CN1016645B

CN1016645B - 捕获靶子及本底的方法及亲和性测定的装置

Info

Publication number: CN1016645B
Application number: CN87107800A
Authority: CN
Inventors: 马克·利奥·柯林斯
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: BP Corp North America Inc
Priority date: 1986-10-23
Filing date: 1987-10-23
Publication date: 1992-05-13
Also published as: EP0265244B1; ZA877772B; CN87107800A; US5780224A; ATE80949T1; EP0265244A2; DE3781860T2; JP2975603B2; CA1309329C; AU8009787A; EP0265244A3; DE3781860D1; JPS63188399A; AU621812B2

Abstract

利用亲和性检测靶分子的方法、组合物和设备，包括使样品与能在样品基质中形成基本均一的分散体系并与靶分子可逆结合的可回收载体接触。该可回收载体能够从样品基质中分离，从其他样品成分中再次捕获靶分子。

Description

本发明涉及用于捕获靶分子的方法、试剂、组合物、药盒及设备。具体地说，本发明涉及从临床样品中捕获脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）的方法、试剂、组合物和药盒。本发明的实施方案提供了在临床样品中迅速而灵敏地检测核酸靶子的方法，这些方法适用于非放射性标记技术和自动化。

为了易于理解本发明，现给出下列定义。本申请中所用术语“生物结合对”是指任一对具有自然亲和性或结合能力的分子。为了本申请的目的，术语“配体”是指生物结合对中的一个分子，术语“抗配体”或“受体”是指生物结合对中的对立分子。例如（并非限制），本发明的实施方案可用于核酸杂交检测，此处的生物结合对包括两条多聚核酸的互补链。一条链称为配体，另一条链则称为抗配体。但是，生物结合对可以包括抗原与抗体、药物与药物受体位点、酶与酶的底物。

术语“探针”是指能够选择性地与抗配体靶子结合的性质已知的配体。对于核酸，术语“探针”是指一条碱基序列与靶链互补的核酸链。

术语“标记物”是指能够检测的半分子，包括（举例而非限制）放射性同位素、酶、发光剂和染料等。所用术语“试剂”是广义的，它包括任何参与产生可测应答的反应的半分子。所用术语“辅因子”是广义的，包括任何参与与试剂反应的半分子。

所用术语“可回收的”是广义的，用它来描述这样一种实体：它基本能够分散于基质中，并能通过固定、过滤、分配及类似方法从该基质中去掉或分离。

术语“载体”单独使用时包括常规载体如滤器和膜以及可回收的载体。

提及配体和抗配体的结合时，术语“可逆的”是指在不永久改变配体和抗配体的基本化学性质的变化下，二者能够结合或释放。例如（并非限制），可逆结合包括由pH、温度和离子强度的改变而控制的结合和释放，这些变化不会破坏配体和抗配体。活细胞中的遗传信息储存于线状DNA分子中。在活体中，DNA分子为双螺旋，其中每条是一条核苷酸链。每个核苷酸的特征在于下列四个碱基中的一个：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。碱基在这样的意义上互补，即由于功能基团的定向，某些碱基对相互吸引并通过氢键键合在一起。一条DNA链中的腺嘌呤与对立的互补链中的胸腺嘧啶配对。一条DNA链上的鸟嘌呤与对立互补链中的胞嘧啶配对。在RNA中，胸腺嘧啶碱基由脲嘧啶代替，脲嘧啶与对立互补链中的腺嘌呤配对。

DNA由共价连接的脱氧核糖核苷酸组成，RNA由共价连接的核糖核苷酸组成。活生物体的遗传密码载于DNA链的碱基对序列中。

每个核酸通过一个核苷酸上的糖的5′羟基和相邻核苷酸上的糖的3′羟基间的磷酸二酯桥连接。每条天然存在的线性DNA或RNA链有一个具有5′游离羟基的末端和另一个具有3′游离羟基的末端。多核苷酸末端通常参照各自的游离羟基称为 5′末端或3′末端。DNA和RNA的互补链形成反平行的复合物，其中一条链的3′末端与对立链的5′末端定向结合。

核酸杂交检测法的基础是，两条核酸链在互补区有配对的趋向。目前，核酸杂交检测法主要用于在完整DNA分子中、在核酸混合物中或在核酸片段的混合物中检测和鉴别独特的DNA或RNA碱基序列或专一性基因。

在组织或培养物样品的全DNA或RNA提取物中，特殊DNA或RNA序列或专一性基因的鉴别可以表明所存在的生理或病理状况。具体地说，在人或动物组织的全DNA或RNA提取物中，特殊DNA或RNA序列或专一性基因的鉴别可以表明遗传疾病的存在，或表明镰形细胞贫血症、组织相容性、癌和癌前期状态、细菌或病毒感染等状况的存在。在细菌培养物或含有细菌的组织的全DNA或RNA提取物中，特殊DNA或RNA序列或专一性基因的鉴别可以表明抗生素抗性、毒素、病毒或质粒的存在，或有助于分辨不同的细菌型。

因此，核酸杂交检测法在疾病诊断和检测中具有巨大潜力。进一步的潜力存在于农业和食品加工中，在这些领域中，核酸杂交检测法可以用来检测植物致病机理或产生毒素的细菌。

使用最为广泛的核酸杂交检测法之一称为Southern吸印滤膜杂交法，或简称为Southern法（Southern，E.，J.Mol.Biol.I，98，503，1975）。Southern法用于鉴别靶DNA或RNA序列。此方法通常通过在硝酸纤维素片上固定RNA或DNA样品进行。固定的RNA或DNA样品与放射性标记的DNA链探针接触，该探针具有互补于靶序列的碱基序列并携有可检测的放射性标记。使探针和DNA样品之间发生杂交。

杂交过程通常是非常专一性的。如果两种核苷酸没有基本互补的碱基对组成，则标记探针不与DNA或RNA样品结合。根据所给条件，杂交可在3-48小时内发生。

然而，实际上标记探针和载体间总存在有非专一性结合，这表现为检测中的“本底噪音”。本底噪音降低检测灵敏度。未杂交的DNA探针随后被洗走。硝酸纤维素片置于X-光胶片上使之曝光。使X-光胶片显影，胶片的曝光区表明与DNA探针杂交的DNA片段的存在，因此，该DNA片段具有所关心的碱基对序列。

放射性标记试剂和Southern检测技术相结合使用，使得人们能够将核酸检测法应用于临床样品。放射性衰变甚至能在含有外源蛋白和有机物的临床样品中检测到。然而，外源蛋白和有机物的存在可能导致探针和固态载体间的非专一性结合。而且，使用放射性标记技术需要很长的曝光时间以显现X-光胶片上的条带。典型的Southern法可能需要1-7天的曝光。使用放射性标记试剂还需要特殊的实验程序和许可证。

涉及放射性同位素标记的检测法中的上述问题，导致了使用非同位素标记物的技术的发展。非同位素标记物的例子有酶、发光剂和染料。发光标记物在外部能源激发下发光，根据激发能源它可分为不同的范畴，包括：从高能粒子获得能量的放射性发光标记物;从化学反应获得能量的化学发光标记物;其激发能可用于生物系统的生物发光标记;由红外、可见、紫外光的电磁辐射单位（光子）激发的光致发光或荧光标记物。一般参见Smith et al.，Ann.Clin.Biochem.，18∶253，274（1981）。

使用可由非放射性能源激发的标记物的非同位素检测技术，避免了放射性标记检测技术中遇到的健康危险和许可等问题。而且，非同位素检测技术具有快速检测的优越性，避免了使用X-光胶片所需要的长期曝光。

然而，非同位素检测法还未赋予检测法以判断其可靠性所必需的灵敏度和专一性。在发光检测法中，生物样品中携带的蛋白基和其他分子的存在可能导致激发光的散射，或可能吸收发光标记物的发射光谱中的光，从而导致发光探针的淬灭。

在酶检测法中，生物样品中携带的蛋白质和其他分子的存在可能干扰酶的活性。

同样，在比色检测法中，由于生物样品中携带的蛋白和其他物质可能无法检测出色度的变化。

本发明的实施方案涉及在载体和可回收载体上（包括磁性颗粒）的靶子和本底捕获。已有将磁性颗粒用作合成有机物的载体的建议，这些有机物包括寡聚体例如DNA、RNA、多肽和其他具有一定序列的多单元分子。例如参见Steven A.Benner和Genetics Institute的欧洲专利83112493.8。但是，还没有建议将磁性颗粒用作靶子捕获和本底去除的可回收载体。

磁性颗粒的其他应用包括：血液中的磁性液体，参见R.Neubauer，IEEE transactions on magnetics MAG-9，445（1973）;功能基团的结合以分离生物分子，参见I.Giaver的美国专利3970518，细胞表面受体的标记，S.Margel et al.，J.Imm.Meth.，28∶341-53（1979）;在治疗过程中与药物结合作为磁性靶，参见A.Senyei et al.，J.APP.Phys.，49（6）∶3578（1978），K.Wieder et al.，Pro.Soc.of Exp.Biol.Med.，58∶141（1978），K.Mosbach and U.Shroeder，FEBS letters，102∶112（1979）;病毒、细菌和其他细胞的选择性分离，参见R.Molday et al.，Nature，268∶438（1977）;以及将磁性颗粒作为载体掺入生物聚合物的凝胶亲和层析中，参见K.Mosbach and L.Anderson，Nature 270∶359（1977），上述文献作为本文参考文献。

在Ann-Christine Syuanen，Matti Laaksonen和Hans Soeder lund所作的一篇文章中（标题为“Fast Quantification of Nucleic Acid Hybrids by Affinity-Based Hybrid Collection”，Nucleic Acids Res.，14（12）∶5037，1986）建议使用双探针系统在常规的非回收载体上进行靶子捕获。

本发明的目的是提供检测有关靶分子的方法、试剂、组合物、药盒和设备。后面还将提出另外的目的。为方便起见，本发明的实施方案（并非限制）可分为靶子捕获、本底捕获和二者的结合等几个方面。

首先讨论靶子捕获，本发明中这一实施方案的特点是用以分离靶分子的捕获和释放循环。该方法包括在结合条件下，使可能含有靶分子的样品基质与探针和结合了或能够结合至少一种探针的第一载体接触。探针能够选择性地和可逆地与靶分子结合，形成包括探针靶子和第一可回收载体的复合物。下一步，从样品基质中分离载体，使之与第二基质接触。然后，使载体处于释放条件下以从载体上释放靶子，并从第二基质中分离载体。然后，使第二载体在结合条件下与第二基质接触。第二载体结合了或能够结合至少一种能与靶分子选择性结合的探针。在结合条件下，靶子与结合在第二载体上的探针形成一种复合物供进一步处理。

第一载体最好可以这样的方式回收：它能够基本均一地分散于样品基质中，基本上能够进行物理分离、回收，或固定于样品基质中。

第一载体从第一基质中的分离，除去了附着于第一载体上的非专一性结合的细胞碎片。靶分子在第二载体上的进一步结合进一步浓缩了用于检测的靶子，使得能够进一步进行释放-捕获循环，以得到更大程度的纯化。

本方法进一步的实施方案的特点是可回收的载体。该方法包括使可能含有核酸靶的样品与结合有探针部分的可回收载体接触。可回收载体能够基本均一地分散于样品基质中。探针部分和可回收载体可通过（仅作为举例）探针部分和可回收载体的共价结合、亲和性结合、氢键或非专一性结合而结合。

载体可采取多种形式，包括（仅作为举例）颗粒形式的硝酸纤维素，它可通过使含有载体的样品基质过筛而进行回收;结合了磁性颗粒等的硝酸纤维素或材料，使硝酸纤维素在样品基质中的磁场作用下迁移;可以过滤或呈现电磁性质的小球或颗粒;分配至水溶液基质表面的聚苯乙烯小球等。

本发明较好的实施方案包括含有磁性小球的可回收载体，其特征在于它们能够基本均一地分散于样品基质中。磁性小球最好含有伯胺功能团，它可促进探针分子和磁性载体颗粒的共价结合或连接。磁性载体小球最好是单区磁体（Single domain magnets）并具有不呈现剩磁的超顺磁性。第一探针包括能在结合条件下与抗配体专一结合的探针配体部分。可回收载体能够基本均一地分散于样品基质中，并至少包括一种能在结合条件下与配体结合以形成靶-探针载体复合物的抗配体部分。然后，分离可回收载体和样品基质，使样品基质进行进一步处理。

本发明的实施方案适于从含有外源物质的临床样品基质中捕获靶分子。使样品基质与探针或可回收载体接触的顺序可以选择。但是，探针和靶子间、探针配体和载体抗配体间的结合动力学两方面都可能影响这种选择。

应用于多核苷酸靶分子和均聚物配体和抗配体时，均聚物配体和抗配体结合一般比探针与靶子的结合要快。探针配体结合到载体抗配体上以后，探针与靶子的结合会受到空间阻碍。一个较好的实施方案包括使样品基质与试剂接触，并将混合物置于杂交条件下。下一步，可回收载体分散于试剂和样品基质中，使之在形成探针载体复合物之前形成靶子探针复合物。

本发明进一步的实施方案的特点是多探针系统。

该方法最好包括一种试剂，该试剂包括一个前述的第一探针和至少一个能与靶分子结合并具有可检测标记物的第二探针。第二探针能够形成靶子（第一和第二）探针-载体复合物。从样品基质中分离可回收载体的步骤不仅从靶子（第一和第二）探针-载体复合物中除去了外源物质，而且分离出所有未与靶子结合的第二探针。未与靶子结合的第二探针可形成本底噪音、表明靶子存在的假信号等。

进一步处理可包括将靶子（第一和第二）探针复合物从可回收载体上释放入第二基质中，并使靶子（第一和第二）探针复合物与新载体再次结合。第一可回收载体可能带有会干扰检测步骤的非专一性结合的物质。因此，靶子-探针复合物从可回收载体上释放并除去可回收载体后，可在结合条件下使具有能与探针配体结合的抗配体的第二载体与靶子探针复合物接触，以进行靶子-探针结合或捕获的进一步循环，从而进一步纯化并浓缩靶子-探针复合物。

进一步处理可包括本底捕获。本发明进一步的实施方案包括这样一种方法，其中的第二探针具有一个第二配体部分。该方法进一步包括一种具有第二抗配体部分的本底载体。第二配体部分和第二抗配体部分只有当第二探针未与靶分子结合时，才能在结合条件下进行稳定结合。该方法进一步包括使可能含有未与靶子结合的第二探针的基质在结合条件下与本底载体接触的步骤。下一步，从基质中分离出本底载体以除去未结合的第二探针，从而降低本底噪音。

所用术语“本底载体”是指它的常规意义，包括滤器和膜以及可回收载体。与本底载体的结合不必是可释放的。

较好的可回收载体包括（仅作为举例，并非限制）能够分散于基质中并从中分离的颗粒、细粒、小球或线状物。分离方法包括（仅作为举例，并非限制）过滤、离心、沉淀、表面浮选、沉降或使用电磁场。

本方法可用于多核苷酸靶分子。与靶子或探针二者之一被固定的情况相比，第一和第二探针最好能与多核苷酸靶“在溶液中”迅速结合。

能够基本分散于溶液中的可回收载体，使可回收载体和探针间的相互作用类似于“在溶液中”的杂交。在溶液中，杂交能在大约3-15分钟内完成。本方法的迅速杂交和简单性可以自动化。本方法使临床样品中的核酸序列从外源物质中分离出来，使得这一方法能够用于非同位素标记技术。

当靶分子是多核苷酸时，本方法的一个实施方案包括使样品基质在结合条件下与试剂接触。该试剂包括至少一种第一多核苷酸探针和至少一种第二多核苷酸探针。第一探针能够与靶分子形成复合物并具有一个第一均聚物配体。除了第一探针外，第二探针也能与靶分子形成复合物。第二探针包括一个具有第二均聚物配体（与第一探针的第一均聚物配体不同）的标记部分。下一步，使试剂和样品基质与本底载体和靶捕获载体接触。本底载体包括至少一种第二均聚物抗配体，它在第二探针未与靶子结合时，能够与所述第二探针的第二均聚物配体结合。靶捕获载体包括至少一种第一均聚物，它能够与第一探针的第一均聚物配体结合。本底载体和靶捕获载体除去本底噪音，并且，靶捕获载体进一步浓缩靶子-（第一和第二）探针复合物以供进一步处理，并从细胞碎片中分离靶子-（第一和第二）探针复合物。进一步的处理包括检测表明靶分子存在的标记物。

现在，更具体地描述本发明中涉及本底捕获的实施方案，一个实施方案包括使探针和靶子形成复合物的方法。下一步，使未形成复合物的探针在结合条件下与一种载体接触。该载体能够选择性地与未结合的探针结合。然后，从探针-靶子复合物中分离出载体。

本发明更进一步的实施方案包括为进一步处理而分离大量靶分子的方法。

一个方案包括在大量载体上依次加入和去除专一于靶分子的探针。一个进一步的方案包括这样一种方法，它包括使样品与第一系列探针接触，并在大量载体上捕获靶子和探针。该第一系列探针包括能够与载体结合的配体。第一探针系列包括所有多靶子的探针，它们能够与专一于每种靶分子的载体结合。载体能够相互分离，分离导致不同类型的靶分子与载体一起分离出来。

本发明进一步的实施方案包括一种试剂组合物。该试剂组合物包括第一探针和第二探针。第一探针能够与靶分子形成复合物，并包括能够在结合条件下与抗配体专一结合的探针配体。第二探针能够与靶分子形成复合物，并包括一个可检测的标记物。该试剂组合物与具有抗配体的可回收载体一起使用时，能用于捕获和检测样品基质中的靶子。

本发明试剂组合物进一步的方案包括一个具有第二配体的第二探针，该第二配体只有在第二探针未与靶分子结合的情况下才能够与抗配体稳定结合。通过使可能含有未结合的第二探针的样品与具有第二抗配体的本底载体相接触，该试剂组合物能够降低本底噪音。

一个进一步的具体方案包括一种能够基本上均一地分散于样品基质中的载体，它具有适于探针上的寡核苷酸配体结合的寡核苷酸抗配体。

一个较好的载体方案包括（仅作为举例）能够分离的颗粒、细粒、线状物和小球。分离方法包括（仅作为举例，而非限制）沉淀、沉降、浮选、过滤、离心和电磁处理等。

一个较好的实施方案包括聚苯乙烯小球，直径在10-100微米之间，它们能基本上均一地分散于基质中并通过过滤或浮选从该基质中分离。另一个较好的方案包括铁磁小球。以BIO-MAG商标上市的铁磁小球能够基本上均一地分散于水溶液基质中，并能通过电磁场进行回收或固定。铁磁小球包括一个铁芯，外面由能与胺反应的覆盖层包裹。小球一般是圆形的，直径为1微米。处理聚苯乙烯和铁磁小球使其含有抗配体部分。

本发明进一步的实施方案包括一种药盒，用来检测属于生物结合对一部分的靶分子。在靶子是具有特殊碱基序列的多核苷酸的情况下，药盒中的试剂包括一种第一多核苷酸探针和一种第二多核苷酸探针。第一和第二探针能够结合在靶子上互不干扰的部位，形成一种两个探针都结合在靶子上的复合物。第一探针能在结合条件下可逆地与第一载体结合，第二探针包括一个可检测的标记部分。药盒进一步包括一种第一载体，它与靶子和探针形成的复合物能够从样品基质中选择性地分离出来。

本药盒进一步的方案包括一种第二探针和一种本底载体。第二探针未与靶子结合时，能够选择性地与本底载体结合。本底载体能够从含有试剂的基质中分离出来，以除去非专一性结合的第二探针。

本发明进一步的实施方案包括一种用以进行本发明检测方法的设备。在靶子是多核苷酸的情况下，该设备包括一个反应室，适于以基本上均一混合的状态接受试剂和靶子。试剂包括第一和第二多核苷酸探针。每个探针能够结合在靶子上互不干扰的部位，形成两个探针都结合在靶子上的复合物。第一探针能够在结合条件下可逆地与第一载体结合，第二探针包括一个可检测的标记部分。该设备进一步包括使第一载体与试剂和样品接触的装置，以使第一探针和靶子-探针复合物结合在载体上。该设备进一步包括使样品、试剂和载体处于结合条件下的装置，以形成与载体结合的靶子-探针复合物。该设备进一步包括使第一探针处于释放条件下的装置。最后，该设备包括从样品以及从试剂中分离载体的装置。

所用术语“反应容器”是广义的，它包括任何容器装置，包括（仅作为举例，并非限制）小杯、试管、毛细管等等。

使样品、试剂和载体处于结合条件下或使试剂和载体处于释放条件下的合适装置包括（仅作为举例）温度控制装置，它可提高或降低样品、试剂和载体的温度以选择性地使多核苷酸链变性或退火。

从试剂或样品中分离载体的合适装置包括（仅作为举例）与磁性小球一起使用的电磁铁，附着于固定载体上的纤维，用于聚苯乙烯细粒的离心机等。

本发明进一步的实施方案包括使试剂和靶子在结合条件下与本底载体接触的装置，以去除所有具有标记物而未与靶子专一性结合的第二探针。

本发明适用于发光标记物的设备的实施方案包括合适的标记物激发手段。用于荧光标记物的设备包括带有确定合适波长的滤光器的激光或光发射组件。用于化学发光标记物的设备包括将辅因子注入反应室中的注射装置。

现在描述附图，它们通过图示描绘了本发明较好的实施方案。具体地说在图1中，以图解形式说明了用必需的试剂组合物检测多核苷酸链靶子的流程。常规的检测技术包括许多靶链，并将用许多探针链进行检测。但是，为了易于进一步理解本发明，示图仅仅描绘了有限数量的探针、载体和靶子。图1的特征在于该方法使用了可回收载体。

图1中表明的检测法的第一步，以图示方式从一个含有细胞的临床样品开始。该细胞可能携有核酸靶DNA或者RNA，它们具有表明病原体、遗传情况或所需基因特性的特殊的碱基序列。该临床样品能够从任何分泌物或生理液体中得到，例如粪便、尿液、痰、脓、血清、血浆、眼球晶状体液、脊髓液、淋巴液、生殖器洗涤液等。本领域的普通技术人员可能期望通过本领域内的已知方法使活体解剖样品处于单细胞悬浮液或小型团块状态。例如，固体组织的活体解剖样品能够有效地形成单细胞悬浮液或小型细胞团块，即使活体解剖样品在一混合物中搅动，其中含有0.5M氯化钠、10mM氯化镁，0.14M磷酸盐缓冲液，pH6.8，以及25mg/ml环己酰胺。这一步骤中还能运用本领域已知的确定方法分离专一类型的细胞，例如差速离心分离、密度梯度离心分离或其他方法等。

然后，处理细胞使其释放DNA和（或）RNA。化学裂解在本领域内是熟知的。化学裂解可用稀碱溶液进行，例如用0.1-1.0m氢氧化钠。碱还有助于使DNA或RNA变性。其他的变性和裂解剂包括高温、有机试剂例如醇类、酰胺、胺、脲、苯酚和亚砜类，或某些无机离子如助溶盐，例如三氟乙酸钠、三氯乙酸钠、高氯酸钠、异硫氰胍、碘化钠、碘化钾、异硫氰酸钠和异硫氰酸钾等。

临床样品也可以进行各种限制性核酸内切酶解以将DNA或RNA切成分开的片段，这些片段更易于操作。样品处理步骤完成后，临床样品中包括核酸样品、细胞碎片和杂质等。过去，从细胞碎片和杂质中分离核酸样品是通过使核酸与滤器或膜非专一性结合后，从滤器或膜上洗掉细胞碎片和杂质而进行的。但实际上，某些细胞碎片和某些杂质，以及非靶核酸也与滤器或膜发生非专一性结合，因而并没有通过洗涤而除去。

本发明的一个实施方案，正如步骤1所示，包括使可能携有核酸靶的样品与结合了探针的可回收载体接触。可回收载体能够基本均一地分散于样品基质中。探针部分与可回收载体的连接，可通过（仅作为举例）探针部分与可回收载体的共价结合、通过亲和性结合、氢键结合或非专一性结合进行。

载体可以采取多种形式，包括（仅作为举例）：颗粒形式的硝酸纤维素，它可通过使含有载体的样品基质过筛进行回收;结合了磁性颗粒等的硝酸纤维素或材料，使硝酸纤维素在样品基质中在磁场作用下迁移;可以过滤或呈现电磁性质的小球或颗粒;分配至水溶液基质表面的聚苯乙烯小球。

本发明较好的实施方案包括含有磁性小球的可回收载体，其特征在于它们能够基本均一地分散于样品基质中。磁性小球最好含有伯胺功能团，它可促进探针分子和磁性载体颗粒的共价结合或连接。磁性载体小球最好是单区磁体并具有不呈现剩磁的超顺磁性。

颗粒或小球可包括在磁铁矿颗粒中，但它们也可以是其他磁性金属或金属氧化物，不管是不纯的、合金的或组合物形式的都可以，只要它们具有能反应的表面并具有对磁场作出反应的能力就行。其他可单独或与铁结合使用的物质包括（但并不限于）钴、镍和硅。制造磁铁矿或金属氧化物颗粒的方法公开于下述文献中：Vandenberghe et al.，“Preparation and Magnetic Properties of Ultrafine Cobalt Ferrites，”J.of Magnetism and Magnetic Materials，15-18∶1117-18（1980）;E.Matijevic，“Mono Dispersed Metal（Hydrous）Oxide-AFasc-inating Field of Colloidal Science”，Acc.Chem.Res.，14∶22-29（1981），这些文献列为本文的参考文献。

适用于本发明的磁性小球包括含有伯胺功能团的磁性小球，以商品名BIO-MAG上市的Advanced Magnetics，Inc.的产品。较好的磁性颗粒是无孔的，但仍能与探针部分结合。不涉及探针结合的反应位点最好封闭起来以防止其他试剂、杂质和细胞物质的非专一性结合。磁性颗粒最好以基本为胶态悬浮体的形式存在。试剂、底物和探针与直接伸展于颗粒周围溶液中的颗粒表面结合。探针部分与溶液中溶解的试剂和底物的反应速率和产率具有溶液反应的特点，而不是与固态载体结合的反应速率。而且，随着颗粒大小的降低，颗粒表面与体积的比例上升，从而允许每单位重量的磁性颗粒结合更多的功能团和探针。

具有活性胺功能团的小球能与多核苷酸反应，使多核苷酸共价附着于小球上。使小球与10%戊二醛在磷酸钠缓冲液中反应，随之在磷酸盐缓冲液中与磷酸化多核苷酸的乙二胺加成物反应，所用方法将在下面的实验说明中给予更详细的描述。

现在说明第2步，使结合有探针的可回收载体与临床样品接触，并且进行到第3步，使之置于结合条件下。专一于有关靶子的探针结合在临床样品中的靶链上。完全分散于样品和试剂基质中的可回收载体，使探针部分和靶子象游离在溶液中一样进行杂交。

探针与靶子的杂交可在大约15分钟内完成。与此相反，探针或靶子之一被固定于不能分散于基质中的载体上而进行的杂交需要长达3-48小时的时间。

外源DNA、RNA、细胞碎片和杂质非专一性地结合在载体上。但实际上，少量的外源DNA、RNA、细胞碎片和杂质能够、并且实际上确实与置于反应容器中包括可回收载体在内的任何实体发生了非专一性结合。本发明的实施方案有助于临床样品的进一步纯化，以从多核苷酸靶中去除外源DNA、RNA、细胞碎片和进一步的杂质。

图1中的第4步描绘了临床样品载体的分离，以及将此载体悬浮到第二基质中。第二基质因此包括连接有探针的可回收载体，该探针结合在多核苷酸链靶子上。可回收载体还携有非专一性结合在载体上的外源DNA、RNA、细胞碎片和杂质，但其浓度比临床样品中最初的浓度低得多。本领域的专业人员会认识到，使载体悬浮于第二基质中之前，洗涤载体可以减少某些不需要的物质。

使结合有探针和靶链的悬浮在第二基质中的可回收载体如第5步所述进一步变性，从而使靶子从可回收载体的探针部分上解离。变性过程可能或不能从可回收载体上释放非专一性结合的外源DNA、RNA、细胞碎片或杂质。然而，本方法的第5步使可回收载体从第二基质中去掉后，使载体上携有许多最初从第一临床样品基质中转移过来的非专一性结合的细胞碎片、杂质和外源DNA、RNA。

如第6步所述，一种新载体可在结合条件下导入第二基质中，再次以结合在可回收载体上的探针捕获多核苷酸链靶子。本领域的专业人员将会认识到，新载体实际上可能包括循环步骤后原来的可回收载体，以进一步纯化并去除非专一性结合的DNA、RNA、细胞碎片和杂质。因此，第二基质中仅存的杂质包括DNA、RNA、细胞碎片、以及原来非专一性结合在载体上的杂质，该杂质后来从第一载体上释放并溶于或悬浮于第二基质中。

然而，这种杂质可进一步从多核苷酸靶中去除，即从第二基质中去除第二可回收载体，并再次重复在进一步的基质中导入可回收载体、变性和去除老载体的循环。本领域的普通专业人员将认识到，本发明所述磁性小球易于从溶液中提出，或当除去溶液或往容器中加入溶液时易于固定在某处。

磁性小球模仿“溶液动力学”链参与反应的能力，使得变性和与靶子结合的循环能在3-15分钟内完成。

在足够的纯化和浓缩后，靶子可通过示于第8步中的技术上已知的发光或放射性法检测。含有靶子的基质的纯化，使得能够检测没有细胞碎片和杂质的非同位素标记部分。

现在说明图2，该方法的特征在于多探针，图示的本检测法的进一步实施方案以一个含有多核苷酸靶的临床样品开始，根据前图对临床样品的处理方法加入增溶剂和反应试剂进行处理。图2所绘检测法中的试剂包括第一多核苷酸探针链（P₁）和第二多核苷酸探针链（P₂），它们能够与靶子形成两个探针（P₁与P₂）都与靶子结合的复合物。第一探针（P₁）能够在结合条件下与可回收载体（S₁）结合。第二探针至少有一个可检测的标记物。附图中用星号标出了标记物。在变性条件下加入增溶剂和试剂后，含有临床样品的溶液可能包含多核苷酸靶以及第一和第二探针形式的试剂，还有细胞碎片、增溶剂、杂质及外源RNA和DNA。

如第2步所示，第一和第二探针（P₁和P₂）在结合条件下结合在靶子上互不干扰的部位。在溶液中探针（P₁和P₂）与靶子的杂交很迅速，不受与固态载体结合的阻碍。为确保靶子与第一和第二探针链（P₁和P₂）的结合，要使用过量的探针。然而，即使不使用过量的探针（P₁和P₂），某些探针也找不到靶子而在样品基质中维持非杂交状态。具有标记物的非杂交的第二探针（P₂）如果存在于检测过程中则会构成本底噪音。

第一探针（P₁）能够通过配体与载体（S₁）结合，该配体能够结合在载体的抗配体部分上。配体（L₁）包括（仅作为举例）含有一个均聚物的尾巴。载体（S₁）包括能够接受并结合配体（L₁）的抗配体（A₁）。抗配体（A₁）包括（仅作为举例）互补于探针（P₁）的配体（L₁）的均聚物。

现在说明第3步，载体（S₁）的抗配体部分（A₁）在结合条件下连接或结合在第一探针（P₁）的配体部分（L₁）上，而第一探针本身是结合在连接于第二探针（P₂）的靶子上。载体可采取多种形式。小球或颗粒载体能够分散于溶液中，它参与的与靶探针结合的反应表现出近似溶液动力学的性质。而且，可回收小球和颗粒载体能够从非溶解性的碎片中分离出探针-靶复合物而不存在阻塞的问题，而这一问题正是在更为常规的滤器或膜中所固有的。

然而，常规的膜、滤器或纤维素载体也可用于不存在阻塞问题的某些目的。由于探针和靶在溶液中的杂交很迅速，在反应溶器中可掺入一种非球体或非颗粒的固态膜或滤器载体。可使试剂和样品的溶液通过载体而进行靶子捕获。图2中所示载体（S₁）是一种可回收载体。

溶液中除了靶-探针载体复合物外，还有未结合的第一和第二探针部分，未结合的靶增溶剂、杂质和细胞碎片。具有标记物的未结合的第二探针（P₂）构成噪音，它产生一个似乎有靶子存在的信号。少量的外源细胞碎片、增溶剂、杂质和探针也可以非专一性地结合在可回收载体上。

在第4步中，从临床样品基质中分离出载体（S₁）。如果使用一种可回收载体，可通过在反应容器中固定可回收载体或通过直接从样品基质中收回可回收载体来完成分离过程。本领域的普通专业人员将认识到，可洗涤固定载体以减少不需要的物质。

现在说明第5步，靶-探针载体复合物基本上不含外源RNA、DNA、增溶剂、杂质和细胞物质，并可监测是否存在有表明靶分子存在的标记物。然而，仍可能有少量外源DNA、RNA、增溶剂、杂质和细胞物质非专一性地结合在载体（S₁）上。而且，如果未结合的含义是指未与靶子结合，则未结合的第二探针（P₂）也可能非专一性地结合在载体（S₁）上，并能够从非同位素标记物中产生信号。具有标记物的未结合的第二探针部分（P₂）的存在是本底噪音的一个重要原因，并因此降低检测过程的准确性。

因此，作为第5步的另一选择，第一载体（S₁）可悬浮在第二基质中，其中的载体（S₁）通过变法从靶-探针复合物中分离。

变性以后，即在第6步中，从第二基质中去除第一载体（S₁）并代以第二载体（S₂）。第二载体（S₂）包括能够与第一探针的配体部分（L₁）结合的抗配体部分（A₁）。

到第7步，在结合条件下，靶-探针复合物与第二载体（S₂）再度结合。除去第一载体（S₁）则从检测基质中除掉了非专一性结合在第一载体（S₁）上的外源物质、碎片和探针。

如第8步所示，可检测含有靶-探针复合物的基质中是否存在标记物。然而，可以一步纯化检测基质以进一步降低本底和外源物质的存在，它们可能是通过非专一性结合在第一可回收载体（S₁）上而从样品基质中带来的，并随后从第一载体（S₁）上溶解或解离到第二基质中。

这样，可使第二可回收载体（S₂）与第三基质接触，使基质置于从载体上释放靶-探针复合物的条件下，除去载体以完成又一个循环。循环次数是可以选择的，根据样品类型、标记物的类型和检测设备的灵敏度而定。在不同的时间可使用不同类型的载体。因此，可回收载体可用来从最初的样品基质或溶液中收集或浓缩靶-探针复合物，以避免膜或滤器中经常遇到的阻塞问题。第二或第三载体最好包括带有抗配体部分（A₁）的膜或滤器，该抗配体结合在第一探针（P₁）的配体部分（L₁）上。膜或滤器载体能够简化方法中的各步骤，能够一次完成靶-探针复合物的回收。

本发明进一步的实施方案特别适用于降低本底噪音。现在参见图3，其中描述了一个前面图2所示的检测方法的修正方法。在图3中，多核苷酸靶与类似于图2所述探针部分的第一和第二探针部分（P₁和P₂）形成一种复合物。但是，此第二探针包括一个第二配体（L₂）。第二配体（L₂）可包括（仅作为举例）与硼酸盐抗配体复合的末端单核糖核苷酸、与互补共聚物结合的另一种共聚物、与抗生物素蛋白抗配体结合的生物素配体、或如图所示，均聚物配体（L₁）、以及一种互补的均聚物抗配体（A₂）。

现在说明第一步，使一种能够选择性地与第二探针（P₂）结合的本底载体（仅仅只是当它未与靶子结合时如此）与含有靶-探针复合物的基质接触。基质中进一步含有游离的、解离的第一和第二探针（P₁和P₂）。标记的第二探针（P₂）造成本底噪音，使它通过摩尔数大大过量的结合在本底载体（B₁）上的抗配体部分（A₂）而专一性地与本底载体（B₁）结合。使未结合的标记探针（P₂）与本底载体（B₁）结合以后，如第2步所示从基质中除去本底载体（B₁）。可监测含有靶-探针复合物的基质，看是否存在第二探针（P₂）所携的标记物及本底噪音的降低。另外，含有靶-探针复合物的基质可进行进一步处理。

进一步的处理可包括进一步的本底降低，即重复图3中所述第1至第3步，或者重复前面图2中所述的步骤。例如，降低本底的步骤可在图2所示的任一点并入临床样品的处理过程，其中，第一和第二探针的配体和抗配体部分不干扰第一和第二探针，而且靶子与第一和第二探针形成复合物。

本方法的一个实施方案可借助于图4中以图解给出的装置进行。该装置包括下列主要元件：至少一个容器控制探针与靶分子和可回收载体结合的装置，从样品溶液中分离可回收载体的装置，从可回收载体上释放靶分子的装置。这些主要元件可采取多种形式，下面给予更详细的描述。

下面将为了说明应用图2和图3中所述方法的目的描述该装置，该方法涉及包括多核苷酸的靶分子。因此，在第1位置，将临床样品置于含有增溶剂例如增溶盐、酶、表面活性剂的容器中，以溶解细胞物质并释放核酸。容器可包括搅拌装置以促进细胞破碎。容器可包括适于装样品的各类容器、试管和小杯等。

在一个为自动化分析而设计的仪器中，图4给出的装置最好包括接受大量容器的装置。为了说明的目的，含有样品的容器依次进行分析。这样，容器被转移至第1位置，然后转移至下面的位置进行检测法的各种步骤。

各种位置由转移装置连接。转移装置可包括可旋转的转台、传送带等。运用于医院中的临床环境时，转移手段可包括人工转运。这样，医务人员可从病人得到组织样品并将此样品置于容器中。样品处理，包括组织样品的破碎和最初的与增溶剂和试剂的混合，可以在病床边开始，并且当容器转移至下一位置进行进一步处理时继续进行。位置的编号仅为了说明的目的。本领域的专业人员将认识到，某些位置或步骤可以合并或逆转。

现在回到第1位置，使样品和增溶剂置于容器中，其中的搅拌器充分混合样品与增溶剂，从细胞物质中释放核酸。转移装置将容器移至第二位置，容器在此处接受试剂。

试剂包括第一多核苷酸探针和第二多核苷酸探针。第一和第二探针能够与多核苷酸靶形成复合物，其中两个探针在互不干扰的部位结合在靶子上。第一探针还能在结合条件下与可回收载体结合。第二多核苷酸探针包括一个可检测的标记部分。试剂和核酸样品通过加热装置变性并转移至第3位置。

在第3位置，容器接受的圆圈表示的第一载体。第一载体通过合适的装置（包括搅拌装置）均一地分散于样品基质中。合适的载体例子包括（并非限制）聚苯乙烯小球、磁性小球和其他颗粒或纤维物质。如所说明的那样，第一载体包括一种具有脱氧胸苷（dT）的多核苷酸抗配体磁性小球。第一探针包括脱氧腺苷（dA）的尾巴，它在结合或杂交条件下能与第一载体结合。

转移至第4位置，通过冷却装置进行冷却，以对样品基质施予杂交条件。然而，本领域的专业人员将认识到，改变盐浓度的装置可以轻易地取代热控装置。这样，多核苷酸靶与第一和第二探针形成复合物。进一步，第一探针的均聚物脱氧腺苷（dA）尾巴与可回收载体的均聚物脱氧胸苷（dT）杂交。

容器从第4位置转移至第5位置，可回收载体在此处通过活化磁性装置被固定在容器壁上。如果用聚苯乙烯小球取代磁性小球，聚苯乙烯小球则通过过滤或密度差固定。处理样品基质中携有的大部分外源DNA、RNA、增溶剂、细胞物质和杂质。洗涤固定化的可回收载体以进一步去除外源DNA、RNA，增溶剂、细胞物质和杂质。

而且，尽管指出了可回收载体被固定于反应容器的壁上，还是有可能通过磁性装置从反应容器中去除可回收载体，并处理含有外源DNA、RNA、增溶剂和细胞物质的第一反应容器，这些物质可以非专一性地结合在反应容器的壁上。

可回收载体置于第二基质中，原来的容器或新的容器都可使用。在第二基质中含有可回收载体的容器转移至第6位置。

在第6位置，通过合适的装置（包括加热装置）使第二基质处于变性条件下。变性过程从可回收载体的（dT）均聚物上释放靶-第一和第二探针复合物。可能携有外源DNA、RNA、杂质和细胞物质的第一载体从第二基质中除去。然后使本底载体与第二基质接触并转移至第7位置。

在第7位置，一个冷却装置使第二基质处于杂交温度下。本底载体包括能与第二探针上的配体专一结合的第二抗配体。例如（并非限制），可合成第二探针的末端核苷酸，使它是一个与第二载体携有的硼酸盐部分专一性结合的核糖衍生物。由于空间障碍，作为探针-靶复合物的一部分结合在靶上的第二探针将不会结合在第三载体携有的硼酸盐上。然而，未结合的第二探针将专一性地结合在硼酸盐载体上。另外，第二探针可包括与第二载体上的脱氧鸟苷（dG）均聚物连接子结合的均聚物如脱氧胞苷（dC）。均聚物的长度设计，要使得靶-第一和第二探针与第二载体的复合物是不稳定的;然而，单独第二探针与第二载体的复合物在反应参数下是稳定的。实际上，本底载体与未结合第二探针的本底捕获结合可能是非可逆的。

下一步，含有第二基质和本底载体的容器转移至第8位置，在此处，具有未与靶-探针复合物结合的第二探针链的本底载体从第二基质中分离出来。本底载体的分离从基质中除掉了非专一性的本底噪音。

正如所说明的那样，本底捕获是由小球起作用的。然而，本领域的专业人员将认识到，靶-第一和第二探针复合物从临床样品中的最初的纯化，去除了所有或大部分固体碎片，从而使得可在滤器或膜载体上进行本底捕获，第二基质可通过它们被洗去。

含有靶-探针复合物并降低了本底的纯化基质从第8位置转移至第9位置。在第9位置，以膜或滤器表示的第三载体与第二基质接触，并通过加热装置使其处于杂交温度下。第三载体包括与第一探针的第一配体部分结合的第一抗配体部分。因此，如果第一探针的第一配体部分是脱氧腺苷（dA）均聚物，则第三载体可能包括脱氧胸苷（dT）均聚物。正如所说明的那样，第三载体包括滤器或膜，第二基质能通过它们洗涤;然而，也可使用小球或颗粒。第三载体的作用是进一步浓缩靶-第一和第二探针复合物，进一步降低本底和不专一性地结合在第三载体上的干扰物质。转移至第10位置，第三载体浓缩靶-第一和第二探针复合物，使得能够检测第二探针所携带的标记部分。

下述典型方法和实验例子进一步说明本发明，它们举例说明了较好的实施方案的特征。

Ⅰ.方法

A.材料

所有试剂至少为分析纯。以商标BIO-MAG上市的含有功能氨基的磁性小球得自Advanced Magnetics，Inc.of Cambridge，MA。

在本实例中，所有标记的核苷酸均得自New England Nuclear，末端转脱氧核苷酰酶（TDT）得自Life Sciences，Inc.，St.Petersburg，Florida。寡聚核苷酸pdT₁₀得自Pharmacia PL Biochemicals。

B.探针合成

下面给出了典型的程序和方法。现在参考图6，根据图6的构建图谱（Spicer，E.K.and J.A.Noble，1982，J.of Biol.Chem.257，55716-55751），构建大肠杆菌（Escherichia coli）肠毒素基因elt Al有意义链的两个探针。

合成的一套探针始于基因序列的483位置，并上行30个核苷酸的长度，此后称此探针为A483探针。合成的第二探针始于基因序列的532位置，并上行30个核苷酸的长度，此后称此探针为A532探针。合成的第三探针始于基因序列的726位置，并上行39个核苷酸的长度，此后称此探针为A726探针。下面的表1给出了具体的碱基序列（5′至3′）：

表1

探针序列

5 A483 AGA CCG GTA TTA CAG AAA TCT GAA TAT AGC

A532 AGA TTA GCA GGT TTC CCA CCG GAT CAC CAA

A726 GTC AGA GGT TGA CAT ATA TAA CAG AAT TCG GGG GGG GGG

探针合成方法在技术上是已知的。计数系统采用从Intelligenetics序列库ECO ELT Al得到的768个核苷酸的序列。

在A726探针3′末端的10个鸟嘌呤碱基中，朝向5′端的三个鸟嘌呤碱基能与肠毒素基因（tox gene）的3个互补的胞嘧啶碱基结合。3个胞嘧啶的区段的在DNA中是常见的。这10个鸟嘌呤碱基形成的配体能与载体携有的Poly C抗配体如寡聚dc-纤维素结合。但是，7个鸟嘌呤碱基在37℃下不会与载体形成稳定的结合，如果探针由于空间障碍和靶-探针复合物的大小而结合在靶子上则更是如此。A 726探针通过在其3′端用末端转移酶随机加入大约三个残基的³²P-dc和³²P-dG而进行修饰。

本领域的专业人员将认识到，可容易地合成其他靶分子的其他探针。

C.制备

实例1、2和3中的靶子是肠毒素基因elt Al。肠毒素基因elt Al作为一部分携带在得自斯坦福大学的质粒EWD-299上。

在实例1中，在Luria液体培养基中使产肠毒素细菌生长至对数期。裂解产肠毒素细菌并分离质粒EWD-299。进一步用限制性酶XbaⅠ和HindⅢ消化质粒EWD-299。用475碱基长的片段作为靶子，并通过用1%琼脂糖凝胶电泳洗脱纯化。为了求得捕获步骤的效率，根据生产厂家的说明，用多核苷酸激酶以³²P-ATP标记片段的5′末端。

在实例2和3中，产肠毒素细菌和不产肠毒素的野生型大肠杆菌JM83分别培养至对数期。用野生型大肠杆菌作为对照。通过在增溶溶液中基本溶解细胞，分别制备产肠毒素细菌和野生型细菌的提取物。这样，在Luria液体培养基中的细菌培养物中，加入固体硫氰酸胍（GuSCN）至浓度为5MGuSCN、Tris-Hcl至浓度为0.3M和EDTA（pH7）至浓度为0.1M。然后，使助溶的细菌溶液加热至100℃保持5分钟，然后冷却。所得到的产肠毒素细菌提取物用不产肠毒素的野生型细菌提取物作系列稀释。用常规技术测定每个细胞中的tox质粒浓度和提取物中的细胞数。最初的提取物溶于GuSCN中，含有大约每毫升10⁹个产肠毒素大肠杆菌和100个质粒/细胞。

D.小球合成

由磁性小球制备可回收载体。其他可回收载体包括颗粒、纤维、聚苯乙烯小球或其他能从基质中进行物理分离的材料。用10个碱基长的脱氧胸苷加成物合成磁性小球，使小球以易于可逆的方式与带有脱氧腺苷尾巴的探针结合。

这样，100ml具有胺功能团的小球如BIO-MAG（M4100）小球，在4个275mlT型瓶中用20mM磷酸钠（pH6.7）洗涤四次。然后，用在20mM磷酸钠中的1%戊二醛洗涤小球。接着，使小球于室温下在100ml在20mM磷酸钠（pH6.7）中的10%戊二醛中反应3小时。然后用20mM磷酸钠（pH6.7）充分洗涤小球，然后再用20mM磷酸盐（pH7.6）洗涤一次。

另外，根据Chu，B.C.F.，G.M.Wahl，and L.E.Orgel;Nucleic Acid Res.11，6513-6529（1983）所述方法，制备纯化的pdT₁₀的乙二胺（EDA）加成物（EDA-ST₁₀）。EDA-dT₁₀的浓度在20mM磷酸盐（pH7.6）中调整至10D/ml。

使EDA-dT₁₀与磁性小球合并，从而允许EDA-dT₁₀与小球的游离醛基反应。将EDA-dT₁₀和小球的混合物分入许多50ml聚丙烯管中。使含有反应混合物和小球的管置于试管旋转器中并在室温下搅拌过夜。

然后，在大的275mlT型瓶中，用20mM磷酸盐（pH6.7）的无菌洗涤液洗涤小球5次，以除去非共价结合的EDA-dT₁₀，然后用洗涤液稀释至200ml。

至于保存，小球能在20mM磷酸盐缓冲液中保存数月，在其中加入0.1%的迭氮钠和0.1%的SDS。小球制备物于4℃下避光保存。

然后使小球在缓冲液中（此后称为“预杂交缓冲液”）进行预杂交以封闭非专一性的结合位点，该缓冲液含有0.75M磷酸钠（pH6.8），0.5%月桂酰肌氨酸钠，10微克/ml大肠杆菌DNA，0.5mg/ml牛血清清蛋白（BSA）（无核酸酶）和5mM乙二胺四乙酸（EDTA）。在将探针和小球用于靶捕获法之前，使小球进行两次预杂交。预杂交方法包括将小球置于10倍的预杂交缓冲液中。

第一次预杂交于60℃在搅拌下进行。第二次预杂交于室温下和旋转中进行。在溶液中加入0.1%的异戊醇作为消泡剂。

根据下列方法测定dT₁₀衍生的小球的结合能力。在不同的容器中，分别以³²P-dT和³²P-dA分别标记dT₅₀和dA₅₀和5′末端，使其比强（Sa）约为10⁶dpm/μg。接着，用三氯乙酸沉淀后精确测定已知量的反应后的dT₅₀的Sa。

然后，具有基本相同Sa（100，000-200，000dpm/mg之间）的5μg³²P-dA₅₀和5μg³²P-dT₅₀，分别加到含有预杂交缓冲液的试管中，使其体积为1ml。

将已知体积的预杂交小球样品置于四个试管中。四个试管中有两个每管接受0.5ml³²P-dA₅₀混合物，剩下的两个试管接受0.5ml³²P-dT₅₀混合物。所有四份溶液都置于杂交条件下5分钟。然后固定小球并洗涤。然后监测溶液的放射性强度。总结合能力C，以微克计的小球制备物来说如下式计算：

C＝V（A-T）/X

在上面的等式中，X为³²P-dT₅₀的比强，单位为cpm/mg，V是总体积与样品体积的体积比，A是悬浮在³²P-dA溶液中的小球的平均强度，单位为cpm，T是悬浮在³²P-dT溶液中的小球的平均强度，单位为cpm。

本领域的专业人员将认识到，可用其他核苷酸结合物或均频物制成其他小球、颗粒、纤维等。例如，在50ml20mM磷酸钠（pH7.6）中，以含有100mgpoly A（分子量＞100，000）的溶液代替纯化的dT₁₀的EDA加成物，就能制备Poly A衍生的小球。

E.靶捕获方法

用小球制备物捕获多核苷酸靶。下面给出了靶捕获方法的典型实验，说明了可回收载体和可逆捕获法（为了说明的目的，而并非限制），该方法将用第一探针A483和第二探针A532进行讨论。用³²P-dCTP和³²P-dGTP随机标记第一探针A483的3′末端，使其比放射性大约为10¹⁰dpm/mg。第二探针A532通过末端转移酶用大约70个未标记的dA残基接尾。

首先，在1.4M氯化钠中，将200μg/ml标记探针A483和400μg/ml接尾探针A532与不同量的热变性475聚体于65℃下混合15分钟，该聚体是肠毒素基因的XbaⅠ-Hind Ⅲ限制性片段。

然后，在进行预杂交以降低磁性小球的非专一性结合之后，通过使含有靶和探针部分的基质与一等份具有3μg/mldA₅₀结合能力的dT₁₀-磁性小球接触而启动靶捕获过程。室温下在5ml聚丙烯试管中的0.1ml预杂交缓冲液中，使磁性小球和探针-靶复合物保温2-5分钟。

将试管置于Corning管磁性分离器中。Corning管磁性分离器在活化后产生通过聚丙烯管的磁场，它使磁性小球固定在试管内壁上。在磁性小球固定在聚丙烯管侧壁上的时间中，移出最初的基质并弃去。

在固定状态时，用0.6ml含有异戊醇作为消泡剂的预杂交缓冲液洗涤小球3次。加入预杂交缓冲液后，去掉磁场并激烈旋转基质而使小球再次悬浮。

然后，再次施加磁场以固定小球，使预杂交缓冲液移出并弃去。加入预杂交缓冲液，再悬浮小球，固定小球和弃去预杂交缓冲液的循环重复2次。保持在小球上的靶-探针复合物可用于进一步处理，包括另外的检测步骤、本底捕获或靶捕获的进一步循环。

较好的靶捕获方法包括释放靶-探针复合物和在第二载体上再次捕获。该载体与第一载体的化学性质最好不同。

靶-探针复合物的释放根据下述典型程序进行。去掉最后的预杂交缓冲液后，在含小球的试管中加入预杂交缓冲液。使小球在60℃下搅拌保温1-2分钟以从小球上释放探针-靶复合物。再次在60℃下活化磁性分离器，从试管中取出含有游离的靶-探针复合物的洗脱液。洗脱液可在另外的可回收载体上再次捕获，或使之在常规载体上进行最终捕获。本领域的专业人员将认识到，靶-探针复合物在可回收载体如本实例的磁性小球上的捕获和释放能够重复进行，重复次数可依降低杂交本底所需要而定。

探针-靶复合物的典型的最终捕获，是在含有非专一性结合或共价结合的dT-3000的硝酸纤维素滤器或尼龙膜上进行。这样，通过使小球于60℃下在预杂交缓冲液中加热2分钟，而从磁性小球上释放它所携带的靶-探针复合物。固定小球，取出洗脱液并使之通过0.2微米的acrodisc（Gelman）以去掉磁性细粒。含有dT-3000的硝酸纤维素滤器选择、结合并捕获未标记探针上的dA尾巴。

在靶-探针复合物的最终捕获中，使用化学性质不同的固态载体可避免结合可能对前面所用载体具有高亲和性的本底分子。仅作为说明指出，对特定载体具有天然高亲和力的低水平污染物，有可能与探针-靶复合物一起重复地与载体结合和脱离。这种低水平污染物若通过重复使用同样组成的可回载体，则不能像将它们暴露于组成很不相同的载体那样完全地稀释去掉。通过使用化学性质不同的物质从载体上释放靶-探针复合物并再捕获，也能够降低水平污染物。

F.本底捕获方法

本底捕获方法能够选择性地降低本底噪音，从而能够检测表明靶子存在的真实信号。本底捕获可运用于单探针系统或使用多于两个探针的系统。例如，在使用单一探针的本底捕获法中，该探针包括一个标记物和一个配体。探针能够与靶结合，而配体只有当探针未与靶结合时才能与载体形成稳定的键合。

同样（仅作为举例），在靶捕获中使用多探针的本底捕获法包括两个探针。第一靶捕获探针具有能与第一载体结合的未标记配体，它用来捕获靶子，第二本底捕获探针具有可检测的标记物，包括能与第二本底载体结合的第二配体。为了在检测中增强信噪比，本底捕获对靶捕获来说是很有用的补充。

下面给出了典型的本底捕获程序，该程序利用第一靶捕获探针A532和第二本底捕获探针A726及肠毒素基因elt Al靶。本领域的专业人员将认识到，为了说明目的而使用的探针仅供选择。其他探针也可使用。

为了最初的靶捕获，探针A532用大约100个dA残基接尾，该尾巴可与dT₁₀共价连接的磁性小球可逆结合;为了最终的靶捕获，使dT3000非专一性地结合在硝酸纤维素上。探针A726用末端转移酶将大约 3个残基的³²P-dC和³²P-dG随机加入3′端进行末端标记。当探针A726未与靶子杂交时，它能够与dC-纤维素结合。

含有靶-第一和第二探针复合物并可能含有未结合的第二探针的溶液与dC-纤维素混合，混合物温度维持在37℃。37℃的温度高于dG₇与寡聚dC的解离温度，从而防止靶-第一和第二探针复合物与dC-纤维素结合。此温度也低于dG₁₀和寡聚dC的解离温度，从而促进具有dG尾巴的未结合的第二探针与dC-纤维素结合。另外，靶-第一和第二探针复合物对dC-纤维素载体的接近比未结合的第二探针受到更大程度的空间障碍。离心去除含有第二探针A726的dC-纤维素，但本领域的专业人员知道，其他方法如过滤也可使用。剩余的洗脱液含有靶-第一和第二探针复合物，以及浓度降低的未结合的标记的第二探针A726。

G.实例

本领域的专业人员将认识到，可回收载体的制备、探针制备、靶捕获和本底捕获等典型程序能够为了特殊需要和目的而进行修饰。除非特别指出，下述实例包括了上面概括的典型程序。

实例1 利用磁性小球进行靶捕获和检测

用两种探针和一种磁性小球可回收载体进行靶捕获检测。靶子包括肠毒素基因elt Al的XbaⅠ-HindⅢ片段。第一探针包括A532三十聚体寡聚核苷酸探针，它用能与磁性小球载体的dT₁₀残基结合的130个未标记的dA残基接尾。第二探针包括A483三十聚体寡聚核苷酸探针，它能与同样的靶子结合，结合位点在第一探针杂交位点下游的20个核苷酸处。第二探针通过用³²P-dCTP和³²P-dGTP接上三十聚体寡聚核苷酸尾巴而进行标记，使其放射性比强为10¹⁰dPm/μg。

接尾的第一探针和标记的第二探针，于65℃下在1.4M氯化钠中与不同数量的热变性的475聚体保温15分钟，此475聚体是tox基因的限制性片段。作为非专一性结合的本底对照，接尾的第一探针和标记的第二探针在没有任何靶子的同样溶液中保温。作为专一性结合的对照，组成另外两份反应混合物。一份反应混合物包括接尾的第一探针和未标记的第二探针，它们与4μg变性的大肠杆菌DNA保温，第二份反应混合物包括接尾的第一探针和标记的第二探针，它们与10μg变性的人DNA在没有任何靶DNA的同样反应混合物中保温。

15分钟杂交期之后，样品与dT衍生的磁性小球在0.7ml0.75M磷酸盐缓冲液（pH6.8）中保温5分钟。通过磁场固定小球，如前述充分洗涤。于60℃下在0.6ml0.20M磷酸盐缓冲液（pH6.8）中将靶-探针复合物从小球上洗脱。第一套小球从洗脱液和靶-探针复合物中分离。在洗脱液中加入第二组磁性小组，置于结合条件下以再次捕获靶-探针复合物，洗涤此第二套小球，靶子再次从小球上洗脱，从洗脱液中分离小球。

在含有靶-探针复合物的洗脱液中加入第三套小球，置于结合条件下使小球再次捕获靶-探针复合物。然后充分洗涤小球，如前述从小球上洗脱靶子。然后从洗脱液中分离小球，使洗脱液通过dT3000-尼龙，进入2ml的正方形槽，捕获靶-探针复合物。

dT3000-尼龙膜是这样制备的，利用杂交槽（hybrislot）装置（Bethesda Research Laboratory）使2μg dT3000共价结合在尼龙上。简而言之，将无盐的Tris缓冲液中的dT3000（Life Sciences）直接点在尼龙膜如Gene-Screen TM（New England Nuclear）上。使膜在室温下干燥10分钟，然后在红外灯下再干燥10分钟，再使之冷却至室温10分钟。含有尼龙膜的滤器装置颠倒于紫外透照器（Fotodyne）上，40uW/cm³暴露于紫外光下2分钟，以使dT3000和滤器交联。

依次使下述溶液过膜而使dT3000膜预杂交：

（1）1% SDS;

（2）在0.5%SDS中的0.5mg/mlBSA;

（3）预杂交缓冲液。

可能含有靶-探针复合物的dT3000尼龙用0.2M磷酸钠和5mMEDTA洗涤。使尼龙载体放射自显影过夜，以检查是否存在第二探针的³²P标记物。放射自显影后，从滤器上切下显影带并在碱性闪烁液中计数。计数在含有3毫微微摩尔的限制性片段（含有tox基因）的溶液中为2100和1400cpm。含有30×10^-18摩尔限制性片段（含有tox基团）的样品的计数为62cpm。

第三个不含DNA的样品产生的计数为7cpm。第四个含10μg热变性的人DNA的样品产生的计数为0cpm。第5份含有4μg热变性大肠杆菌DNA的溶液的计数为7cpm。此程序的绝对灵敏度估计为10^-18摩尔tox基因。回收标记的靶-探针复合物的总效率估计为输入的1-2%。检测表现出良好的专一性。在含有人DNA或大肠杆菌DNA的样品中的标记探针数量与完全不含DNA样品中的一样多。重复实验程序产生了差不多5%总的靶捕获效率。此方法将标记的未杂交探针本底从最初的10¹¹个分子水平降至约10⁴个分子。本底的降低意味着改善了7个数量级，这足以补偿捕获效率的降低还有余。

实例2

本实例特点是具有本底捕获的靶捕获。靶和本底捕获，利用未标记的第一靶捕获探针即靶捕获中所述的A532，和第二标记的本底捕获探针A726进行。

首先，将160ng/mlgA接尾的A532和40ng/ml³²P标记的探针A726合并形成探针混合物。探针混合物加至含有不同数量产肠毒素基因的5μl细菌提取物中。提取物-探针混合物在22℃下保温15分钟。

15分钟杂交期以后，用10倍体积的预杂交缓冲液稀释样品，与dT衍生的磁性小球在0.7ml0.75M磷酸盐缓冲液（pH6.8）中保温5分钟，以进行靶捕获。用磁场固定小球并充分洗涤。靶-第一和第二探针复合物如前所述从第一载体上洗脱，去掉第一固态载体。

然后，含有靶-第一和第二探针复合物和可能含有未结合的第二探针的洗脱液与dC-纤维素混合，混合物温度维持37℃。37℃的温度高于dG₇与寡聚dC的解离温度，以防止靶-第一和第二探针复合物与dC-纤维素结合。此温度也低于dG₁₀和寡聚dC的解离温度，以促进具有dG₁₀尾的未结合的第二探针结合在dC-纤维素上。靶-第一和第二探针复合物与dC-纤维素接近的空间障碍比未结合的第二探针更大。离心去除dC-纤维素，但本领域的专业人员知道，也可使用其他方法例如过滤。

剩下的洗脱液通过0.2μm的acrodisc（Gelman），以除去磁性和纤维素细粒。然后，洗脱液在22℃下通过含有dT 3000的硝酸纤维素滤器。硝酸纤维素进行最终的靶捕获。

表2在下面给出了本底捕获的应用：

表2

步骤信号（cpm）噪音（cpm）

第一实验

靶捕获之前（未知） 200，000

靶捕获之后 1058 231

本底捕获之后 495 25

过滤以后 395 ＜1

第二实验

靶捕获之前（未知） 400，000

靶捕获之后 1588 642

本底捕获之后 1084 69

（未进行过滤步骤）

噪音减至少于1cpm以后，能够检测样品中极少量的靶子。已检测到低于10^-18摩尔的靶子，这一数值在临床应用所必需的范围内。

一轮靶捕获去掉大约3个数量级的本底。一轮本底捕获去掉1个数量级的未被初始靶捕获去掉的本底。通过过滤进行的最终靶捕获（第二轮靶捕获）去掉2个数量级的未被开始两步中任一步去掉的本底。在此实例中，靶和本底捕获法独立作用将本底降低大约6个数量级。本底捕获在第一次靶捕获之后运用效果似乎更好。显然，本底捕获对样品中的杂物比靶捕获灵敏得多。

在靶捕获之后结合使用本底捕获比单独运用任一种产生更大的效益。

虽然前述实例引用了放射性标记物，但本方法对利用非放射性标记物的检测法可望具有最大的作用。具体地说，本发明可应用于发光标记物，包括荧光和化学发光剂。合适的荧光标记物包括（仅作为举例，而并非限制）荧光素、芘、吖啶、硫代罗丹明（Sulforhodamine）、四溴荧光素、赤藓红及其衍生物等。合适的化学发光剂包括（仅作为举例，并非限制）微过氧化物酶、鲁米诺、异鲁米诺、葡糖氧化酶、吖啶鎓酯及其衍生物等。

实例3

下述实例的特征是非放射性标记物和从示踪生物基质中进行多轮靶捕获。示踪生物基质类似于从医疗环境中得到的临床样品。

如前述制备产肠毒素大肠杆菌和野生型大肠杆菌的细胞提取物。为了测定在类似于临床环境的情况下检测tox基因的灵敏度，如前述用含有野生型大肠杆菌的提取物稀释含有产毒素细菌的提取物。

下列物质从无名供体得到：人粪便样品、牛奶、人唾液、人痰、人全血、人血清、人尿和人精液。使临床样品在10分钟内溶解。粪便样品由于具有固态性质，将它溶于5M GuSCN，0.3M Tris-Hcl（pH7.4），0.1MEDTA（pH7），1%β-巯基乙醇的溶液中。溶解以后，将样品分成等份，每等份加入已知量的产毒素大肠杆菌或野生型大肠杆菌以示踪。使混合物通过粗过滤装置（Biorad Econoclumn），在100℃下加热5分钟。

剩下的样品有更多的液体性质，用与粪便不同的方式处理。将液体样品加到固体GuSCN中使最终浓度为5M。固态GuSCN还含有足够的Tris-Hcl，EDTA和β-巯基乙醇，使其最终浓度与粪便例子中相同。然后，样品分成等份，每等份加入已知量的产毒素大肠杆菌或野生型大肠杆菌示踪。使混合物通过粗过滤装置（Biorad Econoeolumn），在100℃下加热5分钟。

实例3中的探针制备与前述实例不同。用质粒pBR322产生第一捕获探针。该质粒用Hha Ⅰ和HaeⅢ进行限制性消化，质粒片段借助于末端转移酶用大约100个dA残基接尾。靶质粒与pBR322有很强的同源性（Spicer and Noble，JBC，257，5716-21）。因此，第一捕获探针以相对较大的数量，从质粒pBR322双链的多片段中产生。

制备第二标记探针使其专一性地与肠毒素基因靶结合。第二标记探针由克隆在噬菌体M13mp18中的elt Al基因的EcoRⅠ-HindⅢ限制性片段产生。用噬菌体感染大肠杆菌HB101，使之生长到对数中期。收集大肠杆菌，分离噬菌体。利用得自Bethesda Research Laboratories的缺口转译药盒，用生物素化的dCTP（Enzo Biochemicals）对噬菌体进行缺口转译。大约5%核苷酸被生物素基核苷酸取代，形成了生物素标记的第二探针。

使8μg/ml M13-tox第二探针和4μg/ml加dA尾的第一探针在20mM Tuis-HCl（pH7.4）和2mMEDTA中结合，制备探针混合物。探针混合物在100℃下加热10分钟以使探针变性。

一倍体积的探针混合物与一倍体积的系列稀释的样品混合，形成杂交混合物。使杂交混合物于57℃置于杂交条件下保持15分钟。随后杂交混合物用十倍体积的封闭缓冲液（0.75M磷酸钠，pH6.8，0.5%月桂酰肌氨酸钠，10mg/ml大肠杆菌DNA，0.5mg/ml牛血清清蛋白（无核酸酶的BSA）和5mM EDTA）稀释。在杂交混合物中加入如前述制备的dT₁₀衍生的磁性小球。在22℃下维持杂交条件大约1分钟。然后通过用磁场固定小球，将小球从杂交混合物中分离出来。15分钟的间隔洗涤小球2次，去掉生物样品中的杂质和未杂交的生物素标记的第二探针。

然后，在大约1分钟的期间内，于65℃在封闭缓冲液中从磁性小球上洗脱第一和第二探针-靶复合物。分离洗脱液和第一小球。

在大约7分钟的期间内，第一和第二探针-靶复合物可逆地结合在第二套小球上并再次释放。然后在稀释的洗脱液中加入第二套dT₁₀衍生的小球，在22℃下维持杂交条件约1分钟。然后洗涤小球，再悬浮于封闭缓冲液中。然后使小球-封闭缓冲液混合物置于65℃下，以释放第一和第二探针-靶复合物。

在5分钟的时间内，在硝酸纤维素上进行第一和第二探针-靶复合物的最终捕获。来自第二小球的洗脱液用Gelman acrodisc（0.2μm）过滤。随后含有第一和第二探针-靶复合物的洗脱液在22℃通过dT3000硝酸纤维素滤器（与封闭缓冲液预杂交）。

在大约30分钟的期间内，进一步处理滤器以检测第二探针的生物素标记。检测中所用缓冲液组成在下面表3给出。

表3 检测缓冲液

缓冲液号组成

1 1M Nacl，0.1M Tris-HCl（pH7.4），

5mM MgCl₂，0.1%吐温-20

1a 1号与5mg/mlBSA，10μg/ml大肠

杆菌DNA

2 1号与5%BSA，0.5%吐温-20

3 0.1M NaCl，0.1M Tris-HCl（pH

9.5），50mM MgCl₂

首先，携有第一和第二探针-靶复合物的滤器在2号检测缓冲液中保温大约5分钟。然后，滤器在用1a号检测缓冲液以1∶200稀释的链丝菌抗生素蛋白碱性磷酸酯酶（Bethesda Research Laboratories）中保温5分钟。此后，滤器在1分钟内用1号检测缓冲液洗涤3次，然后在1分钟内用3号检测缓冲液洗涤2次。

然后，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸（BCIP）和氮蓝四唑（NBT）（Kierkegaard and Perry）在3号检测缓冲液中稀释12倍，通过0.2μm的acrodisc过滤。稀释的BCIP和NBT溶液加入滤器中，使之在37℃显色15分钟。

然后，滤器在50mM Tris-HCl（pH7.4）和10mMEDTA中保温1分钟以终止反应。在滤器上观察或在CS 930（Shimadzu Scientific）上进行光密度扫描以测定灵敏度。

本方法中的各步骤概括于下面的表4中。

表4 时间经历

步骤号所需时间（分）累积时间（分）

1，生物样品的溶解; 10 10

DNA变性

2，加入标记和未标记 15 25

的探针;

于57℃在溶液中杂交

3，在磁性小球上捕获探 1 26

针-靶复合物

4，洗涤磁性小球以去除 15 41

生物样品中的杂质和

杂交本底

5，洗脱探针-靶复合物 1 42

6，在第二套小球上重复 7 49

步骤3-5（省略洗涤）

7，使探针-靶复合物与 5 54

dT3000-硝酸纤维素结合

8，在封闭缓净液中保温 5 59

滤器

9，结合链丝菌抗生物素 5 64

蛋白-碱性磷酸酯酶

10，洗涤 5 69

11，加入染料以检测酶 15 84

12，淬灭反应 1 85

虽然，在表4给出的实例中耗掉的时间只是1个多小时，该方法仍然能够加以改变并能在更短时间内进行。灵敏度可与之比拟的非放射性探针检测法可能需要12小时至几天，并需要精细地制备样品。

本方法的灵敏度在下面表5中给出：

表5 灵敏度水平

生物样品杂交混合物中的浓度细菌数目

单一的细菌提取物 1500

人粪便 2.5%（w/v） 2000

牛奶 12.5%（v/v） 3000

人唾液 12.5%（v/v） 3000

人尿 12.5%（v/v） 9000

人精液 2.5%（v/v） 9000

人血 12.5%（v/v） 9000

人血清 12.5%（v/v） 9000

人痰 12.5%（v/v） 9000

进一步，本方法能够进一步修改以提高灵敏度。例如，在多次捕获和释放的循环中，结合使用热洗脱和化学洗脱产生的信噪比，与单一形式的洗脱相比较，不论是单一的多次热洗脱还是单一的多次化学洗脱都要高出5倍。

运用同样的释放或洗脱方法倾向于从载体上释放同样的本底。然而，运用不同的释放条件则倾向于在载体上保持可被另外方式洗脱的本底。在两种不同的物理或化学条件下，本底与靶子的表现不可能是一致的。

靶-探针复合物从磁性小球上典型的化学洗脱，包括使小球与3M GuSCN在室温下接触1分钟。热洗脱的例子前面已有描述。

检测细菌的能力也可通过制备核糖体RNA序列的探针而得到改善。与基因组DNA和有临床意义的质粒DNA相比较，核糖体RNA序列在每个细胞中的靶子高出一千倍。

因此，本发明的特征是捕获靶子和降低本底的方法及进行亲和检测的设备。虽然已说明并描述了较好的实施方案，但应当理解，本发明能够被改变和修饰，因此，本发明不应限于所给出的精确细节，而应包括落入下述权利要求中的权限范围内的变化和改变。

Claims

1、一种检测样品中的靶核酸的方法，包括下列步骤：

a.使样品在结合条件下与试剂接触，其中该试剂包括第一探针和第二探针，第一和第二探针能与该靶结合形成一复合物，其中该第一和第二探针均各自与该靶结合，形成一种探针靶产物，第一探针在结合条件下与靶相结合时能结合到产物载体上，第二探针具有能被检测的标记部分，当第二探针不与靶结合时，它能结合到本底载体上；

b.使样品在结合条件下与本底载体接触，以允许本底载体与未结合的第二探针形成一种复合物；

c.使本底载体与样品基本上分离，以除去未结合的第二探针，以降低本底；

d.使样品和试剂在结合条件下与一种产物载体接触，该产物载体能与第一探针结合，捕获该探针靶产物；

e.使产物载体与样品基本上分离，形成一种移去产物，该移去产物在靶存在下包含探针靶产物；及

f.检测移去产物中是否存在表明靶核酸存在的标记部分。

2、根据权利要求1的方法，其中所述的本底载体包括小球。

3、根据权利要求2的方法，其中所述小球能够与磁场相互作用。

4、根据权利要求1的方法，其中所述的产物载体能够基本均一地分散于样品中。

5、根据权利要求3的方法，其中所述小球由聚苯乙烯组成。

6、根据权利要求1的方法，还包括下列步骤：

a.使分离出的产物载体与第二基质接触;

b.置该第二基质于释放条件下，以允许从产物载体中释出探针靶产物;

c.使产物载体与第二基质分离，以降低本底;

d.使第二基质与在结合条件下能与探针靶产物形成复合物的第二产物载体接触，以便捕获该探针靶产物;

e.使第二产物载体与第二基质基本上分离，形成一种第二移去产物，该第二移去产物在靶存在下包含探针靶产物;及

f）检测该第二移去产物中是否存在表明靶核酸存在的标记部分。

7、根据权利要求6的方法，其中在所述第二基质中的所述释放条件是从包括从化学洗脱和热洗脱的一组释放方法中选择的。

8、根据权利要求6的方法，其中所述第一和第二载体的化学性质不同。

9、根据权利要求2的方法，其中的小球能与第二探针的核酸顺序专一性结合并能分散于一种液体基质中。

10、根据权利要求9的方法，其中所述小球能够与磁场相互作用。

11、根据权利要求9的方法，其中的小球进一步包括能与探针结合的寡聚核苷酸配体。

12、根据权利要求9的方法，其中所述小球由聚苯乙烯组成。

13、根据权利要求9的方法，其中所述小球直径为1-10微米。

14、根据权利要求9的方法，其中所述小球具有一个均聚物与之共价结合的表面。

15、一种检测样品中的靶核酸的方法，包括下列步骤：

a.使样品在结合条件下与试剂接触，其中该试剂包括第一核酸探针和第二核酸探针，该第一和第二探针能与该靶结合形成一复合物，其中该第一和第二探针均各自与该靶结合，形成一种探针靶产物，第一探针在结合条件下能结合到产物载体上，而第二探针具有能被检测的标记部分;

b.使样品和试剂在结合条件下与一种产物载体接触，该产物载体能与第一探针结合，而第一探针与靶结合成为探针靶产物的一部分;

c.使该产物载体与样品基本上分离，形成一种移去产物，该产物在样品中的靶存在下包含该探针靶产物;

d.使产物载体与第二基质接触，置该产物载体于释放条件下，以在第二基质中形成一种释放产物，该产物在靶存在下包括所述的探针靶产物;

e.使该产物载体与该第二基质基本上分离;

f.使第二基质在结合条件下与第二载体接触，该第二载体能与探针靶产物结合;

g.使第二载体与第二基质基本上分离，以形成一种第二移去产物，该产物在靶存在下包含所述探针靶产物;和

h.检测第二移去产物中是否存在表明靶存在的标记部分。

16、根据权利要求15的方法，其中的产物载体和第二产物载体包括能基本均匀分散在样品中的小球。

17、根据权利要求16的方法，其中的小球能与磁场相互作用。

18、根据权利要求15的方法，还包括下列步骤：

a.使第二产物载体与第三基质接触，置该第二产物载体于释放条件下以形成第三基质中的一种释放产物，在靶存在情况下，该产物包括所述的探针靶产物;

b.使第二产物载体与第三基质基本上分离;

c.使第三基质在结合条件下与第三载体接触，该第三载体能与探针靶产物相结合;

d.使第三载体与第三基质基本上分离，形成一种第三移去产物，在靶存在下，该产物包括探针靶产物;及

e.检测第三移去产物中是否存在表明靶存在的标记部分。

19、根据权利要求15的方法，其中在检测得到的移去产物中是否存在标记物之前，重复进行释放和再捕获步骤。

20、根据权利要求19的方法，其中在检测得到的移去产物中是否存在标记物之前，重复进行释放和再捕获步骤。