DE3781860T2

DE3781860T2 - Ziel- und hintergrundfangmethoden sowie vorrichtung fuer affinitaetsuntersuchungen.

Info

Publication number: DE3781860T2
Application number: DE8787309308T
Authority: DE
Inventors: Mark Leo Collins
Original assignee: BP Corp North America Inc
Current assignee: BP Corp North America Inc
Priority date: 1986-10-23
Filing date: 1987-10-21
Publication date: 1993-05-06
Anticipated expiration: 2007-10-22
Also published as: EP0265244B1; ZA877772B; CN87107800A; US5780224A; ATE80949T1; EP0265244A2; JP2975603B2; CA1309329C; CN1016645B; AU8009787A; EP0265244A3; DE3781860D1; JPS63188399A; AU621812B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden und Kits zur Verwendung beim Einfangen von Targetmolekülen (Zielmolekülen). Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Methoden und Kits zum Einfangen von Desoxyribonucleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsaure (RNA) aus klinischen Proben. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen Methoden zur raschen, empfindlichen Ermittlung von Nukleinsäure-Targets in klinischen Proben zur Verfügung, die für nicht-radioaktive Markierungstechniken und Automation verwendbar sind.
Die folgenden Definitionen werden vorgesehen, um das Verstandnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern. Der Ausdruck "biologisches Bindungspaar", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf irgendein Paar von Molekülen, welche eine natürliche Affinität oder Bindungskapazität zeigen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "Ligand" auf ein Molekül des biologischen Bindungspaares und der Ausdruck "Antiligand" oder "Rezeptor" bezieht sich auf das Gegenmolekül des biologischen Bindungspaares. Beispielsweise haben Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ohne Einschränkung Anwendung bei Nukleinsäurehybridisierungsbestimmungen, wo das biologische Bindungspaar zwei komplementäre Stränge der Polynukleinsäure umfaßt. Einer der Stränge wird als Ligand bezeichnet und der andere Strang wird als Antiligand bezeichnet. Jedoch kann das biologische Bindungspaar Antigene und Antikörper, Arzneimittel und Arzneimittelrezeptorstellen und Enzyme und Enzymsubstrate einschließen.
Der Ausdruck "Untersuchungsprobe" bzw. "Sonde" (engl. probe) bezieht sich auf einen Liganden bekannter Eigenschaften, der in der Lage ist, an einen Target (Ziel)-selektiv zu binden. Angewandt auf Nukleinsäuren bezieht sich der Ausdruck "Sonde" auf einen Strang von Nukleinsäure mit einer Basissequenz komplementär zu einem Targetstrang.
Der Ausdruck "Markierung" (engl. label) oder "Kennzeichnung" bezieht sich auf eine Molekülhälfte oder -teil, die zur Ermittlung befähigt ist, einschließlich beispielsweise ohne Einschränkung, radioaktive Isotope, Enzyme, lumineszierende Mittel und Farbstoffe. Der Ausdruck "Mittel" wird in breitem Sinne verwendet einschließlich irgendeiner Molekülhälfte bzw. -teil, welche an Reaktionen teilnimmt, die zu einer feststellbaren Reaktion führen. Der Ausdruck "Kofaktor" wird in breitem Sinne verwendet und schließt jegliche(n) Molekülhälfte oder -teil ein, welche an Reaktionen mit dem Mittel teilnimmt.
Der Ausdruck "wiedergewinnbar" wird in breitem Sinne verwendet, um eine Einheit bzw. Gebilde zu beschreiben, welche im wesentlichen innerhalb eines Mediums dispergiert und aus dem Medium durch Immobilisieren, Filtrieren, Aufteilen bzw. Trennen oder dergleichen entfernt oder abgetrennt werden kann. Der Ausdruck "Träger", wenn allein verwendet, umfaßt übliche Träger wie Filter und Membrane sowie wiedergewinnbare Träger.
Der Ausdruck "reversibel" im Hinblick auf die Bindung von Liganden und Antiliganden bedeutet befähigt zum Binden oder Freilassen nach Auferlegung von Änderungen, welche die gesamtchemische Natur des Liganden und Antiliganden nicht dauernd verändern. Beispielsweise wird, ohne Einschränkung, eine reversible Bindung eine solche Bindung und Freisetzung umfassen, die durch Änderungen im pH, der Temperatur und ionischer Stärke gesteuert werden, die nicht den Liganden oder Antiliganden zerstören. Genetische Information wird in lebenden Zellen in fadenförmigen Molekülen von DNA gespeichert. In vivo ist das DNA-Molekül eine Doppelhelix, wovon jeder Strang eine Kette von Nukleotiden ist. Jedes Nukleotid ist durch eine von vier Basen charakterisiert: Andenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und Cytosin (C). Die Basen sind komplementär in dem Sinne, daß aufgrund der Orientierung der funktionellen Gruppen gewisse Basenpaare sich anziehen und aneinander durch Wasserstoffbindungen gebunden sind. Adenin in einem Strang von DNA paart sich mit Thymin in einem gegenüberliegenden komplementären Strang. Guanin in einem Strang von DNA paart sich mit Cytosin in einem gegenüberliegenden komplementären Strang. In RNA ist die Thymin-Base durch Uracil (U) ersetzt, welches sich mit Cytosin in einem gegenüberliegenden komplementären Strang paart.
DNA besteht aus kovalent gebundenen Ketten von Desoxyribonukletiden und RNA besteht aus kovalent gebundenen Ketten von Ribonukleotiden. Der genetische Code eines lebenden Organismus wird auf dem DNA-Strang in der Sequenz der Basenpaare geführt.
Jede Nukleinsäure ist durch eine Phosphordiesterbrücke zwischen der 5'-ständigen Hydroxylgruppe des Zuckers des einen Nukleotids und der 3'-ständigen Hydroxylgruppe des Zuckers eines benachbarten Nukleotids verbunden. Jeder lineare Strang von natürlich auftretender DNA oder RNA hat ein 5'-Hydroxylende und ein 3'-Hydroxylende. Die endständigen Enden der Polynukleotide werden oft als 5'-Enden oder 3'-Enden in bezug auf die betreffende freie Hydroxylgruppe bezeichnet. Komplementäre Stränge von DNA und RNA bilden antiparallele Komplexe, worin das 3'-endständige Ende eines Stranges an das 5'- endständige Ende des gegenüberliegenden Stranges orientiert und gebunden ist.
Die Nukleinsäurehybridisierungsbestimmungen basieren auf der Tendenz von zwei Nukleinsäuresträngen an komplementären Bereichen zu paaren. Gegenwärtig werden Nukleinsäurehybridisierungsbestimmungen in erster Linie dazu verwendet, um einmalige bzw. unique DNA- oder RNA-Basensequenzen oder spezifische Gene in einem vollständigen DNA-Molekül, in Mischungen von Nukleinsäure oder in Mischungen von Nukleinsäurefragmenten festzustellen und zu identifizieren.
Die Identifizierung von einmaligen DNA- oder RNA-Sequenzen oder spezifischer Gene innerhalb der Gesamt-DNA oder -RNA extrahiert aus Gewebe- oder Kulturproben, kann die Anwesenheit von physiologischen oder pathologischen Zuständen anzeigen. Insbesondere kann die Identifizierung von einmaligen DNA- oder RNA-Sequenzen oder spezifischen Genen innerhalb der Gesamt-DNA oder -RNA, extrahiert aus menschlichem oder tierischem Gewebe, die Anwesenheit von genetischen Erkrankungen oder Zuständen anzeigen wie Sichelzellenanämie, Gewebeverträglichkeit, Karcinom- oder Vorkarcinom-Zustände, oder bakterielle oder Virusinfektionen. Die Identifizierung von einzigen bzw. uniquen (engl) DNA- oder RNA-Sequenzen oder spezifischen Genen innerhalb der Gesamt-DNA oder -RNA, extrahiert aus bakteriellen Kulturen oder Bakterien enthaltenden Gewebe, kann die Anwesenheit von antibiotischer Resistenz, Toxinen, Viren oder Plasmiden anzeigen, oder die Identifizierung zwischen Bakterientypen schaffen.
So haben Nukteinsäurehybridisierungsbestimmungen ein großes Gewicht bei der Diagnose und Ermittlung von Krankheit. Ein weiteres Potential existiert in der Landwirtschaft und Nahrungsmittelherstellung, wo Nukleinsäurehybridisierungsbestimmungen dazu verwendet werden können, um Pflanzenpathogenese oder Toxin erzeugende Bakterien zu ermitteln.
Eines der am meisten verwendeten Nukleinsäurehybridisierungsbestimmungsverfahren ist bekannt als Southern blot filter hybridization-Verfahren oder einfach das Southern-Verfahren (Southern, E., J. Mol. Biol. I, 98, 503 (1975)). Das Southern- Verfahren wird dazu verwendet, um Target-DNA- oder -RNA- Sequenzen zu identifizieren. Dieses Verfahren wird im allgemeinen durchgeführt, indem eine Probe von RNA oder DNA auf Nitrocellulose-Folien immobilisiert wird. Die immobilisierte Probe RNA oder DNA wird mit radiomarkierten Untersuchungsprobensträngen von DNA in Kontakt gebracht, die eine Basensequenz komplementär zu der Targetsequenz hat und eine radioaktive Hälfte trägt, die festgestellt werden kann. Die Hybridisierung zwischen der Untersuchungsprobe (Sonde) und der DNA-Probe wird stattfinden gelassen.
Der Hybridisierungsprozeß ist im allgemeinen sehr spezifisch. Die markierte Untersuchungsprobe (Sonde) wird nicht mit der DNA- oder RNA-Probe kombinieren, wenn die zwei Nukleotideinheiten im wesentlichen die Basenpaarorganisation nicht teilen. Die Hybridisierung kann von 3 bis 48 Stunden in Abhängigkeit von den gegebenen Bedingungen dauern.
Jedoch ist in der Praxis immer eine nicht-spezifische Bindung der markierten Untersuchungsprobe (Sonde) auf Träger, was als "Hintergrundrauschen bzw. Hintergrundgeräusch" bei der Ermittlung auftritt. Das Hintergrundrauschen vermindert die Empfindlichkeit einer Bestimmung. Die nicht-hybridisierte DNA-Sonde wird anschließend weggewaschen. Die Nitrocellulose-Folie wird auf eine Folie von UV-Film gebracht und der Film wird exponiert. Der UV-Film wird mit den exponierten Flächen des Films entwickelt, der die DNA-Fragmente identifiziert, welche zu der DNA-Sonde hybridisiert wurden, und daher die interessierende Basenpaarsequenz hat.
Die Verwendung von radioaktiven Markierungsmitteln in Verbindung mit Southern-Bestimmungstechniken ermöglichte die Anwendung von Nukleinsäurebestimmungen an klinischen Proben. Die radioaktive Umwandlung ist selbst in klinischen Proben, welche fremdes Protein- und organisches Material enthalten, feststellbar. Jedoch kann die Anwesenheit von fremdem Protein- und organischem Material zur nicht-spezifischen Bindung der
Sonde an den festen Träger beitragen. Außerdem erfordert die Verwendung von radioaktiven Markierungstechniken eine lange Expositionszeit, um die Banden auf dem UV-Film sichtbar zu machen. Ein typisches Southern-Verfahren kann 1 bis 7 Tage zur Belichtung erfordern. Die Verwendung von radioaktiven Markierungsmitteln erfordert weiterhin spezielle Laboratoriumsverfahren und Genehmigungen.
Die obigen Probleme zusammen mit den Bestimmungen, welche radioisotope Markierungen beinhalten, haben zu der Entwicklung von Techniken unter Anwendung nicht-isotoper Markierungen geführt. Beispiele für nicht-isotopische Markierungen umfassen Enzyme, lumineszierende Mittel und Farbstoffe. Lumineszierende Markierungen senden Licht nach Anregung durch eine äußere Energiequelle aus und können in Kategorien eingeteilt werden in Abhängigkeit von der Quelle der erregenden Energie einschließlich: radiolumineszente Markierungen, wobei die Energie aus Hochenergieteilchen stammt; chemilumineszente Markierungen, welche die Energie aus chemischen Reaktionen erhalten; biolumineszente Markierungen, worin die erregende Energie in einem biologischen System angewandt wird; und photolumineszente oder fluoreszierende Markierungen, welche durch Einheiten von elektromagnetischer Strahlung (Photonen) von Infrarot-, sichtbarem oder ultraviolettem Licht erregbar sind (vgl. allgemein Smith et al., Ann. Clin. Biochem., 18:253, 274 (1981)).
Nicht-isotopische Bestimmungstechniken unter Verwendung von Markierungen, welche durch nicht-radioaktive Energiequellen erregbar sind, vermeiden gesundheitliche Risiken und Genehmigungsprobleme, welche mit radioisotopen Markierungsbestimmungstechniken verbunden sind. Darüber hinaus versprechen nicht-isotope Bestimmungstechniken eine rasche Ermittlung und so wird die lange Belichtungszeit, welche mit der Verwendung von UV-Film verbunden ist, vermieden.
Jedoch haben die nicht-isotope Bestimmungen nicht die Empfindlichkeit oder Spezifität der Bestimmungsverfahren erbracht, die notwendig als zuverlässig zu betrachten sind. Bei den Lumineszenzbestimmungen kann die Anwesenheit von Proteinen und anderen Molekülen, die in biologischen Proben enthalten sind, das Streuen der erregenden Strahlung verursachen oder kann Licht im Spektrum der Emission der lumineszierenden Markierung absorbieren, was ein Löschen der lumineszierenden Untersuchungsprobe zur Folge hat.
Bei enzymatischen Bestimmungen kann die Anwesenheit von Proteinen und anderen Molekülen, die in biologischen Proben getragen sind, mit der Aktivität des Enzyms kollidieren.
In gleicher Weise kann bei kolorimetrischen Bestimmungen der Farbwechsel nicht feststellbar über Proteine und andere Materialien, die in biologischen Proben enthalten sind, sein.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind mit Target-(Ziel) und Hintergrund-Einfangen auf Trägern und wiedergewinnbaren Trägern einschließlich magnetischen Teilchen befaßt. Magnetische Teilchen wurden als Träger für die Synthese von organischen Verbindungen einschließlich Oligomeren wie DNA, RNA, Polypeptiden und anderen Multieinheitsmolekülen, welche definierte Sequenzen haben, vorgeschlagen. Vgl. beispielsweise europäische Patentanmeldung Nr. 83 112 493.8 von Steven A. Benner und Genetics Institute. Jedoch wurden magnetische Teilchen nicht als wiedergewinnbare Träger für Target (Ziel)-Einfangen und Hintergrund-Entfernung vorgeschlagen.
Eine andere Anwendung von magnetischen Teilchen schließt magnetische Flüssigkeiten im Blut ein, R. Neubauer, IEEE transactions on magnetics MAG-9, 445 (1973); Anhängen von funktionellen Gruppen zur Trennung von Biomolekülen, US-Patent Nr. 3 970 518 von I. Giaver; Markieren von Zelloberflächenrezeptoren, S. Margel et al., Jour. Imm. Meth. 28:341-53 (1979); Anhängen an Arzneimittel für magnetisches Target während der Therapie, A. Senyei et al., J. App. Phys., 49 (6): 3578 (1978), K. Wieder et al., Pro. Soc. of Exp. Bio. Med. 58:141 (1978), K. Mosbach und U. Shroeder, FEBS letters 102:112 (1979); selektive Trennung von Viren, Bakterien und anderen Zellen, R. Molday et al., Nature 268:438 (1977); und Einverleiben von magnetischen Teilchen als Träger bei der Gelaffinitätschromatographie für biologische Polymere, K. Mosbach und L. Anderson, Nature 270:359 (1977).
Die Verwendung eines Zwei-Sondensystems, um das Target-Einfangen auf üblichen, nicht-wiedergewinnbaren Tragern zu bewirken, wurde in einem Artikel von Ann-Christine Syuanen, Matti, Laaksonen und Hans Soderlaud mit der Bezeichnung "Fast Quantification of Nucleic Acid Hybrids by AffinityBased Hybrid Collection", Nucleic Acids Research, 14(12): 5037 (1986) vorgeschlagen.
Biochem Soc Trans 12 (1984), 693-694, Clin Chem 31 (1985) 1438-1443 und EP-A-0 139 489 beschreibt Sandwich-Hybridisierungsbestimmungen zur Bestimmung von Targetnukleinsäuren unter Verwendung von DNA, die auf einen festen Oberflächenträger zusammen mit beispielsweise enzym-markierten Sonden immobilisiert ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schafft eine Methode zur Bestimmung von Targetnukleinsäure in einer Probe, umfassend die Schritte:
a. Inkontaktbringen der Probe mit einem Reagens unter Bindungsbedingungen, wobei das Reagens eine erste Nukleinsäure- Sonde und eine zweite Nukleinsäure-Sonde umfaßt und wobei die erste und zweite Sonde in der Lage ist, einen Komplex mit dem Target (Ziel) zu bilden, worin die erste und zweite Sonde jeweils an den Target gebunden sind, um ein Sonden-Targetprodukt zu bilden, wobei die erste Sonde in der Lage ist, an einen wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen zu binden, während diese erste Sonde an den Target gebunden ist, und die zweite Sonde eine Markierungshälfte hat, die zur Detektion fähig ist, wobei diese zweite Sonde zur Bindung an einen Hintergrundträger in der Lage ist, wenn diese zweite Sonde nicht an den Target gebunden ist;
b. Inkontaktbringen dieser Probe mit einem Hintergrundträger unter Bindungsbedingungen, um die Bildung eines Komplexes zwischen diesem Hintergrundträger und ungebundener zweiter Sonde zu erlauben;
c. im wesentlichen Abtrennen dieser Hintergrundträgers von der Probe, um ungebundene zweite Sonde zu entfernen, um den Hintergrund zu vermindern;
d. Inkontaktbringen dieser Probe und des Reagens mit einem wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen, wobei dieser wiedergewinnbare Träger in der Lage ist, an die genannte erste Sonde zu binden, um das genannte Sonden-Targetprodukt zu fangen;
e. im wesentlichen Abtrennen des wiedergewinnbaren Trägers aus der Probe unter Bildung eines Entfernungsprodukts, das in Gegenwart von Target Sonden/Target-Produkt umfaßt, und
f. Überwachen des Entfernungsprodukts auf Anwesenheit des Markierungsteils, was die Anwesenheit von Targetnukleinsäure anzeigt.
Die Erfindung schafft auch eine Methode zur Bestimmung einer Probe für Targetnukleinsäure umfassend:
a. Inkontaktbringen der Probe mit Reagens unter Bindungsbedingungen, wobei das Reagens eine erste Nukleinsäure-Sonde und eine zweite Nukleinsäure-Sonde umfaßt, wobei die erste und zweite Sonde in der Lage ist, einen Komplex mit dem Target zu bilden, wobei die erste und zweite Sonde jeweils an das Ziel gebunden sind, um ein Sonden-Targetprodukt zu bilden, wobei die erste Sonde in der Lage ist, an einen wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen zu binden und die zweite Sonde einen Markierungsteil hat, der zur Detektion befähigt ist;
b. Inkontaktbringen der Probe und des Reagens mit einem wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen, wobei der wiedergewinnbare Träger in der Lage ist, diese erste Sonde zu binden, während die erste Sonde an Target als Teil dieses Sonden-Targetprodukts gebunden ist;
c. im wesentlichen Abtrennen des wiedergewinnbaren Trägers von der Probe unter Bildung eines Entfernungsprodukts, das in Gegenwart von Target das Sonden-Targetprodukt umfaßt;
d. Inkontaktbringen des wiedergewinnbaren Trägers mit einem zweiten Medium und Unterwerfen des Produktträgers Freisetzungsbedingungen, um das Sonden-Targetprodukt in das zweite Medium hinein freizusetzen;
e. im wesentlichen Abtrennen des wiedergewinnbaren Trägers von dem zweiten Medium;
f. Inkontaktbringen des zweiten Mediums mit einem zweiten wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen, wobei dieser zweite wiedergewinnbare Träger in der Lage ist, mit dem Sonden-Targetprodukt zu binden;
g. im wesentlichen Abtrennen des zweiten wiedergewinnbaren Trägers von dem zweiten Medium zur Bildung eines zweiten Entgernungsprodukts, das in Anwesenheit von Target dieses Sonden- Targetprodukt einschließt; und
h. Überwachen dieses zweiten Entfernungsprodukts auf Anwesenheit des genannten Markierungsteils, der die Anwesenheit des Targets anzeigt.
Die Erfindung schafft weiter ein Verfahren zur Bestimmung einer Probe für Targetnukleinsäure, umfassend die Schritte:
a. Inkontaktbringen der Probe mit Reagens einschließlich einer Nukleinsäuresonde unter Bindungsbedingungen, wobei die Sonde ein Markierungsteil hat, in der Lage ist, einen Sonden-Targetkomplex mit dem Target zu bilden und in der Lage ist, einen Komplex mit einem Hintergrundträger zu bilden, wenn die Sonde nicht an den Target gebunden ist;
b. Inkontaktbringen der Probe und Reagens mit einem Hintergrundträger unter Bindungsbedingungen, wobei der Hintergrundträger in der Lage ist, die ungebundene Sonde unter Bindungsbedingungen zu binden;
c. im wesentlichen Abtrennen des Hintergrundträgers aus der Probe, um ungebundene Sonde zu entfernen, um den Hintergrund zu vermindern;
d. Inkontaktbringen von Probe und Reagens mit einem wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen, wobei dieser wiedergewinnbare Träger in der Lage ist, an die Sonde zu binden, um den Sonden-Target-Komplex einzufangen;
e. im wesentlichen Abtrennen des wiedergewinnbaren Trägers von der Probe und Bildung eines Entfernungsprodukts, das in Anwesenheit von Target Sonden/Targetprodukt umfaßt; und
f. Überwachen des Entfernungsprodukts auf Anwesenheit des Markierungsteils der die Anwesenheit von Targetnukleinsäure anzeigt.
Die Erfindung betrifft zusätzlich ein Kit zur Detektion der Anwesenheit einer Targetnukleinsäure in einem Probenmedium, umfassend:
a. ein erstes Sondenreagens, das in der Lage ist, unter Bindungsbedingungen an den Target zu binden und ein wiedergewinnbarer Träger;
b. ein zweites Sondenreagens, das in der Lage ist, unter Bindungsbedingungen an den Target und an einen Hintergrundträger zu binden, wenn nicht an den Target gebunden ist und einschließend einen Markierungsteil, der zur Detektion in der Lage ist;
c. einen wiedergewinnbaren Träger, der in der Lage ist, unter Bindungsbedingungen an das erste Sondenreagens zu binden und zur Trennung von dem Probenmedium in der Lage ist, und
d. einen Hintergrundträger, der in der Lage ist, unter Bindungsbedingungen an das zweite Sondenreagens zu binden und zur Abtrennung von dem Probenmedium in der Lage ist; oder
a. ein erstes Sondenreagens, das in der Lage ist, unter Bindungsbedingungen an den Target zu binden und einen wiedergewinnbaren Träger;
b. ein zweites Sondenreagens, das unter Bindungsbedingungen an den Target zu binden in der Lage ist und ein Markierungsteil einschließt, das zur Detektion in der Lage ist; und
c. eine Vielzahl von wiedergewinnbaren Trägern, die in der Lage sind, unter Bindungsbedingungen an die erste Sonde zu binden und zur Trennung von dem Probenmedium in der Lage sind; oder
a. ein Sondenreagens, das zur Bindung an den Target unter Bindungsbedingungen in der Lage ist, einen Hintergrundträger, wenn nicht an den Target gebunden, und einen wiedergewinnbaren Träger und weiterhin einschließend einen Markierungsteil, der zur Detektion in der Lage ist;
b. einen wiedergewinnbaren Träger, der zur Bindung an das Sondenreagens unter Bindungsbedingungen in der Lage ist, wenn das Sondenreagens nicht an den Target gebunden ist, und zur Abtrennung von dem Probenmedium in der Lage ist; und
c. einen Hintergrundträger, der zur Bindung an das Sondenreagens unter Bindungsbedingungen in der Lage ist, wenn das Sondenreagens nicht an den Target gebunden ist, und zur Abtrennung von dem Probenmedium in der Lage ist.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Methoden und Kits zur Durchführung von Bestimmungen für interessierende Targetmoleküle zu schaffen. Weitere Ziele werden im folgenden genannt. Zweckmäßigerweise können Durchführungsformen der vorliegenden Erfindung, ohne eine Beschränkung darzustellen, in Bereichen von Targetfangen, Hintergrundfangen und Kombinationen davon eingeordnet werden.
Zunächst wird das Targetfangen behandelt und eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kennzeichnet Fangen- und Freisetzungszyklen, um Targetmoleküle zu isolieren. Die Methode umfaßt das Inkontaktbringen eines Probenmediums, das möglicherweise Targetmoleküle enthält, mit Sonden und einem ersten Träger, der assoziiert ist oder sich zu assoziieren vermag, mit wenigstens einer Sonde unter Bindungsbedingungen. Die Sonden sind in der Lage, selektiv reversibel an das Targetmolekül zu binden unter Bildung eines Komplexes, der das Sondentarget und den ersten wiedergewinnbaren Träger einschließt. Dann wird der Träger von dem Probenmedium abgetrennt und in Kontakt mit einem zweiten Medium gebracht. Weiter wird der Träger Freisetzungsbedingungen unterworfen, um den Target aus dem Träger freizusetzen und der Träger wird von dem zweiten Medium abgetrennt. Dann wird ein zweiter Träger mit dem zweiten Medium unter Bindungsbedingungen in Kontakt gebracht. Der zweite Träger ist assoziiert mit oder in der Lage zu assoziieren mit wenigstens einer Sonde, die selektiv an das Targetmolekül zu binden vermag. Unter Bindungsbedingungen bildet das Target einen Komplex mit der Sonde, die an den zweiten Träger zur weiteren Verarbeitung assoziiert ist.
Vorzugsweise ist der erste Träger wiedergewinnbar in dem Sinne, daß er in der Lage ist, zu einer wesentlichen homogenen Dispersion innerhalb des Probenmediums und im wesentlichen physikalisch abgetrennt, wiedergewonnen oder innerhalb des Probenmediums immobilisiert werden kann.
Die Abtrennung des ersten Trägers von dem ersten Medium entfernt nicht spezifisch gebundene Zellen-Debris, die an den ersten Träger anhaftet. Ein weiteres Binden des Targetmoleküls an einen zweiten Träger konzentriert den Target weiter zur Auffindung und erlaubt weitere Freisetzungs-Einfangzyklen zur besseren Reinigung.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Methode kennzeichnet einen wiedergewinnbaren Träger. Die Methode umfaßt das Inkontaktbringen der Probe, die möglicherweise Targetnukleinsäure trägt, mit einem wiedergewinnbaren Träger in Assoziation mit einem Sondenteil. Der wiedergewinnbare Träger vermag eine im wesentlichen homogene Dispersion innerhalb des Probenmediums zu bilden. Der Sondenteil kann an den wiedergewinnbaren Träger assoziiert sein, beispielsweise durch kovalente Bindung der Sondenhälfte an den wiedergewinnbaren Träger, durch Affinitätsassoziation, Wasserstoffbindung oder nicht spezifische Assoziation.
Der Träger kann viele Formen haben einschließlich beispielsweise Nitrocellulose, reduziert auf eine zerteilte Form, und wiedergewinnbar nach Passieren des den Träger enthaltenden Probenmediums durch ein Sieb; Nitrocellulose oder die Materialien imprägniert mit magnetischen Teilchen oder dergleichen, welche es der Nitrocellulose ermöglichen, innerhalb des Probenmediums bei Anwendung eines magnetischen Feldes zu wandern; Kügelchen oder Teilchen, welche filtriert werden können oder elektromagnetische Eigenschaften aufweisen; und Polystyrolkügelchen mit Verteilung an der Oberfläche eines wäßrigen Mediums.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt einen wiedergewinnbaren Träger, der magnetische Kügelchen umfaßt, gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit, in einem Probenmedium im wesentlichen homogen dispergiert zu sein. Vorzugsweise enthalten die magnetischen Kügelchen funktionelle primäre Amingruppen, welche die kovalente Bindung oder Assoziation einer Sondeneinheit an die magnetischen Trägerteilchen erleichtern. Vorzugsweise sind die magnetischen Trägerkügelchen Eindomänenmagnete und sind superparamagnetisch und zeigen keinen Restmagnetismus. Die erste Sonde schließt eine Sondenligandenhälfte ein, welche an einen Antiligand unter Bindungsbedingungen spezifisch zu binden vermag. Der wiedergewinnbare Träger ist im wesentlichen zu einer homogenen Dispersion innerhalb des Probenmediums fähig und umfaßt mindestens eine Antiligandenhälfte, die zur Bindung an einen Ligand unter Bindungsbedingungen in der Lage ist, um einen Target-Sonden-Trägerkomplex zu bilden. Dann werden der wiedergewinnbare Träger und das Probenmedium getrennt, damit das Probenmedium weiterverarbeitet werden kann.
Ausführungsformen der Erfindung sind zum Einfangen der Targetmoleküle aus einem klinischen Probenmedium enthaltend Fremdmaterial geeignet. Die Reihenfolge des Kontaktierens des Probenmediums mit Sonde oder wiedergewinnbarem Träger ist eine Sache der Auswahl. Jedoch kann die Wahl durch die Kinetik der Bindung zwischen der Sonde und Target einerseits und zwischen dem Sondenliganden und Trägerantiliganden auf der anderen Seite beeinflußt werden.
Angewandt auf Polynukleotid-Targetmoleküle und Homopolymerliganden und Antiliganden, ist die Homopolymerliganden- und Antiligandenbindung im allgemeinen schneller als die Sondenbindung an den Target. Die Sondenbindung an den Target wird sterisch gehindert, nachdem der Sondenligand an den Trägerantiligand gebunden ist. Eine bevorzugte Ausführungsform umfaßt das Kontaktieren des Probenmediums mit dem Reagens und Bringen des Gemisches auf Hybridisierungsbedingungen. Dann wird der wiedergewinnbare Träger in dem Reagens und Probenmedium dispergiert, um die Bildung eines Target- Sonden-Komplexes vor der Bildung von Sonden-Trägerkomplexen zu ermöglichen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kennzeichnet ein multiples Sondensystem.
Vorzugsweise umfaßt das Verfahren ein Reagens einschließlich einer ersten Sonde wie vorstehend beschrieben, und wenigstens eine zweite Sonde, die in der Lage ist, an das Targetmolekül zu binden und zur Detektion fähige Markierungsteile hat. Die zweite Sonde ist zur Bildung eines Target- (ersten und zweiten)-Sonden-Trägerkomplexes fähig. Der Schritt der Abtrennung des wiedergewinnbaren Trägers von dem Probenmedium entfernt nicht nur Fremdmaterial von dem Traget-(ersten und zweiten)-Sonden-Trägerkomplex sondern trennt auch jegliche zweite Sonde ab, welche nicht an den Target gebunden ist. Die zweite, nicht an den Target gebundene Sonde trägt zu Hintergrundgeräuschen bei, falschen Signalen, welche die Anwesenheit von Target anzeigen.
Die weitere Verarbeitung kann die Freisetzung des Target-(ersten und zweiten)-Sonden-Trägerkomplexes von dem wiedergewinnbaren Träger in ein zweites Medium und Wiederbinden des Target- (ersten und zweiten)-Sondenkomplexes zu einem neuen Träger einschließen. Der erste wiedergewinnbare Träger kann nicht spezifisch gebundene Materialien, welche in die Bestimmungsverfahren eingreifen können, tragen. So kann nach Freisetzung des Target-Sondenkomplexes aus dem wiedergewinnbaren Träger und Entfernung des wiedergewinnbaren Trägers, ein zweiter Träger mit einem Antiligandteil, der zur Bindung an den Sondenliganden fähig ist, in Kontakt gebracht werden mit dem Target-Sondenkomplex unter Bindungsbedingungen, um einen weiteren Zyklus von Target-Sondenbindung oder Fangen zur weiteren Reinigung und Konzentration des Target-Sondenkomplexes zu bewirken.
Das weitere Verfahren kann Hintergrundfangen einschließen. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Methode, wobei die zweite Sonde eine zweite Ligandenhälfte hat. Die Methode umfaßt weiterhin einen Hintergrundträger mit einer zweiten Antiligandenhälfte. Die zweite Ligandenhälfte und zweite Antiligandenhälfte sind in der Lage, unter Bindungsbedingungen stabil zu binden, nur wenn die zweite Sonde an das Targetmolekül ungebunden ist. Die Methode umfaßt weiterhin den Schritt des Kontaktierens eines Mediums, das potentiell eine zweite Sonde ungebunden zu dem Target enthält, mit einem Hintergrundträger unter Bindungsbedingungen. Dann wird der Hintergrundträger von dem Medium abgetrennt, um ungebundene zweite Sonde zu entfernen, was Hintergrundgeräusch vermindert.
Der Ausdruck "Hintergrundträger" wird im üblichen Sinne verwendet, um Filter und Membrane sowie wiedergewinnbare Träger einzuschließen. Die Bindung an den Hintergrundträger braucht nicht freisetzbar sein.
Ein bevorzugter wiedergewinnbarer Träger umfaßt beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung, Teilchen, Körner, Kügelchen oder Filamente, welche zur Dispersion innerhalb und Abtrennung von einem Medium fähig sind. Methoden zur Abtrennung umfassen beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung, Filtrieren, Zentrifugieren, Ausfällen, Oberflächenflotation, Absetzen oder Einführung von elektromagnetischen Feldern.
Die vorliegende Methode kann auf Polynukleotid-Targetmoleküle angewandt werden. Vorzugsweise binden die ersten und zweiten Sonden schnell an ein Polynukleotid-Target "in Lösung" im Gegensatz zur Situation, wo entweder der Target oder die Sonde immobilisiert ist.
Der wiedergewinnbare Träger, der zur wesentlichen Dispersion innerhalb einer Lösung fähig ist, erlaubt Wechselwirkungen zwischen dem wiedergewinnbaren Träger und Sonden, welche "in Lösung"-Hybridisierung nachahmen. In Lösung kann die Hybridisierung in etwa 3 bis 15 Minuten vervollständigt werden. Die raschen Hybridisierungen und die Einfachheit der vorliegenden Methoden erlauben eine Automation. Die vorliegende Methode erlaubt es, Nukleinsäuresequenzen, welche in klinischen Proben enthalten sind, von Fremdmaterial zu trennen, was es ermöglicht, daß die Methoden auf nicht isotope Markierungstechniken angewandt werden können.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Methode, wo das Target-Molekül ein Polynukleotid ist, umfaßt das Inkontaktbringen eines Probenmediums mit Reagens unter Bindungsbedingungen. Das Reagens umfaßt mindestens eine erste Polynukleotid-Sonde und mindestens eine zweite Polynukleotid-Sonde. Die erste Sonde ist zur Bildung eines Komplexes mit dem Targetmolekül fähig und hat einen ersten Homopolymer-Ligandenteil. Die zweite Sonde ist zur Bildung eines Komplexes mit dem Targetmolekül zusätzlich zu der ersten Sonde fähig. Die zweite Sonde umfaßt einen Markierungsteil, welcher einen zweiten Homopolymer-Ligandenteil hat, der verschieden ist von dem ersten Homopolymer-Liganden der ersten Sonde. Dann werden das Reagens und das Probenmedium mit einem Hintergrundträger und einem Targetfangträger in Kontakt gebracht. Der Hintergrundträger umfaßt mindestens eine zweite Homopolymer-Antiligandenhälfte, welche zur Bindung an die zweite Homopolymer-Ligandenhälfte der zweiten Sonde fähig ist, wenn diese zweite Sonde an den Target ungebunden ist. Der Targetfangträger umfaßt mindestens eine erste Homopolymerhälfte, welche zur Bindung an die erste Homopolymer-Ligandenhälfte der ersten Sonde fähig ist. Der Hintergrundträger und der Target-Fangträger entfernen Hintergrundgeräusch und der Target-fangträger konzentriert weiter den Target-(ersten und zweiten)- Sondenkomplex zur weiteren Verarbeitung und trennt den Target- (ersten und zweiten)-Sondenkomplex von Zelldebris ab. Die weitere Behandlung umfaßt das Auffinden der Markierungshälfte, was für die Anwesenheit des Targetmoleküls bezeichnend ist. Speziell zu den Ausführungsformen der Erfindung, die zum Hintergrundfang gehören, umfaßt eine Ausführungsform eine Methode, worin Sonde und Target die Bildung eines Komplexes ermöglicht wird. Zunächst wird eine unkomplexierte Sonde in Kontakt mit einem Träger unter Bindungsbedingungen gebracht. Der Träger vermag die ungebundene Sonde selektiv zu binden. Dann wird der Träger von dem Sonden-Targetkomplex abgetrennt.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Methode der Abtrennung einer Vielzahl von Targetmolekülen zur weiteren Be- bzw. Verarbeitung.
Eine Ausführungsform umfaßt die aufeinanderfolgende Zugabe und Entfernung von Sonden spezifisch für Targetmoleküle auf einer Vielzahl von Trägern. Eine weitere Ausführungsform umfaßt eine Methode, welche das Inkontaktbringen einer Probe mit einer ersten Reihe Sonden einschließt und Fangen des Targets und Sonde auf einer Vielzahl von Trägern. Die erste Sondenreihe umfaßt einen Liganden, der mit dem Träger assoziieren kann. Die erste Sondenreihe umfaßt Sonden für die ganze Vielzahl von Targets, welche in der Lage sind, an Trägern spezifisch für jedes Targetmolekül zu binden. Die Träger vermögen voneinander getrennt zu werden, wobei deren Abtrennung individuelle Typen von Targetmolekülen, welche mit dem Träger isoliert werden, ergibt.
Die vorliegende Erfindung kann eine Reagenszusammensetzung verwenden. Die Reagenszusammensetzung umfaßt eine erste Sonde und eine zweite Sonde. Die erste Sonde vermag einen Komplex mit einem Targetmolekül zu bilden und umfaßt eine Untersuchungsproben-Ligandenhälfte, die spezifisch zum Antiliganden unter Bindungsbedingungen zu binden vermag. Die zweite Untersuchungsprobe vermag einen Komplex mit dem Targetmolekül zu bilden und umfaßt eine zur Auffindung fähige Markierungshälfte. Die Reagenszusammensetzung kann dazu verwendet werden, um den Target in einem Probenmedium zu fangen und aufzufinden, wenn sie mit einem wiedergewinnbaren Träger, der Antiligandenhälften hat, verwendet wird.
Eine weitere Reagenszusammensetzung zur Verwendung gemäß der Erfindung umfaßt eine zweite Sonde mit einer zweiten Ligandenhälfte, welche an einen Antiliganden stabil zu binden vermag, nur in der Situation, wo die zweite Untersuchungsprobe an das Targetmolekül ungebunden ist. Die Reagenszusammensetzung erlaubt es, daß das Hintergrundgeräusch vermindert wird, indem eine Probe, welche potentiell eine ungebundene zweite Untersuchungsprobe mit einem Hintergrundträger enthält, der eine zweite Antiligandenhälfte hat, in Kontakt gebracht wird.
Bei der Erfindung kann ein Träger verwendet werden, der eine im wesentlichen homogene Dispersion in einem Probenmedium bildet, das Oligonukleotid-Antiliganden hat, angepaßt zur Bindung an Oligonukleotid-Liganden auf Untersuchungsproben (Sonden).
Eine bevorzugte Ausführungsform des Trägers umfaßt beispielsweise Teilchen, Körner, Filamente und Kügelchen, die zur Trennung befähigt sind. Mittel zur Abtrennung umfassen beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung, Ausfällen, Absetzen, Flotation, Filtrieren, Zentrifugieren und Elektromagnetismus.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfaßt Polystyrolkügelchen zwischen 10 bis 100 um (Mikron) im Durchmesser, welche zu einer im wesentlichen homogenen Dispersion befähigt sind, und Abtrennung aus einem Medium durch Filtrieren oder Flotation. Eine andere bevorzugte Ausführungsform umfaßt ferromagnetische Kügelchen. Ein ferromagnetisches Kügelchen, das unter der Handelsmarke BIO-MAG vertrieben wird, ist zu einer im wesentlichen homogenen Dispersion in einem wäßrigen Medium in der Lage, und kann durch ein elektromagnetisches Feld wiedergewonnen oder immobilisiert werden. Das ferromagnetische Kügelchen umfaßt einen Eisenkern, der mit einem Aminreagensüberzug bedeckt ist. Die Kügelchen sind im allgemeinen kugelig und haben einen Durchmesser von 1 Mikron. Die Polystyrol- und ferromagnetischen Kügelchen werden behandelt, daß sie Antiligandenhälften umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Kit zur Durchführung von Bestimmungen für Targetmoleküle, welche Teil eines biologischen Bindungspaares sind. In dem Fall, daß der Target ein Polynukleotid mit einer spezifischen Basensequenz ist, umfaßt das Kit ein Reagens, wobei das Reagens eine erste Polynukleotid- Sonde und eine zweite Polynukleotid- Sonde einschließt. Die ersten und zweiten Sonden sind in der Lage, an wechselweise exklusive Teile des Target zu binden, um einen Komplex zu bilden, worin beide Sonden an den Target gebunden sind. Die erste Sonde ist in der Lage, an einen ersten Träger unter Bindungsbedingungen reversibel zu binden und die zweite Sonde umfaßt einen Markierungsteil, der zum Auffinden in der Lage ist. Das Kit umfaßt ferner einen ersten Träger, was es dem Träger erlaubt, Komplexe mit dem Target und Sonden zu bilden, welche selektiv aus dem Probenmedium abgetrennt werden können,, Eine weitere Ausführungsform des vorliegenden Kits umfaßt eine zweite Sonde und einen Hintergrundträger. Die zweite Sonde ist, wenn sie nicht an den Target gebunden ist, in der Lage, an einen Hintergrundträger selektiv zu binden. Der Hintergrundträger vermag aus einem Medium abgetrennt zu werden, das Reagens enthält, um die nicht-spezifisch gebundene zweite Sonde zu entfernen.
Die vorliegende Erfindung verwendet ein Gerät zur Durchführung von Bestimmungen gemäß der vorliegenden Methode. Im Fall, daß der Target ein Polynukleotid ist, umfaßt das Gerät eine Reaktionskammer, welche zur Aufnahme von Reagens und Target in einem im wesentlichen vermischten homogenen Zustand geeignet ist. Das Reagens umfaßt eine erste und zweite Polynukleotid- Untersuchungsprobe (Sonde). Jede Untersuchungsprobe ist in der Lage, an wechselseitig ausschließliche Teile des Targets zu binden, unter Bildung eines Komplexes, worin beide Sonden an den Target gebunden sind. Die erste Sonde vermag an einen ersten Träger unter Bindungsbedingungen reversibel zu binden und die zweite Sonde umfaßt einen Markierungsteil, der zur Detektion in der Lage ist. Das Gerät umfaßt weiterhin Mittel zum Kontaktieren eines ersten Trägers mit dem Reagens und Probe, um zu erlauben, daß die erste Sonde und Target-Sondenkomplex an den Träger gebunden wird. Das Gerät umfaßt ferner Mittel, um die Probe, das Reagens und den Träger zu Bindungsbedingungen zu bringen um Target-Sondenkomplexe gebunden an den Träger zu bilden. Das Gerät umfaßt ferner Mittel, um die erste Sonde in Freisetzungsbedingungen zu bringen. Schließlich umfaßt das Gerät Mittel zur Abtrennung des Trägers von der Probe und von dem Reagens.
Der Ausdruck "Reaktionsgefäß" ist in breitem Sinne verwendet, um jegliches Mittel zur Aufnahme einzuschließen einschließlich beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung, Küvetten, Teströhrchen, Kapillaren und dergleichen.
Geeignete Mittel, um die Probe, das Reagens und den Träger in Bindungsbedingungen zu bringen, oder Reagens und Träger zu Freisetzungsbedingungen zu bringen, umfassen beispielsweise Temperatursteuerungen, welche die Temperatur der Probe, des Reagens und des Trägers erhöhen oder erniedrigen können, um Polynukleotidstränge selektiv zu denaturieren oder zu anelieren.
Geeignete Mittel zum Abtrennen des Trägers von dem Reagens oder der Probe umfassen beispielsweise Elektromagneten zur Verwendung in Verbindung mit magnetischen Kügelchen, Fasern, welche an einen Verankerungsträger fixiert sind, Zentrifugen zur Verwendung mit Polystyrolkörnern, und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung verwendet Mittel, um das Reagens und Target mit dem Hintergrundträger unter Bindungsbedingungen in Kontakt zu bringen, um irgendwelche zweiten Sonden mit Markierungshälften zu entfernen, wobei diese zweiten Sonden nicht spezifisch an den Target gebunden sind.
Ausführungsformen der vorliegenden Vorrichtung, welche zur Verwendung mit lumineszierenden Markierungshälften geeignet sind, umfassen geeignete Markierungserreger. Vorrichtungen zur Verwendung mit fluoreszierenden Markierungshälften umfasser Laser oder Licht aussendende Einheiten mit Filtern, um geeignete Wellenlängen abzugrenzen. Vorrichtungen zur Verwendung mit chemi-lumineszierenden Markierungshälften umfassen Injektionsapparate zum Einspritzen von Ko-Faktoren in die Reaktionskammer.
Bezüglich der Zeichnungen, welche beispielsweise bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen und insbesondere Fig. 1 eine Verfahrensmethode mit den notwendigen Reagenszusammensetzungen zeigt, ist in schematischer Form für eine Bestimmung von Target-Polynukleotidsträngen erläutert. Übliche Untersuchungstechniken umfassen viele Targetstränge und viele Sondenstränge würden zur Durchführung einer Untersuchung verwendet. Jedoch stellt die Erläuterung, der Einfachheit halber für das weitere Verständnis der Erfindung, nur begrenzte Zahlen von Untersuchungsproben (Sonden), Trägereinheiten und Targets dar. Die Fig. 1 charakterisiert eine Methode unter Verwendung von wiedergewinnbaren Trägern.
Schritt 1 des in Fig. 1 erläuterten Versuchs beginnt mit einer klinischen Probe, welche als Erläuterung Zellen enthält. Die Zellen tragen Targetnukleinsäure entweder DNA oder RNA mit einer Basensequenz von besonderem Interesse, die für pathogene genetische Zustände oder erwünschte Gencharakteristika bezeichnend sind. Die klinischen Proben können aus irgendwelchen Exkreten oder physiologischer Flüssigkeit wie Stuhl, Urin, Sputum, Eiter, Serum, Plasma, Augenlinsenflüssigkeit, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphe, Genitalspülungen oder dergleichen erhalten werden. Der Fachmann kann wünschen, Biopsieproben auf einzelne Zellsuspensionen oder kleine Klümpchen durch bekannte Mittel zu reduzieren. Beispielsweise können Biopsieproben von festen Geweben wirksam auf Einzellsuspensionen oder kleine Klümpchen von Zellen vermindert werden, indem die Biopsieprobe in einem Gemisch von 0,5 M Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 0,14 M Phosphatpuffer, pH 6,8, und 25 mg/ml Cyclohexamid, gerührt wird. Die Isolierung der spezifischen Zelltypen durch anerkannte bekannte Verfahren wie Differentialzentrifugieren, Dichtegradientzentrifugieren oder andere Methoden können ebenfalls bei diesem Schritt angewandt werden.
Die Zellen werden dann behandelt, um ihre DNA und/oder RNA freizusetzen. Die chemische Lyse ist in der Fachwelt gut bekannt. Die chemische Lyse kann mit verdünntem wäßrigen Alkali beispielsweise 0,1 bis 1 ,0 M Natriumhydroxid durchgeführt werden. Das Alkali dient auch dazu, die DNA oder RNA zu denaturieren. Andere Denaturierungs- und lysierende Mittel umfassen erhöhte Temperaturen, organische Reagentien, beispielsweise Alkohole, Amide, Amine, Harnstoffe, Phenole und Sulfoxide, oder gewisse anorganische Ionen, beispielsweise chaotropische Salze wie Natriumtrifluoracetat, Natriumtrichloracetat, Natriumperchlorat, Guanidiniumisothiocyanat, Natriumjodid, Kaliumjodid, Natriumisothiocyanat und Kaliumisothiocyanat.
Die klinische Probe kann auch verschiedenen Restriktionsendonukleasen unterworfen werden, um DNA oder RNA in unterschiedliche Segmente zu zerteilen, welche leichter zu handhaben sein können. Bei der Vollendung der Probenverarbeitungsschritte umfaßt die klinische Probe Probennukleinsäure, Zelldebris und Verunreinigungen. Bisher wurde Probennukleinsäure von der Zelldebris und Verunreinigungen durch nicht-spezifische Bindung der Nukleinsäure an Filter oder Membranen und Waschen der Zelldebris und Verunreinigungen von dem Filter oder Membran abgetrennt. Jedoch sind in der Praxis etwas Zelldebris und einige Verunreinigungen sowie Nicht-Targetnukleinsäure nicht-spezifisch an das Filter oder Membran gebunden und sie werden durch Waschungen nicht entfernt.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wie in Stufe 1 erläutert, umfaßt das Inkontaktbringen der Probe, welche potentiell Targetnukleinsäure trägt mit einem wiedergewinnbaren Träger zusammen mit einer Sondenhälfte Der wiedergewinnbare Träger ist zu einer im wesentlichen homogenen Dispersion innerhalb eines Probenmediums befähigt. Die Sondenhälfte kann an den wiedergewinnbaren Träger assoziiert sein, beispielsweise durch kovalente Bindung der Sondenhälfte an den wiedergewinnbaren Träger, durch Affinitätsassoziation, Wasserstoffbindung oder nichtspezifische Assoziation.
Der Träger kann viele Formen haben einschließlich beispielsweise Nitrocellulose, reduziert auf Partikelform und wiedergewinnbar beim Passieren des den Träger enthaltenden Probenmediums durch ein Sieb; Nitrocellulose oder die Stoffe imprägniert mit magnetischen Teilchen oder dergleichen, was es erlaubt, daß die Nitrocellulose innerhalb des Probenmediums bei Anlegung eines magnetischen Feldes zu wandern; Kügelchen oder Teilchen, welche filtriert werden können oder elektromagnetische Eigenschaften aufweisen; und Polystyrolkügelchen mit Verteilung an der Oberfläche eines wäßrigen Mediums.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt einen wiedergewinnbaren Träger enthaltend magnetische Kügelchen, die durch ihre Fähigkeit, in einem Probenmedium im wesentlichen homogen dispergiert zu sein, charakterisiert sind. Vorzugsweise enthalten die magnetischen Kügelchen primäre-aminfunktionelle Gruppen, welche die kovalente Bindung oder Assoziation einer Sondeneinheit an die magnetischen Trägerteilchen erleichtern. Vorzugsweise sind die magnetischen Trägerkügelchen einzelne Ferromagnete und sind superparamagnetisch und zeigen keinen Restmagnetismus.
Die Teilchen oder Kügelchen können aus Magnetitteilchen bestehen, obzwar sie auch andere magnetische Metalle oder Metalloxide sein können, entweder in unreiner Legierungs- oder zusammengesetzter Form, solange sie nur eine reaktive Oberfläche haben und die Fähigkeit aufweisen, auf ein magnetisches Feld zu reagieren. Andere Materialien, welche individuell oder in Kombination mit Eisen verwendet werden können, umfassen, jedoch ohne Beschränkung, Kobalt, Nickel und Silizium. Methoden zur Herstellung von Magnetit- oder Metalloxidteilchen sind offenbart in Vandenberghe et al., "Preparation and Magnetic Properties of Ultrafine Cobalt Ferrites", J. of Magnetism and Magnetic Materials, 15 bis 18: 1117-18 (1980); E. Mat&ijlig;evic, "Mono Dispersed Metal (Hydrous) Oxide--A Fascinating Field of Colloidal Science", Acc. Chem. Res., 14: 22-29 (1981).
Ein magnetisches Kügelchen, geeignet für die vorliegende Erfindung, umfaßt ein magnetisches Kügelchen, das primäre aminfunktionelle Gruppen enthält und im Handel unter der Bezeichnung BIO-MAG von Advanced Magnetics, Inc. erhältlich ist. Ein bevorzugtes magnetisches Teilchen ist nicht porös und erlaubt noch die Assoziation mit einer Sondenhälfte. Reaktive Stellen, welche in die Assoziation einer Sondenhälfte nicht einbezogen sind, sind vorzugsweise blockiert, um nicht-spezifischer Bindung anderer Reagentien, Verunreinigungen und Zellmaterial vorzubeugen. Die magnetischen Teilchen existieren vorzugsweise als im wesentlichen kolloidale Suspensionen. Reagentien und Substrate sowie Sondenhälften, welche an der Oberfläche des Teilchens assoziiert sind, erstrecken sich direkt in die das Teilchen umgebende Lösung. Sondenhälften reagieren mit gelösten Reagentien und Substraten in Lösung mit Geschwindigkeiten und Ausbeuten, die charakteristisch sind für Reaktionen in Lösung eher als Geschwindigkeiten, die mit Feststoffträgerreaktionen verbunden sind. Weiterhin steigt mit abnehmender Teilchengröße das Verhältnis von Oberflächenausdehnung zu Volumen der Teilchen, wodurch es ermöglicht wird, daß mehr funktionelle Gruppen und Sonden per Einheit Gewicht der magnetischen Teilchen verknüpft werden.
Kügelchen mit reaktiven funktionellen Amingruppen können mit Polynukleotiden zur Reaktion gebracht werden, um das Polynukleotid an dem Kügelchen kovalent zu befestigen. Die Kügelchen werden mit 10 % Glutaraldehyd in Natriumphosphatpuffer reagieren gelassen und reagieren dann in einem Phosphatpuffer mit Ethylendiaminaddukt des phosphorylierten Polynukleotids in einem Verfahren, das im größeren Detail in dem folgenden experimentellen Teil erläutert wird.
Was Stufe 2 betrifft, so wird der wiedergewinnbare Träger mit assoziierten Sondenhälften in Kontakt mit der klinischen Probe gebracht und im Verfolg der Stufe 3 zu Bindungsbedingungen gebracht. Die Sondenhälfte, welche für den interessierenden Target spezifisch ist, wird an die Targetstränge gebunden, die in der klinischen Probe vorliegen. Der wiedergewinnbare Träger, der durch die Probe und das Reagensmedium hindurch dispergiert ist, ermöglicht es den Sondenhälften und Target zu hybridisieren, als ob sie frei in einer Lösung wären.
Die Hybridisierungen von Sonden an Target können in etwa 15 Minuten erfolgen. Im Gegensatz dazu dauern die Hybridisierungen, bei denen entweder die Sonde oder Target auf einem Träger immobilisiert sind, der nicht die Fähigkeit besitzt, in dem Medium dispergiert zu werden, so lange wie 3 bis 48 Stunden.
Fremde DNA, RNA, Zellendebris und Verunreinigungen sind nicht spezifisch an den Träger gebunden. Jedoch sind in praktischer Hinsicht eine kleine Menge von Fremd-DNA, -RNA, Zelldebris und Verunreinigungen in der Lage, nicht-spezifisch an irgendeine Einheit innerhalb des Reaktionsgefäßes einschließlich des wiedergewinnbaren Trägers zu binden und tun dies auch. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erleichtern die weitere Reinigung von klinischen Proben zur Entfernung von Fremd-DNA, -RNA, Zelldebris und weiteren Verunreinigungen von den Targetpolynukleotiden.
Stufe 4 von Fig. 1 erläutert die Abtrennung des Trägers der klinischen Probe und die Suspension des Trägers in ein zweites Medium. Das zweite Medium umfaßt so den wiedergewinnbaren Träger mit der assoziierten Sonde gebunden an Targetpolynukleotidstränge. Mit dem wiedergewinnbaren Träger wird auch Fremd-DNA, -RNA, Zelldebris und Verunreinigungen, die nicht-spezifisch an den Träger gebunden sind, mitgeführt, jedoch in weit geringerer Konzentration als es ursprünglich in der klinischen Probe gefunden wurde. Der Fachmann wird erkennen, daß etwas unerwünschte Materialien durch Waschen des Trägers vor der Suspension in dem zweiten Medium reduziert werden können.
Der wiedergewinnbare Träger mit assoziierter Sonde und Targetsträngen, suspendiert in dem zweiten Medium, wird weiterer Denaturierung unterworfen, wie dies in Stufe 5 ausgeführt ist, wodurch es dem Target ermöglicht wird, von den Sondenhälften des wiedergewinnbaren Trägers abgetrennt zu werden. Der Denaturierungsprozeß kann oder kann nicht nicht-spezifisch gebundene Fremd-DNA, -RNA, Zelldebris oder Verunreinigungen von dem wiedergewinnbaren Träger freisetzen. Jedoch erlaubt es Schritt 5 vorliegender Methode, daß der wiedergewinnbare Träger, der aus dem zweiten Medium entfernt wird, vieles von der nicht-spezifisch gebundenen Zelldebris, Verunreinigungen und Fremd-DNA und -RNA, die ursprünglich von dem ersten klinischen Probenmedium überführt wurden, mit sich trägt.
Wie in Stufe 6 gezeigt, kann ein neuer Träger in das zweite Medium unter Bindungsbedingungen eingeführt werden, um wieder Targetpolynukleotidstränge auf Sondenhälften, assoziiert mit dem wiedergewinnbaren Träger, zu fangen. Für den Fachmann ist es klar, daß der neue Träger den ursprünglich wiedergewinnbaren Träger einschließt nach Recyclingschritten zur weiteren Reinigung und Entfernung nicht-spezifisch gebundener DNA, RNA, Zelldebris und Verunreinigungen. So umfassen die einzigen Verunreinigungen, welche in dem zweiten Medium vorhanden sind, DNA, RNA, Zelldebris und Verunreinigungen, die vorher nicht-spezifisch an den Träger gebunden sind, die anschließend von dem ersten Träger freigesetzt und in dem zweiten Medium gelöst oder suspendiert wurden.
Jedoch können solche Verunreinigungen aus den Targetpolynukleotiden weiterhin entfernt werden durch Entfernung des zweiten wiedergewinnbaren Trägers aus dem zweiten Medium und Wiederholung des Zyklus der Einführung des wiedergewinnbaren Trägers in ein weiteres Medium, Denaturierung und Entfernung des alten Trägers. Dem Fachmann wird ersichtlich, daß die magnetischen Kügelchen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, in der Lage sind, aus der Lösung herausgenommen zu werden oder an der Stelle gehalten zu werden, wenn die Lösung entfernt oder zu einem Einschließungsgefäß gegeben wird.
Die Fähigkeit der magnetischen Kügelchen an den Reaktionen teilzunehmen, welche "Unlöslichkeitskinetik"-Stränge nachahmt, erlaubt die Vollendung eines Zyklus der Denaturierung und Bindung an den Target, daß dies in 3 bis 15 Minuten vollzogen ist.
Nach ausreichender Reinigung und Konzentration kann der Target durch lumineszierende- oder radioaktive Methoden, die, wie in Stufe 8 angegeben, bekannt sind, aufgefunden werden.
Die Reinigung des den Target enthaltenden Mediums erlaubt die Auffindung von nicht-isotopischen Markierungshälften ohne Zelldebris und Verunreinigungen.
Betreffend Fig. 2, welche eine Mehrfach -Sondenmethode beinhaltet, wird eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Bestimmungsmethode erläutert, beginnend mit einer klinischen Probe, welche Polynukleotidtarget enthält, das gemäß der klinischen Probe der vorhergehenden Figur verarbeitet wird, mit Einführung von solubilisierenden Mitteln und Reagens. Das Reagens der Bestimmungsmethode, erläutert in Figur 2, umfaßt einen ersten Polynukleotid-Sondenstrang (P&sub1;) und einen zweiten Polynukleotid- Sondenstrang (P&sub2;), der in der Lage ist, einen Komplex mit dem Target zu bilden, worin beide Sonden (P&sub1; und P&sub2;) an den Target gebunden sind. Die erste Sonde (P&sub1;) ist in der Lage, mit einem wiedergewinnbaren Träger (S&sub1;) unter Bindungsbedingungen zu assoziieren. Die zweite Sonde hat mindestens eine Markierungshälfte, die zur Auffindung fähig ist. Die Markierungshälfte ist in den Zeichnungen mit einem Sternchen versehen. Nach der Einführung der löslichmachenden Mittel und des Reagens unter Denaturierungsbedingungen umfaßt die Lösung, welche die potentielle klinische Probe enthält, Targetpolynukleotide und Reagens in Form der ersten und zweiten Sonden plus Zelldebris, löslichmachende Mittel, Verunreinigungen und Fremd-RNA und -DNA.
Unter Bindungsbedingungen, wie in Stufe 2 erläutert, binden die erste und zweite Sonden (P&sub1; und P&sub2;) an wechselseitig ausschließliche Teile des Targets. Die Hybridisierung der Sonden (P&sub1; und P&sub2;) an den Target in Lösung erfolgt rasch und unvermindert durch Assoziation mit einem festen Träger. Um die Bindung des Targets an die ersten und zweiten Sondenstränge (P&sub1; und P&sub2;) zu sichern, wird ein Überschuß der Sonde verwendet. Jedoch selbst wenn ein Überschuß der Untersuchungsprobe(Sonde) (P&sub1; und P&sub2;) nicht verwendet wurde, wird etwas Sonde ermangeln, ein Target zu finden, und wird unhybridisiert in dem Probenmedium verbleiben. Die unhybridisierte zweite Sonde (P&sub2;) mit einer Markierungshälfte stellt das Hintergrundgeräusch dar, wenn ein solches während der Auffindung vorhanden ist.
Die erste Sonde (P&sub1;) vermag an einen Träger (S&sub1;) zu binden mittels eines Liganden, der in der Lage ist, an eine Antiligandenhälfte auf einem Träger zu binden. Der Ligand (L&sub1;) umfaßt beispielsweise einen Schwanzteil enthaltend ein Homopolymeres. Der Träger (S&sub1;) umfaßt einen Antiliganden (A&sub1;), der in der Lage ist, den Liganden (L&sub1; aufzunehmen und zu binden. Der Antiligand (A&sub1;) umfaßt beispielsweise ein Homopolymeres komplementär zu dem Liganden (L&sub1;) der Sonde (P&sub1;).
Bei Stufe 3 assoziiert unter Bindungsbedingungen die Antiligandenhälfte (A&sub1;) des Trägers (S&sub1;) oder bindet an die Ligandenhälfte (L&sub1;) der ersten Sonde (P&sub1;), die ihrerseits an den Target gebunden und an die zweite Sonde (P&sub2;) geknüpft ist. Der Träger kann viele Formen haben. Kügelchen oder Partikelträger können in Lösung dispergiert sein und nehmen an der Bindung mit den Target-Sondenreaktionen teil, welche nahezu Lösungskinetik zeigen.
Weiterhin können wiedergewinnbare Kügelchen und Partikelträger Sonden-Targetkomplexe von nichtlösbarer Debris ohne Verstopfungsprobleme trennen, die in üblicheren Filtern oder Membranen enthalten sind.
Jedoch können auch übliche Membranen, Filter oder Celluloseträger bei einigen Anwendungen verwendet werden, wo das Verstopfen kein Problem ist. Infolge der raschen Hybridisierung der Sonden an Target-Unlösliches kann eine feste, nicht-kugelige oder nicht-partikelförmige Membran oder Filterträger in das Reaktionsgefäß eingebracht werden. Die Lösung des Reagens und Probe kann durch den Träger geleitet werden, um den Targetfang zu beeinflussen. Der Träger (S&sub1;) ist in Fig. 2 als wiedergewinnbarer Träger erläutert.
In Lösung mit dem Target- Sonden-Träger-Komplex sind ungebundene erste und zweite Sondenhälften ungebundene Target löslichmachende Mittel, Verunreinigungen und Zelldebris. Die ungebundene zweite Sonde (P&sub2;), welche Markierungshälften hat, bildet ein Geräusch, was ein Signal produziert, das die Anwesenheit von Target nachahmt. Eine kleine Menge von nicht-dazugehörigen Zelldebris, löslichmachenden Mitteln, Verunreinigungen und Sonden können auch nicht-spezifisch an den wiedergewinnbaren Träger gebunden werden.
In Stufe 4 wird der Träger (S&sub1;) von dem Medium der klinischen Probe abgetrennt. Wenn ein wiedergewinnbarer Träger verwendet wird, kann die Trennung entweder durch Immobilisierung des wiedergewinnbaren Trägers in einem Reaktionsgefäß erfolgen oder durch Entnahme des wiedergewinnbaren Trägers aus dem Probenmedium direkt. Dem Fachmann ist klar, daß der Immobilisierte Träger gewaschen werden kann, um unerwünschtes Material zu vermindern.
Gemäß Stufe 5 ist der Target- Sonden-Träger-Komplex im wesentlichen frei von Fremd-RNA, -DNA, löslichmachenden Mitteln, Verunreinigungen und Zellmaterial, und kann auf Anwesenheit der Markierungshälften überwacht werden, was für die Anwesenheit des Targetmoleküls bezeichnend ist. Jedoch kann eine kleine Menge von Fremd-DNA, -RNA, löslichmachenden Mitteln, Verunreinigungen und Zellmaterialien noch nichtspezifisch an den Träger (S&sub1;) gebunden sein. Darüber hinaus kann ungebunden im Sinne, daß es nicht mit dem Target assoziiert ist, die zweite Sonde (P&sub2;) auch nicht-spezifisch an den Träger (S&sub1;) gebunden sein und kann Signale von nichtisotopischen Markierungsteilen beeinflussen. Die Anwesenheit von ungebundener zweite Sondenhälfte (P&sub2;) mit Markierungsteilen ist eine bedeutsame Ursache von Hintergrundgeräusch, wodurch die Genauigkeit des Bestimmungsverfahrens vermindert wird.
So kann als alternativer Schritt 5 der erste Träger (S&sub1;) in ein zweites Medium suspendiert werden, wo der Träger (S&sub1;) von dem Target- Sondenkomplex durch Denaturierung abgetrennt wird.
Nach der Denaturierung wird in Stufe 6 der erste Träger (S&sub1;) aus dem zweiten Medium entfernt und durch einen zweiten (S&sub2;) ersetzt. Der zweite Träger (S&sub2;) umfaßt einen Antiligandenteil (A&sub1;), der in der Lage ist, an den Ligandenteil (L&sub1;) der ersten Sonde zu binden.
Bei Stufe 7 assoziiert der Target- Sonden-Komplex unter Bindungsbedingungen wieder mit dem zweiten Träger (S&sub2;) Die Entfernung des Trägers (S&sub1;) entfernt Fremdmaterial, Debris und Sonden, die nicht-spezifisch an den ersten Träger (S&sub1;) gebunden sind, aus dem Bestimmungsmedium.
Wie in Stufe 8 erläutert, kann das Medium, welches den Target-Sondenkomplex enthält, auf Anwesenheit der Markierungen überwacht werden. Es kann jedoch eine weitere Reinigung des Bestimmungsmediums durchgeführt werden, um die Anwesenheit von Hintergrund- und Fremdmaterialien weiter zu vermindern, welche mit geführt worden sein könnten, von dem Probenmedium, nichtspezifisch gebunden an den ersten wiedergewinnbaren Träger (S&sub1;) und anschließend gelöst oder abgetrennt von dem ersten Träger (S&sub1;) in das zweite Medium.
So kann der zweite wiedergewinnbare Träger (S&sub2;) in Kontakt mit einem dritten Medium gebracht werden, wobei das Medium in Bedingungen gebracht wird, um den Target-Sondenkomplex von dem Träger freizusetzen und der Träger entfernt wird, um einen weiteren Zyklus zu vollenden. Die Anzahl der Zyklen wird eine Frage der Auswahl sein, in Abhängigkeit von dem Typ der Probe, dem Typ der Markierungsteile und der Empfindlichkeit der Detektionsvorrichtung. Verschiedene Typen von Trägern können zu verschiedenen Zeiten verwendet werden. So kann ein wiedergewinnbarer Träger verwendet werden, um die Target-Sondenkomplex aus Probenmedien oder Lösungen zu sammeln oder zu konzentrieren, anfänglich um Probleme der Verstopfung, welche typisch für Membrane oder Filter sind, zu vermeiden. Der zweite oder dritte Träger umfaßt vorzugsweise eine Membran oder ein Filter mit Antiligandenteilen (A&sub1;), welche an die Ligandenhälfte (L&sub1;) der ersten
Sonde (P&sub1;) binden. Membran- oder Filterträger können die Verfahrensschritte vereinfachen, indem sie die Durchflußwiedergewinnung der Target- Sondenkomplexe erlauben.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist besonders gut zur Verminderung von Hintergrundgeräusch geeignet. Unter Bezugnahme auf Fig. 3 wird eine Modifizierung des vorstehenden Bestimmungsverfahrens, das in Fig. 2 erläutert ist, beschrieben. In Fig. 3 hat ein Targetpolynukleotid einen Komplex mit einem ersten und zweiten Sondenteil (P&sub1; und P&sub2;) gebildet, ähnlich den Sondenteilen, die in Fig. 2 beschrieben sind.
Jedoch umfaßt die zweite Sonde einen zweiten Liganden (L&sub2;). Der zweite Ligand (L&sub2;) kann beispielsweise ein einziges endständiges Ribonukleotid umfassen, das Komplexe bildet mit einem Boratantiliganden, einem alternierenden Copolymeren, das mit einem komplementären Copolymer bindet, einem Biotinliganden, der an einen Avidinantiliganden bindet, oder, wie erläutert, Homopolymerligand (L&sub2;) und ein komplementärer Homopolymerantiligand (A&sub2;).
Bezüglich Stufe 1 wird ein Hintergrundträger, der in der Lage ist, an die zweite Sonde (P&sub2;) selektiv zu binden, nur wenn er nicht an ein Target gebunden ist, wird in Kontakt mit dem Medium gebracht, der den Target-Sondenkomplex enthält. Das Medium umfaßt ferner freie abgetrennte erste und zweite Sonden P&sub1; und P&sub2;). Die markierte zweite Sonde (P&sub2;), welche zu dem Hintergrundgeräusch beiträgt, ist spezifisch an den Hintergrundträger (B&sub1;) gebunden durch einen sehr großen molaren Überschuß von Antiligandenteilen (A&sub2;), assoziiert mit dem Hintergrundträger (B&sub1;). Nach der Bindung der ungebundenen markierten Sonde (P&sub2;) an den Hintergrundträger (B&sub1;) wird der Hintergrundträger ( B&sub1;) aus dem Medium entfernt, wie in Stufe 2 erläutert. Das den Target-Sondenkomplex enthaltende Medium kann auf Anwesenheit der auf der zweiten Untersuchungsprobe (P&sub2;) enthaltenen Markierung überwacht werden, mit einer Verminderung des Hintergrundgeräusches. Alternativ kann das den Target-Sondenkomplex enthaltende Medium einer weiteren Verarbeitung unterzogen werden.
Die weitere Verarbeitung kann eine weitere Hintergrundverminderung einschließen, durch Wiederholung der Stufen 1 bis 3, die in Fig. 3 beschrieben sind, oder der vorstehend beschriebenen Stufen in Verbindung mit Fig. 2. Beispielsweise können die Hintergrundverminderungsschritte in die Verarbeitung einer klinischen Probe einverleibt werden, wie in Fig. 2 erläutert, an jedem beliebigen Punkt, bei dem die Liganden- und Antiligandenteile der ersten und zweiten Sonden sich nicht überschneiden und der Target wird mit den ersten und zweiten Sonden komplexiert.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Methoden kann mit Hilfe einer Vorrichtung erfolgen, die in schematischer Form in Figur 4 dargestellt ist. Die Vorrichtung umfaßt die folgenden Hauptelemente: mindestens ein Einschließungsgefäß, Mittel zur Steuerung der Assoziation einer Sonde mit einem Targetmolekül und einen wiedergewinnbaren Träger, Mittel zur Abtrennung des wiedergewinnbaren Trägers aus einer Probenlösung, und Mittel zur Freisetzung des Targetmoleküls aus dem wiedergewinnbaren Träger. Diese Hauptelemente können verschiedene Formen haben und sind weiter unten eingehender beschrieben.
Die Vorrichtung wird weiter unten zu Erläuterungszwecken beschrieben, wie die in den Fig. 2 und 3 beschriebenen Methoden bezüglich eines Targetmoleküls, das ein Polynukleotid einschließt, angewandt wird. So wird bei Stelle 1 eine klinische Probe in das Einschließungsgefäß mit löslichmachenden Mitteln wie chaotropischen Salzen, Enzymen und oberflächenaktiven Mitteln, gegeben, um das Zellmaterial aufzulösen und Nukleinsäuren freizusetzen. Das Einschließungsgefäß kann Rührelemente enthalten, um das Aufbrechen der Zellen zu erleichtern. Das Gefäß kann jeden Typ von Gefäß, Röhre, Küvette, geeignet zum Enthalten der Probe, einschließen.
In einem zur automatischen Analyse bestimmten Gerät wird die in Fig. 4 vorgesehene Vorrichtung vorzugsweise Mittel zur Aufnahme einer Vielzahl von Einschließungsgefäßen umfassen. Zur Erläuterung werden die die Probe enthaltenden Gefäße aufeinanderfolgend analysiert. So werden die Gefäße zu einer ersten Stelle geführt und dann zu aufeinanderfolgenden Stellen, wo verschiedene Schritte der Untersuchungsmethode durchgeführt werden.
Die verschiedenen Stellen sind durch Beförderungsmittel verbunden. Beförderungsmittel können einen rotierbaren Drehtisch, ein Förderband oder dergleichen einschließen. Angewandt auf einen klinischen Krankenhauseinsatz können die Beförderungsmittel manuelle Bewegung einschließen. So kann das Krankenhauspersonal eine Gewebeprobe von einem Patienten erhalten und die Probe in das Einschließungsgefäß geben. Die Verarbeitung der Probe einschließlich Aufbrechen der Gewebeprobe und anfängliches Vermischen der löslichmachenden Mittel und Reagentien wird am Krankenbett begonnen und fortgesetzt, wenn das Gefäß zu einer nachfolgenden Stelle zur weiteren Verarbeitung gebracht wurde. Bezugnahmen auf Stellen sind zu Erläuterungszwecken. Der Fachmann wird erkennen, daß bestimmte Stellen oder Schritte kombiniert oder umgekehrt werden können.
Bezugnehmend auf die erste Station werden die Probe und löslichmachende Mittel in ein Gefäß gegeben, worin ein Rührelement die Probe und die löslichmachenden Mittel gründlich vermischt, wobei Nukleinsäuren aus den Zellmaterialien freigesetzt werden. Beförderungsmittel tragen das Gefäß zu Station 2, wo das Gefäß das Reagens erhält.
Das Reagens umfaßt eine erste Polynukleotid-Sonde und eine zweite Polynukleotid-Sonde, ersten und zweiten Sonden sind in der Lage, einen Komplex mit den Target-Polynukleotiden zu bilden, worin beide Sonden an wechselseitig ausschließliche Teile des Targets gebunden werden. Die erste Sonde ist auch in der Lage, an einen wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen zu binden. Die zweite Polynukleotid-Sonde umfaßt einen Markierungsteil, der zur Feststellung fähig ist. Das Reagens und die Proben-Nukleinsäure werden durch ein Heizelement denaturiert und zu Station 3 gebracht.
Bei Station 3 erhält das Einschließungsgefäß einen ersten Träger, der durch offene Kreise dargestellt ist. Der erste Träger wird in dem Probenmedium durch geeignete Mittel einschließlich eines Rührelements homogen dispergiert. Beispiele für geeignete Träger umfassen, jedoch ohne Beschränkung, Polystyrolkügelchen, magnetische Kügelchen und andere einzelne oder fasrige Substanzen. Wie erläutert, umfaßt der erste Träger ein magnetisches Kügelchen mit Polynukleotid-Antiliganden des Desoxythymidins (dT). Die erste Sonde- umfaßt einen Schwanzteil des Dexoxyadenosins (dA), welches an den ersten Träger während Bindungs- oder Hybridisierungsbedingungen zu binden vermag. Bei Bewegung zu Station 4 werden Hybridisierungsbedingungen auf das Probenmedium durch Kühlen mittels eines Kühlelementes eingegeben. Jedoch wird es dem Fachmann klar, daß Mittel zur Änderung der Salzkonzentrationen leicht anstelle von thermischen Steuerungen eingesetzt werden können. So bindet das Target-Polynukleotid einen Komplex mit den ersten und zweiten Sonden. Weiterhin hybridisiert das Homopolymer-Desoxyadenosins- (dA) Schwanzteil der ersten Sonde zu dem Homopolymer-Desoxythimidin (dT) des rückgewinnbaren Trägers.
Von der Station 4 wird das Einschließungsgefäß zu Station 5 bewegt, wo der rückgewinnbare Träger auf der Wand des Einschließungsgefäßes durch Aktivierung eines magnetischen Elements immobilisiert wird. Wenn Polystyrolkügelchen anstelle magnetischer Kügelchen eingesetzt wurden, wird das Polystyrolkügelchen durch Filter- oder Dichteunterschiede immobilisiert. Das Probenmedium ist geeignet, das meiste der Fremd-DNA, -RNA, löslichmachender Mittel, Zellmaterialien und Unreinheiten mitzuführen. Der immobilisierte rückgewinnbare Träger wird gewaschen, um Fremd-DNA, -RNA, löslichmachende Mittel, Zellmaterialien und Verunreinigungen weiter zu entfernen.
Außerdem ist es, obzwar es erläutert ist, daß der wiedergewinnbare Träger auf der Wand des Reaktionsgefäßes immobilisiert wird, auch möglich, den wiedergewinnbaren Träger aus dem Reaktionsgefäß durch ein magnetisches Element zu entfernen und Beseitigung des ersten Reaktionsgefäßes, das darin Fremd-DNA, -RNA, löslichmachende Mittel und Zellmaterial enthält, die an die Reaktionsgefäßwände nicht-spezifisch gebunden sind.
Der rückgewinnbare Träger wird in ein zweites Medium gebracht, entweder das gleiche Einschließungsgefäß oder ein neues Einschließungsgefäß. Das Gefäß, welches den wiedergewinnbaren Träger in einem zweiten Medium enthält, wird zu Station 6 gebracht.
In Station 6 wird das zweite Medium durch geeignete Mittel einschließlich eines Heizelementes zu Denaturierungsbedingungen gebracht. Der Denaturierungsprozeß setzt den Targeterste und zweite Sonden-Komplex aus dem (dT) Homopolymeren des wiedergewinnbaren Trägers frei. Der erste Träger, der potentiell Fremd-DNA, -RNA, Verunreinigungen und Zellmaterial trägt, wird aus dem zweiten Medium entfernt. Ein Hintergrundträger wird dann in Kontakt mit dem zweiten Medium gebracht und zu Station 7 geleitet.
Bei Station 7 bringt ein Kühlelement das zweite Medium auf Hybridisierungstemperaturen. Der Hintergrundträger umfaßt einen zweiten Antiliganden, der in der Lage ist, an einen Liganden, der auf der zweiten Sonde getragen wird, spezifisch zu binden. Beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung, kann ein End-Nukleotid der zweiten Sonde synthetisiert werden, um ein Riboderivat zu sein, das spezifisch an Boratteil bindet, das auf dem zweiten Träger vorhanden ist. Die zweite Sonde, welche an den Target als Teil eines Sonden-Targetkomplexes gebunden ist, wird nicht an das Borat auf dem dritten Träger infolge sterischer Hinderung binden. Jedoch wird ungebundene zweite Sonde spezifisch an den Boratträger binden. Alternativ kann die zweite Sonde ein Homopolymeres wie Desoxycytosin (dC) enthalten, das an Desoxyguanin- (dG) Homopolymer-Verknüpfer auf einem zweiten Träger bindet. Die Länge der Homopolymeren sind so bestimmt, daß Komplexe der Target-erste und zweite Sonden mit dem zweiten Träger nicht stabil sind; jedoch sind Komplexe der zweiten Sonde allein mit dem zweiten Träger innerhalb der Reaktionsparameter stabil. Tatsächlich kann Hintergrundfangbindung des Hintergrundträgers an ungebundene zweite Sonde irreversibel sein.
Dann wird das Einschließungsgefäß, welches das zweite Medium und den Hintergrundträger enthält, zu Station 8 geführt, wo der Hintergrundträger, der Stränge von zweiter Sonde, ungebunden an den Target- Sonden-Komplex hat, von dem zweiten Medium abgetrennt wird. Die Abtrennung des Hintergrundträgers entfernt nicht-spezifisches Untergrundgeräusch aus dem Medium.
Wie erläutert, wird Hintergrundfangen auf Kügelchen bewirkt. Jedoch wird der Fachmann erkennen, daß die anfängliche Reinigung des Target-erste und zweite Sonden-Komplexes von der klinischen Probe alle oder die meiste feste Debris entfernt, welche das Hintergrund-Fangen auf Filter- oder Membranträgern erlaubt, durch die das zweite Medium gespült bzw. ausgeschwemmt werden kann.
Von Station 8 wird das gereinigte Medium, welches den Target-Sonden-Komplex mit reduziertem Hintergrund enthält, zu Station 9 geführt. Bei Station 9 wird ein dritter Träger, der als Membran oder Filter dargestellt ist, in Kontakt mit dem zweiten Medium gebracht, das auf Hybridisierungstemperaturen durch ein Heizelement gebracht wird. Der dritte Träger umfaßt erste Antiligandenteile, welche an die ersten Ligandenteile der ersten Sonde binden. So kann, wenn der erste Ligandenteil der ersten Sonde aus einem Homopolymeren von Desoxyadenosin (dA) ist, der dritte Träger Homopolymeres von Desoxythymidin (dT) enthalten. Wie erläutert, umfaßt der dritte Träger Filter oder Membrane durch die das zweite Medium gespült werden kann; jedoch können auch Kügelchen oder Teilchen verwendet werden. Der dritte Träger dient dazu, um den Target - erste und zweite Sondenkomplex zu konzentrieren, und erlaubt eine weitere Verminderung des Hintergrundes und störender Materialien, welche an den dritten Träger nicht-spezifisch binden. Bei Bewegung zu Station 10 konzentriert der dritte Träger den Target-erste und zweite Sonden-Komplex und erlaubt die Bestimmung von Markierungsteilen, die auf der zweiten Sonde getragen werden.
Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden typischen Verfahren und Versuchsbeispielen, welche Merkmale der bevorzugten Ausführungsform beispielhaft erläutern, weiter beschrieben werden.

I. Verfahren

A. Materialien

Alle Reagentien waren von analytischer Qualität oder besser. Die magnetischen Kügelchen, welche unter der Handelsmarke BIO-MAG im Handel sind, die funktionelle Aminogruppen enthalten, wurden von Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, MA, erhalten.
In dem vorliegenden Beispiel wurden alle markierten Nukleotide von New England Nuclear erhalten. Das Enzym terminale Desoxynukleotidyltransferase (TDT) wurde von Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida, erhalten. Das Oligonukleotid pdT&sub1;&sub0; wurde von Pharmacia PL Biochemicals erhalten.

B. Synthese der Sonden

Die folgenden Ausführungen zeigen typische Protokolle und Methoden. Unter Bezugnahme auf Fig. 5 wurden zwei Sonden aufgebaut zu dem sinnentsprechenden Strang des Enterotoxingens elt Al von Escherichia coli, in Übereinstimmung mit der Constructional Map, Fig. 5, von Spicer, E. K. und J. A. Noble, J. of Biological Chem., (1982), 257, 55716-55751.
Ein Satz von Sonden wurde synthetisiert, beginnend bei Position 483 der Gensequenz und sich weiter ausdehnend um 30 Nukleotide in der Länge, wobei im folgenden auf A483Sonde Bezug genommen wird. Eine zweite Sonde wurde synthetisiert, beginnend bei Position 532 in der Gensequenz und sich ausdehnend 30 Nukleotide in der Länge, worauf im folgenden als A532-Sonde Bezug genommen wird. Eine dritte Sonde wurde synthetisiert, beginnend bei Position 726 in der weggefallenen Sequenz und sich ausdehnend 39 Nukleotide in der Länge, wobei im folgenden darauf als A726-Sonde Bezug genommen wird. Die spezifischen Basensequenzen (5' bis 3') sind in der folgenden Tabelle I angegeben. Tabelle I
Die Sonden wurden durch der Fachwelt zugängliche Methoden synthetisiert. Das Numerierungssystem ist ähnlich bzw. angeglichen aus der 768-Nukleotidsequenz, zugänglich durch Intelligenetics Sequence Bank ECO ELT A1.
Von den zehn G-Resten am 3'-Ende der Sonde A726 sind drei Guaninbasen gegen das 5'-Ende in der Lage, an drei komplementäre Cytosinbasen des Tox-Gens zu binden. Strecken von drei Cytosinen sind in DNA üblich. Die zehn Guaninbasen bilden einen Liganden, der in der Lage ist, an einen Poly-C- Antiliganden zu binden, der auf einem Träger wie Oligo-dC- Cellulose getragen ist. Jedoch werden sieben Guaninbasen nicht eine stabile Assoziation mit einem Träger bei 37ºC bilden, besonders wenn die Sonde an Target gebunden ist, infolge der sterischen Hinderung und der Größe des Target- Sonden-Komplexes. Die Sonde A 726 wurde durch die willkürliche Zugabe von etwa drei Resten von ³²P-dC und ³²P-dG an ihrem 3'-Ende mit terminaler Transferase modifiziert.
Dem Fachmann ist klar, daß er andere Sonden zu anderen Target-Molekülen leicht synthetisiert werden können.

C. Herstellung

Das Target in den Beispielen 1, 2 und 3 ist das Enterotoxin- Gen elt A1. Das Enterotoxin-Gen elt A1 wird als Teil des Plasmids EWD-299 geführt, erhalten von der Stanford Universität.
Im Beispiel Nr. 1 wurden enterotoxigene Bakterien bis zur log- Phase in Luria-Nährmedium gezüchtet. Die enterotoxigenen Bakterien wurden lysiert und das Plasmid EWD-299 isoliert. Das Plasmid EWD-299 wurde weiter mit den Restriktionsenzymen Xba1 und HindIII aufgeschlossen. Ein Fragment der 475-Basenlänge wurde als ein Target verwendet und durch Elektroelution aus 1- %igem Agarosegel gereinigt. Um der Wirksamkeit der Fangschritte zu folgen, wurde das Fragment am 5'-Ende mit ³²pATP mit dem Enzym Polynukleotidkinase nach den Instruktionen des Herstellers markiert.
In den Beispielen Nr. 2 und 3 wurden die enterotoxigenen Bakterien und ein Wildtyp nicht-enterotoxigenes E. coli JM83 getrennt bis zur log-Phase gezüchtet. Der Wildtyp E. coli diente als Kontrolle. Es wurden getrennte Extrakte der enterotoxigenen Bakterien und Bakterien des Wildtyps hergestellt durch wesentliches Löslichmachen der Zellen in chaotropen Lösungen. So wurden die Bakterienkulturen in Luria-Brühe zu festem Guanidiniumthiocyanat (GuSCN) zu einer Konzentration von 5M GuSCN, Tris-HCl zu einer Konzentration von 0,3 M, und EDTA (pH 7) zu einer Konzentration von 0,1 M zugesetzt. Die chaotropen Bakterienlösungen wurden dann auf 100ºC während 5 Minuten erhitzt und abgekühlt. Der entstehende enterotoxigene Bakterienextrakt wurde serienmäßig mit dem nicht-enterotoxigenen Bakterienextrakt des Wildtyps verdünnt. Die Konzentration der Toxplasmide pro Zelle und die Zellzahl in den Extrakten wurden durch übliche Techniken gemessen. Die ursprünglichen Extrakte, löslich gemacht in GuSCN, enthielten etwa 10- enterotoxigenes E. coli pro ml und 100 Plasmiden/ Zelle.

D. Synthese der Kügelchen

Wiedergewinnbare Träger wurden aus magnetischen Kügelchen hergestellt. Andere wiedergewinnbare Träger schließen ein Teilchen, Fasern, Polystyrolkügelchen oder andere Dinge, die zur physikalischen Trennung aus einem Medium fähig sind. Magnetische Kügelchen wurden synthetisiert mit einem Addukt von Desoxythymidin von zehn Basenlängen, um die Kügelchen assoziieren zu lassen mit Sonden, die am Ende mit Desoxyadenosin in leicht reversibler Weise versehen sind.
So wurden 100 ml Kügelchen mit aminfunktionellen Gruppen wie BIO-MAG (M4100)-Kügelchen viermal mit 20 mM Natriumphosphat (pH 6,7) in vier 275-ml-T-Kolben gewaschen. Die Kügelchen wurden dann mit 1 % Glutaraldehyd in 20 mM Natriumphosphat gewaschen. Dann wurden die Kügelchen in 100 ml 10 %igem Glutaraldehyd in 20 mM Natriumphosphat (pH 6,7) während 3 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Die Kügelchen wurden dann ausgiebig mit 20 mM Natriumphosphat (pH 6,7) gewaschen und dann einmal mit 20 mM Phosphat (pH 7,6) gewaschen.
Getrennt wurde ein gereinigtes Ethylendiamin- (EDA) Addukt von pdT&sub1;&sub0; (EDA-dT&sub1;&sub0;) gemäß Chu, B.C.F., G. M. Wahl, und L. E. Orgel, Nucleic Acid Res. 11 (1983), 6513-6529, darin durch Bezugnahme eingeschlossen, hergestellt. Die Konzentration von EDA-dT&sub1;&sub0; wurde auf 1 OD/ml in 20 mM Phosphat (pH 7,6) eingestellt.
Das EDA-dT&sub1;&sub0; wurde mit den magnetischen Kügelchen vereinigt, um das EDA-dT&sub1;&sub0; mit den freien Aldehydgruppen der Kügelchen reagieren zu lassen. Das Gemisch von EDA-dT&sub1;&sub0; und Kügelchen wurde in eine Vielzahl von 50 ml Polypropylenröhrchen aufgeteilt. Die Röhrchen, welche das Reaktionsgemisch und die Kügelchen enthielten, wurden in einen Röhren-Rotationsapparat gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Dann wurden die Kügelchen fünfmal gewaschen, um nicht-kovalent gebundenes EDA-dT&sub1;&sub0; zu entfernen, mit einer Waschlösung von sterilem 20 mM Phosphat (pH 6,7) in großen 275-ml-T-Kolben und verdünnt auf 200 ml mit der Waschlösung.
Zur Aufbewahrung können die Kügelchen während Monaten in einem Puffer von 20 mM Phosphat, zu dem Natriumazid auf 0,1 % und SDS auf 0,1 % zugesetzt wurden, gehalten werden. Die Kügelchenpräparate werden bei 4ºC lichtgeschützt aufbewahrt.
Die Kügelchen wurden dann prähybridisiert, um nicht-spezifische Bindungsstellen zu blockieren, in einem Puffer, der im folgenden als "Prähybridisierunspuffer" bezeichnet werden soll, von 0,75 M Natriumphosphat (pH 6,8), 0,5 % Natriumlauroylsarcosin, 10 Mikrogramm/Milliliter (mg/ml) E. coli DNA, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) (nukleasefrei), und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Vor der Anwendung der Sonden und Kügelchen auf Target-Fangverfahren wurden zwei Prähybridisierungen der Kügelchen durchgeführt. Das Prähybridisierungsverfahren umfaßte das Unterbringen der Kügelchen in 10 Volumina Prähybridisierungspuffer.
Das erste Prähybridisierungsverfahren wurde unter Rühren bei 60ºC durchgeführt. Das zweite Prähybridisierungsverfahren wurde bei Raumtemperatur unter Aufwirbeln durchgeführt. Eine 0,1 %ige Isoamylalkohollösung wurde zu den Lösungen als Entschäumer zugegeben.
Die Bindungskapazität von dT&sub1;&sub0; abgeleiteten Kügelchen wurde durch das folgende Verfahren gemessen. In getrennten Gefäßen wurden dT&sub5;&sub0; und dA&sub5;&sub0; mit ³²P-dT und ³²P-dA 5'-endmarkiert auf eine spezifische Aktivität (Sa) von etwa 10&sup6; dpm/ Mikrogramm. Dann wurde das Sa für eine bekannte Menge von umgesetztem dT&sub5;&sub0; durch Trichloressigsäureausfällung genau gemessen.
Dann wurden 5 ug ³²P-dA&sub5;&sub0; und 5 ug von ³²P-DT&sub5;&sub0; mit im wesentlichen identischen Sa-Werten von zwischen 100000-200000 dpm/mg getrennt zu Röhrchen gegeben, die Vorhybridisations- Puffer enthielten und auf ein Volumen von 1 ml gebracht.
Ein bekanntes Probenvolumen von prähybridisierten Kügelchen wurde in vier Röhrchen gegeben. Zwei der vier Röhrchen erhalten jeweils 0,5 ml der ³²P-dA&sub5;&sub0;-Mischung und die restlichen zwei Röhrchen erhalten 0,5 ml der ³²P-dT&sub5;&sub0;-Mischung. Alle vier Lösungen wurden während 5 Minuten auf Hybridisierungsbedingungen gebracht. Die Kügelchen werden danach immobilisiert und gewaschen. Die Aktivitäten der Lösungen werden dann überwacht. Die totale Bindungskapazität C für eine Menge von Kügelchen-Präparat, gemessen in Mikrogramm, ergibt sich folgendermaßen:
C = V(A - T)/X
In der obigen Gleichung ist X die spezifische Aktivität von ³²P-dT&sub5;&sub0; in cpm/mg, V ist das Volumenverhältnis des Gesamtvolumens zum Probenvolumen, A ist die mittlere Aktivität Kügelchen, die in ³²P-dA-Lösungen suspendiert sind, in cpm, und T ist die durchschnittliche Aktivität der Kügelchen, die in ³²P-dT-Lösungen suspendiert sind, in cpm.
Dem Fachmann wird ersichtlich, daß andere Kügelchen, Teilchen Filamente und dergleichen mit anderen Nukleotidkombinationen oder Homopolymeren formuliert werden können. Beispielsweise wurden Poly-A-abgeleitete Kügelchen hergestellt durch Einsetzen (für das gereinigte EDA-Addukt von dT&sub1;&sub0;) einer Lösung enthaltend 100 mg Poly-A (Molekulargewicht > 100000) in 50 ml 20 mM Natriumphosphat (pH 7,6).

E. Target-Fangverfahren

Kügelchenpräparate wurden zum Fangen von Targetpolynukleotiden verwendet. Im folgenden ist ein typisches Versuchstarget- Fangprotokoll angegeben, das wiedergewinnbare Träger und reversibles Einfangen zu Zwecken der Erläuterung ohne jede Beschränkung zeigt, wobei dieses Verfahren unter Verwendung einer ersten Sonde.. A483 und einer zweiten Sonde A532 diskutiert wird. Die erste Sonde A483, wurde mit ³²P-dCTP und ³²PdGTP willkürlich 3'-endmarkiert auf eine spezifische Radioaktivität von etwa 10¹&sup0; dpm/mg. Die zweite Sonde A532, wurde mit etwa 70 unmarkierten dA-Resten durch das Enzym terminale Transferase am Endstück versehen.
Zunächst wurden 200 ug/ml der markierten Sonde A483 und 400 ug/ml der am Endstück behandelten Sonde A532 mit wechselnden Mengen eines hitze-denaturierten 475-mer Xba 1-HIND III-Restriktionsfragments des Enterotoxingens bei 65ºC während 15 Minuten in 1,4 M Natriumchlorid vermischt.
Dann wurde das Targetfangen eingeleitet, indem das Medium, welches den Target und die Sondenhälften enthielt, mit einem aliquoten Anteil der dT&sub1;&sub0;-magnetischen Kügelchen mit 3 Mikrogramm/ml dA&sub5;&sub0;-Bindungskapazität kontaktiert wurden, anschließend erfolgten Prähybridisierungsverfahren, um nicht-spezifische Bindung an das magnetische Kügelchen zu vermindern. Das magnetische Kügelchen und der
Sonden-Targetkomplex wurde bei Raumtemperatur in 0,1 ml Prähybridisierungspuffer in 5 ml-Polypropylen-Teströhrchen während 2 bis 5 Minuten bebrütet.
Die Proberöhrchen wurden in einen Proberöhrchen-Corning-Magnetabscheider gegeben. Der Proberöhrchen-Corning-Magnetabscheider setzt bei Aktivierung ein magnetisches Feld durch die Polypropylen-Teströhrchen, was die magnetischen Kügelchen auf den Innenwänden der Röhrchen immobilisiert. Während der Zeit, während der die magnetischen Kügelchen an den Seitenwänden der Polypropylen-Teströhrchen immobilisiert ,werden, wurde das ursprüngliche Medium entfernt und verworfen.
Während sie immobilisiert sind, wurden die Kügelchen dreimal mit 0,6 ml Prähybridisierungspuffer, der Isoamylalkohol als Entschäumer enthielt, gewaschen. Nach der Zugabe des Prähybridisierungspuffers wurden die Kügelchen wieder suspendiert, indem die Röhrchen aus dem magnetischen Feld entfernt wurden und das Medium einer kräftigen Wirbelung unterworfen wurde.
Dann wurde das magnetische Feld wieder angelegt, um die Kügelchen zu immobilisieren und der Prähybridisierungspuffer wurde entfernt und verworfen. Der Zyklus der Zugabe des Prähybridisierungspuffers, Wiedersuspendieren der Kügelchen, Immobilisieren der Kügelchen und Verwerfen des Prähybridisierungspuffers wurde zweimal wiederholt. Die Target- Sondenkomplexe, die auf den Kügelchen gehalten werden, sind für weitere Verarbeitung einschließlich zusätzlicher Stufen der Auffindung, Hintergrundfangen oder weitere Zyklen des Target- Fangens verfügbar.
Ein bevorzugtes Target-Fangverfahren umfaßt die Freisetzung des Target- Sondenkomplexes und Wiederfangen auf einem zweiten Träger. Vorzugsweise ist der Träger von dem ersten Träger chemisch verschieden.
Die Freisetzung des Target-Sondenkomplexes wird in dem folgenden typischen Protokoll bewirkt. Nach der Entfernung des letzten Prähybridisierungspuffers, wurde Prähybridisierungspuffer zu dem die Kügelchen enthaltenden Proberöhrchen gegeben. Die Kügelchen wurden unter Rühren bei 60ºC während 1 bis 2 Minuten bebrütet, um die Sonden- Targetkomplexe aus den Kügelchen freizusetzen. Der Magnetabscheider wurde wieder mit der Temperatur bei 60ºC aktiviert und das Eluat, das die freien Target-Sondenkomplexe enthält, wurde aus dem Proberöhrchen entfernt. Das Eluat kann auf zusätzlichen wiedergewinnbaren Trägern wieder eingefangen werden oder einem endgültigen Einfangen auf üblichen Trägern unterworfen werden. Der Fachmann wird erkennen, daß das Einfangen und Freisetzen des Target-Sonden-Komplexes aus wiedergewinnbaren Trägern wie die magnetischen Kügelchen des vorliegenden Beispiels so oft wie gewünscht wiederholt werden kann, um Hybridisierungs-Hintergründe zu vermindern.
Das endgültige Fangen des Sonden-Targetkomplexes wird typischerweise auf Nitrocellulosefiltern oder Nylonmembranen bewirkt, die nicht spezifisch gebundenes oder kovalent gebundenes dT-3000 enthalten. So wurden die Target-Sonden Komplexe, die auf den magnetischen Kügelchen getragen werden, aus den magnetischen Kügelchen durch Erhitzen der Kügelchen auf 60ºC in Prähybridisierungspuffer während 2 Minuten freigesetzt. Die Kügelchen wurde immobilisiert und das Eluat entfernt und durch eine 0,2 Mikron Acroscheibe (Gelman) zur Entfernung magnetischer Feinstoffe geleitet. Das Nitrocellulosefilter, das dT-3000 enthielt, selektierte, band und fing das dA-Ende auf den unmarkierten Sonden ein.
Die Verwendung eines chemisch verschiedenen festen Trägers für das endgültige Fangen des Target- Sondenkomplexes vermeidet es, Hintergrundmoleküle zu binden, welche eine hohe Affinität für die vorher verwendeten Träger haben können. Beispielsweise ist es für gering vorhandene Verunreinigungen mit einer natürlichen hohen Affinität für einen bestimmten Träger möglich, wiederholt mit einem Träger zusammen mit den Sonden-Targetkomplexen zu binden und zu eluieren. Solche geringen Verunreinigungen können durch wiederholte Verwendung eines wiederverwendbaren Trägers der gleichen Zusammensetzung nicht so vollständig ausverdünnt werden, wie wenn sie Trägern sehr verschiedener Zusammensetzungen ausgesetzt werden. Gering vorhandene Verunreinigungen können auch verringert werden, indem chemisch unterschiedliche Mittel zur Freisetzung der Target-Sonden-Komplexe aus Trägern und Wiederfangen verwendet werden.

F. Hintergrund-Fangmethoden

Hintergrund-Fangmethoden erlauben die selektive Verminderung von Hintergrundgeräusch, was die Auffindung von wahrem, echtem Signal ermöglicht, das für die Anwesenheit des Targets indikativ bzw. aufzeigend ist. Das Hintergrundfangen kann in einem einzigen Sondensystem oder in Systemen unter Verwendung von mehr als zwei Sonden angewandt werden. Beispielsweise umfaßt im Hintergrund-Fangverfahren mit einer einzigen Sonde die Sonde einen Markierungsteil und einen Liganden. Die Sonde ist fähig, an einen Target zu binden und der Ligand ist fähig zur Bildung einer stabilen Bindung an einen Träger nur wenn die Sonde zum Target ungebunden ist.
In ähnlicher Weise umfassen beispielsweise Hintergrund-Fangmethoden mit mehrfachen Sonden in Verbindung mit dem Targetfangen zwei Sonden. Eine erste Target- Fangsonde die einen unmarkierten Liganden hat, der zur Bindung an einen ersten Träger in der Lage ist, wird verwendet, um den Target zu fangen und eine zweite Hintergrund-Fangsonde mit einem Markierungsteil, der zum Auffinden fähig ist, umfaßt einen zweiten Liganden, der zur Bindung an einen zweiten Hintergrundträger fähig ist. Das Hintergrundfangen ist eine wertvolle Ergänzung zum Targetfangen um das Signal zu den Geräuschdaten eines Versuchs zu erhöhen.
Im folgenden wird ein typisches Hintergrund-Fangprotokoll wiedergegeben, wobei eine erste Target-Fangsonde A532 und eine zweite Hintergrund-Fangsonde A726 und ein Target-Enterotoxingen elt A1 verwendet wird. Dem Fachmann wird klar, daß die verwendeten Sonden zu Demonstrationszwecken lediglich eine Sache der Auswahl ist.
Andere Sonden könnten ebenso gut verwendet werden.
Die Sonde A532 wurde mit etwa 100 dA-Endstückresten versehen, die fähig sind, reversibel an dT&sub1;&sub0; kovalent verknüpfte magnetische Kügelchen zu binden, zwecks Anfangs- Targetfangen und dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0; nicht-spezifisch gebunden an Nitrocellulose für Endtargetfangen. Die Sonde A726 wurde am Ende mit der willkürlichen Zugabe von etwa drei Resten von ³²P-dC und ³²P-dG zu dem 3'-Ende mit terminaler Transferase markiert. Die Sonde A726 ist fähig, an dC-Cellulose zu binden, wenn die Sonde nicht zum Target hybridisiert wird.
Eine Lösung, welche den Target-erste und zweite Sonden-komplex enthält und wirksam ungebundene zweite Sonde enthält, wird mit dC-Cellulose vermischt und die Temperatur des Gemisches bei 37ºC gehalten. Die Temperatur, 37ºC, ist höher als die Zerfallstemperatur von dG&sub7; mit Oligo-dC, was die Bindung des Target-Erste und Zweite Sonden-Komplexes an die dC-Cellulose verhindert. Die Temperatur ist auch niedriger als die Zerfallstemperatur von dG&sub1;&sub0; mit Oligo-dC, um die Bindung von ungebundener zweiter Sonde mit einem dG-Endstück zu der dC-Cellulose hervorzurufen. Außerdem ist der Target-Erste und Zweite Sonden-Komplex in höherem Grade an seiner Annäherung zu dem dC-Celluloseträger sterisch gehindert als ungebundene zweite Sonde. Die dC-Cellulose, welche die zweite Sonde A726 enthält, wird durch Zentrifugieren entfernt, jedoch ist es dem Fachmann klar, daß andere Methoden, wie Filtrieren, ebenso gut verwendet werden können. Das verbleibende Eluat enthält Target- Erste und zweite Sonden-Komplex und eine verminderte Konzentration an ungebundener markierter zweiter Sonde A 726.

G. Beispiele

Dem Fachmann ist klar, daß die typischen Protokolle für wiedergewinnbare Trägerherstellung, Sondenherstellung,
Targetfangen und Hintergrundfangen modifiziert werden können, um für spezielle Bedürfnisse und Zwecke geeignet zu sein. Die folgenden Beispiele umfassen die typischen oben erwähnten Verfahren, wenn nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Targetfangen und Assay unter Verwendung magnetischer Kügelchen

Ein Targetfang-Assay mit zwei Sonden und einem wiederverwendbaren Träger mit magnetischen Kügelchen wurde durchgeführt. Der Target umfaßte das Xba 1-Hind III-Fragment des enterotoxingenen Gens elt A1. Eine erste Sonde umfaßte eine A&sup5;³ 2-Dreifach-Oligonukleotid-Sonde, welche am Ende mit 130 unmarkierten dA-Resten versehen war und zur Bindung an die dT&sub1;&sub0;-Reste des Trägers mit magnetischen Kügelchen fähig war. Eine zweite Sonde umfaßte eine A&sup4;&sup8;³-Thirtimer-Oligonukleotid-Sonde, welche in der Lage ist, an den gleichen Target 20 Nukleotide stromabwärts von dem Sitz der Hybridisierung der ersten Sonde zu binden. Die zweite Sonde wurde markiert, indem das Thirtimer-Oligonukleotid mit ³²P-dCTP und ³²P-dGTP an den Enden mit einer spezifischen Radioaktivität von 10¹&sup0; dpm/Mikrogramm versehen wurde.
Die mit Endstück versehene erste Sonde und die markierte zweite Sonde wurden bei 65ºC während 15 Minuten in 1,4 M Natriumchlorid mit verschiedenen Mengen von wärmedenaturierten 475 mer-Restriktionsfragmenten des Toxgens bebrütet. Als nichtspezifische Bindungshintergrundkontrolle wurde die mit Endstücken versehene erste Sonde und die markierte zweite Sonde in identischen Lösungen in Abwesenheit von irgendwelchem Target bebrütet. Als spezifische Bindungskontrollen wurden zwei zusätzliche Reaktionsmischungen gebildet. Eine Reaktionsmischung umfaßte die mit Endstücken versehene erste Sonde und die unmarkierte zweite Sonde, bebrütet mit 4 Mikrogramm denaturierter E. coli-DNA, und eine zweite Reaktionsmischung der mit Endstücken versehenen ersten Sonde und der markierten zweiten Sonde bebrütet in 10 Mikrogramm denaturierter Human-DNA in identischen Reaktionsmischungen ohne irgendwelche Target-DNA.
Nach einer 15-minütigen Hybridisierungsperiode wurden die Proben während 5 Minuten mit dT-abgeleiteten magnetischen Kügelchen in 0,7 Milliliter 0,75 molarem Phosphatpuffer (pH 6,8) bebrütet. Die Kügelchen wurden magnetisch immobilisiert und ausgiebig wie vorher beschrieben gewaschen. Der Target- Sonden-Komplex wurde aus den Kügelchen bei 60ºC in 0,6 Milliliter 0,20 molarem Phosphatpuffer (pH 6,8) eluiert. Die erste Reihe von Kügelchen wurde aus dem Eluat und dem Target-Sondenkomplex abgetrennt. Eine zweite Gruppe magnetischer Kügelchen wurde zu dem Eluat gegeben und auf Bindungsbedingungen gebracht, um den Target und Sondenkomplex wieder zu fangen. Die zweite Gruppe von Kügelchen wurde gewaschen und der Target wieder aus den Kügelchen eluiert und die Kügelchen von dem Eluat abgetrennt.
Eine dritte Gruppe von Kügelchen wurde zu dem Eluat gegeben, das den Target-Sonden-Komplex enthielt und unter Bindungsbedingungen gesetzt, so daß die Kügelchen nochmals den Target-Sondenkomplex fangen konnten. Die Kügelchen wurden dann ausgiebig gewaschen und der Target aus den Kügelchen wie vorstehend beschrieben eluiert. Die Kügelchen wurden dann aus dem Eluat abgetrennt und das Eluat durch dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Nylon in 2 mm² Vertiefungen geleitet, wo der Target-Sonden-Komplex gefangen wurde.
Die dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Nylon-Membran wurde hergestellt, indem 2 ug dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0; kovalent an Nylon gebunden wurde und unter Verwendung von Hybri-Vertiefungsapparat (Betlesda Research Laboratory). Kurz gesagt, dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0; (Life Sciences) wurde direkt auf eine Nylon-Membran wie Gene-Screen Tm (New England Nuclear) in einem salzfreien Tris-Puffer getüpfelt. Die Membran wurde bei Raumtemperatur während 10 Minuten getrocknet und dann unter einer Infrarotlampe während weiterer 10 Minuten getrocknet, bevor sie während weiterer 10 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt wurde. Der Filterapparat, welcher die Nylon-Membran enthielt, wurde auf einem UV-Transilluminator (Fotodyne) gegeben und während 2 Minuten bei 40 uW/cm² dem UV-Licht ausgesetzt, um das dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0; zu dem Filter zu vernetzen.
Die dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Membran wurde prähybridisiert durch aufeinanderfolgendes Durchleiten der folgenden Lösungen durch die Membran:
(1) 1 % SDS;
(2) 0,5 mg/ml BSA in 0,5 % SDS; und schließlich
(3) Prähybridisierungspuffer.
Das dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Nylon, das wirksam den Target- Sondenkomplex enthielt, wurde mit 0,2 molarem Natriumphosphat und 5 millimolarer EDTA gewaschen. Der Nylonträger wurde über Nacht audioradiographisch auf Anwesenheit der ³²P-Markierungsteile der zweiten Sonde überwacht. Nach der Audioradiographie wurden die Banden von dem Filter ausgeschnitten und in basischer Szintillierungsflüssigkeit gezählt. Die Zählungen waren 2100 und 1400 Zählungen pro Minuten in der Lösung, welche drei Femtomole eines Restriktionsfragments enthielt, das das Toxgen enthielt. Proben enthaltend 30 Attomole des Restriktionsfragments, das das Toxgen enthielt, erzeugten eine Zählung von 62 Zählungen pro Minute.
Eine dritte Probe, welche keine DNA enthielt, erzeugte 7 Zählungen pro Minute. Eine vierte Probe, welche 10 Mikrogramm wärmedenaturierte Human-DNA enthielt, erzeugte 0 Zählungen pro Minute. Eine fünfte Lösung enthaltend 4 Mikrogramm wärmedenaturierte E. coli-DNA, erzeugte 7 Zählungen pro Minute. Die absolute Empfindlichkeit des Protokolls wurde auf, 10&supmin;¹&sup8; Mol Toxgen geschätzt. Die Gesamteffizienz der Gewinnung des markierten Target-Sondenkomplexes wurde auf 1 bis 2 % des Eingangs geschätzt. Der Versuch zeigte eine gute Spezifizität. Es ist keine markierte Sonde in den Proben enthaltend Human-DNA oder E. coli-DNA mehr vorhanden als in der Probe, welche überhaupt keine DNA enthält. Die Wiederholung des Versuchsprotokolls erzeugte eine Gesamteffizienz des Fangens des Targets von fast 5 %. Die Verfahren verminderten den Hintergrund von einem anfänglichen Wert von 10¹¹ Molekülen der markierten unhybridisierten Sonden auf etwa 10&sup4; Mol. Die Reduktion und der Hintergrund stellen eine 7 log-Verbesserung dar mit mehr als adäquater Kompensation für die Reduktion und Effizienz des Fangens.

Beispiel 2

Das vorliegende Beispiel zeigt Targetfangen mit Hintergrundfangen. Target- und Hintergrundfangen wurde bewirkt unter Verwendung einer unmarkierten ersten Target-Fangsonde A532 wie beim Targetfangen beschrieben, und einer zweiten markierten Hintergrund-Fangsonde A726.
Zunächst wurde 160 ng/ml dA-Endstück-A532 und 40 ng/ml 32 markierte Sonde A726 kombiniert, um ein Sondengemisch zu bilden. Das Sondengemisch wurde zu 5 ul Bakterienextrakt gegeben, der verschiedene Mengen an enterotoxigenem Gen enthielt. Die Extrakt- Sondenmischung wurde bei 22ºC während 15 Minuten bebrütet.
Nach einer 15-minütigen Hybridisierungszeit wurden die Proben mit 10 Volumina Prähybridisierungspuffer verdünnt, der während 5 Minuten mit dT-abgeleiteten magnetischen Kügelchen in 0,7 ml 0,75 M Phosphatpuffer (pH 6,8) inkubiert wurde, um das Targetfangen zu bewirken. Die Kügelchen wurden magnetisch immobilisiert und ausgiebig gewaschen. Der Target-Erste und Zweite Sonden-Komplex wurde aus dem ersten Träger eluiert, wie vorstehend beschrieben, und der erste feste Träger wurde entfernt.
Dann wurde das Eluat, das den Target-Erste und zweite-Sondenkomplex enthielt und potentiell ungebundene zweite Sonde enthielt, mit dC-Cellulose vermischt und die Temperatur des Gemisches bei 37ºC gehalten. Die Temperatur von 37ºC ist höher als die Zerfallstemperatur des dG&sub7; mit Oligo-dC, um das Binden des Target-Erste-und zweite-Sondenkomplexes an die dC-Cellulose zu verhindern. Die Temperatur wurde auch niedriger als die Zerfallstemperatur von dG&sub1;&sub0; mit Oligo-dC gehalten, um das Binden der ungebundenen zweiten Sonde mit einem dG&sub1;&sub0;-Endstück an die Cellulose zu fördern. Der Target-Erste- und zweite-Sondenkomplex ist in höherem Maße sterisch gehindert in seiner Annäherung an den dC-Celluloseträger als ungebundene zweite Sonde. Die dC- Cellulose wurde durch Zentrifugieren entfernt, jedoch ist es für den Fachmann klar, daß andere Methoden, wie Filtrieren, ebenso gut verwendet werden können.
Das verbleibende Eluat wurde durch eine 0,2 um (Mikron) Acroscheibe (Gelman) geleitet, um Magnet- und Cellulosefeinstoffe zu entfernen. Dann wurde das Eluat durch Nitrocellulosefilter enthaltend dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0; bei 22ºC geleitet. Die Nitrocellulose bewirkte das endgültige Targetfangen.
Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die Anwendung von Hintergrundfangen: Tabelle 2 Schritt Signal (cpm) Geräusch (cpm) Erster Versuch vor dem Targetfangen (unbekannt) nach dem Targetfangen nach dem Hintergrundfangen nach Filtrieren Zweiter Versuch (die Filtrationsstufe wurde nicht durchgeführt)
Das Entfernen des Geräusches auf weniger als 1 cpm erlaubt das Auffinden von sehr kleinen Mengen von Target innerhalb einer Probe. So geringe Mengen wie 10&supmin;¹&sup8; Mole Target wurden aufgefunden, das in dem Bereich liegt, der für klinische Anwendungen notwendig ist.
Eine Runde Targetfangen entfernte etwa 3 logs Hintergrund. Eine Runde Hintergrundfangen entfernte 1 log Hintergrund, der durch das erste Targetfangen noch nicht entfernt war. Das endgültige Targetfangen durch Filtrieren (eine zweite Runde Targetfangen) entfernte 2 logs Hintergrund, der durch die ersten beiden Schritte noch nicht entfernt war. Die Target- und Hintergrund-Fangmethoden arbeiten unabhängig, um Hintergründe um etwa 6 logs in diesem Beispiel zu reduzieren. Das Hintergrundfangen scheint besser zu arbeiten, wenn es nach einem ersten Targetfangen angewandt wird. Offensichtlich ist das Hintergrundfangen sehr viel empfindlicher für Verunreinigungen in der Probe als das Targetfangen.
Die Kombination von Hintergrundfangen anschließend an Targetfangen erzeugt einen größeren Nutzen als jedes allein angewandt.
Obzwar die vorhergehenden Beispiele radioaktive Markierungsteile anführen, wird erwartet, daß das vorliegende Verfahren seine größte Wirkung bei Untersuchungsverfahren unter Verwendung nicht-radioaktiver Markierungshälften haben würde. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung anwendbar auf lumineszierende Markierungshälften einschließlich fluoreszierender und chemi-lumineszierender Mittel. Geeignete fluoreszierende Markierungen umfassen als nicht beschränkende Beispiele Fluoroscein, Pyren, Acridin, Sulforhodamin, Eosin, Eryhtrosin und deren Derivate. Geeigneteehemi-lumineszierende Mittel umfassen als nicht beschränkende Beispiele Mikroperoxidase, Luminol, Isoluminol, Glukoseoxidase, Acridiniumester und deren Derivate.

Beispiel 3

Das folgende Beispiel zeigt nicht-radioaktive Markierungsteile und mehrere Runden von Targetfangen aus gespikten biologischen Medien. Das gespikte biologische Medium ähnelt Proben, welche klinisch in einer medizinischen Situation erhalten würden.
Zellextrakte von enterotoxigener E. coli und Wildtyp E. coli wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt. Um die Empfindlichkeit der Auffindung von Toxgenen in einer einer der klinischen Situation analogen Umgebung zu messen, wurde der die toxigenen Bakterien enthaltende Extrakt mit der Extrakt, der die Wildtyp E. coli enthielt, wie vorstehend beschrieben, verdünnt.
Die folgenden Materialien wurden von anonymen Spendern erhalten: Probe von menschlichem Stuhl, Kuhmilch, menschlicher Speichel, menschlicher Schleim, humanes Vollblut, Humanserum, menschlicher Urin und menschlicher Samen. Klinische Proben wurden während einer Zeitdauer von 10 Minuten solubilisiert. Die Stuhlprobe wurde infolge ihrer festen Natur in einer Lösung von 5 M GuSCN, 0,3 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 M EDTA (pH 7), 1 % beta-Mercaptoethanol solubilisiert. Nach der Solubilisierung wurden aliquote Anteile der Probe hergestellt und jedes Aliquot wurde mit einer bekannten Menge von jeweils toxigener E. coli oder Wildtyp E. coli präpariert. (spiked) Das Gemisch wurde dann durch eine rohe Filtration (Biorad Econocolumn) geleitet und während 5 Minuten auf 100ºC erhitzt.
Der Rest der Proben waren von Natur aus flüssiger und wurden anders behandelt als Stuhl. Flüssige Proben wurden zu festem GuSCN gegeben, um die Endkonzentration 5 M herzustellen. Das feste GuSCN enthielt auch genügend Tris-HCl, EDTA und beta- Mercaptoethanol, um die Endkonzentrationen gleich der der Stuhlprobe zuerbringen. Dann wurden aliquote Anteile der Proben hergestellt und jedes Aliquot wurde mit einer bekannten Menge von toxigener E. coli oder Wildtyp E. coli präpariert. Das Gemisch wurde durch eine rohe Filtration (Biorad Econocolumn) geleitet und während 5 Minuten auf 100ºC erhitzt.
Die Herstellung der Sonden in Beispiel 3 unterschied sich von den vorhergehenden Beispielen. Eine erste Fangsonde wurde mit dem Plasmid pBR322 geschaffen. Das Plasmid wurde mit Hha I und Hae III begrenzt und die Plasmidfragmente wurden mit etwa 100 dA-Resten mit terminaler Transferase am Ende versehen. Das Targetplasmid enthält weitläufige Homologie mit pBR322 (Literaturstelle Spicer and Noble, JBC 257, 5716-21). Demnach wurden erste Fangsonden aus vielfachen Fragmenten von beiden Strängen des Plasmids pBR322 in verhältnismäßig großen Mengen erzeugt.
Eine zweite Markierungssonde be wurde hergestellt, um spezifisch zu dem Target-Enterotoxingen zu kombinieren. Die zweite Markierungssonde wurde aus einem EcoRI-Hind III-Restriktionsfragment des elt A1-Gens geklont in Bacteriophage M13mp18 erzeugt. Die E. coli HB101 wurde mit dem Bacteriophagen infiziert und zur midlog-Phase wachsen gelassen. Die E. coli wurde geerntet und der Bacteriophag wurde isoliert. Der Bacteriophage wurde mit biotinylierter dCTP (Enzo Biochemicals) (nick-translated) schlitz-übertragen unter Verwendung eines Vorrats-Schlitz-Übertragungskits, was von Bethesda Research Laboratories erhältlich ist. Etwa 5 % der Nukleotide wurden durch Biotinylnukleotiden ersetzt, um eine Biotin-markierte zweite Sonde zu bilden.
Das Sondengemisch wurde hergestellt, indem 8 ug/ ml der zweiten M13-tox-Sonde mit 4 ug/ml der ersten dA-präparierten(tailed) Sonde in 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 2 mM EDTA kombiniert wurden. Das Sonden-gemisch wurde während 10 Minuten auf 100ºC erhitzt, um die Sonden zu denaturieren.
Ein Volumen des Sonden-gemisches wurde mit einem Volumen der Probe der Verdünnungsreihe vermischt, um eine Hybridisierungsmischung zu bilden. Das Hybridisierungsgemisch wurde unter Hybridisierungsbedingungen bei 57ºC während 15 Minuten gehalten. Die Hybridisierungsmischungen wurden anschließend mit 10 Volumina blockierendem Puffer verdünnt (0,75 M Natriumphosphat, pH 6,8, 0,5 % Natriumlaurylsarcosin, 10 mg/ml E. coli DNA, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA-nukleasefrei) und 5 mM EDTA). Zu dem Hybridisierungsgemisch wurden dT&sub1;&sub0;-abgeleitete Magnetkügelchen, hergestellt wie vorstehend beschrieben, gegeben. Die Hybridisierungsbedingungen wurden etwa 1 Minute bei 22ºC aufrechterhalten. Die Kügelchen wurden dann von dem Hybridisierungsgemisch durch magnetische Immobilisierung der Kügelchen abgetrennt. Die Kügelchen wurden zweimal während eines 15-minütigen Zeitabstands gewaschen, um Verunreinigungen in der biologischen Probe und unhybridisierte Biotin-markierte zweite Sonde zu entfernen.
Dann wurde in einem Zeitraum von etwa 1 Minute der erste und zweite Sonden-Targetkomplex aus den magnetischen Kügelchen bei 65ºC in blockierendem Puffer eluiert. Das Eluat und die ersten Kügelchen wurden abgetrennt.
In einer Zeitdauer von etwa 7 Minuten wurde der erste und zweite Sonden- Targetkomplex freisetzbar an eine zweite Serie von Kügelchen gebunden und wieder freigesetzt. Eine zweite Serie von dT&sub1;&sub0;-abgeleiteten Kügelchen wurden dann zu dem verdünnten Eluat gegeben und unter Hybridisierungsbedingungen während etwa 1 Minute bei 22ºC aufrechterhalten. Die Kügelchen wurden dann gewaschen und in blockierendem Puffer wieder suspendiert. Das Gemisch Kügelchen/blockierender Puffer wurde dann auf 65ºC gebracht, um den ersten und zweiten Sonden-Targetkomplex freizusetzen.
Während eines Zeitraums von 5 Minuten wurde das endgültige Fangen des ersten und zweiten Sonden-Targetkomplexes auf Nitrocellulose bewirkt. Das Eluat aus den zweiten Kügelchen wurde durch eine Gelman-Acroscheibe (0,2 um (Mikron)) filtriert. Das Eluat, welches den ersten und zweiten Sonden-Targetkomplex enthielt, wurde dann durch ein dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Nitrocellulosefilter (prähybridisiert mit blockierendem Puffer) bei 22ºC geleitet.
In einem Zeitraum von etwa 30 Minuten wurde das Filter weiter verarbeitet, um die Biotinmarkierungen der zweiten Sonde zu finden. Pufferzusammensetzungen, welche bei der Auffindung verwendet wurden, sind in der nachstehenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Detektionspuffer Puffer-Nr. Zusammensetzung
Zunächst wurde das Filter, welches den ersten und zweiten Sonden- -Targetkomplex trägt, während etwa 5 Minuten in Detektionpuffer Nr. 2 bebrütet. Dann wurde das Filter während 5 Minuten in einer 1:200-Verdünnung von Strepavidin-alkalische Phosphatase (Bethesda Research Laboratories) in Detektionspuffer-Nr. 1a bebrütet. Danach wurde das Filter dreimal während 1 Minute in Detektionspuffer-Nr. 1 gewaschen und dann zweimal während 1 Minute in Detektionspuffer-Nr. 3 gewaschen.
Das wurde 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Nitroblautetrazolium (NBT) (Kierkegaard und Perry) zwölfmal in Detektionspuffer-Nr. 3 verdünnt und durch eine 0,2 Mikron Acroscheibe filtriert. Die verdünnte BCIP- und NBT-Lösung wurde zu dem Filter gegeben und die Farbe während 15 Minuten bei 37ºC sich entwickeln gelassen.
Dann wurde das Filter in 50 mMTris-HCl (pH 7,4) und 10 mM EDTA während 1 Minute bebrütet, um die Reaktion zu stoppen. Die Empfindlichkeit wurde visuell auf dem Filter oder durch densitometrisches Abtasten auf einem CS 930 (Shimadzu Scientific) bestimmt.
Die Schritte gemäß der vorliegenden Methode sind nachstehend in Tabelle 4 dargelegt. Tabelle 4 abgelaufene Zeit Schritt Nr. erforderliche Zeit (min) Summe der Zeit (min) 1. Auflösung der biologischen Probe; Denaturierung der DNA 2. Zusatz von markierten und unmarkierten Sonden; Hybridisieren in Lösung bei 57ºC 3. Fangen des Sonden-Targetkomplexes auf magnetischen Kügelchen 4. Waschen der magnetischen Kügelchen zur Entfernung von Verunreinigungen in der biologischen Probe und Hybridisierungshintergründen 5. Eluieren des Sonden-Targetkomplexes 6. Wiederholung der Schritte 3 bis 5 auf einer zweiten Serie von Kügelchen (ausgenommen Abkürzen der Waschungen) 7. Bindung des Sonden-Targetkomplexes an dT&sub3;&sub0;&sub0;&sub0;-Nitrocellulose 8. Bebrütung des Filters in blockierendem Puffer 9. Bindung von Streptavidin-alkalischer Phosphatase 10. Waschen 11. Zusatz von Farbstoffen zur Auffindung des Enzyms 12. Abschreckungsreaktion
Obzwar Tabelle 4 ein Beispiel zeigt, worin die abgelaufene Zeit gerade über 1 Stunde beträgt, ist das Verfahren modifikationsfähig und kann in kürzeren Zeiten durchgeführt werden. Nicht-radioaktive Sonden-Assays vergleichbarer Empfindlichkeit können 12 Stunden bis mehrere Tage erfordern und ferner eine umfangreiche Probenherstellung erfordern.
Die Empfindlichkeit der vorliegenden Untersuchung ist in der nachstehenden Tabelle 5 angegeben: Tabelle 5 Empfindlichkeitsspiegel biologische Probe Konzentration in der Hybridisierungsmischung Anzahl der Bakterien bakterieller Extrakt allein menschlischer Stuhl (Gew./Vol.) Kuhmilch (Vol./Vol.) menschlicher Speichel menschlicher Urin menschlicher Samen menschliches Blut menschliches Serum menschlicher Schleim
Weiterhin sind die vorliegenden Verfahren zur weiteren Modifikationen fähig, um die Empfindlichkeiten zu verbessern. Beispielsweise erzeugt eine Kombination von thermischer Elution und chemischer Elution in vielen Fang/Freisetzungs-Zyklen ein Signal zu Geräuschverhältnis, das fünfmal besser ist als einzelne Formen der Elution, oder vieler thermischer Elutionen allein oder vieler chemischer Elutionen allein.
Die Anwendung des gleichen Freisetzungs- oder Elutionsverfahrens neigt dazu, den gleichen Hintergrund aus dem Träger freizusetzen. Jedoch neigt die Anwendung verschiedener Freisetzungsbedingungen dazu, Hintergrund auf dem Träger zurückzuhalten, was andernfalls eluiert würde. Es ist unwahrscheinlich, daß Hintergrund sich identisch zu Target unter zwei physikalisch oder chemisch unterschiedlichen Bedingungen identisch verhalten wird.
Eine typische chemische Elution von Target-Sonden-Komplexen auf magnetischen Kügelchen schließt ein das Inkontaktbringen der Kügelchen mit 3 M GuSCN während 1 Minute bei Raumtemperatur. Beispiele von thermischen Elutionen wurden vorstehend beschrieben.
Die Fähigkeit zur Detektion von Bakterien wird auch verbessert, indem die Sonden zu ribosomalen RNA-Sequenzen gerichtet werden. Ribosomale RNA-Sequenzen stellen eine 1000-fache Steigerung im Target pro Zelle dar, verglichen mit genomischer DNA und klinisch signifikanter Plasmid-DNA.
Demnach zeigt die vorliegende Erfindung eine Methode zum Targetfangen und Hintergrundreduktion und eine Vorrichtung zur Durchführung von Affinitätsuntersuchungen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung einer Probe für Targetnukleinsäure, umfassend die Schritte:

a. Inkontaktbringen der Probe mit einem Reagens unter Bindungsbedingungen, wobei das Reagens eine erste Nukleinsäure- Sonde und eine zweite Nukleinsäure-Sonde umfaßt und wobei die erste und zweite Sonde in der Lage ist, einen Komplex mit dem Target (Ziel) zu bilden, worin die erste und zweite Sonde jeweils an den Target gebunden sind, um ein Sonden-Targetprodukt zu bilden, wobei die erste Sonde in der Lage ist, an einen wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen zu binden, während diese erste Sonde an den Target gebunden ist, und die zweite Sonde eine Markierungshälfte hat, die zur Detektion fähig ist, wobei diese zweite Sonde zur Bindung an einen Hintergrundträger in der Lage ist, wenn diese zweite Sonde nicht an den Target gebunden ist;

b. Inkontaktbringen dieser Probe mit einem Hintergrundträger unter Bindungsbedingungen, um die Bildung eines Komplexes zwischen diesem Hintergrundträger und ungebundener zweiter Sonde zu erlauben;

c. im wesentlichen Abtrennen dieses Hintergrundträgers von der Probe, um ungebundene zweite Sonde zu entfernen, um den Hintergrund zu vermindern;

d. Inkontaktbringen dieser Probe und des Reagens mit einem wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen, wobei dieser wiedergewinnbare Träger in der Lage ist, an die genannte erste Sonde zu binden, um das genannte Sonden-Targetprodukt zu fangen;

e. im wesentlichen Abtrennen des wiedergewinnbaren Trägers aus der Probe unter Bildung eines Entfernungsprodukts, das in Gegenwart von Target Sonden/Target-Produkt umfaßt, und

f. Überwachen des Entfernungsprodukts auf Anwesenheit des Markierungsteils, was die Anwesenheit von Targetnukleinsäure anzeigt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei dieser Hintergrundträger Kügelchen umfaßt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei diese Kügelchen zur Wechselwirkung mit einem magnetischen Feld befähigt sind.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei dieser wiedergewinnbare Träger zur im wesentlichen homogenen Dispersion innerhalb einer Probe befähigt ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei diese Kügelchen Polystyrol umfassen.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, umfassend weiterhin die Schritte:

a. Kontaktieren des abgetrennten wiedergewinnbaren bzw. rückgewinnbaren Trägers mit einem zweiten Medium;

b. das zweite Medium wird Freisetzungsbedingungen unterworfen, um die Freisetzung des Sonden- Targetprodukts aus dem rückgewinnbaren Träger zu ermöglichen;

c. im wesentlichen Abtrennen des wiedergewinnbaren Trägers von dem zweiten Medium, um den Hintergrund zu vermindern.

d. Kontaktieren des zweiten Mediums mit einem zweiten rückgewinnbaren Träger, der zur Bildung eines Komplexes mit dem Sonden-Targetprodukt befähigt ist, unter Bindungsbedingungen, um das Abfangen des Sonden-Targetprodukts zu ermöglichen;

e. im wesentlichen Abtrennen des zweiten wiedergewinnbaren Trägers von dem zweiten Medium unter Bildung eines zweiten Entfernungsprodukts, das in Gegenwart von Target das Sonden-Targetprodukt umfaßt; und

f. Überwachen des zweiten Entfernungsprodukts auf Anwesenheit der Markierungshälfte, was die Anwesenheit von Targetnukleinsäure anzeigt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei diese Freisetzungsbedingungen in diesem zweiten Medium ausgewählt sind aus Freisetzungsmethoden einschließlich chemischer Elution und thermischer Elution.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei dieser wiedergewinnbare und Hintergrund-Träger chemisch verschieden sind.

9. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei diese Kügelchen zur spezifischen Assoziation mit einer Nukleinsäuresequenz dieser zweiten Sonde befähigt sind, und in einem flüssigen Medium dispergierbar sind.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei diese Kügelchen zur Wechselwirkung mit magnetischen Feldern befähigt sind.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei diese Kügelchen weiterhin Oligonukleotid-Liganden umfassen, befähigt zur Bindung an eine Nukleinsäuresonde.

12. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei diese Kügelchen Polystyrol umfassen.

13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei diese Kügelchen einen Durchmesser von 1 bis 10 um (Mikron) haben.

14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei diese Kügelchen eine Oberfläche haben, an die Homonukleotide kovalent gebunden sind.

15. Verfahren zur Bestimmung einer Probe für Targetnukleinsäure, umfassend:

a. Inkontaktbringen der Probe mit Reagenz unter Bindungsbedingungen, wobei das Reagens eine erste Nukleinsäure-Sonde und eine zweite Nukleinsäure-Sonde umfaßt, wobei die erste und zweite Sonde in der Lage ist, einen Komplex mit dem Target zu bilden, wobei die erste und zweite Sonde jeweils an das Ziel gebunden sind, um ein Sonden-Targetprodukt zu bilden, wobei die erste Sonde in der Lage ist, an einen wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen zu binden und die zweite Sonde einen Markierungsteil hat, der zur Detektion befähigt ist;

b. Inkontaktbringen der Probe und des Reagens mit einem wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen, wobei der wiedergewinnbare Träger in der Lage ist, diese erste Sonde zu binden, während die erste Sonde an Target als Teil dieses Sonden-Targetprodukts gebunden ist;

c. im wesentlichen Abtrennen des wiedergewinnbaren Trägers von der Probe unter Bildung eines Entfernungsprodukts, das in Gegenwart von Target das Sonden-Targetprodukt umfaßt;

d. Inkontaktbringen des wiedergewinnbaren Trägers mit einem zweiten Medium und Unterwerfen des Produktträgers Freisetzungsbedingungen, um das Sonden-Targetprodukt in das zweite Medium hinein freizusetzen;

e. im wesentlichen Abtrennen des wiedergewinnbaren Trägers von dem zweiten Medium;

f. Inkontaktbringen des zweiten Mediums mit einem zweiten wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen, wobei dieser zweite wiedergewinnbare Träger in der Lage ist, mit dem Sonden-Targetprodukt zu binden;

g. im wesentlichen Abtrennen des zweiten wiedergewinnbaren Trägers von dem zweiten Medium zur Bildung eines zweiten Entfernungsprodukts, das in Anwesenheit von Target dieses Sonden- Targetprodukt einschließt; und

h. Überwachen dieses zweiten Entfernungsprodukts auf Anwesenheit des genannten Markierungsteils, der die Anwesenheit des Targets anzeigt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin der wiedergewinnbare Träger und der zweite wiedergewinnbare Träger Kügelchen umfaßt, welche zur im wesentlichen homogenen Dispersion in der Probe befähigt sind.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Kügelchen zur Wechselwirkung mit magnetischen Feldern befähigt sind.

18. Verfahren zur Bestimmung einer Probe für Targetnukleinsäure, umfassend die Schritte:

a. Inkontaktbringen der Probe mit Reagens einschließend eine Nukleinsäure- Sonde unter Bindungsbedingungen, wobei die Sonde eine Markierungshälfte hat, zur Bildung eines Sonden-Targetkomplexes mit dem Target befähigt ist und zur Bildung eines Komplexes mit einem Hintergrundträger befähigt ist, wenn die Sonde nicht an den Target gebunden ist;

b. Kontaktieren der Probe und Reagens mit einem Hintergrundträger unter Bindungsbedingungen, wobei der Hintergrundträger zur Bindung von ungebundener Sonde unter Bindungsbedingungen befähigt ist;

c. im wesentlichen Abtrennen des Hintergrundträgers von der Probe, um ungebundene Sonde zur Verminderung des Hintergrunds zu entfernen

d. Kontaktieren der Probe und Reagens mit einem wiedergewinnbaren Träger unter Bindungsbedingungen, wobei dieser wiedergewinnbare Träger zur Bindung an die Sonde befähigt ist, um den Sonden-Targetkomplex zu fangen;

e. im wesentlichen Abtrennen des wiedergewinnbaren Tragers von der Probe, um ein Entfernungsprodukt zu bilden, das in Anwesenheit von Target Sonden-Targetprodukt umfaßt; und

f. Überwachen des Entfernungsprodukts auf Anwesenheit von Markierungsteil, was die Anwesenheit von Targetnukleinsäure anzeigt.

19. Kit zum Auffinden der Anwesenheit einer Targetnukleinsäure in einem Probenmedium, umfassend:

a. ein erstes Sonden-Reagens, das zur Bindung an den Target unter Bindungsbedingungen befähigt ist und einen wiedergewinnbaren Träger;

b. ein zweites Sonden -Reagens, das zur Bindung an den Target unter Bindungsbedingungen und an einen Hintergrundträger, wenn nicht an den Target gebunden, befähigt ist, und eine Markierungshälfte befähigt zur -Detektion einschließt;

c. einen wiedergewinnbaren Träger, der zur Bindung an das erste Sonden-Reagens unter Bindungsbedingungen befähigt ist und zur Abtrennung von dem Probenmedium befähigt ist; und

d. einen Hintergrundträger, der zur Bindung an das zweite Sonden-Reagens unter Bindungsbedingungen befähigt ist und zur Abtrennung von dem Probenmedium in der Lage ist.

20. Kit zum Auffinden der Anwesenheit einer Targetnukleinsäure in einem Probenmedium, umfassend:

a. ein erstes Sonden-Reagens befähigt unter Bindungsbedingungen zur Bindung an den Target und einen wiedergewinnbaren Träger;

b. ein zweites Sonden-Reagens befähigt zur Bindung unter Bindungsbedingungen an den Target und einschließend eine Markierungshälfte, die zur Detektion befähigt ist; und

c. eine Vielzahl von wiedergewinnbaren Trägern, die zur Bindung an die erste Sonde unter Bindungsbedingungen befähigt sind und zur Abtrennung von dem Probenmedium befähigt sind.

21. Kit gemäß Anspruch 20, worin jeder wiedergewinnbare Träger zur Bildung einer im wesentlichen homogenen Dispersion in dem Medium, das die Targetnukleinsäure enthält, in der Lage ist.

22. Kit gemäß Anspruch 21, wobei jeder wiedergewinnbare Träger eine Sammlung von Kügelchen ist, welche zur Wechselwirkung mit magnetischen Feldern befähigt sind.

23. Kit zum Auffinden der Anwesenheit einer Targetnukleinsäure in einem Probenmedium, umfassend:

a. ein Sonden-Reagens, das zur Bindung an den Target unter Bindungsbedingungen befähigt ist, einen Hintergrundträger, wenn nicht an den Target gebunden, und einen wiedergewinnbaren Träger, und weiterhin umfassend eine Markierungshälfte, die zum Auffinden in der Lage ist;

b. einen wiedergewinnbaren Träger, der zur Bindung an das Sonden-Reagens unter Bindungsbedingungen befähigt ist, und zur Abtrennung von dem Probenmedium in der Lage ist; und

c. einen Hintergrundträger, der zur Bindung an das Sonden-Reagens unter Bindungsbedingungen in der Lage ist, wenn das Sonden-Reagens nicht an den Target gebunden ist, und zur Abtrennung von dem Probenmedium befähigt ist.