在一个末端含有三烷氧基硅烷基团的连接体基团可以被连接到金属材料或包被的金属材料如二氧化硅或玻璃包被的磁颗粒的表面。优选的三烷氧基硅烷化合物具有式R1-Si(OR)3,其中R是低级烷基,以及R1是有机基团,选自直链、支链和环,并包括1至100个原子。原子优选地选自C、H、B、N、O、S、Si、P、卤素和碱金属。代表性的R1基团是3-氨丙基、2-氰乙基和2-羧乙基,以及含有可裂解部分的基团,如下面更详细描述的。在优选的实施方案中,三烷氧基硅烷化合物包括可裂解中心部分和反应性基团末端部分,其中,反应性基团通过与叔胺、叔膦或有机硫化物反应在一个步骤中可以转换成四元或三元盐。
[0067]已经发现,在使用氟化物离子的过程中,此连接体基团可以被安置在金属颗粒和玻璃或二氧化硅包被的金属颗粒的表面上。反应可以在有机溶剂中进行,有机溶剂包括低级醇和芳香族溶剂,包括甲苯。合适的氟化物源在这样的有机溶剂中具有可观的溶解性,并包括氟化铯和氟化四烷基铵盐。
[0068]包含在可用于本发明的方法中的固相结合材料中的NAB基团似乎具有双重目的。NAB基团吸引并结合具有各种长度和碱基组成或碱基序列的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。它们也具有一些将核酸从细胞包膜中释放出来的能力。核酸结合基团包括例如羧基、胺和三元或四元基(ternary or quaternary onium groups)。胺基团可以是NH2、烷基胺以及二烷基胺基团。优选的NAB基团是三元或四元基,包括三烷基季铵基团(-QR3 +)、基(-QR3 +)包括三烷基或三芳基或混合的烷基芳基基团、以及三元锍基(-QR2 +)。固相可以含有一种以上类型的核酸结合基团,如本文中所述。含有其中R基团是具有至少4个碳的烷基的三元或四元基-QR2 +或-QR3 +的固相材料在结合核酸中特别有效,但少至1个碳的烷基基团也如芳基那样有用。此类固相材料以高的韧度保持结合的核酸并在现有技术中已知用于洗脱的大多数条件下阻止核酸的去除或洗脱。大部分已知的低和高离子强度的洗脱条件对于除去结合的核酸是无效的。不同于含有DEAE和PEI基团的传统阴离子交换树脂,三元或四元固相材料保持带正电,无论反应介质的pH如何。
[0069]某些优选的实施方案利用固相结合材料,在其中,NAB基团通过可以被选择性断裂的键连接到基质。断裂该连接有效地将任何结合的核酸与固相“分开(disconnect)”。连接可以通过任何化学、酶法、光化学或特异性断裂可裂解接头中的键(许多键)但也不破坏感兴趣的核酸的其他方法而裂解。此类可裂解固相材料包括固体支持部分(solid support portion),所述固体支持部分包括选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物、不溶多糖和金属材料的基质,所述金属材料选自金属、金属氧化物和金属硫化物。用于吸引和结合核酸的核酸结合(NAB)部分通过可裂解的连接体部分连接到固体支持物的表面。
[0070]在一个优选的实施方式中,NAB是式QR2+X-的三元基,或四元基QR3+X-,如上所述。
[0071]可裂解连接体部分优选选自直链、支链和环状的有机基团,并包括1至100个原子。该原子优选选自C、H、B、N、O、S、Si、P、卤素和碱金属。示例性的连接体基团是通过水解裂解的水解可裂解基团。羧酸酯和羧酸酐、硫代酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸乙酯、二酰亚胺、磺酰胺和磺酰亚胺是代表性的,如同磺酸酯也是代表性的。在一个优选的实施方案中,可裂解连接用含水碱性溶液处理。连接体基团的另一个示例性类别是经受还原性裂解的那些基团,如二硫(S-S)键,所述二硫键通过硫醇例如乙硫醇、巯基乙醇和DTT被裂解。另一个代表性基团是含有过氧化物(O-O)键的有机基团。过氧化物键可以通过硫醇、胺和膦裂解。
[0072]另一代表性的基团是光化学可裂解连接体基团如硝基取代的芳族醚和酯,具有下式。
其中Rd为H、烷基或苯基。邻硝基苄基酯根据下面熟知的反应被紫外光裂解。
[0073]另一代表性的可裂解基团是可酶法裂解连接体基团。示例性的基团包括通过酯酶和水解酶裂解的酯、通过蛋白酶和肽酶裂解的酰胺和肽、通过糖苷酶裂解的糖苷基团。
[0074]另一代表性的可裂解基团是可裂解的1,2-二氧杂环丁烷(dioxetane)部分。此类材料包含可以被热分解或由化学剂或酶剂引发成片段的二氧杂环丁烷部分。除去保护基以产生氧阴离子,促进二氧杂环丁烷环的分解。根据熟知的方法,通过裂解过氧化物的O-O键以及C-C键而发生断裂(fragmentation)。可裂解的1,2-二氧杂环丁烷描述于无数专利和出版物中。代表性的例子包括美国专利4,952,707、5,707,559、5,578,253、6,036,892、6,228,653和6,461,876。
可选地,连接的基可以被结合到芳基Ar或结合到可裂解的基团Y。进一步可选地,与固相和三元或四元基的连接从所示出的方向被颠倒。
[0075]另一可裂解的连接体基团是可以转化成不稳定的1,2-二氧杂环丁烷部分的多电子的C-C双键。在该双键上的至少一个取代基利用O、S或N原子被结合到双键上。多电子双键与单态氧的反应产生不稳定的1,2-二氧杂环丁烷环基团,其在环境温度下自发断裂(fragment),以产生两个羰基片段。由多电子的双键形成的不稳定的1,2-二氧杂环丁烷描述于无数专利和出版物中,例子是A.P.Schaap和S.D.Gagnon,J.Am.Chem.Soc.,104,3504-6(1982);W.Adam,Chem.Ber.,116,839-46,(1983);美国专利5,780,646。
[0076]具有可裂解连接体基团的另一组固相材料具有乙烯酮二硫缩醛(ketenedithioacetal)作为可裂解部分,如在PCT公布WO 03/053934中所公开。乙烯酮二硫缩醛经受通过与过氧化物酶和过氧化氢的酶氧化导致的氧化性裂解。
可裂解部分具有所示的结构,包括在9,10-二氢化吖啶环上具有取代的类似物,其中Ra、Rb和Rc每一个都是有机基团,该有机基团含有1至约50个选自C、N、O、S、P、Si和卤素原子的非氢原子,并且其中Ra和Rb可以被接合在一起而形成环。无数的其他可裂解基团对技术人员而言将是明显的。
[0077]在本发明的另一个方面,提供了从生物或细胞材料的样品捕获核酸的方法,由下述组成:
a)提供固相,包括:通过可选择性裂解的键连接有核酸结合部分的基质;
b)将所述固相与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相。
[0078]还提供了从生物或细胞材料的样品分离核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相包括:
通过可选择性裂解的键连接有核酸结合部分的基质;
b)将所述固相与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相;
c)从所述固相分离所述样品;和
d)任选地,洗涤所述固相;和
e)通过选择性裂解所述连接体,从所述固相释放结合的核酸。
[0079]在优选的实施方案中,所述固相包括:选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基质,和结合至所述基质表面上的基,所述基选自其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2 +X-的三元锍基,其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3 +X-的季铵基,以及其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季基PR3 +X-,并且其中X是阴离子。
[0080]将固相与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合的步骤,涉及将样品材料与固相结合材料混合,和任选地,机械搅拌混合物以将固相均匀分散在样品体积内,所用时间为有效地破坏细胞材料并将核酸结合至固相。样品的所有核酸内含物不必都结合至固相,然而尽可能多地结合是有利的。对样品/固相混合物的搅拌可以采用任何便利的形式,包括摇动、使用机械振荡器或摇摆器、旋转、超声波搅拌和类似形式。在该步骤中结合核酸所需要的时间通常在几秒钟至少数几分钟的水平,但是可通过常规实验进行实验性地检验。
[0081]从固相分离样品的步骤可以通过下列方法完成:过滤、重力沉降、倾析、磁力分离、离心、真空吸气、过压空气或其它气体以使液体通过多孔膜或例如过滤毡片(filter mat)。该样品中除了核酸之外的组分在该步骤被除去。就其它组分的除去不完全而言,可以进行一种或多种洗涤,以帮助它们完全被去除。用于去除样品组分如盐、生物或细胞碎片、蛋白质和血红蛋白的洗涤剂包括水和含水缓冲溶液并可以含有表面活性剂。
[0082]从固相释放结合的核酸的步骤,涉及将所述固相材料与溶液结合以从所述固相释放结合的核酸。溶液应该溶解并充分保护释放的核酸。该溶液可以是试剂组合物,其包括pH约7-9的含水缓冲液,任选地含有0.1-3M的缓冲盐、金属卤化物或醋酸盐以及任选地含有0.1-50%的有机助溶剂、或表面活性剂。
[0083]用于裂解后从固相释放核酸的试剂可以选择性的是强碱含水溶液。浓度至少为10-4M的碱金属氢氧化物或氢氧化铵的溶液有效地将核酸从裂解的固相切割和洗脱出来。强碱性溶液可用于联合固相结合材料,在其中,核酸结合部分通过基团被连接到基质,所述基团可以通过共价键的断裂(breakage)而被片断化(fragmented)或裂解(cleaved)。此类材料描述于下和前述共同在审美国专利申请序列第10/714,763、10/715,284和10/891,880中。释放步骤可以在室温下进行,但是可以使用任何便利的温度。洗脱温度对于本发明分离核酸的方法的成功并不是至关重要的。优选环境温度,但是在一些情况下,高温可以增加洗脱速度。
[0084]固相核酸捕获的方法可以投入许多用途中。如在下面的特定实施例中显示地,单链和双链核酸都可以被捕获并释放。DNA、RNA和PNA可以被捕获并释放。
[0085]本方法的优选用途是从全血分离DNA。如上面背景部分描述,在全血中从白细胞提取DNA通常或者是难以自动化的繁琐的、多步骤的过程,或者在裂解条件下利用固体支持物。本发明的方法克服了现有方法的局限性。该方法操作简单,仅仅需要将血样品与固相结合材料混合一短暂的时间,以将核酸内含物捕获到固相材料。整个过程可以在5分钟内手工进行。当固相材料是颗粒或微粒的形式时,该方法是特别有效和快捷的。尽管简单且所需的时间短,但是大部分量的核酸被捕获。
[0086]这些方法的重要优势是它们与许多下游的分子生物学过程相容。在很多情况下,通过本方法分离的核酸可以在进一步的过程中被直接使用。扩增反应例如PCR、美国专利5,998,175中描述的多寡聚体连接(Ligation of Multiple Oligomers,LMO)、以及LCR可以采用此类核酸洗脱液。通过常规技术、尤其是从细菌培养物或从血样中分离核酸,采用沉淀步骤,这通过加入高体积百分比的低分子量醇进行。然后,在使用前,沉淀的物质必须被分离、收集并重溶于合适的介质中。通过使用本方法,从本发明的固相结合材料洗脱核酸,这些步骤可以被免除。将含有释放的核酸的溶液直接用于核酸扩增反应中,从而用聚合酶或连接酶-介导的反应扩增核酸或其片段的量,这是优选的实践。
[0087]在前面的部分中已经描述了许多不同的固相结合材料,在随后的具体实施例的要求保护的方法中示出了众多具体的示例性材料。本领域技术人员将能够通过本文中描述的方法的常规应用来确定合适的材料。
[0088]本发明还涉及用于上述方法的含有固相结合材料的试剂盒。试剂盒包括固相结合材料和用于从固相释放核酸的试剂。试剂盒也可以包括其他组分,例如洗涤缓冲液、稀释剂或使用说明书。
[0089]所述固相结合材料能够在不使用裂解溶液或包被裂解剂的情况下从生物或细胞材料直接捕获核酸。该捕获核酸的用途不需要任何初步的裂解步骤,并允许生物或细胞材料的核酸内含物在一个步骤中被捕获。在一个实施方案中,固相材料是微粒材料或磁响应性微粒材料。
实施例
[0090]当存在于下面的实施例中时,结构图旨在仅仅说明固相材料的可裂解连接体部分。所述图不代表固相材料的完整定义。
实施例1.4′-羟苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯的合成。
[0091]将100.9g 4-氯甲基苯甲酸和1.2L的亚硫酰氯装载入3L瓶中。回流反应4小时,之后,在减压下除去亚硫酰氯。通过加入CH2Cl2和减压下蒸发,除去残留的亚硫酰氯。
[0092]向含有113.1g的4-氯甲基苯甲酸氯化物的3L瓶中装载入98.17g 4-羟基苯硫酚和1.5L CH2Cl2。吹扫入(purged in)氩,并加入67.75mL吡啶。在搅拌过夜后,用1L CH2Cl2稀释反应混合物并用总共5L水萃取。水层用CH2Cl2反萃取。合并的CH2Cl2溶液经硫酸钠干燥,并浓缩至固体。用500mL CH2Cl2洗涤该固体,过滤并风干。1H NMR(丙酮-d6):δ4.809(s,2H),6.946-6.968(d,2H),7.323-7.346(d,2H),7.643-7.664(d,2H),8.004-8.025(d,2H)。
实施例2.用聚甲基丙烯酸酯连接体官能化的、并含有三丁基基和可裂解芳基硫酯键(arylthioester linkage)的磁性二氧化硅颗粒的合成。
[0093]将磁性的羧酸官能化的二氧化硅颗粒(Chemicell,SiMag-TCL,1.0meq/g,1.5g)置于20mL亚硫酰氯中并回流4小时。减压下除去过量的亚硫酰氯。将该树脂重悬于25mL CHCl3中并通过超声分散该悬浮液。蒸发溶剂并重复超声洗涤处理。真空下干燥该颗粒,待进一步使用。
[0094]酰基氯官能化的颗粒与388mg二异丙基乙胺一起被悬于38mL CH2Cl2中。加入4′-羟苯基4-氯甲基-硫代苯甲酸酯(524mg)并将密封的反应瓶置于摇床上过夜。将颗粒转移至50mL塑料管,并用若干份CH2Cl2、CH3OH、1∶1的CH2Cl2/CH3OH,然后用CH2Cl2反复洗涤,伴随以磁分离。通过TLC监测洗涤溶液中未反应的可溶性原材料的去除。在进一步使用前风干该固体。
[0095]在氩下,将该树脂(1.233g)悬于20mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(395mg)并摇动该浆液7天。将颗粒转移至50mL塑料管,并用40mL CH2Cl2洗涤4次,随后用40mL MeOH洗涤4次以及用40mL CH2Cl2洗涤4次。然后,风干该树脂,得到1.17g浅棕色固体。
实施例3.用含有三丁基基的可裂解连接体官能化的硅酸盐连接体体的合成
[0096]将3-氨丙基三乙氧基硅烷(13.2mL)在75mL庚烷和13mL乙醇中的溶液置于Ar下,并用5.5g的琥珀酸酐搅拌。回流反应4.5h,然后冷却至室温过夜。除去溶剂,产生酰胺产物,为清澈的油。
[0097]将EDC氢氯化物(4.0g)和2.86g上述产物在100mL CH2Cl2中的溶液放置在Ar下,并搅拌1h,然后加入5.5g的4′-羟苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯(实施例1)。反应过夜搅拌。将反应混合物层析到150g的二氧化硅上,用1-2%EtOH/CH2Cl2洗脱,产生1.84g偶联的产物,为白色固体。
实施例4.用含有三丁基基的可裂解的连接体官能化的二氧化硅颗粒的合成。
[0098]在Ar覆盖下,将在50mL干燥甲苯中的实施例3的产物(1.84g)通过套管加入到含有3.83g烘箱干燥的二氧化硅的瓶中。反应回流过夜。在冷却至室温之后,过滤出二氧化硅,用500mL的CH2Cl2洗涤,真空干燥4h。
[0099]将在50mL的CH2Cl2中的具有氯苄基末端基团的衍生化的二氧化硅(2.0g)与8.0g的三丁基膦混合。反应混合物在Ar下搅拌2天。过滤出二氧化硅,用CH2Cl2和己烷洗涤,真空干燥几小时。
实施例5.用含有三丁基基的可裂解连接体包被的磁性颗粒的合成
[0100]通过在Ar下,在回流的甲苯中过夜搅拌,将实施例3的硅酸盐连接体(0.25g)与0.5g Fe3O4颗粒反应。冷却之后,将固体和甲苯溶液转移至50mL离心管。将固体吸引到外部磁体上,倾析甲苯,固体用甲苯洗涤三次,用CH2Cl2洗涤3次。
[0101]将前面步骤的颗粒(0.40g)悬浮在25mL CH2Cl2中。将三丁基膦(1.6g)加到该悬浮液中,并且在放置在轨道式振荡器(orbital shaker)1.5天之前,密封容器。固体进行上面描述的“磁法洗涤(magnetic wash)”,产生黑色粉末。
实施例6.含有三丁基基的可裂解连接体包被的磁性二氧化硅颗粒的合成
[0102]通过被动地将可裂解的核酸结合基团吸附到二氧化硅颗粒表面,制备核酸结合材料。
[0103]将硬脂酸(1.33g)在10mL的SOCl2中回流2h。减压下,去除过量的SOCl2,产生硬脂酰氯,为棕色液体。
[0104]将硬脂酰氯溶解在10mL的CH2Cl2中,并加入到于30mL CH2Cl2中的1.0g如实施例1中所述制备的4′-羟苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯和1.56mL二异丙基乙胺的溶液中,并将混合物搅拌过夜。去除溶剂,将残留物进行柱层析,使用1∶1己烷/CH2Cl2作为洗脱液。分离硬脂酰酯(1.43g),为白色固体。
[0105]在Ar气氛下,将上面的产物(1.43g)和三丁基膦(1.27mL)在30mL的CH2Cl2中的溶液搅拌2天。除去CH2Cl2之后,残留物用6×50mL的醚洗涤,重新溶解在CH2Cl2中,并用醚沉淀,产生1.69g的盐产物。发现该材料在水中是不溶的。
[0106]将盐(0.6g)溶解在6mL的CH2Cl2中,并伴随着搅拌加入到6.0g的硅胶中。蒸发溶剂,产生核酸结合材料。
实施例7.具有含聚乙烯基苄基三丁基基团的聚合物层的磁性颗粒的合成。
[0107]在玻璃瓶中,将磁性Merrifield肽树脂(Chemicell,SiMag Chloromethyl,100mg)加至2mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(80μL),并在室温下摇动浆液3天。在该瓶下放置磁体,并用移液管除去上清液。用2mL CH2Cl2洗涤固体4次(洗涤液也通过磁体/移液管步骤除去)。风干该树脂(93mg)。
实施例8.含三丁基基团和可裂解芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物颗粒的合成。
[0108]将聚(甲基丙烯酰氯)颗粒(1.0meq/g,1.5g)置于含2.45g二异丙基乙胺的75mL CH2Cl2中。加入三乙胺(1.2g)。加入4′-羟苯基4-氯甲基硫代苯甲酸酯(4.5g),并将密封的反应混合物在室温下搅拌过夜。过滤该浆液,并用10mL CH2Cl2、200mL丙酮、200mL MeOH、2×100mL 1∶1的THF/CH2Cl2、250mL THF、250mLCH2Cl2、250mL己烷洗涤树脂。风干该树脂,待进一步使用。
[0109]在氩下,将该树脂(1.525g)悬于25mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(1.7g)并搅拌该浆液4天。过滤该树脂,并用225mL CH2Cl2,随后用175mL己烷洗涤4次。然后,风干该树脂,得到1.68g固体。
实施例9.含三丁基基的聚苯乙烯聚合物的合成。
[0110]在氩填塞(argon pad)下,在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中,搅拌Merrifield肽树脂(Merrifield peptide resin)(Sigma,1.1meq/g,20.0g),其为交联的氯甲基化聚苯乙烯。加入过量的三丁基膦(48.1g,10当量),并在室温下搅拌浆液7天。过滤该浆液,并用200mL CH2Cl2洗涤所得到的固体2次。在真空下干燥树脂(21.5g)。元素分析:观察到的(Found)P 2.52%,Cl 3.08%;期望的(Expected)P 2.79%,Cl3.19%:P/Cl比率为0.94。
实施例10.含三丁基铵基团的聚苯乙烯聚合物的合成。
[0111]在氩填塞下,在150mL CH2Cl2中,搅拌Merrifield肽树脂(Aldrich,1.43meq/g,25.1g)。加入过量的三丁基胺(25.6g,4当量),并在室温下搅拌浆液8天。过滤该浆液,并用250mL CH2Cl2洗涤所得到的固体2次。在真空下干燥树脂(28.9g)。元素分析:观察到的N 1.18%,Cl 3.40%;期望的N 1.58%,Cl 4.01%:N/Cl比率为0.88。
实施例11.用三丁基基团官能化的二氧化硅颗粒的合成。
[0112]将在Ar下于110℃干燥1小时的硅胶(4.82g)与2.79g的Et3N一起加入到50mL的CH2Cl2中。将混合物搅拌20分钟,这之后,加入2.56g的3-溴丙基三氯硅烷,引起放热。将混合物搅拌24h,过滤,并用3×40mL的CH2Cl2、4×40mL的MeOH和2×40mL的CH2Cl2依次洗涤固体。过夜空气干燥固体,称重,为6.13g。
[0113]将于50mL的CH2Cl2中的上面制备的官能化的二氧化硅(5.8g)与5.33mL的三丁基膦一起搅拌10天。过滤混合物,并用7×50mL的丙酮洗涤固体。风干固体,产生5.88g的产物。
实施例12.在实施例6的NAB材料中的连接体的可控裂解。
[0114]将实施例6的包被的二氧化硅材料(70mg)悬浮在1.0mL的D2O中,并通过旋转混合3分钟。通过1H NMR对水溶液的分析显示,没有材料释放到溶液中。
[0115]用40μL的40%NaOD处理二氧化硅悬浮液,旋转3分钟,并对上清液进行NMR分析,显示连接体裂解并从二氧化硅释放到溶液。
实施例13.硅氧烷包被的磁铁矿的合成
[0116]将在100mL无水乙醇中的磁铁矿1.00g(Alfa Aesar)与3.2mL的TEOS、3.32g的CsF和1.0mL的水在Ar下回流中反应2小时。倾析冷却的反应混合物,用乙醇磁法洗涤固体4次,用CH2Cl2磁法洗涤5次。在Ar下干燥固体,产生3.14g的固体。1.0g份的该材料用5×50mL的去离子水和5×50mL的甲醇依次洗涤。干燥产生0.67g的固体。
实施例14.含有聚乙烯基苄基三丁基基团的磁性颗粒的合成。
[0117]在超声波浴的帮助下,将1.0g氧化铁分散在100mL乙醇中。反应容器装载1.50mL的TEOS、1.65g的p-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷(Gelest)、3.32g的氟化铯和1.0mL的去离子水。在Ar下,在大气中,反应混合物回流搅拌2小时。将混合物冷却到室温,倾析溶剂,用乙醇磁法洗涤固体5次,用CH2Cl2洗涤5次。用Ar蒸汽干燥固体,产生2.96g产物。
[0118]将前述步骤的颗粒(0.50g)悬浮在20mL的CH2Cl2中。将三丁基膦(0.5mL)加入到悬浮液,密封容器,然后置于轨道式振荡器上过夜。固体用CH2Cl2磁法洗涤5次。用Ar蒸汽干燥固体,得到0.48g的产物。
实施例15.官能化的硅氧烷包被的磁铁矿的合成
[0119]将在200mL无水乙醇中的磁铁矿1.00g(Alfa Aesar)与3.0mL的3-(三乙氧基甲硅烷基)-丙腈、3.32g的CsF和1.0mL的水在Ar下回流中反应2小时。倾析冷却的反应混合物,用乙醇磁法洗涤固体4次,用CH2Cl2磁法洗涤5次。在Ar下干燥固体,产生2.46g的固体。
实施例16.官能化的硅氧烷包被的可控孔度玻璃的合成
[0120]在Ar的覆盖(blanket)下,将在50mL的干燥甲苯中的实施例2中硅酸盐连接体(1.84g)通过套管加入到含有3.83g经烘箱干燥的可控孔度玻璃PrimeSynthesis native CPG(0.5g)的瓶中。反应过夜回流。在冷却至室温后,过滤出玻璃,用500mL CH2Cl2洗涤,真空干燥4h。
[0121]在50mL的CH2Cl2中,具有氯苄基末端基团的衍生化的玻璃(2.0g)与8.0g的三丁基膦混合。反应混合物在Ar下搅拌2天。过滤出玻璃,用CH2Cl2和己烷洗涤,真空干燥几小时。
实施例17A.官能化的磁性聚苯乙烯的合成
[0122]获取在H2O中的胺-官能化的磁性聚苯乙烯珠(Spherotech)悬浮液(4×1mL,每一含有25mg),并加入到两个1.5mL管。除去上清液,珠用3×1mL的pH 4.0的0.1M MES缓冲液洗涤。向每一个管加入600μL的MES缓冲液和28mgEDC(0.147mmol)以及50mg 4-氯甲基苯甲酸在300μL DMF(0.174mmol)中的溶液。搅拌一天之后,对管声波处理1小时,并放置在磁性架(magnetic rack)上。将反应混合物转移到两个50mL管,并用H2O稀释至40mL。珠用水(4×40mL)、1∶1CH3OH∶H2O(40mL)和CH3OH(3×40mL)磁法洗涤,并允许在管中干燥。
[0123]将上面的固体(90mg)置于1.5mL管中,加入800μL的CH3OH。将30mgPBu3在200μL CH3OH中的溶液加入到该悬浮液。反应混合物超声波处理30min,并在室温中搅拌。搅拌9天后,通过保持在磁体上去除上清液。珠用水(4×1mL)、CH3OH(4×1mL)和水(1×1mL)磁法洗涤。然后,将1mL水加入到珠,制备10mg/mL的贮存悬浮液。
实施例17B.官能化的磁性聚苯乙烯的可选合成
[0124]将1.00g 4-氯甲基苯甲酸(5.86mmol)和3,00mL三丁基膦(12.0mmol)在30mL丙酮中的溶液在Ar下过夜搅拌,导致形成白色沉淀,经1H NMR鉴定为4-羧苄基三丁基氯化物(4-carboxybenzyltributylphosphonium chloride),过滤收集固体,并用丙酮洗涤,然后用己烷洗涤。产量2.19g,89%。
[0125]获取在H2O中的胺-官能化的磁性聚苯乙烯珠(Spherotech)悬浮液(2×1mL,每一含有25mg),并加入到两个1.5mL管中。除去上清液,珠用3×1mL的pH4.0的0.1M MES缓冲液洗涤。向每一个管加入600μL的MES缓冲液和30mg 4-羧苄基三丁基氯化物(80μmol)在200μL DMF/200μL MES缓冲液中的溶液以及EDC(15mg,78μmol)。对管超声波处理30min,并放置在振荡器上1天。通过保持在磁体上去除上清液。珠用水(4×1mL)、CH3OH(4×1mL)和水(1mL)磁法洗涤,然后加入水,制备100mg/mL的贮存悬浮液。
实施例18.官能化的磁性聚苯乙烯的合成。
[0126]在Ar下,将1.0g 4′-氨苯基4-氯甲基-苯硫代羧酸酯(4′-aminophenyl4-chloromethylbenzenethiocarboxylate)(通过EDC偶联4-氯甲基苯甲酸和4-氨基苯硫酚(4-aminothiophenol)而制备)在30mL丙酮中的溶液与2.0g三丁基膦搅拌过夜。过滤出已经形成的沉淀,并用丙酮和己烷洗涤。盐的产量是1.41g,82%。
[0127]倾析1mL来自100mg/mL悬浮液的磁性羧化聚苯乙烯树脂,固体用3×1mL的pH 4.0的0.1M MES缓冲液洗涤。将前面步骤的产物(50mg)溶解在400μL DMF和400μL MES缓冲液中。将该溶液加入到于200μL MES缓冲液中的珠悬浮液。然后加入28mg EDC,对悬浮液超声波处理30min,并置于振荡器上。搅拌一天之后,去除反应混合物。珠用4×1mL H2O、4×1mL CH3OH、1×1mL H2O磁法洗涤。将该珠悬浮在H2O(100mg/mL)中。
实施例19.官能化的磁性聚苯乙烯的合成
[0128]从1mL 100mg/mL的磁性羧化聚苯乙烯树脂的悬浮液中去除上清液,固体用3×1mL的pH 4.0的0.1M MES缓冲液()洗涤。将珠悬浮在800μL MES中,加入63mg 1,4-二氨基丁烷在200μL MES缓冲液中的溶液。加入EDC(28mg,0.147mmol),对珠超声波处理30min,然后在室温中搅拌。将反应混合物与珠磁法分开。然后将珠用4×1mL水和4×1mL MES缓冲液磁法洗涤。
[0129]将50mg 4-羧苄基三丁基氯化物(4-carboxybenzyitributylphosphoniumchloride)(0.134mmol)溶解在400μL DMF/MES缓冲液的1∶1混合物中,并加入到上述珠在600μL的MES缓冲液的悬浮液中。对管进行超声波处理30min,并保持在振荡器中。搅拌一天之后,倾析溶液,珠用水(4×1mL)、CH3OH(4×1mL)和水(1mL)磁法洗涤,并加入水制备100mg/mL贮存缓冲液。
实施例20.与基团静电缔合的磁性聚合物的合成
[0130]从1mL 100mg/mL的磁性羧化聚苯乙烯树脂悬浮液去除上清液。珠与1mL0.1M NaOH搅拌5min。倾析溶液之后,珠用1mL水洗涤。将20mgPlus EnhancerTM(如美国专利5,451,437所述制备)在400μL水中的溶液加入到珠,并将混合物搅拌5分钟。去除上清液后,珠用3×1mL水洗涤,并加入水,制备100mg/mL贮存缓冲液。
实施例21.官能化的磁性聚合物的合成
[0131]在磁体的帮助下,倾析含有25mg固体的等分试样的珠(Dynal magneticCOOH珠,目录号G03810))。然后,在过夜干燥之前,用3×1mL水和3×1mL CH3CN洗涤珠。将珠悬浮在800μL的CH2Cl2中,向CH2Cl2加入15mg的EDC(78μmol)。将实施例1化合物(30mg)在200μL DMF中的溶液加入到混合物。对管超声波处理30分钟,并振荡过夜。除去上清液,珠用4×1mL CH2Cl2、1mL 1∶1 MeOH∶CH2Cl2、3×1mL MeOH和4×1mL CH2Cl2磁法洗涤。在空气中过夜干燥该珠。
[0132]将珠悬浮在1mL的CH2Cl2中,向CH2Cl2加入30μL三丁基膦。对反应混合物超声波处理30分钟,并振荡,共5天。通过保持在磁体上,倾析溶剂。珠用4×1mL CH2Cl2、3×1mL CH3OH和2×1mL水磁法洗涤。加入1mL水,制备珠贮存溶液(25mg/mL)。
[0133]实施例22.官能化的磁性聚合物的合成。
[0134]将等分试样的Dynal甲苯磺酰基活化珠(Dynal tosyl activated beads)(1mL97.5mg/mL贮存液,目录号F68710)置于1.5mL管中,使用磁性架去除溶剂。用2×1mL水和5×1mL CH3OH洗涤珠。将三丁基膦(100μL)加入到于1mL CH3OH的悬浮液中的珠。室温中将管放置在振荡器上。9天之后,在磁体的帮助下除去上清液。珠用4×1mL水、4×1mL CH3OH和1mL水洗涤。然后,将1mL水加入到珠,制备100mg/mL贮存液。
实施例23.具有含有非共价结合到颗粒的三丁基基团的可裂解连接体的磁性聚合物颗粒的合成。
[0135]从磁性羧化的聚苯乙烯颗粒的贮存液(100mg/mL)中,取500μL放置在架上的1.5mL管中,并除去上清液。珠用3×500μL水和4×500μL MeOH洗涤。将10mg上面所示化合物溶解在100μL CH3OH中,加入到珠,并使溶剂在空气中蒸发。
实施例24.用聚甲基丙烯酸酯连接体官能化的、并含有三(羧乙基)基团和可裂解芳基硫酯键的磁性二氧化硅颗粒的合成。
[0136]除了最后步骤外,如实施例2中所述,对磁性羧酸-官能化的二氧化硅颗粒(Chemicell,SiMAG-TCL,1.0meq/g,1.5g)进行官能化。通过超声波处理3分钟,将该材料(116.5mg)悬浮在10mL CH2Cl2中。加入三(2-羧乙基)膦(66.8mg)和32μL三乙胺,振荡浆液7天。将颗粒转移至瓶中,用20mL CH2Cl2洗涤三次,然后用20mL MeOH洗涤4次,以及用20mL CH2Cl2洗涤2次。然后风干该固体,产生109mg材料。
实施列25.官能化的磁性聚甲基丙烯酸酯颗粒的合成。
[0137]磁法收集来自40mL Sera-Mag Magnetic Carboxylate-Modified微颗粒悬浮液(Seradyn)的磁性颗粒,并倾析上清液。颗粒用4×50mL I型水磁法洗涤,然后用4×50mL的乙腈磁法洗涤。最终洗涤之后,干燥颗粒,产生1.93克棕色固体。
[0138]100mL的圆底瓶装载1.02g该颗粒、0.2899克(1.5mmol)EDC、0.5058克实施例1的连接体(1.8mmol)和50ml CH2Cl2。混合物超声波处理10分钟,并放置在轨道式振荡器上,搅拌(170rpm)11天,伴随周期性的超声波处理5分钟,以确保均匀。磁法收集产物,固体用4×50mL CH2Cl2、50mL 1∶1 CH2Cl2/MeOH、4×50mL MeOH、50mL 1∶1 CH2Cl2/MeOH和4×50mL CH2Cl2磁法洗涤。干燥固体,产生0.951g棕色固体。
[0139]50mL的圆底瓶装载0.8993g上述材料和20mL CH2Cl2。混合物超声波处理5分钟,加入0.24g(1.2mmol)三丁基膦。加入之后,超声波处理该混合物另外的15分钟,在轨道式振荡器上搅拌7天,伴随周期性的超声波处理。然后磁法收集产物,用4×50mL CH2Cl2、50mL 1∶1 CH2Cl2/MeOH、4×50mL MeOH、50mL 1∶1CH2Cl2/MeOH和4×50mL CH2Cl2洗涤。干燥固体,产生0.8801克棕色固体。
实施例26.通过在预形成的聚合物中包含氧化铁,合成磁性官能化的聚合物
[0140]在加入20mL CH2Cl2之前,将1.00g实施例9的聚合物产物和0.2g氧化铁的混合物混合均匀。对混合物超声波处理15分钟,用己烷稀释至100mL并过滤。收集的固体用200mL丙酮和400mL水洗涤,直到不再出现颜色,然后用200mL丙酮洗涤。用4×40mL丙酮磁法洗涤固体。过滤收集固体,用丙酮洗涤并干燥。有0.7g的固体,当在显微镜下检查时,仅仅显示极小数量的游离磁铁矿。
实施例27.官能化的可控孔度玻璃的制备
[0141]将0.5g天然可控孔度玻璃(Prime Synthesis,Aston,PA 18-50目,500孔径大小)与实施例3的三乙氧基硅烷连接体(0.25g,0.43mmol)和50mL无水甲苯合并。在Ar覆盖下,混合物回流18h。冷却至室温后,通过抽气过滤分离玻璃颗粒,并用0.2L甲苯和0.2L CH2Cl2洗涤。过夜风干之后,获得0.52g玻璃颗粒。
[0142]将0.450g份的上述玻璃颗粒与10mL CH2Cl2和PBu3(0.91g,4.5mmol)混合。在室温下,将混合物放置在旋转轨道式振荡器上,并振荡3天。通过抽气过滤分离玻璃颗粒,用0.2L CH2Cl2、0.2L MeOH和0.3L CH2Cl2依次洗涤。过夜风干之后,获得0.454g玻璃颗粒。
[0143]遵照进行类似的步骤,获得具有120-200目的尺寸和500或1000孔径大小的CPG。
实施例28.官能化的烧结玻璃的制备
[0144]四个小的烧结玻璃过滤器(约35mg ea,R & H Filter Co.)依次用20%含水NaOH、1N HCl、水和MeOH预处理。干燥之后,将玻璃料与实施例3的三乙氧基硅烷(0.32g.0.55mmol)、10mL甲苯和10μL H2O混合。在Ar覆盖下,混合物回流16小时。冷却至室温之后,移出玻璃料,并依次用CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2洗涤。
[0145]将上述玻璃过滤物与10mL CH2Cl2和PBu3(0.20g,0.99mmol)混合。在室温中,将混合物放置在旋转轨道式振荡器上,振荡7天。移出过滤物,用CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2依次洗涤。
实施例29.吖啶酰胺(acridinium amide)官能化的硅胶的制备
[0146]3-氨丙基硅胶或者从商业上获得(Silicycle,Quebec,Canada),或者通过在甲苯中用过量的3-氨丙基三乙氧基硅烷过夜回流“硅胶60(silica gel 60)”而制备。在Ar覆盖下,将3-氨丙基衍生化的硅胶(1.00g,装载约1mmol/g)悬浮在CH2Cl2(15mL)中。通过注射器加入N,N-二异丙基乙胺(1.5mL,8.61mmol),然后加入吖啶9-酰基氯(360mg,1.49mmol)。将混合物放置在旋转轨道式振荡器上,室温中振荡2小时。在烧结玻璃漏斗上抽气过滤深棕色反应产物,并依次用CH2Cl2(0.2L)、20%(v/v)MeOH∶CH2Cl2(0.2L)和CH2Cl2(0.25L)洗涤。风干后,获得1.16g粉末状固体。将上面制备的材料(1.00g)悬浮在CH2Cl2(15mL)中,并旋转以分散固体。
[0147]将如上制备的材料(1.00g)悬浮在CH2Cl2(15mL)中,并回荡(swirl)以分散固体。加入三氟甲基磺酸甲酯(0.17mL,1.5mmol),用橡胶隔膜密封反应。将混合物放置在旋转轨道式振荡器上,并在室温下振荡16小时。在烧结玻璃漏斗上抽气过滤所得的混合物,并用CH2Cl2(0.2L)、MeOH(0.2L)和CH2Cl2(0.25L)依次洗涤。风干之后,获得1.02g粉末状固体。
实施例30.官能化的硅胶的制备
[0148]室温中,2.00g 2-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)琥珀酸酐((triethyoxysilylpropyl)succinic anhydride)和1.82g 4′-氨苯基4-氯甲基苯硫代羧酸酯在30mL CH2Cl2中的溶液过夜搅拌。蒸发溶剂,得到3.8g的蜡状固体。将该固体与在170mL甲苯中的1.0g二氧化硅混合,伴随着搅拌,在70℃加热16小时。冷却之后,过滤黄色固体,用丙酮(5×50mL)、CH2Cl2(5×50mL)、MeOH(5×50mL)和CH2Cl2(2×50mL)依次洗涤。风干之后,获得3.02g黄色固体。
[0149]将2.00g上述物质在100mL CH2Cl2中的悬浮液超声波处理5分钟,放置在氩的掩蔽下,用1.40mL三丁基膦处理。该混合物搅拌7天,过滤,并依次用CH2Cl2(4×50mL)、MeOH(4×50mL)和CH2Cl2(4×50mL)洗涤。风干之后,获得2.04g黄色的固体。
实施例31.从人全血捕获DNA
[0150]在管中,将10mg份的颗粒与70μL的人全血混合。旋转该管15秒,在室温中放置5分钟,并再次旋转15秒。用300μL pH 8.0的10mM tris缓冲液稀释混合物,并且当利用磁响应性颗粒时,在磁体的帮助下,从颗粒去除液体。用DynalMPC-5磁性架进行磁分离。
实施例32.从人全血分离DNA
[0151]根据前面实施例的程序、捕获在固相结合材料上的核酸用500μL pH 8.0的10mM tris缓冲液洗涤三次,每次丢弃上清液。通过在37℃,用100μL的0.1MNaOH洗脱5分钟,从颗粒移去核酸。NaOH的其他浓度也有效。
实施例33.快速分离方案
[0152]在管中,将1mg份的颗粒与100μL的人全血混合。旋转该管30秒。用300μL pH 8.0的10mM tris缓冲液稀释混合物,并且当利用磁响应性颗粒时,在磁体的帮助下从颗粒去除液体。根据前面的实施例的程序捕获在固相结合材料上的核酸用500μL pH 8.0的10mM tris缓冲液洗涤三次,每次丢弃上清液。通过在室温中用50μL 0.05M NaOH洗脱30秒,从颗粒移去核酸。
实施例34.荧光试验方案
[0153]使用PicoGreenTM染色DNA,通过荧光试验分析上清液和洗脱液的DNA含量。简而言之,将含有或疑似含有DNA的10μL等分试样的溶液与190μL荧光DNA“染色”溶液温育。荧光染料是PicoGreen(Molecular Probes),用0.1M tris,pH7.5、1mM EDTA以1∶400稀释。在温育样品至少5分钟之后,在微量板荧光计(microplate fluorometer)(Fluoroskan,Labsystems)中测量荧光。滤波器组为480nm和535nm。同时进行含有已知数量的同样的DNA的阳性对照、以及阴性对照。对于在100μL 0.1M NaOH中洗脱核酸的实验,使用10μL等分试样。对于在50μL 0.05M NaOH中洗脱核酸的实验,使用5μL等分试样。
实施例35.凝胶电泳方案
[0154]或者0.75%或者1.5%的琼脂糖凝胶被制备,用于分析核酸洗脱物。通过煮沸2分钟,将合适数量的琼脂糖溶解在10mL TAE缓冲液中。一旦冷却至50-60℃,加入1mg/mL溴化乙锭溶液(20μL),并倾倒凝胶。将每一样品(约12μL)与2μL 6×加样缓冲液混合,所述加样缓冲液含有0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯腈蓝和30%丙三醇。在70V跑胶。
实施例36.基因组DNA的PCR扩增
[0155]使用一对24个碱基的引物PCR扩增DNA,产生200bp的扩增子;所述DNA通过用实施例2、4-11和13-30中的每一实施例的固相结合材料(1或2μL)将本发明方法施用于全血而洗脱在0.05M或0.1M NaOH中。PCR反应混合物含有下表列出的组分。
组分 | 体积(μL) |
10×PCR缓冲液 | 2 |
引物1(100ng/μL)引物2(100ng/μL)2.5mM dNTPs50mM MgCl2Taq DNA聚合酶(5U/μL)模板去离子水 | 2221.250.2519.5 |
总计 | 20 |
阴性对照用1μL水替换反应混合物中的模板。一个另外的反应使用1μL的、以1∶10稀释于水中的模板。反应混合物经受30个循环:94℃,30秒;60℃,30秒;72℃,30秒。在1.5%琼脂糖凝胶上分析的反应产物,显示了期望的扩增子。
[0156]在独立的实验中,使用实施例2的颗粒分离的DNA被用于若干不同的染色体的区域扩增反应,如下面所列的。结果证明,由该分离程序获得的DNA是整个基因组的代表。
基因 | 基因区域 | 染色体 |
因子V Leiden | NA(未能提供) | 1 |
促肾上腺皮质激素-β-脂蛋白前体 | 外显子 | 2 |
CFTR | NA | 7(外显子10) |
(Cystic Fibrosis(囊性纤维化)) | (未能提供) | |
甲状腺球蛋白 | 5′侧翼 | 8 |
干扰素α | 3′非翻译区 | 9 |
因子II(凝血酶原) | NA(未能提供) | 11 |
腺苷脱氨酶 | 内含子 | 20 |
β-2整联蛋白 | 3′非翻译区 | 21 |
实施例37.用不同量的颗粒从全血捕获和分离核酸
[0157]将来自70μL人全血的DNA结合到不同量的实施例2的颗粒上,并根据实施例33的快速方案分离。也检验了在洗脱液中不同浓度的NaOH的影响。通过荧光对洗脱的DNA的数量进行定量,并与标准的DNA参考样品比较。
[NaOH] | 1mg | 0.5mg | 0.1mg |
50mM | 1.3μg | 1.0μg | 0.47μg |
60mM | 1.0μg | 1.1μg | 0.62μg |
70mM | 1.3μg | 1.0μg | 0.67μg |
80mM | 1.1μg | 0.9μg | 0.71μg |
90mM | 0.7μg | 1.2μg | 0.49μg |
100mM | 1.2μg | 1.3μg | 0.51μg |
实施例38.用不同量的颗粒从全血捕获和分离核酸
[0158]根据实施例31和32的方案,将来自70μL人全血的DNA结合到不同量的各种颗粒上并分离。通过凝胶电泳分析洗脱液,如图4所示。为了比较,显示了大小范围为500bp至40,000bp的大小标记物(size marker)梯。
[0159]另外的样品示出于图6中。
实施例39.用不同量的颗粒从不同体积的全血捕获和分离核酸
[0160]根据实施例31和33的方案,将来自1mL人全血的DNA结合到5mg的实施例2的颗粒上并分离。通过荧光对重复样品(replicate sample)的洗脱液(100μL)的分析表明,产量为17-24μg DNA。用10mg同样类型的颗粒从70μL血分离DNA,用100μL 0.1M NaOH洗脱30秒钟或1分钟得到的洗脱液,对之进行类似的分析,分别产生6.5μg和7.3μg。通过方案31、32,使用实施例5的颗粒从70μL血产生2.8μg DNA。
实施例40.用不同的固相材料从全血捕获和分离核酸
[0161]根据实施例33的快速方案,采用本发明的方法,来自100μL人全血的DNA结合至1mg不同的固相材料,并用50μL 50mM NaOH溶液洗脱。通过荧光对洗脱的DNA的量进行定量,并与标准DNA参考样品比较。
实施例 | DNA(μg) |
26 | 1.35 |
24 | 0.4 |
[0162]除了在离心而不是在磁分离之后从固体除去液体之外,也如上面所述,测试实施例27的非磁性可控孔度玻璃颗粒(10mg)和重量为10mg的实施例28的烧结玻璃料。
实施例 | DNA(μg) |
30 | 7.5 |
28 | 0.65 |
27-A | 11.2 |
27-B | 2.63 |
27-C | 10.3 |
27-A:18-50目,500孔径大小
27-B:100-200目,1000孔径大小
27-C:100-200目,500孔径大小
Claims (46)
1.从生物或细胞材料的样品捕获核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相结合材料;和
b)将所述固相结合材料与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相结合材料。
2.从生物或细胞材料的样品分离核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相结合材料;
b)将所述固相结合材料与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相结合材料;
c)从所述固相结合材料分离所述样品;
d)任选地,洗涤所述固相结合材料;和
e)从所述固相结合材料释放结合的核酸。
3.权利要求1所述的方法,其中所述生物或细胞材料选自胞外核酸,动物、植物或细菌来源的完整细胞,和含有动物、植物或细菌来源的完整细胞的组织。
4.权利要求2所述的方法,其在5分钟内进行。
5.从生物体的全血捕获核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相结合材料;和
b)将所述固相结合材料与全血的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相结合材料。
6.权利要求5所述的方法,还包括下述步骤:
c)从所述固相结合材料分离所述样品;
d)任选地,洗涤所述固相结合材料;和
e)从所述固相结合材料释放结合的核酸。
7.权利要求5所述的方法,其中所述核酸包含在所述全血的白细胞内。
8.权利要求6所述的方法,其在5分钟内进行。
9.权利要求1所述的方法,其中所述核酸选自DNA和RNA。
10.权利要求1所述的方法,其中所述核酸是生物体的基因组DNA。
11.权利要求1所述的方法,其中所述固相材料选自二氧化硅、玻璃、烧结玻璃、可控孔度玻璃、烧结玻璃、氧化铝、氧化锆、氧化钛、不溶的合成聚合物、不溶的多糖和选自金属、金属氧化物和金属硫化物的金属材料。
12.权利要求1所述的方法,其中所述固相还包括磁响应部分。
13.权利要求1所述的方法,其中所述固相包括共价连接的核酸结合部分。
14权利要求1所述的方法,其中所述固相包括非共价连接的核酸结合部分。
15.权利要求1所述的方法,其中所述固相包括选自下述的基团:羟基、硅烷醇、羧基、氨基、铵、三元锍基、季铵基和季基。
16.权利要求13所述的方法,其中所述共价连接的核酸结合部分包括季基。
17.权利要求13所述的方法,其中所述共价连接的核酸结合部分包括羧基基团。
18.权利要求13所述的方法,其中所述核酸结合部分通过可以被选择性地裂解的键连接到所述材料。
19.权利要求1所述的方法,其中所述结合的核酸在强碱性溶液中从所述固相释放。
20.权利要求1所述的方法,其中所述结合的核酸在溶液中从所述固相释放,所述溶液可直接用于下游分子生物学过程。
21.权利要求19所述的方法,其中所述结合的核酸在溶液中从所述固相释放,所述溶液可直接用于下游分子生物学过程。
22.权利要求20所述的方法,其中所述下游分子生物学过程是核酸扩增反应。
23.权利要求21所述的方法,其中所述下游分子生物学过程是核酸扩增反应。
24.从生物或细胞材料的样品捕获核酸的方法,由下述组成:
a)提供固相,包括:连接有核酸结合部分的基质;
b)将所述固相与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相。
25.从生物或细胞材料的样品分离核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相,包括:连接有核酸结合部分的基质;
b)将所述固相与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相;
c)从所述固相分离所述样品;
d)任选地,洗涤所述固相结合材料;和
e)从所述固相释放结合的核酸。
26.从生物或细胞材料的样品捕获核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相,包括:通过可选择性裂解的键连接有核酸结合部分的基质;
b)将所述固相与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相。
27.从生物或细胞材料的样品分离核酸的方法,由以下组成:
a)提供固相,包括:通过可选择性裂解的键连接有核酸结合部分的基质;
b)将所述固相与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述固相;
c)从所述固相分离所述样品;
d)任选地,洗涤所述固相结合材料;和
e)通过选择性裂解该连接体,从所述固相释放结合的核酸。
28.权利要求24所述的方法,其中所述固相包括选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基质,和结合至所述基质表面上的基,所述基选自其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2 +X-的三元锍基,其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3 +X-的季铵基,以及其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季基PR3 +X-,并且其中X是阴离子。
29.权利要求26所述的方法,其中所述固相包括选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基质,和结合至所述基质表面上的基,所述基选自其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2 +X-的三元锍基,其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3 +X-的季铵基,以及其中R选自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季基PR3 +X-,并且其中X是阴离子。
30.从生物或细胞材料的样品捕获核酸的方法,由以下组成:
a)提供颗粒结合材料;和
b)将所述颗粒结合材料与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述颗粒结合材料。
31.权利要求30所述的方法,其中所述核酸在3分钟内被捕获。
32.权利要求30所述的方法,其中所述核酸在30秒内被捕获。
33.从生物或细胞材料的样品分离核酸的方法,由以下组成:
a)提供颗粒结合材料;
b)将所述颗粒结合材料与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述颗粒结合材料
c)从所述颗粒结合材料分离所述样品;
d)任选地,洗涤所述颗粒结合材料;和
e)从所述颗粒结合材料释放结合的核酸。
34.权利要求33所述的方法,在5分钟内进行。
35.从生物或细胞材料的样品捕获核酸的方法,包括:
a)提供颗粒结合材料;和
b)将所述颗粒结合材料与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合不超过3分钟的一段时间,以将所述核酸结合至所述颗粒结合材料。
36.从生物或细胞材料的样品分离核酸的方法,包括:
a)提供颗粒结合材料;
b)将所述颗粒结合材料与含有核酸的生物或细胞材料的样品混合一段时间,所述时间足以将所述核酸结合至所述颗粒结合材料;
c)从所述颗粒结合材料分离所述样品;
d)任选地,洗涤所述颗粒结合材料;和
e)从所述颗粒结合材料释放结合的核酸,其中所述方法在5分钟内进行。
37.试剂盒,包括:
a)用于从生物或细胞材料直接捕获核酸的固相结合材料,其在不使用裂解液或包被裂解剂的情况下,具有从生物或细胞材料直接捕获核酸的能力;和
b)用于从所述固相释放核酸的试剂。
38.权利要求37所述的试剂盒,其中所述固相结合材料是颗粒材料。
39.权利要求38所述的试剂盒,其中所述颗粒材料是磁响应性的。
40.权利要求37所述的试剂盒,其中所述固相材料选自二氧化硅、玻璃、烧结玻璃、可控孔度玻璃、烧结玻璃、氧化铝、氧化锆、氧化钛、不溶的合成聚合物、不溶的多糖和选自金属、金属氧化物和金属硫化物的金属材料。
41.权利要求37所述的试剂盒,其中所述固相包括共价连接的核酸结合部分。
42.权利要求41所述的试剂盒,其中所述核酸结合部分通过可以被选择性地裂解的键连接到所述材料。
43.权利要求41所述的试剂盒,其中所述用于从所述固相释放核酸的试剂是强碱性溶液。
44.权利要求37所述的试剂盒,其中所述固相包括选自下述基团:羟基、硅烷醇、羧基、氨基、铵、三元锍基、季铵基和季基。
45.权利要求41所述的试剂盒,其中所述共价连接的核酸结合部分包括季基。
46.权利要求42所述的试剂盒,其中所述共价连接的核酸结合部分包括季基,并且所述用于从所述固相释放核酸的试剂是强碱性溶液。
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