JP2002500897A - 電子的核酸検出の増幅 - Google Patents

電子的核酸検出の増幅

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、シグナル増幅および標的増幅の両方を含む様々な増幅技術を使用する、核酸検出において有用な組成物と方法に関する。検出は、核酸と関連させた電子伝達部位（ＥＴＭ）を使用して直接的にまたは間接的に行い、電極を使用してＥＴＭの電子的検出を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、１９９８年１月２７日付け米国特許出願番号０９／０１４，３０４
、１９９８年１月２９日付け６０／０７３，０１１、１９９８年３月１６日付け
６０／０２８，１０２、１９９８年５月６日付け６０／０８４，４２５、１９９
８年５月６日付け６０／０８４，５０９、および１９９８年８月１７日付け０９
／１３５，１８３の継続出願であり、それらはすべてそのまま加えて、本明細書
の一部とする。
【０００２】 本発明の分野 本発明は、種々の増幅技術を用いる核酸検出に有用な組成物および方法に関係
し、シグナル増幅および標的増幅の両方が含まれる。検出は、核酸に付随し、直
接かまたは間接的の何れかで、電極を用いる電子伝達部(ＥＴＭ)の電子的検出を
可能とする、ＥＴＭの使用を介し行う。
【０００３】 本発明の背景 特定核酸の検出は、診断医学および分子生物学研究にとって重要なツールであ
る。遺伝子プローブアッセイは、最近、細菌およびウイルスのような感染生物の
同定、通常遺伝子の発現探索および癌遺伝子のような変異遺伝子の同定、組織移
植の実施に適する組織の検査、法医学用の組織または血液サンプルの適合におい
て、そして異なる種の遺伝子間の相同性の探索に役割を担う。
【０００４】 理想的には、遺伝子プローブアッセイは、感度が高く、特異的であり、容易に
自動化され得る(再調査として、Nickerson, Current Opinion in Biotechnology
4:48-51(1993))。必要とされる感度(すなわち、下方検出限界)が、下記に概略 するように分析前に特定核酸配列を研究者が指数関数的に増幅し得るポリメラー
ゼ連鎖反応(ＰＣＲ)および他の増幅技術の発達により、非常に解決された。
【０００５】 感度、すなわち検出限界は、核酸検出システムにおいて重大な傷害を残したま
まであり、種々の技術が開発され刊行物に掲載された。簡単にいうと、これらの
技術は標的増幅またはシグナル増幅の何れかとして分類できる。標的増幅は、検
出する標的核酸の増幅(すなわち、複製)を含み、標的分子の有意な増加を生ずる
。標的増幅ストラテジーは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、鎖置換増幅(stran
d displacement amplification)(ＳＤＡ)および増幅に基づく核酸配列(nucleic
acid sequence based amplification)(ＮＡＳＢＡ)を含む。
【０００６】 他に、標的の増幅以外に、他の技術は、鋳型として標的を用いシグナルプロー
ブを複製し、多数のシグナルプローブを生ずる小数の標的分子を生じ、次いで、
これらを検出し得る。シグナル増幅ストラテジーには、リガーゼ鎖反応(ligase
chain reaction)(ＬＣＲ)、サイクリングプローブ技術(cycling probe technolo
gy)(ＣＴＰ)、およびシグナル標的配列に結合する多標識プローブを生ずる“分 枝状ＤＮＡ”のような“増幅プローブ”の使用を含む。
【０００７】 ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)は、広く用いられ、述べられており、温度サイ
クリングと組合せるプライマー伸張の使用を含み、標的配列を増幅する(米国特 許番号４，８６３，１９５および４，６８３，２０２およびPCR Essential Data
, J. W. Wiley & sons, Ed. C. R. Newton, 1995、すべて引用によりこの文書に
加える)。
【０００８】 鎖置換増幅(ＳＤＡ)は、通常、Molecular Methods for Virus Detection, Aca
demic Press, Inc.,1995中のWalkerらにより、そして米国特許番号５，４５５，
１６６および５，１３０，２３８に記載されており、それらはすべて引用により
この文書に加える。
【０００９】 増幅に基く核酸配列(ＮＡＳＢＡ)は、通常、米国特許番号５，４０９，８１８
および“Profiting from Gene-based Diagnostics”, CTB International Publi
shing Inc., N, J., 1996に記載されており、それらは引用によりこの文書に加 える。
【００１０】 サイクリングプローブ技術(ＣＰＴ)は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)におい
て行うような標的増幅以外のシグナルまたはプローブ増幅に基づく核酸検出シス
テムである。サイクリングプローブ技術は、ＲＮＡの切断容易連結を含むモーラ
ー過剰の標識プローブに基く。プローブによる標的へのハイブリダイゼーション
において、生じたハイブリッドは、一部のＲＮＡ：ＤＮＡを含む。このＲＮＡ：
ＤＮＡ２本鎖の領域は、ＲＮＡｓｅＨで認識され、ＲＮＡを切除し、プローブの
切断を生ずる。この度のプローブは、２つのより小さい配列からなり、それは放
出され得、そのため、反応の繰り返しラウンドに標的未処理物が残る。非反応プ
ローブが除去され、次いで標識が検出される。ＣＰＴは、通常、米国特許番号５
，０１１，７６９、５，４０３，７１１、５，６６０，９８８および４，８７６
，１８７およびＰＣＴ公開出願ＷＯ９５／０５４８０、ＷＯ９５／１４１６およ
びＷＯ９５／００６６７に記載されており、それらはすべて引用によりこの文書
に加える。
【００１１】 ライゲーション鎖反応(ligation chain reaction)(ＬＣＲ)には、リガーゼの 鋳型として標的配列を用いる単一の長いプローブ中への２つのより小さいプロー
ブのライゲーションが含まれる。一般的に、米国特許番号５，１８５，２４３お
よび５，５７３，９０７、ＥＰ０３２０３０８Ｂ１、ＥＰ０３３６７３１Ｂ１、
ＥＰ０４３９１８２Ｂ１、ＷＯ９０／０１０６９、ＷＯ８９／１２６９６、およ
びＷＯ８９／０９８３５参照。それらは引用によりこの文書に加える。
【００１２】 “分枝ＤＮＡ”シグナル増幅は、あるプローブに付け得る標識の量を増加する
機能を有する核酸“アーム”の多様性を含む、分枝核酸の合成に依存する。この
技術は、通常、米国特許番号５，６８１，７０２、５，５９７，９０９、５，５
４５，７３０、５，５９４，１１７、５，５９１，５８４、５，５７１，６７０
、５，５８０，７３１、５，５７１，６７０、５，５９１，５８４、５，６２４
，８０２、５，６３５，３５２、５，５９４，１１８、５，３５９，１００、５
，１２４，２４６および５，６８１，６９７に記載されており、それらはすべて
引用によりこの文書に加える。
【００１３】 同様に、核酸のデンドライマー(dendrimer)は、別の組成物であるが同様な概 念を用い、単一の分子に加え得る標識の量を非常に増大させる役割を担う。この
技術は、米国特許番号５，１７５，２７０およびNilsen et al., J. Theor. Bio
l. 187:273(1997)に記載されており、それらは両方とも引用によりこの文書に加
える。
【００１４】 最終的に米国特許番号５，５９１，５７８、５，８２４，４７３、５，７７０
，３６９、５，７０５，３４８および５，７８０，２３４およびＰＣＴ出願ＷＯ
９８／２０１６２は、電極を含む、電子伝達部を含む核酸含有新規化合物につい
て記載しており、それにより核酸ハイブリダイゼーションの新規検出方法を行い
得る。
【００１５】 本発明の要旨 略述した上記の目的に従い、本発明は、標的核酸配列を検出する方法を提供す
る。当該方法は、少なくとも第一プライマー核酸を標的配列にハイブリダイズさ
せ、第一ハイブリダイゼーション複合体を形成すること、第一ハイブリダイゼー
ション複合体を第一酵素に接触させ、修飾した第一プライマー核酸を形成するこ
とを含む。次いで、第一ハイブリダイゼーション複合体を解離する。これらのス
テップは、複数回繰り返し得る。次いで、少なくとも１つのＥＴＭおよび修飾し
た第一プライマー核酸を含む第一アッセイ複合体を形成する。アッセイ複合体は
、電極と共有結合する。次いで、電子伝達を、標的配列の存在を示すＥＴＭと電
極との間で検出する。当該方法は、第一標的配列に実質的に相補的な第二標的配
列において同じ方法を含み得る。
【００１６】 更なる態様では、当該方法は、ＤＮＡポリメラーゼを使用し、プライマーへの
修飾は、そのようにしてポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)が生ずるプライマーの伸
張である。
【００１７】 更なる態様では、当該方法はリガーゼを利用し、プライマーへの修飾には、第
一標的配列の第一ドメインにハイブリダイズする第一プライマーによる、第一標
的配列の第二隣接ドメインにハイブリダイズする第三プライマーへのライゲーシ
ョンを含む。そのようにして、リガーゼ鎖反応(ＬＣＲ)が生ずる。
【００１８】 更なる態様では、本発明は、第一プローブ配列、第一切断容易連結および第二
プローブ配列を含む第一プライマーを利用する。酵素は、第一切断容易連結を切
断し、第一標的配列が未処理のままとなる一方、第一および第二プローブ配列の
分離ならびにハイブリダイゼーション複合体の解離を生じ、そのようにして、サ
イクリングプローブ技術(ＣＰＴ)反応が生ずる。
【００１９】 更なる態様では、当該方法は、第一プライマーを伸張するポリメラーゼである
第一酵素を利用し、第一新規合成鎖を含む修飾第一プライマーを形成し、当該方
法は、さらに、伸張した第一プライマーにニックを入れるニッキング酵素を含む
第二酵素の添加を含み、第一標的配列を未処理のままとする。その方法は、ポリ
メラーゼを用いニックからの伸張を更に含み、それによって、第一新規合成鎖を
置換し、そして第二新規合成鎖を生成する。そのようにして、鎖置換増幅(ＳＤ Ａ)が生ずる。
【００２０】 更なる態様では、当該方法は、ＲＮＡ標的配列である第一標的配列、ＲＮＡポ
リメラーゼプロモーターを含むＤＮＡプライマーである第一プライマー核酸を利
用し、そして、第一酵素は第一プライマーを伸張する逆転写酵素であり、第一新
規合成ＤＮＡ鎖を形成する。当該方法は、更に、第一標的配列を分解するＲＮＡ
分解酵素を含む第二酵素の添加を含む。次いで、第三プライマーを加え、第一新
規合成ＤＮＡ鎖にハイブリダイズする。第三プライマーを伸張して第二新規合成
ＤＮＡ鎖を形成するＤＮＡポリメラーゼを含む第三酵素が加えられ、新規合成Ｄ
ＮＡハイブリッドを形成させる。次いで、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを認
識しＤＮＡハイブリッドから少なくとも１つの新規合成ＲＮＡ鎖を生成するＲＮ
Ａポリメラーゼを含む第四酵素が加えられる。そのようにして、核酸配列に基く
増幅(ＮＡＳＢＡ)が生ずる。
【００２１】 更なる態様では、本発明は、増幅プローブおよび標的配列を含む第一ハイブリ
ダイゼーション複合体の形成を含む標的核酸配列を検出する方法を提供する。当
該増幅プローブは、少なくとも２つの増幅配列を含み、少なくとも１つの標識プ
ローブの第一部分を少なくとも１つの増幅配列のすべてまたは一部にハイブリダ
イズすることを含む。次いで、標識プローブの第二部分を、導電性オリゴマーを
介し電極に共有結合した検出プローブにハイブリダイズさせ、少なくとも第一電
子伝達部(ＥＴＭ)を含む第二ハイブリダイゼーション複合体を形成する。次いで
、標識プローブを、当該第一ＥＴＭと当該電極との間の電子伝達を測定すること
により検出する。
【００２２】 更なる態様では、本発明は、増幅プローブおよび標的配列を含む第一ハイブリ
ダイゼーション複合体の形成を含む標的核酸配列を検出する方法を提供する。当
該増幅プローブは、少なくとも２つの増幅配列を含み、そして、当該第一ハイブ
リダイゼーション複合体は、導電性オリゴマーを含む単層を含む電極に共有結合
する。少なくとも１つの電子伝達部(ＥＴＭ)を含む少なくとも１つの標識プロー
ブを、少なくとも１つの増幅配列のすべてまたは一部にハイブリダイズさせ、そ
して標識プローブを、当該第一ＥＴＭと当該電極の間の電子伝達を測定すること
により検出する。
【００２３】 更なる態様では、本発明は、標的配列の少なくとも第一ドメインに実質的に相
補的な少なくとも第一核酸プライマーおよび第一核酸プライマーを修飾する少な
くとも第一酵素を含む第一標的核酸配列の検出用のキットを提供する。キットは
、更に、導電性オリゴマーを介して電極に共有結合する少なくとも１つの検出プ
ローブを含む電極を含む。
【００２４】 発明の詳細な記載 本発明は、シグナル増幅および標的増幅を含め、様々な増幅技術を用いる核酸
の検出に有用な組成物および方法に関するものである。一旦増幅が行われると、
検出は電子伝達に基いて行われるが、これについては下記で説明され、また全般
的には米国特許第５５９１５７８、５８２４４７３、５７７０３６９、５７０５
３４８および５７８０２３４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９８／２０１６２に概略が
示されており、これらをそのまま引用して説明の一部とする。
【００２５】 従って、好ましい態様において、本発明は、増幅を利用した標的核酸の検出方
法を提供する。ここで「標的核酸」または「標的配列」または文法的にこれと均
等内容の語は、核酸の１本鎖における核酸配列を指す。標的配列は、遺伝子の一
部、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含むＲＮＡ
などであり得る。それはいかなる長さでもあり得るが、配列が長いとより特異的
であるものとする。態様によっては、試料核酸を１００〜１００００塩基対のフ
ラグメントへ断片化または開裂するのが望ましい場合もあり得、ほぼ５００塩基
対のフラグメントが好ましい場合もあり得る。当業界の専門技術者が認めるよう
に、相補的標的配列は多くの形態をとり得る。例えば、それはより大きな核酸配
列、すなわち遺伝子またはｍＲＮＡの全部または一部、プラスミドまたはゲノム
ＤＮＡの制限フラグメントなどの内に含まれ得る。標的配列を含む試料は、事実
上いかなる生物体からのいかなる組織でもあり得、例えば血液、骨髄、リンパ、
硬組織（例、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺などの器官）、唾液、膣および肛門分
泌物、尿、糞、汗、涙および他の体液、並びにウイルスを含む細菌および病原体
の細胞ライゼートであり得る。
【００２６】 さらに下記で概説している通り、プローブ（プライマーを含む）を、標的配列
とハイブリダイズさせることにより、試料中における標的配列の存在または非存
在を測定する。概して、この語は、当業界の専門技術者であれば理解できるもの
である。
【００２７】 標的配列はまた、異なる標的ドメインにより構成され得る。例えば、下記で概
説されている「サンドイッチ」型検定において、試料標的配列の第１標的ドメイ
ンは、捕獲プローブまたは捕獲エキステンダープローブの一部にハイブリダイズ
し得、第２標的ドメインは、アンプリファイアプローブの一部、標識プローブ、
または異なる捕獲または捕獲エキステンダープローブなどにハイブリダイズし得
る。さらに、標的ドメインは近接（すなわち隣接）しているかまたは分離され得
る。例えば、ＬＣＲ技術を使用する場合、第１プライマーは第１標的ドメインに
ハイブリダイズし得、第２プライマーは第２標的ドメインにハイブリダイズし得
る。さらに下記で概説されているように、ドメインは隣接しているか、またはそ
れらは、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの使用により結合された、１個またはそれ
以上のヌクレオチドにより分離され得る。
【００２８】 「第１」および「第２」の語は、標的配列の５'−３'方向に関して配列の配向
を与えるものではない。例えば、相補的標的配列の５'−３'配向を仮定すると、
第１標的ドメインは第２ドメインに対して５'、または第２ドメインに対して３'
に位置し得る。
【００２９】 必要ならば、標的配列は、公知技術を用いて製造される。当業界の専門技術者
が認めるところによると、例えば、試料を処理することにより、公知溶解緩衝液
、音波処理、電気穿孔などを用いて細胞を溶解し、必要に応じて精製する。さら
に、ここで概説されている反応は、当業界の専門技術者が認めるように様々な方
法で達成され得る。反応の成分は、同時に、または連続的に適当な順序で加えら
れ得るが、好ましい態様については下記で概説されている。さらに、反応には、
検定に含まれ得る様々な他の試薬も含まれ得る。これらには、試薬、例えば塩類
、緩衝液、中性タンパク質、例えばアルブミン、デタージェントなどがあり、こ
れらを用いることにより、最適なハイブリダイゼーションおよび検出が簡易化さ
れ、および／または非特異的またはバックグラウンド相互作用が低減化され得る
。また、試料製造方法および標的純度によっては、別の点で検定効率を改善する
試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤なども使用され
得る。
【００３０】 さらに、殆どの態様において、２本鎖標的核酸を変性させて、それらを１本鎖
にすることにより、本発明によるプライマーおよび他のプローブのハイブリダイ
ゼーションが行われ得る。好ましい態様の場合、一般に反応温度を約９５℃に上
昇させることによる熱処理段階を利用するが、ｐＨ変化および他の技術も使用さ
れ得る。
【００３１】 次いで、プライマー核酸を標的配列と接触させることにより、ハイブリダイゼ
ーション複合体を形成させる。ここで「プライマー核酸」とは、標的配列のある
部分、すなわちドメインとハイブリダイズするプローブ核酸を意味する。本発明
の標的配列およびプローブのハイブリダイゼーションが行われるように、本発明
のプローブは、標的配列（後述されているように、試料の標的配列または他のプ
ローブ配列に対し）と相補的になるように設計されている。下記で概説されてい
る通り、この相補性は完全である必要はない。本発明の標的配列および１本鎖核
酸間のハイブリダイゼーションを阻む塩基対の誤対合がかなり多数存在し得る。
しかしながら、突然変異の数が大きすぎるため最低のストリンジェンシーのハイ
ブリダイゼーション条件下でさえハイブリダイゼーションが全く起こり得ない場
合、配列は相補的標的配列ではない。すなわち、ここで「実質的に相補的」とは
、プローブが、標的配列と十分に相補的であるため通常の反応条件下でハイブリ
ダイズすることを意味する。
【００３２】 高度、中度および低度ストリンジェンシー条件を含め、様々なハイブリダイゼ
ーション条件が本発明では使用され得る。例えば、Maniatisら、Molecular Clon
ing: A Laboratory Manual 第２版、１９８９、および Short Protocols in Mol
ecular Biology、 Ausubelら編参照、これらを引用して説明の一部とする。スト
リンジェント条件は、配列依存的であり、環境によって異なる。配列が長いとき
、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関
する十分な指針は、Tijssen、Techniques in Biochemistry and Molecular Biol
ogyHybridization with Nucleic Acid Probes、“Overview of principles of h
ybridization and the strategy of nucleic acid assays”（１９９３）に記載
されている。一般に、選択されるストリンジェント条件は、特定されたイオン強
度ｐＨでの特異配列に関する熱融解点（Ｔｍ）より約５−１０℃低い。Ｔｍは、
標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列とハイブリダイズする
温度（特定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度で）である（標的配列はＴｍ
で過剰に存在するため、プローブの５０％は平衡状態で占拠される）。ストリン
ジェント条件は、ｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０未満のナトリウムイオン 、典型的には約０.０１〜１.０モルのナトリウムイオン濃度（または他の塩類）
であり、温度は、短いプローブ（例、１０〜５０ヌクレオチド）の場合少なくと
も約３０℃であり、長いプローブ（例、５０ヌクレオチドより大）の場合少なく
とも約６０℃である。またストリンジェント条件は、脱安定（destabilizing） 剤、例えばホルムアミドを添加することにより達成され得る。当業界で公知のよ
うに、非イオン性バックボーン、すなわちＰＮＡを使用する場合は、ハイブリダ
イゼーション条件もまた変化し得る。さらに、架橋剤は、標的結合後に加えられ
ることにより、ハイブリダイゼーション複合体の２本鎖を架橋、すなわち共有結
合させ得る。
【００３３】 すなわち、検定は、一般に標的の存在下でのみハイブリダイゼーション複合体
を形成させ得るストリンジェンシー条件下で行われる。ストリンジェンシーは、
限定的ではないが、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、
ｐＨ、有機溶媒濃度などを含む熱力学的変数である段階パラメーターを改変する
ことにより制御され得る。
【００３４】 米国特許第５６８１６９７号で全般的に概説されているように、これらのパラ
メーターはまた、非特異的結合の制御にも使用され得る。すなわち、非特異的結
合を低減化するため高いストリンジェンシー条件である種の段階を遂行するのが
望ましい場合もあり得る。
【００３５】 プローブ（プライマーを含む）は核酸を含む。本明細書で「核酸」または「オ
リゴヌクレオチド」またはそれらと均等内容の語は、一緒に共有結合されている
少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般にホスホジエス
テル結合を含むが、場合によっては、下記で概説されている通り、交互のバック
ボーンを有し得る核酸類似体が含まれ、例えばホスホルアミド（Beaucageら、Te
trahedoron ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびそれに記載された参考 文献、Letsinger, J. Org. Chem. ３５：３８００（１９７０）、Sprinzlら、Eu
r. J. Biochem. ８１：５７９（１９７７）、Letsingerら、Nucl. Acids Res. １４：３４８７（１９８６）、Sawaiら、Chem. Lett. ８０５（１９８４）、Let
singerら、Ｊ. Am. Chem. Soc. １１０：４４７０（１９８８）、およびPauwels
ら、Chemica Scripta ２６：１４１ ９１９８６））、ホスホロチオエート（Mag
ら、Nucleic Acids Res. １９：１４３７（１９９１）、および米国特許第５６ ４４０４８号）、ホスホロジチオエート（Briuら、J. Am. Chem. Soc. １１１：
２３２１（１９８９）、Ｏ−メチルホスホルアミダイト連鎖（Eckstein、Oligon
ucleotides and Analogues: A Practical Approach、オクスフォード・ユニバー
シティー・プレス参照）、およびペプチド核酸バックボーンおよび連鎖（Egholm
、J. Am. Chem. Soc. １１４：１８９５（１９９２）、Meierら、Chem. Int. Ed
. Engl.、３１：１００８（１９９２）、Nielsen、Nature、３６５：５６６（１
９９３）、Carissonら、Nature ３８０：２０７（１９９６）参照、これら全て を引用して説明の一部とする）が含まれる。他の類似核酸には、正のバックボー
ン（Denpcyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９２：６０９７（１９９５））、
非イオン性バックボーン（米国特許第５３８６０２３,５６３７６８４,５６０２
２４０,５２１６１４１および４４６９８６３号、Kiedrowshiら、Angew. Chem.
Intl. Ed. English、３０：４２３（１９９１）、Letsingerら、J. Am. Chem. S
oc.、１１０：４４７０（１９８８）、Letsingerら、Nucleoside & Nucleotide 、１３：１５９７（１９９４）、２および３章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５
８０、“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”、Y.S. Sanghui
およびP. Dan Cook編、Mesmaekerら、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett.、４
：３９５（１９９４）、Jeffsら、J. Biomolecular NMR、３４：１７（１９９４
）、Tetrahedron Lett.３７：７４３（１９９６））および非リボースバックボ ーンを伴うもの、例えば米国特許第５２３５０３３および５０３４５０６号、お
よび６および７章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、“Carbohydrate Modif
ications in Antisense Research”、Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cook編記載の ものがある。また、１個またはそれ以上の炭素環状糖類を含む核酸も核酸の定義
内に含まれる（Jenkinsら、Chem. Soc. Rev.（１９９５）１６９−１７６頁参照
）。幾つかの核酸類似体は、Rawls、C & E News １９９７年６月２日号、３５頁
に報告されている。これらの参考文献は全て特に引用して説明の一部とする。リ
ボース−リン酸バックボーンにこれらの修飾を加えることにより、ＥＴＭの付加
が簡易化され、または生理学的環境における上記分子の安定性および半減期が増
加され得る。さらに、「ＤＮＡ」および「ＲＮＡ」の語の使用は、当然核酸類似
体を含むものとする。
【００３６】 当業界の技術者が認めるように、これらの核酸類似体は全て本発明で使用され
得る。さらに、天然に存する核酸および類似体の混合物が製造され得る。例えば
、伝達性オリゴマーまたはＥＴＭ結合部位では、類似構造が使用され得る。別法
として、異なる核酸類似体の混合物、および天然核酸および類似体の混合物も製
造され得る。
【００３７】 特に好ましいのは、ペプチド核酸類似体を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）である
。天然に存する核酸の高荷電ホスホジエステルバックボーンとは対照的に、これ
らのバックボーンは中性条件下では実質的に非イオン性である。これによって、
２つの利点が得られる。まず、ＰＮＡバックボーンは、改善されたハイブリダイ
ゼーション速度論を呈する。ＰＮＡは、誤対合対完全適合塩基対において融解温
度（Ｔｍ）のより大きな変化を有する。ＤＮＡおよびＲＮＡは、内部誤対合の場
合典型的にはＴｍの２−４℃降下を呈する。非イオン性ＰＮＡバックボーンの場
合、降下は７−９℃に近い。これによって、誤対合が検出され易くなる。同様に
、それらの非イオン的性質故に、これらのバックボーンに結合された塩基のハイ
ブリダイゼーションは、塩濃度に対して比較的非感受性である。還元塩ハイブリ
ダイゼーション溶液は、生理学的塩溶液よりも（１５０ミリモルの範囲で）低い
ファラデー電流を有するため、これは本発明のシステムでは特に有利である。
【００３８】 核酸は、明記されている通り１本または２本鎖であるか、または２本鎖または
１本鎖の両配列の一部を含み得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム性およびｃＤＮＡの
両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、その場合核酸はデオキシリボ−およ
びリボ−ヌクレオチドの任意の組み合わせ、並びにウラシル、アデニン、チミン
、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン
、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせを含む。好ましい態様は、米
国特許第５６８１７０２号で総括的に記載されている通り、非特異的ハイブリダ
イゼーションを低減化するために、標的配列ではなく、他のプローブと相補的に
なるように設計された核酸においてイソシトシンおよびイソグアニンを用いる。
ここで使用されている、「ヌクレオシド」の語は、ヌクレオチド並びにヌクレオ
シドおよびヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオシド、例えばアミノ修飾ヌ
クレオシドを包含する。さらに、「ヌクレオシド」は、非天然的類似構造を包含
する。すなわち、例えば各々塩基を含む、ペプチド核酸の個々の単位は、ここで
はヌクレオシドと称される。
【００３９】 プライマー核酸の大きさは、当業界の技術者が認めるように、一般に５〜５０
０ヌクレオチド長の範囲で変化し得、使用および増幅技術によって、１０および
１００間のプライマーが好ましく、１５および５０間が特に好ましく、さらに１
０〜３５が特に好ましい。
【００４０】 さらに、異なる増幅技術は、下記で詳述されているように、プライマーのさら
に別の必要条件を有し得る。
【００４１】 一旦プライマーおよび標的配列間でハイブリダイゼーション複合体が形成され
ると、「増幅酵素」と呼ばれることもある、一酵素を用いてプライマーを修飾す
る。ここで概略が示された全方法に関する限りでは、酵素は、プライマーを加え
る前、間または後の、検定中におけるいずれの時点で加えられてもよい。酵素の
同定は、下記でさらに十分概説されている通り、使用される増幅技術により異な
る。同様に、修飾は、下記で概説されている通り、増幅技術により異なるが、一
般にここでの全反応の第１段階はプライマーの伸長であり、すなわちヌクレオチ
ドはプライマーに付加されてその長さを延長する。
【００４２】 一旦酵素がプライマーに修飾を加えることにより修飾プライマーが形成される
と、ハイブリダイゼーション複合体は解離される。一般に、増幅段階を一定期間
反復することにより、元の標的配列のコピー数および検出感度によって多数の周
期が可能となり、その場合周期は１〜１０００の範囲であって、１０〜１００周
期が好ましく、２０〜５０の周期が特に好ましい。
【００４３】 適当な時間または増幅後、下記でさらに十分に概説されている通り、修飾プラ
イマーは検定複合体に組込まれる。検定複合体は電極に共有結合され、後述され
ている、少なくとも１個の電子伝達部分（ＥＴＭ）を含む。次いで、ＥＴＭおよ
び電極間の電子伝達が検出されることにより、後述されている通り、元の標的配
列の存在または非存在が示される。
【００４４】 好ましい態様において、増幅は標的増幅である。標的増幅は、標的配列のコピ
ー数が増加されるように、検出される標的配列の増幅（複製）を含む。適当な標
的増幅技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およ
び核酸配列に基く増幅（ＮＡＳＢＡ）があるが、これらに限定はされない。
【００４５】 好ましい態様において、標的増幅技術はＰＣＲである。ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）については、広範に使用および報告されており、熱サイクリングと組
み合わせてプライマー伸長を使用することにより標的配列が増幅される。米国特
許第４６８３１９５および４６８３２０２号、並びに PCR Essential Data、J.W
.Wiley & sons、C.R. Newton編、１９９５（これらを全て引用して説明の一部と
する）参照。さらに、本発明でも使用されるＰＣＲの変形法が若干存在し、特に
、「定量競合的ＰＣＲ」または「ＱＣ−ＰＣＲ」、「不定プライマー（arbitrar
ily primed）ＰＣＲ」または「ＡＰ−ＰＣＲ」、「イムノ−ＰＣＲ」、「Ａｌｕ
−ＰＣＲ」、「ＰＣＲ１本鎖配座多形性」または「ＰＣＲ−ＳＳＣＰ」、「逆転
写酵素ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」、「ビオチン捕獲ＰＣＲ」、「ベクトレ
ットＰＣＲ」、「パンハンドルＰＣＲ」および「ＰＣＲセレクトｃＤＮＡサブト
レーション（subtration）」がある。一態様の場合、増幅技術はＰＣＲではない
。
【００４６】 一般に、ＰＣＲは、簡単に述べると次のように記載され得る。一般的には温度
を上げることにより２本鎖標的核酸を変性させ、次いで過剰のＰＣＲプライマー
の存在下で冷却し、次いでこれを第１標的鎖とハイブリダイズさせる。次に、Ｄ
ＮＡポリメラーゼの作用によりプライマーが伸長され、ハイブリダイゼーション
複合体を形成する新しい鎖が合成される。次いで、試料を再加熱してハイブリダ
イゼーション複合体を解離し、このプロセスを反復する。相補的標的鎖に関する
第２ＰＣＲプライマーを用いることにより、迅速な指数的増幅が行われる。すな
わち、ＰＣＲ段階は、変性、アニーリングおよび伸長である。ＰＣＲの詳細は公
知であり、耐熱性ポリメラーゼ、例えばＴａｑＩポリメラーゼの使用および熱サ
イクリングが含まれる。
【００４７】 従って、ＰＣＲ反応は、少なくとも１つのＰＣＲプライマーおよびポリメラー
ゼを必要とする。
【００４８】 好ましい態様において、標的増幅技術はＳＤＡである。鎖置換増幅（ＳＤＡ）
は、Walkerら、Molecular Methods for Virus Detection、アカデミック・プレ ス、インコーポレイテッド（１９９５）、および米国特許第５４５５１６６およ
び５１３０２３８号に記載されており、これらを特にそのまま引用して説明の一
部とする。
【００４９】 一般に、ＳＤＡは次のように記載され得る。１本鎖標的核酸、通常ＤＮＡ標的
配列を、ＳＤＡプライマーと接触させる。「ＳＤＡプライマー」は、一般に２５
−１００ヌクレオチドを有し、約３５ヌクレオチドのＳＤＡプライマーが好まし
い。ＳＤＡプライマーは、標的配列の３'末端にある領域と実質的に相補的であ り、プライマーは、下記で概説されている通り、その５'末端（標的に相補的で ある領域の外側）に、ここで「ニッキング酵素」または「ニッキングエンドヌク
レアーゼ」と称されることもある制限エンドヌクレアーゼに関する認識配列であ
る配列を有する。次いで、ＳＤＡプライマーは、標的配列にハイブリダイズする
。ＳＤＡ反応混合物はまた、ポリメラーゼ（下記で概説されている「ＳＤＡポリ
メラーゼ」）および４種の全デオキシヌクレオシド−三リン酸（デオキシヌクレ
オチドまたはｄＮＴＰとも呼ばれる、すなわちｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰお
よびｄＧＴＰ）の混合物を含み、後者のうちの少なくとも１種は置換または修飾
ｄＮＴＰである。すなわち、ＳＤＡプライマーは修飾される、すなわち伸長され
ることにより、ここで「新規合成鎖」と称されることもある修飾プライマーを形
成する。置換ｄＮＴＰは、置換ｄＮＴＰを含む鎖における開裂を阻止するが、他
の鎖における開裂については阻止しないように修飾される。適当な置換ｄＮＴＰ
の例には、２'デオキシアデノシン５'−Ｏ−（１−チオ三リン酸）、５−メチル
デオキシシチジン５'−三リン酸、２'−デオキシウリジン５'−三リン酸、およ び７−デアザ−２'−デオキシグアノシン５'−三リン酸があるが、これらに限定
はされない。さらに、ｄＮＴＰの置換は新規合成鎖への組込み後に行われ得る。
例えば、メチラーゼを使用することにより、メチル基が合成鎖に付加され得る。
さらに、ヌクレオチド全てが置換されている場合、ポリメラーゼは、５'−３'エ
キソヌクレアーゼ活性を有し得る。しかしながら、全部ではないヌクレオチドが
置換されている場合、ポリメラーゼは、好ましくは５'−３'エキソヌクレアーゼ
活性を欠いている。
【００５０】 当業界の専門技術者が認めるところによると、認識部位／エンドヌクレアーゼ
対は、広く多様な公知組み合わせのいずれかであり得る。エンドヌクレアーゼは
、認識部位またはそれに対する３'もしくは５'のいずれかにおいて鎖を開裂する
ように選択されるが、酵素が１本鎖を開裂するだけであるためか、または置換ヌ
クレオチドが組込まれているため、相補的配列を開裂することはない。適当な認
識部位／エンドヌクレアーゼ対は、当業界では公知である。適当なエンドヌクレ
アーゼには、ＨｉｎｃII、ＨｉｎｄII、ＡｖａＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｔｔｈｌｌｌ
ｌ、Ｎｃｌｌ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＩなどがあるが、これらに限定されるわけで
はない。適当な酵素、およびそれらの対応する認識部位および使用すべき修飾ｄ
ＮＴＰを描くチャートは、米国特許第５４５５１６６号に記載されており、これ
を特に引用して説明の一部とする。
【００５１】 一旦ニッキングされると、ポリメラーゼ（「ＳＤＡポリメラーゼ」）を用いて
、新規にニッキングされた鎖を伸長することにより、別の新規合成鎖が作成され
る。選択されたポリメラーゼは、ニック部位で５'−３'重合を開始させ得るべき
であり、また、ニックから下流の重合鎖を置換すべきであり、５'−３'エキソヌ
クレアーゼ活性を欠くべきである（これはさらに遮断剤の添加により達成され得
る）。すなわち、ＳＤＡにおける適当なポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウ断片、シークエナーゼ１.０およびシークエナーゼ２.０（ＵＳバイ
オケミカル）、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ があるが、これらに限定はされない。
【００５２】 従って、ＳＤＡ反応は、特定順序ではなく、ＳＤＡプライマー、ＳＤＡポリメ
ラーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼおよびｄＮＴＰを必要とし、後者のうち
の少なくとも１種は修飾されている。
【００５３】 一般に、ＳＤＡは熱サイクリングを必要とはしない。反応温度は、一般に非特
異的ハイブリダイゼーションを阻止するのには十分な程度高いが、特異的ハイブ
リダイゼーションを行わせるのに十分な程度低く設定される。これは、酵素によ
って異なるが、一般に約３７℃〜約４２℃である。
【００５４】 好ましい態様において、ここに記載されている増幅技術の大部分に関する限り
では、相補的標的配列を用いて第２増幅反応が行われることにより、設定期間の
間に増幅が実質的に増加され得る。すなわち、第２プライマー核酸を、実質的に
第１標的配列と相補的である第２標的配列へハイブリダイズすることにより、第
２ハイブリダイゼーション複合体が形成される。酵素を添加した後、第２ハイブ
リダイゼーション複合体が解離されると、若干の新規合成第２鎖が生成される。 こうして、若干の標的分子が製造される。下記でより詳しく概説されているよ
うに、これらの反応（すなわち、これらの反応の生成物）は、若干の方法で検出
され得る。一般に、標的産物の直接的または間接的検出のいずれかが行われ得る
。この明細書で使用されている「直接」検出は、ここで概説された他の増幅戦略
の場合と同様、標的配列への標識、この場合は電子伝達部分（ＥＴＭ）の組込み
を必要し、下記で概説されている「メカニズム−１」または「メカニズム−２」
に従い検出が行われる。この態様では、ＥＴＭ（複数可）は、３つの方法で組込
まれ得る。すなわち、（１）プライマーが、例えば塩基、リボース、燐酸または
核酸類似体における類似構造に結合されたＥＴＭ（複数可）を含むか、（２）Ｅ
ＴＭ（複数可）により塩基またはリボースが（または核酸類似体における類似構
造に）修飾された修飾ヌクレオシドが使用され、次いでこれらのＥＴＭ修飾ヌク
レオシドが三リン酸形態に変換され、ポリメラーゼにより新規合成鎖へ組込まれ
るか、または（３）ＥＴＭの「テイル」が下記で概説されているように付加され
得る。これらの方法のいずれかにより、ＥＴＭを含む新規合成鎖が生成され、下
記で概説されているように直接検出され得る。
【００５５】 別法として、間接的検出は、ＥＴＭを殆どまたは全く含まない新規合成鎖との
、サンドイッチ検定として行われる。次いで、検出は、ＥＴＭ（複数可）を含む
標識プローブの使用により行われる。これらの標識プローブは、下記でより詳述
されているように、直接新規合成鎖または中間体プローブ、例えば増幅プローブ
とハイブリダイズする。この場合、下記で概説されている検出に使用されるのは
、標識プローブにおけるＥＴＭである。
【００５６】 好ましい態様において、標的増幅技術は、核酸配列に基く増幅法（ＮＡＳＢＡ
）である。ＮＡＳＢＡは、全般的に米国特許第５４０９８１８号および“Profit
ing from Gene-based Diagnostics”、ＣＴＢインターナショナル・パブリッシ ング・インコーポレイテッド、ニュージャージー（１９９６）に記載されており
、これら両方をそのまま特に引用して説明の一部とする。 一般に、ＮＡＳＢＡは次のように説明され得る。１本鎖標的核酸、通常ＲＮＡ
標的配列（ここでは「第１標的配列」または「第１鋳型」と称されることもある
）を、第１ＮＡＳＢＡプライマーと接触させる。「ＮＡＳＢＡプライマー」は、
一般に２５−１００ヌクレオチドの長さを有し、約５０−７５ヌクレオチドのＮ
ＡＳＢＡプライマーが好ましい。第１ＮＡＳＢＡプライマーは、好ましくはその
３'末端に第１鋳型の３'末端と実質的に相補的である配列を有するＤＮＡプライ
マーである。第１ＮＡＳＢＡプライマーは、その５'末端にＲＮＡポリメラーゼ プロモーターを有する。次いで、第１ＮＡＳＢＡプライマーを第１鋳型とハイブ
リダイズさせると、第１ハイブリダイゼーション複合体が形成される。第１ＮＡ
ＳＢＡプライマーが修飾、すなわち伸長されることにより、ＲＮＡ（第１鋳型）
およびＤＮＡ（新規合成鎖）のハイブリダイゼーション複合体を含む、修飾第１
プライマーが形成されるように、ＮＡＳＢＡ反応混合物はまた、逆転写酵素（「
ＮＡＳＢＡ逆転写酵素」）および４種のｄＮＴＰの混合物を含んでいる。
【００５７】 ここで「逆転写酵素」または「ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、Ｄ
ＮＡプライマーおよびＲＮＡ鋳型からＤＮＡを合成し得る酵素を意味する。適当
なＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼには、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素
（「ＡＭＶＲＴ」）およびモロニーネズミ白血病ウイルスＲＴがあるが、これら
に限定はされない。
【００５８】 上記で列挙された成分に加えて、ＮＡＳＢＡ反応はまた、ここではリボヌクレ
アーゼと称されることもあるＲＮＡ分解酵素を含み、それは１本または２本鎖Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡを加水分解せずにＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水
分解する。適当なリボヌクレアーゼには、エシェリキア・コリ（E.coli）および
子牛胸腺からのリボヌクレアーゼＨがあるが、これらに限定はされない。
【００５９】 リボヌクレアーゼが、ハイブリダイゼーション複合体における第１ＲＮＡ鋳型
を分解することにより、ハイブリダイゼーション複合体が解離され、ここで「第
２鋳型」と称されることもある、第１の１本鎖新規合成ＤＮＡ鎖が脱離する。
【００６０】 さらに、ＮＡＳＢＡ反応はまた、一般にＤＮＡ（プライマーを含め、ここでの
プローブ全てに関する限り、核酸類似体も使用され得る）を含む第２ＮＡＳＢＡ
プライマーを含む。この第２ＮＡＳＢＡプライマーは、第２鋳型の３'末端と実 質的に相補的である配列をその３'末端に有し、また機能的プロモーターに関す るアンチセンス配列および転写開始部位のアンチセンス配列を含む。すなわち、
このプライマー配列は、第３ＤＮＡ鋳型の合成用鋳型として使用されるとき、Ｒ
ＮＡポリメラーゼの特異的で有効な結合および所望の部位における転写開始を可
能にするだけの情報を含んでいる。好ましい態様では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー ゼのものであるアンチセンスプロモーターおよび転写開始部位を使用するが、他
のＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび開始部位も下記で概説されている通り
同様に使用され得る。
【００６１】 第２プライマーは第２鋳型とハイブリダイズし、反応にも存在する「ＤＮＡ依
存性ＤＮＡポリメラーゼ」とも呼ばれるＤＮＡポリメラーゼが第３鋳型（第２新
規合成ＤＮＡ鎖）を合成することにより、２本の新規合成ＤＮＡ鎖を含む第２ハ
イブリダイゼーション複合体が生成される。
【００６２】 最後に、ＲＮＡポリメラーゼおよび必要とされる４種のリボヌクレオシド三リ
ン酸（リボヌクレオチドまたはＮＴＰ）を封入すると、ＲＮＡ鎖（第１鋳型と本
質的には同じである第３新規合成鎖）が合成される。ここでは「ＤＮＡ依存性Ｒ
ＮＡポリメラーゼ」と称されることもあるＲＮＡポリメラーゼは、プロモーター
を認識し、開始部位でのＲＮＡ合成を特異的に開始させる。さらに、ＲＮＡポリ
メラーゼは、好ましくは１つのＤＮＡデュプレックス（二重らせん）につきＲＮ
Ａの幾つかのコピーを合成する。好ましいＲＮＡポリメラーゼには、Ｔ７ ＲＮ Ａポリメラーゼ、およびファージＴ３、ファージφｌｌ、サルモネラ（Salmonel
la）ファージｓｐ６、またはシュードモナス（Pseudomonase）ファージｇｈ−１
のものを含む他のバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼがあるが、これらに限
定はされない。
【００６３】 従って、ＮＡＳＢＡ反応は、特定順序ではなく、下記で概説されている検出成
分に加えて、第１ＮＡＳＢＡプライマー、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのア
ンチセンス配列を含む第２ＮＡＳＢＡプライマー、プロモーターを認識するＲＮ
Ａポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ分解酵素、ＮＴＰお
よびｄＮＴＰを必要とする。
【００６４】 これらの成分により、単一ＤＮＡデュプレックスを生成する単一出発ＲＮＡ鋳
型が得られる。しかしながら、このＤＮＡデュプレックスにより多ＲＮＡ鎖が作
製され、次いでこれらが再び反応開始に使用され得るため、増幅が迅速に行われ
る。
【００６５】 ここで概説されている通り、新規合成鎖の検出は幾つかの方法で行われ得る。
プライマーへの組込みまたは増大している鎖への修飾標識ヌクレオチドの組込み
により、新規合成鎖がＥＴＭ標識を含むとき、直接的検出が行われ得る。別法と
して、下記でより詳しく概説されている通り、非標識鎖（この場合検出モードに
おける「標的」として用いられる）の間接的検出は、様々なサンドイッチ検定立
体配置を用いて行われ得る。当業界の専門技術者が認めるように、リボヌクレア
ーゼの存在によりＲＮＡ鎖は潜在的に不安定であるためＮＡＳＢＡ中にＤＮＡ鎖
を検出するのが好ましい。
【００６６】 好ましい態様において、増幅技術はシグナル増幅である。シグナル増幅では、
鋳型として限られた数の標的分子を使用することにより、多重シグナル送信プロ
ーブを生成するかまたは多重シグナル送信プローブの使用を可能にする。シグナ
ル増幅戦略は、ＬＣＲ、ＣＰＴおよびサンドイッチ検定における増幅プローブの
使用を含む。
【００６７】 好ましい態様において、全般的に図２１、２８および２９に描かれている通り
、シグナル増幅技術はＬＣＲである。この方法は、２つの異なる方法で実施され
得る。第１の態様では、標的配列の唯一の鎖を連結反応用の鋳型として使用する
（図２８）。別法として、両鎖が使用され得る（図２９）。全般的には米国特許
第５１８５２４３および５５７３９０７号、ＥＰ０３２０３０８Ｂ１、ＥＰ０３
３６７３１Ｂ１、ＥＰ０４３９１８２Ｂ１、ＷＯ９０／０１０６９、ＷＯ８９／
１２６９６およびＷＯ８９／０９８３５およびＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／０７８１０２
および６０／０７３０１１参照、ただし、これら全てを引用して説明の一部とす
る。
【００６８】 好ましい態様において、１本鎖標的配列は第１標的ドメインおよび第２標的ド
メインを含み、そして第１ＬＣＲプライマーおよび第２ＬＣＲプライマー核酸が
加えられ、それらはその各標的ドメインと実質的に相補的であるため、標的ドメ
インとハイブリダイズする。これらの標的ドメインは直接隣接、すなわち連続し
ているか、または若干のヌクレオチドにより分離され得る。それらが非連続的で
ある場合、ヌクレオチドはヌクレオチド連結手段、例えばポリメラーゼを随伴し
て付加され、プライマーの１つにヌクレオチドが加えられる。次いで、２つのＬ
ＣＲプライマーは、例えばリガーゼ酵素、例えば当業界で公知のものを用いて共
有結合される。これによって、連結されたプローブおよび標的配列を含む第１ハ
イブリダイゼーション複合体が形成される。次いで、このハイブリダイゼーショ
ン複合体を変性（解離）させ、プロセスを反復すると、連結されたプローブのプ
ールが生成される。さらに、下記の通り、検出プローブを有し、検出プローブが
連結反応用鋳型として使用され得ないように、プローブ連結部位に誤対合を含む
のが望ましい場合もあり得る。
【００６９】 好ましい態様において、ＬＣＲは２本鎖標的配列の２本鎖に関して行われる。
標的配列を変性し、２セットのプローブ、すなわち標的の１鎖に関して上記で概
説された１セット、および標的の他方の鎖に関する別のセット（すなわち、第３
および第４プライマープローブ（robe）核酸）を加える。好ましい態様では、増
幅が行われ得るように、第１および第３プローブがハイブリダイズし、第２およ
び第４プローブがハイブリダイズする。すなわち、第１および第２プローブが結
合されたとき、連結されたプローブは、第３および第４プローブの結合用に、第
２標的配列に加えて、鋳型として使用され得る。同様に、連結された第３および
第４プローブは、第１標的鎖に加えて、第１および第２プローブの結合用鋳型と
して使用される。こうして、直線的ではなく、指数的増幅が行われ得る。
【００７０】 また、上記で概説した通り、ＬＣＲ反応の検出は、プライマーの一方または両
方が少なくとも１つのＥＴＭを含む場合、直接的に、または追加プローブの使用
を介するサンドイッチ検定法を用いて間接的に行われ得る。すなわち、連結され
たプローブは標的配列として用いられ得、検出は増幅プローブ、捕獲プローブ、
捕獲伸長プローブ、標識プローブおよび標識伸長プローブなどを利用し得る。
【００７１】 ＬＣＲの変形法は、米国特許第５６１６４６４および５７６７２５９号で総括
的に概説されているように（両方を特にそのまま引用して説明の一部とする）、
ある種の「化学的連結反応」を利用する。この態様では、ＬＣＲと同様、一対の
プライマーを使用し、その場合、第１プライマーは標的の第１ドメインと実質的
に相補的であり、第２プライマーは標的の隣接第２ドメインと実質的に相補的で
ある（ただし、ＬＣＲに関する限りでは、「ギャップ」が存在する場合、ポリメ
ラーゼおよびｄＮＴＰはギャップを「埋める」ために加えられ得る）。各プライ
マーは、標的配列とは結合しない「側鎖」として作用し、水素結合、塩架橋、フ
ンデルワールス力などを通して非共有結合的に相互作用する幹構造の半分に作用
する一部分を有する。好ましい態様は、側鎖として実質的に相補的な核酸を利用
する。すなわち、プライマーが標的配列とハイブリダイゼーションすると、プラ
イマーの側鎖は空間的近位になり、側鎖が核酸も含む場合、同じく側鎖ハイブリ
ダイゼーション複合体を形成し得る。
【００７２】 プライマーの側鎖の少なくとも１つは、一般的には側鎖に共有結合した活性化
可能な架橋剤を含み、活性化されると、化学的架橋または化学的連結反応が行わ
れる。活性化可能基は側鎖の架橋を行わせ得る部分を含み、化学的、光的および
熱的に活性化された基が含まれ、その場合光活性化可能な基が好ましい。態様に
よっては、側鎖の１つに単一活性化可能基があれば、他の側鎖にある官能基に対
する相互作用による架橋形成には十分である。別の態様において、活性化可能基
は各側鎖に必要とされる。
【００７３】 一旦ハイブリダイゼーション複合体が形成され、プライマーが共有結合される
ように架橋剤が活性化されると、ハイブリダイゼーション複合体を解離させ得る
条件に反応を付すことによって、標的は自由化されて次の連結反応または架橋用
の鋳型として用いられる。こうして、シグナル増幅が行われ、ここに概説されて
いる要領で検出され得る。
【００７４】 好ましい態様において、シグナル増幅技術はＣＰＴである。ＣＰＴ技術は、米
国特許第５０１１７６９、５４０３７１１、５６６０９８８および４８７６１８
７号、およびＰＣＴ公開出願ＷＯ９５／０５４８０、ＷＯ９５／１４１６および
ＷＯ９５／００６６７、およびＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／０１４３０４を含む若干の特
許および特許出願に記載されており、特にこれら全てをそのまま引用して説明の
一部とする。
【００７５】 一般に、ＣＰＴは次のように説明され得る。ＣＰＴプライマー（ここでは「切
断可能プライマー」と称されることもある）は、切断可能な連鎖により分離され
た２つのプローブ配列を含む。ＣＰＴプライマーは、標的配列と実質的に相補的
であるため、それとハイブリダイズすることにより、ハイブリダイゼーション複
合体を形成する。標的配列を開裂せずに、切断可能な連鎖を開裂することにより
、２つのプローブ配列が分離される。すなわち、２つのプローブ配列は、標的か
らさらに解離され易くなり得、反応は何回か反復され得る。次いで、ここに概説
されている通り、開裂されたプライマーが検出される。
【００７６】 ここで「切断可能な連鎖」とは、プローブがハイブリダイゼーション複合体の
一部であるとき、すなわち２本鎖複合体が形成されるときに開裂され得る切断可
能プローブ内にある連鎖を意味する。標的配列がシグナル増幅の反応において再
利用され得るように、切断可能な連鎖が、ハイブリダイズする相手の配列（すな
わち標的配列またはプローブ配列のいずれか）ではなく切断可能プローブのみを
開裂することは重要である。ここで使用されている、切断可能な連鎖は、２つの
プローブ配列を連結し、プローブ配列または切断可能プローブがハイブリダイズ
される配列のいずれも開裂することなく、選択的に開裂され得る結合的化学構造
を包含する。切断可能な連鎖は単結合または多重ユニット配列であり得る。当業
界の専門技術者が認めるところでは、若干の可能な切断可能な連鎖が使用され得
る。
【００７７】 好ましい態様において、切断可能な連鎖はＲＮＡを含む。このシステムは、先
に上記概説で報告されたように、ある種の２本鎖ヌクレアーゼ、特にリボヌクレ
アーゼがＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション複合体からＲＮＡヌクレオシド
をニックまたは切除するという事実に基づいている。この態様で特に有用なのは
、リボヌクレアーゼＨ、ＥｘｏIIIおよび逆転写酵素である。
【００７８】 一態様では、切断可能プローブは全てＲＮＡから成り、特に２本鎖リボヌクレ
アーゼ、例えばリボヌクレアーゼＨまたはＥｘｏIIIにより実施されるときニッ キングは容易になる。完全にＲＮＡ配列から成るＲＮＡプローブは、第一に、そ
れらが酵素的により容易に製造され得るため、および第二に、ニッキング剤、例
えばリボヌクレアーゼによるニッキングまたは開裂を受け易い開裂部位をより多
く有するため、特に有用である。すなわち、切断可能な連鎖はプローブ固有であ
るため、完全にＲＮＡから成る切断可能プローブは、切断可能な連鎖に左右され
るものではない。
【００７９】 好ましい態様において、切断可能な連鎖が核酸、例えばＲＮＡである場合、米
国特許第５６６０９８８号およびＷＯ９５／１４１０６（これらを特に引用して
説明の一部とする）に総括的に記載されている通り、本発明方法は誤対合の検出
に使用され得る。これらの誤対合検出方法は、配列に誤対合が存在する場合、リ
ボヌクレアーゼＨがＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスに結合および／またはこれを
開裂し得ないという事実に基づいている。すなわち、ＮＡ1−Ｒ−ＮＡ2態様では
、ＮＡ1およびＮＡ2は非ＲＮＡ核酸、好ましくはＤＮＡである。好ましくは、誤
対合はＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックス内にあるが、態様によっては、誤対合は、
リボヌクレアーゼＨに影響し得るほど十分近く、目的配列に非常に近い隣接配列
に存在する場合もある（一般的には１個または２個の塩基内）。すなわち、この
態様では、核酸の切断可能な連鎖は、切断可能な連鎖の配列が検出される特定配
列、すなわち推定的誤対合の領域を反映するように設計される。
【００８０】 誤対合検出の実施態様によっては、放出フラグメントの発生速度が、これらの
方法によって本質的にイエス／ノーの結果が提供される程度のものであるため、
それによって、実際に放出フラグメントがあるとすればその検出が目的標的配列
の存在を示す場合もある。しかしながら、典型的には、ごく僅かの誤対合（例え
ば１−、２−または３−塩基誤対合、または３−塩基欠失）しか存在しないとき
、標的配列が存在しないとしても、開裂された配列がある程度は生成される。す
なわち、開裂フラグメントの発生速度および／または開裂フラグメントの最終量
を定量すると、標的の存在または非存在が示される。さらに、２次的および３次
的な切断可能プローブの使用は、これが完全対合および誤対合間の差異を増幅し
得るため、この態様では特に有用であり得る。これらの方法は、患者の同型接合
または異型接合状態の測定に特に有用であり得る。
【００８１】 この態様では、標的およびプローブ間で疑われる差異によりその長さが測定さ
れることは、切断可能な連鎖の重要な特徴である。特に、これは、切断可能な連
鎖が疑われる差異を包含するのに十分な長さを有していなくてはならないが、疑
われる差異が存在するとき、切断可能な連鎖が選択された核酸分子と不適当に「
特異的に」ハイブリダイズし得ない程度には短くなければならないことを意味す
る。上記の不適当なハイブリダイゼーションは、選択された核酸分子が核酸プロ
ーブと十分には相補的でない場合でも切断可能な連鎖の削除、すなわち開裂を行
わせる。すなわち好ましい態様では、１ヌクレオチド〜３ヌクレオチドの疑われ
るヌクレオチド差異が切断可能な連鎖に包含されるように、切断可能な連鎖は３
〜５ヌクレオチド長であり、０、１または２ヌクレオチドは差異のいずれかの側
にある。
【００８２】 すなわち、切断可能な連鎖が核酸であるとき、好ましい態様は１〜約１００ヌ
クレオチドを利用し、約２〜約２０が好ましく、約５〜約１０が特に好ましい。 ＣＰＴは酵素的または化学的に行われ得る。すなわち、リボヌクレアーゼＨに
加えて、ＲＮＡ（または他の核酸）の切断可能な結合を開裂するのに有用であり
得る幾つかの他の開裂剤が存在する。例えば、幾つかの化学的ヌクレアーゼが報
告されている。例えば、Sigmanら、Annu. Rev. Biochem. １９９０、５９、２０
７−２３６、Sigmanら、Chem. Rev. １９９３、９３、２２９５−２３１６、Bas
hkinら、J. Org. Chem. １９９０、５５、５１２５−５１３２、およびSigmanら
、Nucleic Acids and Molecular Biology、第３巻、F.Ecksteinおよび D.M.J.Li
lley（編）、スプリンガー‐フェルラーク、ハイデルベルク１９８９、１３−２
７頁（これらを全て特に引用して説明の一部とする）参照。
【００８３】 特異的ＲＮＡ加水分解はまた活性領域である。例えばChin, Acc. Chem. Res. １９９１、２４、１４５−１５２、Breslowら、Tetrahedron、１９９１、４７、
２３６５−２３７６、Anslynら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、１９９７、３ ６、４３２−４５０、およびそこに記載されている参考文献参照、これら全てを
特に引用して説明の一部とする。
【００８４】 反応性リン酸中心はまた、切断可能な連鎖の開発における興味の対象でもある
。Hendryら、Prog. Inorg.Chem.:Bioinorganic Chem.１９９０、３１、２０１−
２５８参照、これもまた特に引用して説明の一部とする。
【００８５】 部位指定ＲＮＡ加水分解に関する現行方法には、ＲＮＡと配列特異的ハイブリ
ダイズし得る認識エレメントへのホスホジエステル結合を開裂し得る反応性部分
のコンジュゲーションがある。殆どの場合、金属錯体は、安定したヘテロ２本鎖
を形成するＤＮＡ鎖に共有結合される。ハイブリダイゼーション後、ルイス酸は
ＲＮＡバックボーンのごく近位に配置されることにより加水分解を行う。Magda ら、J. Am. Chem. Soc. １９９４、１１６、７４３９、Hallら、Chem. Biology
１９９４、１、１８５−１９０、Bashkinら、J. Am. Chem. Soc. １９９４、１ １６、５９８１−５９８２、Hallら、Nucleic Acids Res.１９９６、２４、３５
２２、Magdaら、J. Am. Chem. Soc. １９９７、１１９、２２９３、およびMagda
ら、J. Am. Chem. Soc. １９９７、１１９、６９４７参照、これら全てを特に引
用して説明の一部とする。
【００８６】 同様の方法で、ＤＮＡポリメラーゼコンジュゲートは、部位指定ＲＮＡ鎖切断
を誘導することが立証された。例えば、Yoshinariら、J. Am. Chem. Soc. １９ ９１、１１３、５８９９−５９０１、Endoら、J. Org. Chem. １９９７、６２、
８４６、および Barbierら、J. Am. Chem. Soc. １９９２、１１４、３５１１−
３５１５参照、これら全てを特に引用して説明の一部とする。 好ましい態様では、切断可能な連鎖は必ずしもＲＮＡではない。例えば、化学
的開裂部分は、核酸における塩基性部位を開裂するのに使用され得る。Belmont ら、New J. Chem. １９９７、２１、４７−５４、およびそこに記載された参考 文献参照、これらの全てを特に引用して説明の一部とする。同様に、例えば遷移
金属を用いると、光開裂性部分も使用され得る。Moucheronら、Inorg. Chem. １
９９７、３６，５８４−５９２参照、これを特に引用して説明の一部とする。
【００８７】 他の方法は、化学的部分または酵素によるものである。例えばKeckら、Bioche
mistry、１９９５、３４、１２０２９−１２０３７、Kirkら、Chem. Commun. １
９９８（投稿中）参照。金属錯体によるＧ−Ｕ塩基対の開裂、Biochemistry、１
９９２、３１、５４２３−５４２９参照、ＲＮＡの開裂用ジアミン錯体、Komiya
maら、J. Org. Chem. １９９７、６２、２１５５−２１６０、およびChowら、Ch
em. Rev. １９９７、９７、１４８９−１５１３、およびそこに記載された参考 文献参照、これら全てを特に引用して説明の一部とする。
【００８８】 ＣＰＴ方法の第一段階は、標的への１次切断可能プライマー（１次切断可能プ
ローブとも呼ばれる）のハイブリダイズを必要とする。これは、当業界の専門技
術者が認める通り、好ましくはより長い１次プローブの結合および１次プローブ
の短い開裂部分の解離の両方を可能にする温度で行われる。ここで概説されてい
る通り、これは溶液中で行われ得るか、または標的または切断可能プローブの１
つまたはそれ以上が固体支持体に結合され得る。例えば、固体支持体または電極
において標的配列の一部、好ましくは切断可能プローブが結合する同じ配列では
ない配列と実質的に相補的である「アンカープローブ」を使用することが可能で
ある。
【００８９】 同様に、ここで概説されている通り、好ましい態様は、固体支持体、例えばビ
ーズに結合した１つまたはそれ以上の切断可能プローブを有する。この態様では
、可溶性標的が拡散することにより、可溶性標的配列および支持体結合切断可能
プローブ間にハイブリダイゼーション複合体が形成され得る。この態様では、下
記で概説されている通り、シグナルを最大限にするため、１切断可能プローブ当
たり複数のプローブ配列が検出され得るように、切断可能プローブに追加の切断
可能な連鎖を含ませることにより２つまたはそれ以上のプローブ配列を放出させ
るのが望ましいことがあり得る。上記態様は、総括的に図３４および３５に描か
れている。
【００９０】 この態様において（およびここに記載された他の増幅技術において）、好まし
い方法では、切断またはせん断技術を用いることにより、標的配列を含む核酸試
料を、ビーズ表面に標的配列を十分に拡散させ得るサイズに切断する。これは、
機械的な力（例、音波処理）を通して核酸をせん断することによりまたは制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて核酸を開裂することにより達成され得る。別法として
、標的含有フラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の場合と同様ポリ
メラーゼ、プライマーおよび試料を鋳型として用いることにより生成され得る。
さらに、ＰＣＲまたはＬＣＲまたは関連方法を用いる標的の増幅も行われ得る。
これは、標的配列が非常に低いコピー数で試料中に存在する場合特に有用であり
得る。同様に、攪拌、加熱、全体濃度を高める技術、例えば沈降、乾燥、透析、
遠心分離、電気泳動、磁気ビーズ濃縮などを含む混合およびハイブリダイゼーシ
ョンの速度を増加させる多様な技術が当業界では知られている。
【００９１】 一般に、切断可能プローブは、それらの標的へモル過剰で導入され（標的配列
または他の切断可能プローブの両方を含む、例えば２次または３次切断可能プロ
ーブが使用される場合）、少なくとも約１００：１の切断可能プローブ：標的比
が好ましく、少なくとも約１０００：１が特に好ましく、そして少なくとも約１
００００：１がさらに好ましい。態様によっては、過剰のプローブ：標的はさら
に大きくなる場合もある。さらに、例えばこれらの割合はここに概説されている
全増幅技術に使用され得る。
【００９２】 一旦切断可能プローブおよび標的間にハイブリダイゼーション複合体が形成さ
れると、複合体は開裂条件に付される。当然のことであるが、これは切断可能プ
ローブの組成により異なる。それがＲＮＡである場合、リボヌクレアーゼＨが導
入される。ある種の環境下で、例えばＷＯ９５／００６６６およびＷＯ９５／０
０６６７（ここに引用して説明の一部とする）で総括的に概説されている場合、
２本鎖結合剤、例えばリボヌクレアーゼＨを用いることにより、１次プローブ：
標的ハイブリダイゼーション複合体のＴｍより高温でも反応が続行されることに
注意すべきである。従って、まず切断可能プローブが標的に加えられ、次いで開
裂剤または開裂条件が導入され得るか、またはプローブが開裂剤または条件の存
在下で加えられ得る。
【００９３】 開裂条件により、１次切断可能プローブの２つ（またはそれ以上）のプローブ
配列が分離される。その結果として、短い方のプローブ配列は標的配列とハイブ
リダイズした状態ではないため、ハイブリダイゼーション複合体は解離し、標的
配列は無傷で脱離される。ＣＰＴ反応の実施に最適な温度は、一般にプローブ：
標的ハイブリダイゼーション複合体の融解温度より低い約５℃〜約２５℃である
。これによって、迅速なハイブリダイゼーション速度および標的配列に関する高
度な特異性が達成される。当業界では公知のように、特定ハイブリダイゼーショ
ン複合体のＴｍは、塩濃度、Ｇ−Ｃ含有量、および複合体の長さにより異なる。
【００９４】 反応の間、ここに記載された他の増幅技術の場合と同様、非特異的ヌクレアー
ゼによりプローブおよび標的配列の開裂を抑制することが必要であり得る。上記
ヌクレアーゼは、一般に加熱または抽出処理によるＤＮＡの分離中に試料から除
去される。若干の１本鎖ヌクレアーゼ阻害剤、例えばバナデート、インヒビター
ズｉｔ−ＡＣＥおよびＲＮＡシン、胎盤タンパクは、リボヌクレアーゼＨの活性
に影響を及ぼさない。これは、リボヌクレアーゼおよび／または標的試料の純度
によって必要ではない場合もあり得る。
【００９５】 ある一定期間反応を進行させることにより、これらの段階を反復する。反応は
、通常約１５分〜約１時間行われる。一般に、標的配列の各分子は、プローブの
長さおよび配列、特異的反応条件および開裂方法により、この期間に１００ない
し１０００回代謝回転する。例えば、試験試料中に存在する標的配列の各コピー
の場合、１００〜１０００分子がリボヌクレアーゼＨにより開裂される。ここで
概説されている通り、反応をさらに長く続行させるか、または２次、３次または
４次プローブを用いることにより、さらに高レベルの増幅が達成され得る。
【００９６】 一般には開裂の時間または量により決定される反応完了時、未開裂プローブが
検出プローブと結合して誤った正のシグナルを誘発しないように、未開裂切断可
能プローブは検出前に除去または中和されなければならない。これは、総括的に
下記で検討されているように様々な方法で行われ得る。
【００９７】 好ましい態様では、１次プローブを含むビーズの使用により分離が簡易化され
る。すなわち、切断可能プローブをビーズに結合させるとき、濾過、遠心分離、
磁場の適用、荷電ビーズに関する静電的相互作用、接着などによってビーズを除
去することにより、未開裂プローブが除去される。
【００９８】 好ましい態様において、分離は、当業界では公知であるように反応生成物のゲ
ル電気泳動に基いており、短い開裂プローブ配列から長い未開裂プローブを分離
する。
【００９９】 好ましい態様では、分離は強酸沈殿に基く。これは小さいフラグメント（一般
に約１０ヌクレオチド）から長いもの（一般に５０ヌクレオチドより大）を分離
するのに有用である。強酸、例えばトリクロロ酢酸を溶液に導入すると、長いプ
ローブの沈殿が誘発され、開裂した小フラグメントは溶液中に残存している。こ
の溶液を遠心分離または濾過すると、沈殿物が除去され、開裂されたプローブ配
列が定量され得る。
【０１００】 好ましい態様において、親和性支持体を用いて分離を実施するため、切断可能
プローブは、ＥＴＭおよび親和性結合リガンドまたは部分の両方を含む。この態
様では、未開裂プローブ、および親和性部分を含む開裂プローブの除去により、
検出可能なＥＴＭが全て除去されることのないように、検出に使用されるＥＴＭ
は親和性部分を含む同じプローブ配列上にはないことが重要である。別法として
、切断可能プローブは、共有結合したＥＴＭではなく、親和性標識を含み得る。
適当な親和性部分には、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、レクチン、
ハプテン、抗体などがあるが、これらに限定はされない。当業界で公知の通り、
親和性部分の結合相手を固体支持体、例えばガラスビーズ、ラテックスビーズ、
デキストランなどに結合させ、これを用いて未開裂プローブを取り出す。親和性
部分を含まない開裂プローブ配列は、溶液中に残存したままであり、次いで下記
で概説された要領で検出され得る。
【０１０１】 好ましい態様において、上記態様と同様、核酸の分離配列を切断可能プローブ
に含ませると、反応中に開裂されることはない。分離配列に相補的な核酸を固体
支持体例えばビーズに結合させ、キャッチャー配列として用いる。好ましくは、
普遍キャッチャー配列が様々な検定で利用され得るように、分離配列を切断可能
プローブに付加すると、標的配列により認識されることはない。
【０１０２】 好ましい態様では、図３２で総括的に描かれているように、実質的に相補的な
中和核酸を加えることにより、未開裂プローブを中和する。捕獲配列を含むプロ
ーブに対する相補体が、開裂プローブ配列：検出プローブ複合体よりもその長さ
故により安定したハイブリダイゼーション複合体を形成するため、この方法は、
捕獲配列、分離配列、および１段階システムを用いる態様では特に有用である。
当業界の専門技術者が認めるように、検出は核酸を通る電子伝達に基いているた
め、未開裂プローブの完全除去は要求されない。むしろ重要なのは、開裂配列に
特異的な検出電極プローブへの結合に、未開裂プローブが利用できないことであ
る。すなわち、一態様において、中和ハイブリダイゼーション複合体からのシグ
ナルは開裂フラグメントのシグナルに加担しないため、中和核酸は、離れた「ア
ドレス」にある電極表面における検出プローブである。別法として、中和核酸は
、ビーズに結合され得る。中和ビーズが加えられると、反応はクエンチングされ
、次いで検出前に除去される。
【０１０３】 未開裂プローブの除去または中和後、下記で概説されている通り、開裂プロー
ブ配列を検出組成物に加えることにより検出が続行され、この場合「メカニズム
−１」または「メカニズム−２」システムが利用され得る。メカニズム−１シス
テムは、次のように説明され得る。開裂されたプローブ配列が、電極へ伝達性オ
リゴマーにより共有結合された第１検出１本鎖プローブにハイブリダイズするこ
とにより、第２ハイブリダイゼーション複合体が形成される。検出プローブ：プ
ローブ配列を含む、第２のハイブリダイゼーション複合体は、少なくとも１つの
第１ＥＴＭを含む。ここで概説されている通り、このＥＴＭはプローブ（プライ
マー）配列または検出プローブに共有結合されるか、またはハイブリダイゼーシ
ョン指標として非共有結合的に付加されるか、またはその両方であり得る。上記
で概説された通り、好ましい態様は、検出用に１ハイブリダイゼーション複合体
につき複数のＥＴＭを使用する。
【０１０４】 好ましい態様では、高いオーダーのプローブは全く使用されず、検出は１次プ
ライマーのプローブ配列（複数可）に基いている。すなわち、好ましい態様では
、電極は、１次切断可能プローブの開裂部分の全部または一部と実質的に相補的
である少なくとも１つの第１検出プローブを含む。一態様では、１タイプのみの
検出プローブが使用され、それは１次プローブのプローブ配列の全部または一部
と実質的に相補的であり得る。好ましい態様では、複数タイプの検出プローブが
使用され、各検出プローブは１次プローブの各プローブ配列の全部または一部と
実質的に相補的である。すなわち、１次プローブが２つのプローブ配列を含むと
き、２つの検出プローブが使用される。３つのプローブ配列は、３つの検出プロ
ーブを使用する。ここに記載されている通り、プローブがビーズに結合されてい
るとき、これは追加の切断可能な連鎖の使用を必要とし得る。次いで、検出プロ
ーブおよび１次プローブ配列はハイブリダイゼーション複合体を形成し、それら
は共有結合ＥＴＭを含むか、またはハイブリダイゼーション指標形態のＥＴＭが
システムに加えられ（または両方）、次いでここで概説されている通り検出され
る。好ましい態様では、ハイブリダイゼーション指標を使用する場合、それらを
反応完了時にシステムに加えるだけで、ハイブリダイゼーション指標とプローブ
：標的複合体の会合は回避されるが、態様によっては、反応中にハイブリダイゼ
ーション指標を存在させることが可能な場合もあり得る。
【０１０５】 好ましい態様において、各々からのシグナルが合わされるように、検出プロー
ブは電極表面で混合される。標的配列が低コピー数で存在する場合これは特に好
ましいものであり得る。別法として、検出プローブは、各々表面上の異なる「ア
ドレス」に存在し得る。このためシステムからの可能なシグナルが低減化され、
各々からのシグナルが均等であるべきという点で内部制御として有用である。さ
らに、異なるアドレスは異なる密度のプローブを有するため、標的配列に対する
様々な感受性をもつアドレスが作製され得る。ビーズに結合された各々１次プロ
ーブのプローブ配列に対する、２つの検出プローブを用いるシステムについては
、総括的に図３０で描かれており、結合ＥＴＭが使用されている。
【０１０６】 好ましい態様では、少なくとも１つ、および好ましくはそれ以上の２次プロー
ブ（ここでは２次プライマーとも称される）を使用する。２次切断可能プローブ
は、幾つかの方法で反応に加えられ得る。誤った正のシグナルが発生することに
なるため、２次切断可能プローブが未開裂１次プローブとハイブリダイズしない
ようにすることは重要である。これらの方法は、ビーズ結合プローブが使用され
るか否かによって幾つかの方法で報告され得る。 好ましい態様では、１次および２次プローブを固体支持体に結合する。好まし
い態様では、一般に支持体結合２次プローブはビーズ表面の未開裂１次プローブ
に結合し得ないため、１次および２次プローブを一緒に加える。それは標的によ
る１次プローブのハイブリダイゼーション時のみであるため、ビーズからの１次
プローブ配列の開裂および放出が行われ、現時点で拡散可能な１次プローブ配列
は２次プローブに結合し得る。一方、１次プローブ配列が２次切断可能プローブ
に関する標的として用いられることにより、２次プローブ配列の開裂および放出
が行われる。
【０１０７】 別の態様では、１次プローブを含むビーズを加え、ある一定期間反応を進行さ
せ、次いで２次プローブを含むビーズを加え、１次ビーズについては除去する場
合としない場合がある。別法として、１次プローブを含むビーズを除去し、可溶
性２次切断可能プローブを加える。
【０１０８】 別の態様では、完全反応が溶液中で行われる。この態様では、上記で概説され
ているように、１次プローブを加え、反応をある一定期間進行させ、そして未開
裂１次切断可能プローブを除去する。次いで、２次プローブを加え、反応を進行
させる。次いで２次未開裂プローブを除去し、総括的にここで概説されているよ
うに開裂した配列が検出される。
【０１０９】 上記のように、可能な限り多くの２次プローブ配列を検出するのが一般的に好
ましく、さらに１次プローブ配列も同様に検出され得る。すなわち、好ましい態
様は、切断可能プローブの各プローブ配列の全部または一部と実質的に相補的な
検出プローブを使用する。別法として、「高いオーダー」プローブ配列に関する
検出プローブのみが使用される。さらに、態様によっては、切断可能プローブの
プローブ配列の１つのみに関する検出プローブが使用され得る場合もある。さら
に、上記で概説されている通り、これらの態様では、他の場合と同様、検出プロ
ーブは、所望の結果次第で、配列により分離されるか、または混合され得る。
【０１１０】 好適な態様においては、少なくとも1種の、好ましくはそれ以上の三級プロー ブを使用する。三級の開裂可能なプローブを数種の方法で反応に添加することが
可能である。三級の開裂可能なプローブは、偽陽性シグナルを生成することとな
るので、未切断の二級プローブにハイブリッド形成するのを防止することが重要
である。これらの方法はビーズに結合したプローブを使用しているかどうかによ
り、幾つかの方法で説明することが可能である。
【０１１１】 好適な態様において、一級、二級および三級のプローブは固形の支持体に結合
させる。好適な態様において、一級、二級および三級のプローブは共に添加する
が、その理由は一般に支持体に結合した二級プローブはビーズ表面上の未切断一
級プローブに結合し得ないからであり、また、支持体に結合した三級プローブは
ビーズ表面上の未切断二級プローブに結合し得ないからである。ビーズからプロ
ーブ配列の切断と放出が起こり、そこで拡散可能となったプローブ配列がより高
次のプローブに結合し得るのは、その標的（すなわち、一級プローブ用サンプル
の標的配列、または二級および三級プローブそれぞれのプローブ配列）と開裂可
能なプローブのハイブリッド形成によってのみである。
【０１１２】 代り得る態様においては、ビーズと溶液プローブの組合わせが用いられ、その
可能な組合わせは：一級プローブビーズ、可溶性二級プローブ、三級ビーズ；可
溶性一級プローブ、可溶性二級プローブ、三級ビーズ；一級プローブビーズ、二
級プローブビーズ、可溶性三級プローブ；などである。重要なことは、可溶性プ
ローブを使用する場合、それらを次の高次プローブを添加する前に除去しなけれ
ばならないことである。
【０１１３】 代り得る態様において、完全な反応は溶液中で実施する。この態様においては
、一級プローブを加え、一定時間反応を進行させ、未切断の一級開裂可能プロー
ブを上に概略したように除去する。二級プローブを次いで添加し、反応を進行さ
せる。二級未切断のプローブを次いで除去し、次いで三級プローブを添加し、反
応を進行させる。未切断の三級プローブを次いで除去し、切断された配列を本明
細書に一般的に概説するように検出する。
【０１１４】 上記のように、可能な限り多くの三級プローブ配列を同定することが一般に好
ましく、二級および一級のプローブ配列を同様にさらに検出することができる。
このように、好適な態様では、開裂可能なプローブの各プローブ配列の全部また
は一部に実質的に相補的な検出プローブを利用する。再び、検出配列は電極上分
離するか、あるいは混合して最大のシグナル増幅を可能とする。
【０１１５】 好適な態様において、少なくとも1種の、好ましくはそれ以上の四級プローブ を使用する。このものは三級プローブについて上に概説したように進める。
【０１１６】 このように、ＣＰＴは、再び特定の順序なしに、第一のプローブ配列、開裂可
能な結合および第二のプローブ配列を含んでなる第一のＣＰＴプライマー、およ
び切断剤を必要とする。
【０１１７】 この方法において、ＣＰＴは大量の切断されたプライマーを生成するに至り、
それを次いで以下に概説するように検出することができる。
【０１１８】 好適な態様において、シグナル増幅技術は“サンドイッチ”アッセイである が、本方法は一般的にはＵＳＳＮ６０／０７３，０１１に、また、ＵＳ特許番号
５，６８１，７０２、５，５９７，９０９、５，５４５，７３０、５，５９４，
１１７、５，５９１，５８４、５，５７１，６７０、５，５８０，７３１、５，
５７１，６７０、５，５９１，５８４、５，６２４，８０２、５，６３５，３５
２、５，５９４，１１８、５，３５９，１００、５，１２４，２４６および５，
６８１，６９７などに記載されており、これらのすべてを参照により本明細書に
取込む。サンドイッチアッセイはプライマーを変更させるようなものではないが
、サンドイッチアッセイでは、多重シグナル（すなわち、ラベルプローブ）が単
一の標的に結合し、シグナルを増幅させるために、シグナル増幅技法と考えるこ
とができる。サンドイッチアッセイは、標的配列が殆どまたは全くＥＴＭラベル
を含んでいない場合に使用される；すなわち、ＥＴＭラベルを含んでなる第二プ
ローブを用いシグナルを生成させる場合に使用される。
【０１１９】 本明細書で検討するように、留意すべきことはサンドイッチアッセイが一級標
的配列（例えば、患者サンプルからの）の検出のために、あるいは上述の増幅反
応の産物を検出する方法として使用し得ることである；このように、例えば、Ｐ
ＣＲ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡなどを用いて上記のように新たに合成した鎖
をサンドイッチアッセイの“標的配列”として使用することができる。
【０１２０】 一般に、サンドイッチ・シグナル増幅技法は以下のように説明し得る。好適な
態様において、これは要求されるものではないが、標的配列は電極の表面に固定
化する。これは、好ましくは、捕獲プローブを用い、任意には１種以上の捕獲エ
クステンダープローブを用い実施する；図１５参照。捕獲プローブのみを利用す
る場合、それぞれの標的配列に対しユニーク捕獲プローブを得ることが必要であ
る；すなわち、その表面はユニーク捕獲プローブを含むように設計しなければな
らない。あるいは、捕獲エクステンダープローブを用いることができるが、それ
は“普遍的”表面、すなわち、標的配列を検出するのに使用し得る単一型の捕獲
プローブを含む表面を可能とする。“捕獲エクステンダー”プローブは図１５お
よびその他の図に一般的に図示されるが、捕獲プローブの全部または一部にハイ
ブリッド形成する第一の部分および標的配列の第一部分にハイブリッド形成する
第二の部分をもつ。これは次いで設計された可溶性プローブの生成を可能とし、
それは当業者が認識するように、一般にはより簡単で費用もかさまない。本明細
書に示すように、２つの捕獲エクステンダープローブが使用し得る。これは一般
にアッセイ複合体を安定化するために、例えば、標的配列が大きい場合に、ある
いは大きなアンプリファイアープローブ（特に、分枝したまたは樹状プローブ）
を用いる場合に実施されている。
【０１２１】 好適な態様において、核酸は以下に検討するＳＡＭの形成後に加えられる。こ
れは、当業者が認識するように種々の方法で実施し得る。一態様において、末端
官能基を有する伝導性オリゴマーは、活性化されたカルボン酸エステルとイソチ
オシアン酸エステルを利用する好適な態様により調製されるが、該エステルは、
活性化されたカルボン酸エステルを用いる図６に一般的に図示したように、核酸
に取付けた一級アミンと反応する。これら二種類の試薬は水溶液中で安定である
という利点をもち、さらに一級アルキルアミンと反応する。しかし、塩基の一級
芳香族アミンと二級および三級アミンは反応せず、それによって核酸がその表面
に部位特異的に付加するのを可能とする。これがその表面上に既知方法（インク
ジェット、スポッティングなど）によるプローブ（捕獲プローブまたは検出プロ
ーブのいずれか、または両方）のスポッティングを可能とする。
【０１２２】 さらに、核酸を表面上に固相化するために用い得る多くの非核酸方法がある。
例えば、結合パートナー対が利用し得る；すなわち、一方の結合パートナーは下
記に説明するように付着リンカーの末端に付着し、他方は核酸末端に付着する。
これはまた核酸捕獲プローブを使用せずに実施し得る；すなわち、一方の結合パ
ートナーは捕獲プローブとして作用し、他方は標的配列または捕獲エクステンダ
ープローブのいずれかに付着する。すなわち、標的配列が結合パートナーを含む
か、または標的配列にハイブリッド形成する捕獲エクステンダープローブが結合
パートナーを含むかのいずれかである。適切な結合パートナー対は、ビオチン／
ストレプトアビジンなどのハプテン対、抗原／抗体、ＮＴＡ／ヒスチジンタグな
どであるが、これらに限定されるものではない。一般に、より小型の結合パート
ナーが好ましく、それにより電子が核酸から伝導性オリゴマーに渡り、検出を可
能とする。
【０１２３】 好適な態様において、標的配列それ自体が修飾され結合パートナーを含む場合
、結合パートナーは標的配列に酵素的に付着し得る修飾ヌクレオチドを介して、
例えば、ＰＣＲ標的増幅工程に際して付着する。あるいは、結合パートナーは標
的配列に容易に付着する。
【０１２４】 あるいは、標的にハイブリッド形成するための核酸部分並びに結合パートナー
を有する捕獲エクステンダープローブを利用してもよい（例えば、捕獲エクステ
ンダープローブは結合パートナーに付着するのに使用されるアルキルリンカーな
どの非核酸部分を含んでいてもよい）。この態様においては、安定のために標的
の二本鎖核酸と捕獲エクステンダープローブとを、例えば、技術上既知のプソラ
レンを用い架橋することが望ましい。
【０１２５】 一態様において、該標的は捕獲プローブを用いる電極表面に結合しない。この
態様において重要なことは、本明細書のすべてのアッセイについて、過剰のラベ
ルプローブは検出前に除去すべきであり、アッセイ複合体は表面に接近させるべ
きことである。当業者が認識するように、これは他の方法で実施するのがよい。
例えば、ＥＴＭを含んでなるアッセイ複合体は、単層を含んでなる電極に付加さ
れるビーズ上に存在してもよく、次いで該ビーズを、表面上ビーズの重量沈降、
ビーズ成分と表面間の静電気的または磁気的相互作用などの技術上周知の技法を
用い、上述の結合パートナー付着を用いて電極表面に接近せしめることができる
。あるいは、過剰のラベルプローブなどの過剰の試薬を除去した後、アッセイ複
合体を、例えば、アッセイ複合体を表面に押し込むのに充分な電圧をもつシステ
ムにパルス送達することにより、表面に送り込むことが可能である。
【０１２６】 しかし、好適な態様では、核酸捕獲プローブを介して付着したアッセイ複合体
を利用する。
【０１２７】 標的配列が電極に好適に固定されたところで、アンプリファイアープローブを
直接にまたは１種以上のラベルエクステンダープローブを使用して標的配列にハ
イブリッド形成させるが、該アンプリファイアープローブは“一般の”アンプリ
ファイアープローブが形成されるように作用する。好ましくは、該アンプリファ
イアープローブは多様な増幅配列を含むが、下記のようにある態様においては単
一の増幅配列または少なくとも２つの増幅配列を含むこともある。アンプリファ
イアープローブは多くの異なる形状をとることができる；分枝したコンホメーシ
ョン、樹状のコンホメーション、または増幅配列の線状の“糸”などである。Ｅ
ＴＭを含んでなるラベルプローブは次いで増幅配列にハイブリッド形成し（また
はある場合にはラベルプローブが直接標的配列にハイブリッド形成する）、ＥＴ
Ｍは下記により詳しく説明するように、電極を用いて検出する。
【０１２８】 当業者が認識するように、本発明のシステムは、図１５、１６、２７などに一
般的に図示するように、多数の異なる構成を採ることが可能である。一般に、使
用し得るシステムには３つのタイプがある：（１）“非サンドイッチ”システム
（本明細書では“直接”検出ともいう）であり、そこでは標的配列それ自体がＥ
ＴＭにより標識される（再度、プライマーがＥＴＭを含んでいることによるか、
またはＥＴＭが新たに合成された鎖に組込まれることによる）；（２）ラベルプ
ローブが標的の分析対象に直接結合するシステム；および（３）ラベルプローブ
が標的の分析対象に、例えば、アンプリファイアープローブの使用により間接的
に結合するシステム。
【０１２９】 したがって、本発明はアンプリファイアープローブを含んでなる組成物を提供
する。本明細書において“アンプリファイアープローブ”または“核酸マルチマ
ー”または“増幅マルチマー”または文法上の等価物とは、シグナルの増幅を容
易にするために使用する核酸プローブを意味する。アンプリファイアープローブ
は、少なくとも、下記定義の第一一本鎖核酸プローブ配列と、少なくとも１つの
一本鎖核酸増幅配列を含んでなり、好適な多様な増幅配列をもつ。 アンプリファイアープローブは標的配列にハイブリッド形成するのに直接また
は間接的に使用される第一プローブ配列を含んでなる。すなわち、アンプリファ
イアープローブはそれ自体標的配列に対し実質的に相補的な第一プローブ配列を
有してもよく、あるいはさらなるプローブの一部に実質的に相補的な第一プロー
ブ配列を有するが、この場合、さらなるプローブはラベルエクステンダープロー
ブと称して、標的配列に対し実質的に相補的な第一部分を有する。好適な態様に
おいて、アンプリファイアープローブの第一プローブ配列は標的配列に対し実質
的に相補的である。
【０１３０】 一般に、本明細書におけるプローブのすべてにおいて、第一プローブ配列は特
異性と安定性を与えるのに充分な長さのものである。かくして一般に、他の核酸
（すなわち、プローブ配列、増幅配列、より大きなプローブの部分またはドメイ
ン）にハイブリッド形成するように設計されている本発明のプローブ配列は少な
くとも約５個のヌクレオシド長のものであり、少なくとも約１０個をもつものが
好ましく、少なくとも約１５個のものが特に好ましい。
【０１３１】 好適な態様においては、図１８に図示するように、該アンプリファイアープロ
ーブまたは本発明の他のプローブのいずれかは、その標的が存在しない場合、ヘ
アピン・ステム−ループ構造を形成してもよい。ステム二本鎖配列の長さは、ヘ
アピン構造が標的の存在に有利にならないように選択される。これらのタイプの
プローブの使用は、本発明のシステムにおいて、またはいずれかの核酸検出シス
テムにおいて、非特異的結合の有意な減少とそれによるシグナル・ノイズ比の増
大をもたらす。
【０１３２】 一般に、これらのヘアピン構造は４つの成分を含んでなる。第一の成分は標的
結合配列、すなわち、標的に相補的な領域（この標的は結合を必要とするサンプ
ル標的配列または他のプローブ配列であってもよい）であって、約１０個のヌク
レオシド長であり、好ましくは約１５個である。第二の成分はループ配列であり
、核酸ループの形成を容易にすることができる。この点で好ましいのは、ＧＴＣ
の繰返し体であるが、ＧＴＣは脆弱Ｘ染色体症候群に折り返しを形成するものと
して同定された。（ＰＮＡ類似体を使用する場合、プロリン残基からなる折り返
しが好ましい）。一般に、３個から５個の繰返しが用いられるが、４個ないし５
個が好ましい。第三の成分は自己相補性領域であり、標的配列領域の一部に相補
的である第一部分とラベルプローブ結合配列の第一部分を含んでなる第二部分を
有する。第四の成分はラベルプローブ（または、場合により他のプローブ）に実
質的に相補的である。第四成分はさらに“付着末端”、すなわち、該プローブの
他の部分にはハイブリッド形成しない部分を含んでなり、好ましくは、すべてで
はないとしてもＥＴＭの殆どを含んでいる。一般的な構造を図１８に図示する。
当業者が認識するように、本明細書に記載のプローブのあるものまたはすべてが
、その標的不在の場合にはヘアピンを形成するように形状化するが、その例とし
てはアンプリファイアー、捕獲、捕獲エクステンダー、ラベルおよびラベルエク
ステンダープローブを包含する。
【０１３３】 好適な態様においては、数種の異なるアンプリファイアープローブが用いられ
るが、そのそれぞれが標的配列の異なる部分にハイブリッド形成する第一プロー
ブ配列を有する。すなわち、１より大きな増幅レベルがある；アンプリファイア
ープローブは多様な標識化事象によるシグナルの増幅を提供し、数種の異なるア
ンプリファイアープローブがそれぞれラベルの多様性をもち、それぞれの標的配
列に対して使用される。このように、好適な態様では少なくとも２つの異なるア
ンプリファイアープローブのプールを利用するが、各プールは標的配列の異なる
部分にハイブリッド形成するための異なるプローブ配列を有する；異なるアンプ
リファイアープローブの数に唯一実際に制限となるのは当初の標的配列の長さで
ある。さらに、異なるアンプリファイアープローブは、一般に好ましいことでは
ないが、異なる増幅配列を含むことも可能である。
【０１３４】 好適な態様においては、アンプリファイアープローブはサンプルの標的配列に
ハイブリッド形成しないが、その代りにラベルエクステンダープローブの第一部
分にハイブリッド形成する。このことは “一般的な” アンプリファイアープロ
ーブ、すなわち、様々な異なる標的と使用し得るアンプリファイアープローブの
使用を可能とするために特に有用である。これはアンプリファイアープローブの
幾つかが特別の合成技術を必要とするので望ましい。このように、ラベルエクス
テンダープローブとして比較的短いプローブを加えることが好ましい。このよう
に、アンプリファイアープローブの第一プローブ配列は、第一ラベルエクスデン
ダー一本鎖核酸プローブの第一部分またはドメインに実質的に相補的である。ラ
ベルエクステンダープローブはまた標的配列の一部に実質的に相補的な第二部分
またはドメインを含む。これらの部分は両方ともその長さが好ましくは少なくと
も約１０ないし約５０個のヌクレオチドからなり、約１５ないし約３０個の範囲
であることが好ましい。“第一”および“第二”という用語は、標的またはプロ
ーブ配列の５'−３'方向に関し配列の方向を付与することを意味するものではな
い。例えば、相補的標的配列の５'−３'方向を仮定すると、第一部分は第二部分
に対し５'側に位置してもよく、あるいは第二部分に対し３'側に位置してもよい
。本明細書では便宜上、プローブ配列の順序は一般に左から右に示す。
【０１３５】 好適な態様においては、１個より多いラベルエクステンダープローブ−アンプ
リファイアープローブ対、すなわち、ｎが１より大きい対を使用し得る。すなわ
ち、複数のラベルエクステンダープローブを使用し得るが、それぞれが標的配列
の異なる部分に実質的に相補的である部分をもつ；これは増幅のもう一つのレベ
ルとして働く。このように、好適な態様では、標的配列の長さにより決まる上限
をもつ少なくとも２つのラベルエクステンダープローブのプールを利用する。
【０１３６】 好適な態様においては、１つより多いラベルエクステンダープローブを単一の
アンプリファイアープローブとともに用い、非特異結合を減少させるが、このこ
とはＵＳ特許番号５，６８１，６９７に一般的に概説されており、この特許を参
照により本明細書に取込む。この態様においては、第一ラベルエクステンダープ
ローブの第一部分が標的配列の第一部分にハイブリッド形成し、第一ラベルエク
ステンダープローブの第二部分がアンプリファイアープローブの第一プローブ配
列にハイブリッド形成する。第二ラベルエクステンダープローブの第一部分が標
的配列の第二部分にハイブリッド形成し、第二ラベルエクステンダープローブの
第二部分がアンプリファイアープローブの第二プローブ配列にハイブリッド形成
する。これらは場合により“十字形”構造または構成と言われる構造を形成し、
一般には、大型の分枝または樹状のアンプリファイアープローブを用いる場合に
安定性を付与するために実施される。
【０１３７】 さらに、当業者が認識するように、ラベルエクステンダープローブはアンプリ
ファイアープローブと直接反応するよりもむしろ下記のようにプレアンプリファ
イアープローブと相互作用する。
【０１３８】 同様に、上に概説したように、好適な態様では、それぞれラベルエクステンダ
ープローブの異なる部分にハイブリッド形成する第一プローブ配列をもつ数種の
異なるアンプリファイアープローブを利用する。さらに、上に概説したように、
異なるアンプリファイアープローブは、一般に好ましいことではないが、異なる
増幅配列を含むことも可能である。
【０１３９】 第一プローブ配列に加えて、アンプリファイアープローブはまた少なくとも１
つの増幅配列を含んでなる。本明細書での“増幅配列”または“増幅セグメント
”または文法上の等価物は、以下により詳細に記載しているように、ラベルプロ
ーブの第一部分に、直接または間接的に結合するのに用いる配列を意味する（た
だし、ある場合には増幅配列が検出プローブに結合してもよい；図２７Ｃ参照）
。好ましくは、アンプリファイアープローブは多様な増幅配列を含んでなり、好
ましくは約３ないし約１０００個、特に好ましくは約１０ないし約１００個、そ
してとりわけ好ましいのは約５０個を有する。ある場合には、例えば、線状のア
ンプリファイアープローブを使用する場合、約１ないし約２０個が好ましく、特
に約５ないし約１０個が好ましい。
【０１４０】 増幅配列は、当業者が認識するように、様々な様式で互いに結合し得る。それ
らは互いに直接、または介在配列もしくは化学部分に、リン酸ジエステル結合、
ＰＮＡ結合などを介して、またはアミノ酸、炭水化物もしくはポリオール架橋な
どの介入結合剤を介して、または他の架橋剤もしくは結合パートナーを介して共
有結合してもよい。結合部位はセグメントの末端、および／または鎖内の１つ以
上の内部ヌクレオチドであってもよい。好適な態様においては、増幅配列は核酸
結合を介して付着する。
【０１４１】 好適な態様においては、一般的にＵＳ特許番号５，１２４，２４６に記載され
ているように分枝したアンプリファイアープローブを使用するが、この特許を参
照により本明細書に取り込む。分枝したアンプリファイアープローブは“フォー
ク様”または“櫛様”のコンホメーションを採ることができる。“フォーク様”
分枝したアンプリファイアープローブは一般に分枝構造を形成する開始点から広
がる３個以上のオリゴヌクレオチドセグメントを有する。開始点は少なくとも３
個のセグメントが共有結合によりまたは堅固に結合し得るもう一つのヌクレオチ
ドセグメントまたは多機能分子である。“櫛様”の分枝したアンプリファイアー
プローブは線状のバックボーンをもち、そのバックボーンから多様な側鎖オリゴ
ヌクレオチドが伸びている。いずれのコンホメーションにおいても、垂れ飾りと
なるセグメントは通常、オリゴヌクレオチド付着用の適切な官能基をもつ修飾ヌ
クレオチドまたは他の有機部分に左右される。さらに、いずれのコンホメーショ
ンにおいても、多数の増幅配列が直接または間接的に検出プローブに結合させる
ために利用可能である。一般に、これらの構造は修飾した多機能ヌクレオチドを
用いて、技術上既知であるように、例えば、とりわけＵＳ特許番号５，６３５，
３５２および５，１２４，２４６に記載のように調製される。
【０１４２】 好適な態様においては、樹状のアンプリファイアープローブが使用されるが、
これは一般的にＵＳ特許番号５，１７５，２７０に記載されており、本特許を特
に参照により本明細書に取り込む。樹状のアンプリファイアープローブはハイブ
リッド形成により付着している増幅配列をもち、結果としてそれら構造の成分と
して二本鎖核酸の部分をもつ。樹状アンプリファイアープローブの外表面は多様
な増幅配列をもつ。
【０１４３】 好適な態様においては、線状のアンプリファイアープローブを使用するが、そ
こでは個々の増幅配列が末端同士直接または短い介入配列と結合してポリマーを
形成している。他のアンプリファイアー配置では、増幅配列間にさらなる配列ま
たは部分が存在することがある。さらに、本明細書に概説するように、線状の増
幅プローブは、図１８に図示するようにヘアピン・ステム−ループ構造を形成す
ることも可能である。
【０１４４】 一態様において、線状のアンプリファイアープローブは単一の増幅配列を有す
る。これは、標的にハイブリッド形成し、次いで除去されてさらなるプローブが
結合するようにするアンプリファイアープローブのプールを形成させるハイブリ
ッド形成／解離のサイクルが起こる場合に、あるいは大量のＥＴＭを各ラベルプ
ローブに対し用いる場合に有用である。しかし、好適な態様において、線状のア
ンプリファイアープローブは多様な増幅配列を含んでなる。
【０１４５】 さらに、該アンプリファイアープローブは全体として線状、全体として分枝、
全体として樹枝状、またはそのいずれかの組み合わせであってもよい。
【０１４６】 該アンプリファイアープローブの増幅配列は、検出を可能とするラベルプロー
ブに結合するために、直接または間接的に使用する。好適な態様において、アン
プリファイアープローブの増幅配列は、ラベルプローブの第一部分に実質的に相
補的である。別法として、アンプリファイアーエクステンダープローブを使用す
るが、これは増幅配列に結合する第一部分とラベルプローブの第一プローブに結
合する第二部分を有する。
【０１４７】 さらに、本発明の組成物は“プレアンプリファイアー”分子を含んでもよく、
これはラベルエクステンダー分子とアンプリファイアープローブとの間の架橋部
分として働く。この様式において、さらなるアンプリファイアーおよびさらなる
ＥＴＭは最終的に検出プローブに結合する。プレアンプリファイアー分子は線状
であっても分枝状であってもよく、典型的には約３０〜３０００個の範囲のヌク
レオチドを含む。
【０１４８】 このように、ラベルプローブは増幅配列に、または標的配列の一部に実質的に
相補的である。したがって、ラベルプローブは本明細書に一般的に記載している
ように様々な方法で、下記に説明するように“メカニズム−１”の検出システム
を利用するのか、または“メカニズム−２”の検出システムを利用するのかにし
たがい、設定することができる。
【０１４９】 本発明の増幅反応の検出は、増幅産物の直接検出およびラベルプローブを利用
する間接検出（すなわち、サンドイッチアッセイ）を包含し、下記により詳しく
説明するように、様々な様式でアッセイ複合体に付着し得る、ＥＴＭを含んでな
るアッセイ複合体を検出することにより実施する。一般に、基本的な検出メカニ
ズムは２つある。好適な態様において、ＥＴＭの検出は、二本鎖核酸の積み重な
ったπ−軌道を経る電子移動に基づいている。この基本的メカニズムはＵＳ特許
番号５，５９１，５７８、５，７７０，３６９、５，７０５，３４８、５，８２
４，４７３および５，７８０，２３４、およびＷＯ９８／２０１６２に記載され
ているが、これらのすべてを参照により特に本明細書に取込み、“メカニズム−
１”と称する。簡単に説明すると、以前の研究では、電子の移動は二本鎖核酸の
積み重なったπ−軌道を経るときは急速に進むが、一本鎖核酸を経るときは有意
によりゆっくりと進む。したがって、このことがアッセイの基礎として役割を果
たしている。このように、伝導性オリゴマーを介して検出電極に付着する核酸に
ＥＴＭを（下記のように、ハイブリッド形成指標の使用を介して、鎖の一方には
共有結合により、またはハイブリッド形成複合体には非共有結合により）付加す
ることにより、核酸と伝導性オリゴマーを介してＥＴＭと電極間の電子移動を検
出することができる。この一般的な概念を図２７に図示する。
【０１５０】 別法として、ＥＴＭは必ずしも核酸を介する電子移動によらず検出可能であり
、むしろ伝導性オリゴマーを用いて直接検出することができる；すなわち、ＥＴ
Ｍからの電子は、シグナルを発生するために、積み重なったπ−軌道を経て移動
する必要はない。代りに、伝導性オリゴマーを含んでなる自己集合単層（ＳＡＭ
）表面上にＥＴＭの存在することが直接に検出可能である。この基本概念を本明
細書では“メカニズム−２”と称する。このように、標的配列の結合に基づき、
ＥＴＭを含んでなるラベルプローブを表面にもっていき、ＥＴＭの検出は、推定
伝導性オリゴマーを経て電極へと進むことができる（あるいは、標的がＥＴＭを
含んでなる）。本質的には、伝導性オリゴマーを含んでなるＳＡＭの役割は、電
極の電子表面を“嵩上げする”ことであり、一方、電極を溶液組成物から遮断し
、電極への非特異結合量を減少させる利益を提供することである。異なる見方と
して、標的配列の役割は表面に対するＥＴＭのリクルートに特異性を提供するこ
とであり、その場合、それらは電子的に露出した末端をもつ伝導性オリゴマーを
用いて検出することができる。この一般的な概念を図１６に示す。
【０１５１】 このように、いずれかの態様において、ＥＴＭを含むアッセイ複合体が形成さ
れるが、次いでそれを検出電極により検出する。本発明はこのように最少の標的
配列を含んでなるアッセイ複合体を提供する。本明細書の“アッセイ複合体”は
、プローブおよび標的などの核酸を含んでなるハイブリッド形成複合体の集積物
を意味し、少なくとも１つのＥＴＭを含み、検出を可能とするものである。アッ
セイ複合体の組成物は本明細書に概説した異なるプローブ成分を使用することに
依存する。かくして、図１６Ａと１６Ｂのアッセイ複合体は捕獲プローブと標的
配列を含んでなる。該アッセイ複合体はまた、本明細書に概説するように、使用
する構成に依存して、ラベルプローブ、捕獲エクステンダープローブ、ラベルエ
クステンダープローブ、およびアンプリファイアープローブを包含する。
【０１５２】 アッセイ複合体は少なくとも１つのＥＴＭを含んでなるが、ＥＴＭは本明細書
に説明するようにアッセイ複合体の成分または下記の“ハイブリッド形成指標”
に共有結合により付着することができる。本明細書での“電子供与体部分”“電
子受容体部分”および“ＥＴＭ”または文法上の等価物という用語は、特定の条
件下で電子移動し得る分子をいう。電子供与体および受容体の能力は相対的であ
ることを理解すべきである；すなわち、ある実験条件下で電子を失い得る分子は
異なる実験条件下で電子を受容し得ることである。理解されるべきことは、可能
な電子供与体部分と電子受容体部分の数は非常に大きいこと、電子移動化合物の
当業者は本発明における多くの化合物を利用し得ることである。好適なＥＴＭは
遷移金属複合体、有機ＥＴＭ類、および電極などであるが、これらに限定される
ものではない。
【０１５３】 好適な態様において、ＥＴＭは遷移金属複合体である。遷移金属とはその原子
が一部または全部のｄ殻電子を有するもののことである。本発明に使用するのに
適した遷移金属はカドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジ
ウム（Ｐｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒ
ｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（
Ｓｃ）、チタニウム（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（
Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、タン
グステン（Ｗ）、およびイリジウム（Ｉｒ）などであるが、これらに限定される
ものではない。すなわち、遷移金属の第一シリーズ、白金族（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ
、Ｏｓ、ＩｒおよびＰｔ）並びにＦｅ、Ｒｅ、Ｗ、ＭｏおよびＴｃが好ましい。
特に好ましいのはルテニウム、レニウム、オスミウム、白金、コバルトおよび鉄
である。
【０１５４】 遷移金属は種々のリガンドとキレート化し、技術上周知の適切な遷移金属複合
体を形成する。Ｌは補助リガンドであり、金属イオン結合のための配位原子を提
供する。当業者が認識するように、補助リガンドの数と性質は金属イオンの配位
数に依存する。単座、二座または多座補助リガンドはどの位置で使用してもよい
。
【０１５５】 技術的に認識されるように、補助リガンドは同一であっても異なってもよい。
適切なリガンドは２つの範疇に入る：配位原子（一般的には文献上、シグマ（σ
）供与体という）として（金属イオンに依存して）、窒素、酸素、イオウ、炭素
またはリン原子を用いるリガンド、およびメタロセンリガンドなどの有機金属リ
ガンド（一般的には文献上、パイ（π）供与体といい、本明細書ではＬmで図示 する）である。適切な窒素供与リガンドは技術上周知であり、以下のものを包含
するがこれらに限定されるものではない：ＮＨ2；ＮＨＲ；ＮＲＲ'；ピリジン；
ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの
置換誘導体；テルピリジンおよび置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０
−フェナントロリン（ｐｈｅｎと略記）およびフェナントロリンの置換誘導体、
例えば、４，７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリド［３，２−ａ：２' ，３'−ｃ］フェナジン（ｄｐｐｚと略記）；ジピリドフェナジン；１，４，５ ，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（ｈａｔと略記）；９，１０−フェ
ナントレンキノン・ジイミン（ｐｈｉと略記）；１，４，５，８−テトラアザフ
ェナントレン（ｔａｐと略記）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラ
デカン（ｃｙｃｌａｍと略記）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびイソシアニド。融合
した誘導体を包含する置換誘導体も使用することができる。ある態様においては
、ポルフィリンおよびポルフィリンファミリーの置換誘導体を使用してもよい。
例えば、Comprehensive Coordination Chemistry, Ed. Wilkinson et al., Perg
ammon Press, 1987, Chapters 13.2 (pp 73-98), 21.1 (pp 813-898) and 21.3
(pp 915-957)参照。この文献の全部を特に参照により本明細書に取込む。
【０１５６】 炭素、酸素、イオウおよびリンを用いる適切なシグマ供与リガンドは技術上既
知である。例えば、適切なシグマ炭素供与体はCotton and Wilkenson, Advanced
Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, 1988に見出されるが、
この文献を参照により本明細書に取込む；例えば、３８ページ参照。同様に、適
切な酸素リガンドは、クラウンエーテル、水、および技術上既知の他のものを包
含する。ホスフィンおよび置換ホスフィンも適切である；Cotton and Wilkenson
の３８ページ参照。
【０１５７】 酸素、イオウ、リンおよび窒素−供与リガンドは、ヘテロ原子が配位原子とし
て作動するような様式で付着する。
【０１５８】 好適な態様においては、有機金属リガンドを用いる。レドックス部分として使
用する純有機化合物、およびヘテロ環状またはエキソ環状置換基として供与原子
をもつδ−結合有機リガンドとの種々の遷移金属配位複合体に加えて、π−結合
有機リガンドをもつ多様な遷移金属有機金属化合物が入手可能である（Advanced
Inorganic Chemistry, 5th Ed., Cotton & Wilkinson, John Wiley & Sons, 19
88, Chapter 26; Organometallics, A Concise Introduction, Elschenbroich e
t al., 2nd Ed., 1992, VCH; およびComprehensive Organometallic Chemistry
II, A Review of the Literature 1982-1994, Abel et al. Ed., Vol. 7, Chapt
ers 7, 8, 10 & 11, Pergamon Press, 特に参照により本明細書に取込む）。か かる有機金属リガンドは、シクロペンタジエニド・イオン［Ｃ5Ｈ5（−１）］な
どの環状芳香族化合物および種々の環置換および環融合誘導体、例えば、インデ
ニリド（−１）イオンなどであって、一群のビス（シクロペンタジエニル）金属
化合物（すなわち、メタロセン）を産生する；例えば、Robins et al., J. Am.
Chem. Soc., 104: 1882-1893 (1982); およびGassman et al., J. Am. Chem. So
c., 108: 4228-4229 (1986)参照；これらを参照により取込む。これらの内、フ ェロセン［（Ｃ5Ｈ5）2Ｆｅ］およびその誘導体が多様な化学的（Connelly e al
., Chem. Rev. 96: 877-910 (1996), 参照により取込む）および電子化学的（Ge
iger et al., Advances in Organometallic Chemistry 23: 1-93; およびGeiger
et al., Advances in Organometallic Chemistry 24: 87, 参照により取込む）
電子移動または“レドックス”反応に使用されているプロトタイプの例である。
様々な第一、第二および第三列遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸に共有結合
により付着するレドックス部分としての有力な候補である。他の潜在的に適切な
有機金属リガンドは、ベンゼンなどの環状アレンなどを包含し、ビス（アレン）
金属化合物とその環置換および環融合誘導体を産生するが、そのビス（ベンゼン
）クロミウムはプロトタイプの例である。アリル（−１）イオンなどの他の非環
状π−結合リガンドまたはブタジエンは潜在的に適切な有機金属化合物を産生し
、かかるリガンドはすべて他のπ−結合およびδ−結合リガンドと連携して、金
属−炭素結合をもつ一般クラスの有機金属化合物を構成する。架橋有機リガンド
およびさらなる非架橋リガンドを有し、同様に金属−金属結合を有し、また有さ
ない、かかる化合物の種々のダイマーおよびオリゴマーの電気化学的研究は、核
酸分析における有力な候補レドックス部分である。
【０１５９】 １種以上の補助リガンドが有機金属リガンドである場合、該リガンドは一般に
有機金属リガンドの炭素原子の一つを介して付着するが、ただし付着はヘテロ環
状リガンドに対し他の原子を介してであってもよい。好適な有機金属リガンドは
、置換誘導体およびメタロセンオファンを含むメタロセンリガンドを包含する（
上記Cotton and Wilkensonの１１７４ページ参照）。例えば、メチルシクロペン
タジエニルなどのメタロセンリガンドの誘導体、好ましくは複数のメチル基を有
する例えば、ペンタメチルシクロペンタジエニルなどを用い、メタロセンの安定
性を増大させることができる。好適な態様において、メタロセンの２つのメタロ
センリガンドの１つのみが誘導化される。
【０１６０】 本明細書に記載するように、リガンドはどのような組合わせで用いてもよい。
好適な組合わせは以下のとおりである：ａ）すべてのリガンドが窒素供与リガン
ドである；ｂ）すべてのリガンドが有機金属リガンドである；そしてｃ）１つの
リガンドがメタロセンリガンドであり、もう一つが窒素供与リガンドであり、他
のリガンドについては、要すれば、窒素供与リガンドであるか、メタロセンリガ
ンドであるか、またはその混合体である。
【０１６１】 遷移金属複合体に加えて、他の有機電子供与体および受容体は、本発明に使用
する核酸に共有結合により付着していてもよい。これらの有機分子は、リボフラ
ビン、キサンテン色素、アジン色素、アクリジンオレンジ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−
２，７−ジアザピレニウム・ジクロリド（ＤＡＰ2+）、メチルビオロジェン、臭
化エチジウム、キノン類、例えば、Ｎ，Ｎ'−ジメチルアントラ（２，１，９− ｄｅｆ．６，５，１０−ｄ'ｅ'ｆ’）ジイソキノリン・ジクロリド（ＡＤＩＱ2+ ）；ポルフィリン（［メソ−テトラキス（Ｎ−メチル−ｘ−ピリジニウム）ポル
フィリン・テトラクロリド］）、ベルラミン・ブルーＢ塩酸塩、ビンドシェドラ
ー（Bindschedler）グリーン；２，６−ジクロロインドフェノール、２，６−ジ
ブロモフェノールインドフェノール；ブリリアント・クレストブルー（塩化３−
アミノ−９−ジメチルアミノ−１０−メチルフェノキシアジン）、メチレンブル
ー； ナイルブルーＡ（アミノアフトジエチルアミノフェノキサジン硫酸塩）、 インジゴ−５，５'，７，７'−テトラスルホン酸、インジゴ−５，５'，７−ト リスルホン酸；フェノサフラニン、インジゴ−５−モノスルホン酸；サフラニン
Ｔ；塩化ビス（ジメチルグリオキシマト）鉄（ＩＩ）；インデュリンスカーレッ
ト、ニュートラルレッド、アントラセン、コロネン、ピレン、９−フェニルアン
トラセン、ルブレン、ビナフチル、ＤＰＡ、フェノチアジン、フルオランテン、
フェナントレン、クリセン、１，８−ジフェニル−１，３，５，７−オクタテト
ラセン、ナフタレン、アセナフタレン、ペリレン、ＴＭＰＤおよびこれら化合物
の類似体と置換誘導体であるが、これらに限定されるものではない。
【０１６２】 一態様において、電子供与体および受容体は技術上既知のレドックスタンパク
質である。しかし、多くの態様においてレドックスタンパク質は好ましくない。
【０１６３】 特異ＥＴＭの選択は、下に一般的に概説するように、使用した電子移動検出の
タイプに影響される。好適なＥＴＭはメタロセンであり、フェロセンが特に好ま
しい。
【０１６４】 好適な態様においては、複数のＥＴＭが使用される。多数のＥＴＭを使用する
ことはシグナルの増幅を提供し、その結果、より感度のよい検出限度を可能とす
る。相補鎖にハイブリッド形成する核酸上の多数ＥＴＭの使用（すなわち、メカ
ニズム−１のシステム）は、付着の数、部位、および複数ＥＴＭ間の空間に依存
してハイブリッド形成複合体のＴm減少を引起す一方、ＥＴＭがリクルートリン カー上にある場合、これは相補配列にハイブリッド形成しないので、ファクター
ではない。したがって、複数のＥＴＭが好ましく、アッセイ複合体当たり少なく
とも約２ＥＴＭが好ましく、少なくとも約１０個が特に好ましく、少なくとも約
２０ないし５０個がとりわけ好ましい。ある場合には、非常に多数のＥＴＭ（１
００ないし１００００個以上）を使用することができる。
【０１６５】 アッセイ複合体に対するＥＴＭの付着は様々な方法で実施し得るが、検出のメ
カニズムに依存し、また、検出が直接になされるのか間接になされるのかに依存
する。一般にはＷＯ９８／２０１６２（その全文を参照により本明細書に取込む
）に概説されている方法と組成物が使用できる。
【０１６６】 好適な態様において、それはＥＴＭを含んでなるラベルプローブである。好適
な態様において、ラベルプローブはメカニズム−２のシステムにおいて使用され
る。このように、当業者が認識するように、ＥＴＭを含んでなるラベルプローブ
（またはある態様においては標的）の部分（本明細書においては“リクルートリ
ンカー”または“シグナル担体”と呼称する）は核酸であるか、またはそれはＥ
ＴＭにラベルプローブの第一ハイブリッド形成可能な部分を結合する非核酸リン
カーであってもよい。すなわち、ラベルプローブのこの部分はメカニズム−２シ
ステムを用いる場合ハイブリッド形成を必要としないので、容易に合成がなし得
るとしても、それが核酸である必要はない。ある態様において、以下により詳細
に説明するように、リクルートリンカーは二本鎖部分を含んでなることができる
。 かくして、当業者が認識するように、使用し得る構成は様々である。好適な態
様において、リクルートリンカーは核酸（類似体を含む）であり、ＥＴＭの付着
は以下を介して可能である：（１）塩基；（２）リボース、リン酸エステル、ま
たは核酸類似体に匹敵する構造を含むバックボーン；（３）下記のヌクレオシド
置換体；または（４）下記のメタロセンポリマー。好適な態様において、リクル
ートリンカーは非核酸であり、ＥＴＭ置換基を含むメタロセンポリマーまたはア
ルキル型ポリマー（下により詳細に説明するように、ヘテロアルキルを含む）の
いずれかである。これらの選択肢は図中に一般的に図示する。 メカニズム−１の検出システムを用いてラベルプローブを検出する場合、ラベ
ルプローブが検出プローブにハイブリッド形成するには、本明細書に概説するよ
うに、ハイブリッド形成複合体の形成を必要とするので、ＥＴＭは上記の（１）
または（２）を介して一般に付着する。
【０１６７】 好適な態様において、リクルートリンカーは核酸であり、共有結合により付着
したＥＴＭを含んでなる。ＥＴＭは様々な位置で核酸内のヌクレオシドに付着し
ていてもよい。好適な態様は、（１）ヌクレオシド塩基への付着、（２）塩基置
換体としてのＥＴＭの付着、（３）リボース−リン酸バックボーンのリボースま
たはリン酸部分への、または核酸類似体の類似構造へなどの核酸バックボーンへ
の付着、および（４）メタロセンポリマーを介しての付着、などであり、後者が
好ましいが、これらに限定されるものではない。
【０１６８】 さらに、下記のように、リクルートリンカーが核酸である場合、第二のラベル
プローブを用いることが望ましく、該プローブは本明細書に定義のように第一ラ
ベルプローブの一部にハイブリッド形成する第一部分とリクルートリンカーを含
んでなる第二部分を有する。これは一般的に図１６Ｈに図示される；これはアン
プリファイアープローブの使用に似ているが、第一および第二ラベルプローブ両
者がＥＴＭを含んでなる場合は例外である。
【０１６９】 好適な態様において、伝導性オリゴマーの付着のために、ＥＴＭはＷＯ９８／
２０１６２（参照により取込む）に一般的に概説されているようにヌクレオシド
の塩基に付着する。付着は内部ヌクレオシドまたは末端ヌクレオシドに対してな
される。
【０１７０】 共有結合による塩基への付着は選定されたＥＴＭ上の部分に依存するが、一般
にはＷＯ９８／２０１６２に概説されているように、伝導性オリゴマーが塩基に
付着するのに似ている。付着は、一般には、塩基のどの部位になされてもよい。
好適な態様において、ＥＴＭは遷移金属複合体であり、かくして、適切な金属リ
ガンドの塩基への付着がＥＴＭの共有結合による付着に導く。あるいは、当業者
が認識するように、同様のタイプの結合を有機ＥＴＭの付着に使用してもよい。
【０１７１】 一態様において、シトシンのＣ４付着アミノ基、アデニンのＣ６付着アミノ基
、またはグアニンのＣ２付着アミノ基が遷移金属リガンドとして使用し得る。
【０１７２】 芳香族基を含むリガンドは技術上既知のようにアセチレン結合を介して付着す
ることができる（Comprehensive Organic Synthesis, Trost et al., Ed., Perg
amon Press, Chapter 2.4; Coupling Reactions Between sp2 and sp Carbon Ce
nters, Sonogashira, pp 521-549, and pp 950-953参照; 参照により取込む）。 構造１は金属イオンと他の必要なリガンド存在下での代表的な構造を図示する；
構造１ではウリジンを図示しているが、本明細書全体について、他の塩基を使用
することも可能である。
【０１７３】
【化１】 Ｌaはリガンドであり、窒素、酸素、イオウまたはリン供与リガンドまたはメ タロセンリガンドなどの有機金属リガンドを包含する。適切なリガンドＬaはフ ェナントロリン、イミダゾール、ｂｐｙおよびｔｅｒｐｙなどであるが、これら
に限定されるものではない。ＬrおよびＭは上記定義のとおりである。再度、当 業者が認識するように、リンカー（“Ｚ”）はヌクレオシドとＥＴＭの間に含ま
れる。
【０１７４】 同様に、伝導性オリゴマーとしては、その結合がリンカーを用いてなされるが
、リンカーはアミド結合を利用することができる（一般的に、Telser et al., J
. Am. Chem. Soc. 111: 7221-7226 (1989); Telser et al., J. Am. Chem. Soc.
111: 7226-7232 (1989)参照；両文献を特に参照により取込む）。これらの構造
は下記構造２に一般的に図示する。再度ここではウリジンを塩基として使用して
いるが、上記同様、他の塩基も使用し得る。
【化２】
【０１７５】 この態様において、Ｌは上記定義のリガンドであり、Ｌと同様、Ｍも上記定義
のとおりである。好ましくは、Ｌはアミノ、ｐｈｅｎ、ｂｙｐおよびｔｅｒｐｙ
である。
【０１７６】 好適な態様において、ヌクレオシドに付着したＥＴＭはメタロセンである；す
なわち、構造２のＬおよびＬｒは両者ともメタロセンリガンドであり、上記のＬ m ' である。構造３は好適な態様を図示するものであり、この場合メタロセンはフ
ェロセン、塩基はウリジンであるが、他の塩基も使用可能である。
【化３】
【０１７７】 予備データが示唆するところでは、構造３は環化可能であって、第二アセチレ
ン炭素原子がカルボニル酸素を攻撃し、フラン様構造を形成する。好適なメタロ
センはフェロセン、コバルトセンおよびオスミウムオセンなどである。 好適な態様において、ＥＴＭは核酸のリボース−リン酸バックボーンのいずれ
かの位置、すなわち、５'または３'末端またはいずれかの内部ヌクレオシドでリ
ボースに付着している。この場合のリボースはリボース類似体を包含する。技術
的に知られているように、リボースの２'または３'位置のいずれかで修飾されて
いるヌクレオシドは、窒素、酸素、イオウおよびリン−含有修飾により可能とな
し得る。アミノ−修飾および酸素−修飾リボースが好ましい。一般的には、ＷＯ
９５／１５９７１およびＷＯ９８／２０１６２（参照により取込む）を参照され
たい。これらの修飾基は遷移金属リガンドとして、または他の遷移金属リガンド
および有機金属リガンド付着のための化学的に官能性の部分、または当業者認知
の有機電子供与体部分として使用することができる。この態様において、本明細
書において“Ｚ”として図示したようなリンカーも同様に、またはリボースとＥ
ＴＭ間の伝導性オリゴマーも使用可能である。好適な態様では、リボースの２' または３'位での付着を利用するが、２'位置が好ましい。このように例えば、Ｗ
Ｏ９８／２０１６２の構造１３、１４および１５に図示された伝導性オリゴマー
はＥＴＭに置換えることができる；あるいは、ＥＴＭは伝導性オリゴマーの遊離
末端に加えてもよい。
【０１７８】 好適な態様において、メタロセンはＥＴＭとして作動し、下記構造４に図示す
るようにアミド結合を介して付着する。例示ではメタロセンがフェロセンである
場合の好適な化合物につきその合成を概説する。
【化４】
【０１７９】 好適な態様においては、アミンの結合が構造５に一般的に図示するように使用
される。
【化５】 Ｚは本明細書に定義のごときリンカーであり、１〜１６原子のものが好ましく、
２〜４原子がとりわけ好ましい。ｔは１または０である。
【０１８０】 好適な態様においては、オキソ結合が構造６に一般的に図示するように使用さ
れる。
【化６】 構造６において、Ｚは本明細書に定義のとおりのリンカーであり、ｔは１また
は０である。好適なＺリンカーは、（ＣＨ2）nおよび（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nなどの ヘテロアルキル基を含むアルキル基を包含し、ｎは１ないし１０が好ましく、ｎ
＝１ないし４がとりわけ好ましく、ｎ＝４が特に好ましい。
【０１８１】 他のヘテロ原子を利用する結合も可能である；ヌクレオシドに対するＥＴＭの
多様な結合を図１に示す。
【０１８２】 好適な態様において、ＥＴＭは核酸のリボース−リン酸バックボーンのいずれ
かの位置でリン酸エステルに付着する。これは様々な様式でなされる。一態様に
おいて、ホスホジエステル結合類似体、例えば、ホスホラミドまたはホスホラミ
ダイト結合は核酸中に取込まれていてもよく、その場合、ヘテロ原子（すなわち
、窒素）が遷移金属リガンドとして作動する（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１５９７１
およびＷＯ９８／２０１６２参照；参照により取込む）。あるいは、ＷＯ９８／
２０１６２の構造２３および２４に図示されている伝導性オリゴマーをＥＴＭに
置換えてもよい。好適な態様において、組成物は構造７に示した構造を有する。
【化７】
【０１８３】 構造７において、ＥＴＭはリン酸エステル結合を介して、一般にはリンカーＺ
を使用することにより付着する。好適なＺリンカーは、（ＣＨ2）n、（ＣＨ2Ｃ Ｈ2Ｏ）nなどのヘテロアルキル基を含むアルキル基を包含し、ｎは１ないし１０
が好ましく、ｎ＝１ないし４がとりわけ好ましく、ｎ＝４が特に好ましい。
【０１８４】 ＥＴＭがヌクレオシドの塩基またはバックボーンに付着している場合、より詳
しく下に概説するように、“樹枝状”構造を介してＥＴＭを付着させることが可
能である。図面に一般的に示すように、アルキルベースのリンカーを用い、各枝
の末端に１個以上のＥＴＭを含んでなる多数の分枝構造を創り出すことができる
。一般に、これは多数のヒドロキシ基を含む分枝点を創り出すことにより実施さ
れるが、このヒドロキシ基を用いてさらなる分枝点を加えることができる。末端
のヒドロキシ基は次いでホスホラミダイト反応に用い、一般的にはヌクレオシド
置換およびメタロセンポリマー反応のために以下に実施するように、ＥＴＭに加
えることができる。
【０１８５】 好適な態様において、メタロセンなどのＥＴＭは、ＥＴＭとして作動するよう
に“ヌクレオシド置換体”として使用する。例えば、フェロセンの２つのシクロ
ペンタジエン環の間の距離は、二本鎖核酸中の２つの塩基間の直交距離に類似し
ている。フェロセンに加え、他のメタロセン、例えば、コバルトまたはルテニウ
ムなどを含むメタロセンなどの空気安定性メタロセンを使用することができる。
このように、メタロセン部分は、構造８（リボース−リン酸バックボーンを有す
る核酸）および構造９（ペプチド核酸バックボーン）に一般的に図示するように
、核酸のバックボーンに取込んでもよい。構造８および９ではフェロセンを図示
しているが、当業者が認識するように、他のメタロセンも同様に使用し得る。一
般に、空気に安定なメタロセンが好ましく、金属としてルテニウムおよびコバル
トを利用するメタロセンが包含される。
【０１８６】
【化８】 構造８において、Ｚは上記定義のリンカーであり、一般的には短いアルキル基
をもち、酸素などのヘテロ原子を含むものが好ましい。一般に、重要なことはリ
ンカーの長さであり、より詳しく以下に説明するように、二本鎖核酸の最少の摂
動がもたらされるようにする。このように、メチレン、エチレン、エチレングリ
コール、プロピレンおよびブチレンがすべて好適であり、エチレンおよびエチレ
ングリコールが特に好ましい。さらに、各Ｚリンカーは同一であっても、異なっ
てもよい。構造８はリボース−リン酸バックボーンを表示しているが、当業者が
認識するように、リボース類似体およびリン酸エステル結合類似体などの核酸類
似体を使用してもよい。
【０１８７】
【化９】 構造９において、好適なＺ基は上記掲載のとおりであるが、再度、各Ｚリンカ
ーは同一または異なってもよい。上述のように、他の核酸類似体も同様に使用し
得る。
【０１８８】 さらに、上記の構造と検討ではメタロセン、特にフェロセンを描出しているが
、同じ一般的な着想を用い、下記のように、メタロセンに加えヌクレオシドの置
換体として、またはポリマーの態様において、ＥＴＭを付加することができる。
このように、例えば、１、２または３個（またはそれ以上）のリガンドを含んで
なる、メタロセン以外の遷移金属複合体である場合、該リガンドをフェロセンに
ついて表現したように機能化し、ホスホラミダイト基の付加を可能とすることが
できる。特に、この態様において好ましいのは、少なくとも２つの環（例えば、
アリールおよび置換アリール）リガンドを含んでなる複合体であり、その場合、
各リガンドはホスホラミダイト化学による付着のための官能基を含んでなる。当
業者が認識するように、このタイプの反応は、ここで生じるシグナルの増幅を可
能とするために、核酸バックボーンの一部としてまたは核酸の“側鎖基”として
ＥＴＭのポリマーを創出するが、正しい化学基を含むように官能化し得る実質的
にいずれのＥＴＭによっても実施することができる。
【０１８９】 このように、フェロセンなどのメタロセン（または他のＥＴＭ）を核酸のバッ
クボーンに挿入することにより、核酸類似体が調製される；すなわち、本発明は
少なくとも１個のメタロセンを含んでなるバックボーンをもつ核酸を提供する。
このことはバックボーンに付着した、すなわち、リボース、リン酸エステルなど
を介して、メタロセンを有する核酸から識別される。すなわち、伝統的な核酸ま
たは類似体から造られた２つの核酸（この場合の核酸は単一のヌクレオシドを包
含する）それぞれは、メタロセンを介して互いに共有結合により付着することが
できる。異なる観点で、メタロセン誘導体または置換メタロセンが提供されるが
、その場合は、メタロセンの２つの芳香環それぞれが核酸置換基を有する。
【０１９０】 さらに、より詳しく以下に説明するように、間にヌクレオチドをもつか、およ
び／または隣接するメタロセンをもつ１個より多いメタロセンをバックボーンに
取込ませることが可能である。隣接するメタロセンをバックボーンに付加する場
合、これは“メタロセンポリマー”としての下記の工程と同じである；すなわち
、バックボーン内にメタロセンポリマーの領域が存在する。
【０１９１】 核酸置換基に加え、ある場合には、メタロセン（またはＥＴＭ）の芳香環の一
方または双方にさらなる置換基を付加することが望ましい。例えば、これらのヌ
クレオシド置換体は一般に実質的に相補的な核酸、例えば、標的配列またはもう
一つのプローブ配列とハイブリッド形成すべきプローブ配列の部分なので、置換
基をメタロセン環に付加して、反対鎖上の１個または複数個の塩基に水素結合形
成するのを容易にすることが可能である。これらはメタロセン環上のどの位置に
付加してもよい。適切な置換基は、アミド基、アミン基、カルボン酸、および置
換アルコールを含むアルコール類であるが、これらに限定されるものではない。
さらに、これらの置換基は同様にリンカーを介して付着させることができるが、
一般的には好ましくない。
【０１９２】 さらに、ＥＴＭ、特にフェロセンなどのメタロセン上に置換基を付加してＥＴ
Ｍのレドックス性を変化させてもよい。このように、例えばある態様では、より
詳しく以下に記載するように、異なる様式で（すなわち、塩基またはリボース付
着）、異なるプローブ上、または異なる目的で（例えば、校正または内部基準と
して）付着した異なるＥＴＭを有することが望ましい。このように、メタロセン
上に置換基を付加することは、２つの異なるＥＴＭの識別を可能とする。
【０１９３】 これらのメタロセン−バックボーン核酸類似体を生成させるために、中間成分
も提供される。このように、好適な態様において、本発明は構造１０に一般的に
表示するように、ホスホラミダイト・メタロセンを提供する。
【化１０】
【０１９４】 構造１０において、ＰＧは保護基であり、一般に核酸の合成に適した基でああ
て、ＤＭＴ、ＭＭＴおよびＴＭＴなどがすべて好適である。芳香環はメタロセン
の環であるか、または遷移金属複合体もしくは他の有機ＥＴＭ用リガンドの芳香
環であることができる。芳香環は同一または異なってもよく、また、本明細書に
検討するように置換されていてもよい。
【０１９５】 構造１１はフェロセン誘導体を図示する：
【化１１】
【０１９６】 これらのホスホラミダイト類似体は技術上既知の標準的オリゴヌクレオチド合
成に追加することができる。
【０１９７】 構造１２はフェロセンペプチド核酸（ＰＮＡ）モノマーを図示し、技術上既知
のＰＮＡの合成に追加することができ、図面と実施例内に表示される。
【化１２】 構造１２において、ＰＧ保護基はペプチド核酸合成に使用するのに適しており
、ＭＭＴ、ｂｏｃ、およびＦｍｏｃなどが好ましい。
【０１９８】 これら同一の中間化合物を用いてＥＴＭまたはメタロセンポリマーを形成する
ことが可能であり、これらは、より詳しく以下に説明するように、バックボーン
置換体としてよりもむしろ核酸に付加される。
【０１９９】 好適な態様において、ＥＴＭはポリマーとして、例えば、メタロセンポリマー
として、本明細書およびＵＳ特許番号５，１２４，２４６に概説されているよう
に、“分枝したＤＮＡ”態様と同様の“分枝した”構成で、修飾した機能化ヌク
レオチドを用い付着させる。一般的な着想は以下のとおりである。修飾されたホ
スホラミダイトヌクレオチドが生成されるが、それはメタロセンなどのホスホラ
ミダイトＥＴＭの付着に使用し得る遊離のヒドロキシ基を最終的に含むことがで
きる。この遊離のヒドロキシ基は塩基またはリボースもしくはリン酸エステルな
どのバックボーン上に存在し得る（当業者も認識するであろうが、他の構造を含
む核酸類似体も使用し得る）。修飾されたヌクレオチドを核酸に取込み、ヒドロ
キシ保護基を除去し、遊離のヒドロキシを生じる。構造１０および１において上
述したように、メタロセンなどのホスホラミダイトＥＴＭの付加に基づき、メタ
ロセンＥＴＭなどのＥＴＭを付加する。メタロセンなどのさらなるホスホラミダ
イトＥＴＭを付加し、特にフェロセンについて本明細書に描写した“メタロセン
ポリマー”を含む“ＥＴＭポリマー”を形成することができる。さらに、ある態
様においては、図１２に一般的に描出したように、“キャッピング”基をポリマ
ー中の末端ＥＴＭに、例えば、最終リン酸エステル基をメタロセンに付加するこ
とによりポリマーの溶解性を上昇させることが望ましい。他の適切な溶解度上昇
性“キャッピング”基は当業者が認識するであろう。留意すべきことは、これら
の溶解度上昇性基は、リガンド環、例えば、本明細書で検討したメタロセンの他
の位置でポリマーに付加させることができることである。
【０２００】 この一般的な着想の好適な態様を図面に概説する。この態様において、ホスホ
ラミダイトヌクレオチドのリボースの２'位置は、この場合はオキソ結合を介し て保護されたヒドロキシ基を含むように先ず官能化するが、リンカーの数につい
ては、Ｚリンカーについて本明細書で一般的に記載するようにいずれの数も使用
し得る。保護修飾されたヌクレオチドは、次いで標準的なホスホラミダイトの化
学により伸長する核酸中に取込む。保護基を除去し、遊離のヒドロキシ基を用い
、再び標準的なホスホラミダイトの化学を用い、フェロセンなどのホスホラミダ
イトメタロセンを付加させる。同様の反応は核酸の類似体についても可能である
。例えば、構造１２に示したペプチド核酸とメタロセンモノマーを用い、メタロ
センポリマーを含むペプチド核酸構造を生成させることができた。
【０２０１】 このように、本発明は図１２および１３に一般的に図示したように、メタロセ
ンポリマーの“分枝”を含んでなる核酸のリクルートリンカーを提供する。好適
な態様ではメタロセンの長さが１ないし約５０個、好ましくは約５ないし約２０
個、とりわけ好ましくは約５ないし約１０個のメタロセンポリマーを利用する。
【０２０２】 さらに、リクルートリンカーが核酸である場合、ＥＴＭの組合わせがなされる
。 好適な態様において、リクルートリンカーは核酸ではなく、代りに如何なる種
類のリンカーまたはポリマーであってもよい。当業者が認識するように、ＥＴＭ
を含むように修飾し得る一般的なリンカーまたはポリマーを用いることができる
。一般に、ポリマーまたはリンカーは適度に溶解すべきであり、ＥＴＭ付加のた
めの適切な官能基を含むべきである。
【０２０３】 本明細書にて用いる場合、“リクルートポリマー”とは少なくとも２または３
個のサブユニットを含んでなり、共有結合により付着している。モノマーサブユ
ニットの少なくともある部分はＥＴＭの共有結合による付着のための官能基を含
む。ある態様において、カップリング部分はサブユニットとＥＴＭとを共有結合
させるために用いる。付着のための好適な官能基は、アミノ基、カルボキシ基、
オキソ基およびチオール基などであって、アミノ基が特に好ましい。当業者が認
識するように、多様なリクルートポリマーが可能である。
【０２０４】 適切なリンカーとしては、アルキルリンカー（ヘテロアルキル（（ポリ）エチ
レングリコール型構造を含む）、置換アルキル、アリールアルキルリンカーを含
む）を包含するが、これらに限定されるものではない。ポリマーについては上記
のごとく、リンカーはＥＴＭ付着のための１個以上の官能基を含んでなり、付着
は当業者認識のとおりに、例えば、周知のホモ−またはヘテロ−二官能性リンカ
ーを使用することによって実施される（１９９４年Pierce Chemical Companyの カタログ、架橋剤に関する技術のセクション、１５５〜２００ページ参照。参照
により取込む）。
【０２０５】 適切なリクルートポリマーは、機能化したスチレン、例えば、アミノスチレン
、機能化したデキストラン、およびポリアミノ酸などを包含するが、これらに限
定されるものではない。好適なポリマーは、ポリリジンなどのポリアミノ酸（ポ
リ−Ｄ−アミノ酸およびポリ−Ｌ−アミノ酸両方）、およびリジンと特に好適な
他のアミノ酸を含むポリマーなどである。他の適切なポリアミノ酸は、ポリグル
タミン酸、ポリアスパラギン酸、リジンとグルタミン酸またはアスパラギン酸と
の共重合体、リジンとアラニン、チロシン、フェニルアラニン、セリン、トリプ
トファン、および／またはプロリンとの共重合体などである。
【０２０６】 好適な態様において、リクルートリンカーは上記のようにメタロセンポリマー
を含んでなる。 リクルートリンカーのラベルプローブ第一部分への付着は、当業者が認識する
ように、リクルートリンカーの組成に依存する。リクルートリンカーが核酸であ
る場合、一般にそれは、要求されるＥＴＭ含有ヌクレオシドの取込みとともに、
ラベルプローブ第一部分の合成の際に形成される。あるいは、ラベルプローブの
第一部分とリクルートリンカーが別個に造られ、次いで付着してもよい。例えば
、相補性の重なり合う区分があって、例えば、技術的に既知のプソラレンを使用
することにより、化学的に架橋し得る二本鎖核酸の区分を形成してもよい。非核
酸リクルートリンカーを使用する場合、リクルートリンカーのリンカー／ポリマ
ー付着は一般に、当業者が認識するような標準的化学技法を用いて実施される。
例えば、アルキル−ベースのリンカーを使用する場合、付着は核酸への絶縁体付
着と同様である。
【０２０７】 さらに、核酸と非核酸の混合物であるリクルートリンカーを、線状形態（すな
わち、核酸セグメントがアルキルリンカーとともに結合している）または分枝形
態（ＥＴＭを含み、かつ、さらに分枝していてもよいアルキル“分枝”をもつ核
酸）で入手することが可能である。
【０２０８】 好適な態様において、ＥＴＭはプライマーに取込まれることにより、または標
的配列の新たに合成された部分に取込まれることにより、標的配列に付着する。
共有結合により付着したＥＴＭを含んでなる標的配列は図面に示すように、メカ
ニズム−１またはメカニズム−２のシステムを用い直接検出することができる。
【０２０９】 この態様において、それはラベルプローブのリクルートリンカーよりもむしろ
ＥＴＭを担持する標的配列それ自体である。本明細書にて検討するように、これ
はプライマー内にまたは新たに合成された鎖内に包含するある数の位置に取込ま
れたＥＴＭを有する標的配列を用いて実施し、本明細書にて概説するように、種
々の位置において核酸に付着させることができる。この態様において、他のシス
テムとしては、プローブおよび標的の３'−５'方向が、単層表面にできるだけ接
近するような、また、正しい方向にあるＥＴＭ−含有構造（すなわち、ラベルプ
ローブ、リクルートリンカーまたは標的配列）を得るために選択される。これは
図面に一般的に示すように、絶縁体または伝導性オリゴマーを介する付着を用い
て実施し、どのメカニズムを使用するかに依存する。さらに、当業者が認識する
ように、捕獲プローブの５'−３'方向が異なっている場合の配置において、また
は多くの捕獲プローブが使用された場合に標的の“ループ”が形を成す場所にお
いて、多重捕獲プローブが利用可能である。
【０２１０】 標的配列のＥＴＭによる標識は、新たな標的鎖の合成に際し起こり得る。例え
ば、本明細書にて説明するように、本発明のＥＴＭを含んでなる三リン酸ヌクレ
オチドを伸長途上の核酸に、例えば、すでに説明した増幅技法に際して、酵素的
に付加させることが可能である。当業者が認知するように、数種の酵素が一般に
修飾したヌクレオチドに寛容であることが示されている一方、本発明の修飾ヌク
レオチドの一部、例えば、“ヌクレオシド置換体”の態様および推定上ある種の
リン酸エステル付着は、伸長途上の核酸への取込みを可能とする酵素により認識
される場合とされない場合がある。したがって、この態様における好適な付着は
ヌクレオチドの塩基またはリボースに対してである。
【０２１１】 別法として、ＥＴＭを含んでなるヌクレオチドを核酸の末端、例えば、標的核
酸に、より詳細に以下に説明するように、酵素的に付加することが可能である。
この態様においては、有効な“リクルートリンカー”を標的配列の末端に付加さ
せ、それを検出に使用することができる。このように、本発明は、伝導性オリゴ
マーの単層と捕獲プローブを含んでなる電極を利用する組成物、およびアッセイ
複合体の成分にハイブリッド形成することの可能な第一部分と、アッセイ複合体
の成分にハイブリッド形成せず、少なくとも１つの共有結合により付着した電子
移動部分を含んでなる第二部分とを含んでなる標的配列を提供する。同様に、こ
れらの組成物を利用する方法も提供する。
【０２１２】 プローブ配列、すなわち、相補性配列にハイブリッド形成するように設計され
た配列に連接したＥＴＭを入手することも可能である。このように、ＥＴＭは非
リクルートリンカーにも同様に付加させることができる。例えば、アッセイ複合
体の成分にハイブリッド形成するラベルプローブ断片、例えば、第一部分に、ま
たは上記の標的配列に付加したＥＴＭが存在してもよい。これらのＥＴＭは一部
の態様において電子移動検出に使用してもよく、あるいはその位置とシステムに
よっては使用することができない。例えば、ある態様において、例えば、図１６
Ａに図示したように、無作為に取込ませたＥＴＭを含有する標的配列が捕獲プロ
ーブに直接ハイブリッド形成する場合には、捕獲プローブにハイブリッド形成す
る部分にＥＴＭが存在する。もし捕獲プローブが伝導性オリゴマーを用いる電極
に付着するならば、これらのＥＴＭはすでに説明したように電子移動を検出する
のに使用することができる。あるいは、これらのＥＴＭは特異的に検出し得ない
可能性もある。
【０２１３】 同様に、ある態様においては、リクルートリンカーが核酸である場合、リクル
ートリンカーの一部またはすべてが二本鎖であることが、ある例では望ましい。
一態様においては、第二リクルートリンカーが存在し、それが実質的に第一リク
ルートリンカーに相補的であり、第一リクルートリンカーにハイブリッド形成し
得ることがある。好適な態様において、第一リクルートリンカーは共有結合によ
り付着したＥＴＭを含んでなる。別の態様において、第二リクルートリンカーは
ＥＴＭを含み、第一リクルートリンカーは含まず、ＥＴＭは第二リクルートリン
カーが第一に対してハイブリッド形成することによりその表面に集められる。さ
らにもう一つの態様においては、第一および第二リクルートリンカー双方がＥＴ
Ｍを含んでなる。留意すべきことは、上記のように、大量数のＥＴＭを含んでな
る核酸は、同様にはハイブリッド形成しない、すなわち、ＥＴＭの付着部位と特
性に依存してＴmが低下することがある。かくして、一般に、多数のＥＴＭが鎖 のハイブリッド形成に用いられるとき、一般には約５より小さく、好ましくは約
３より小さくする。あるいはＥＴＭは、介在するヌクレオチドが充分にハイブリ
ッド形成して良好な反応速度が可能となるように十分な空間距離をとるべきであ
る。
【０２１４】 一態様においては、非共有結合により付着したＥＴＭを使用してもよい。一態
様において、ＥＴＭはハイブリッド形成の指標である。ハイブリッド形成の指標
は、ミランらの方法と同様に、通常は逆に、二本鎖核酸と優先的に会合するＥＴ
Ｍが添加されたときに作動する（Millan et al., Anal. Chem. 65: 2317-2323 (
1993); Millan et al., Anal. Chem. 66: 2943-2948 (1994); 両文献を特に参照
により本明細書に取込む）。この態様において、表面での二重鎖核酸とＥＴＭハ
イブリッド形成の指標との会合によるＥＴＭの局部的濃度上昇は伝導性オリゴマ
ーを含んでなる単層を用いてモニターすることができる。ハイブリッド形成の指
標は挿入剤と小溝および／または主溝結合部分を含んでいる。好適な態様におい
ては挿入剤を用いてもよい；挿入は一般に二本鎖核酸の存在下にのみ起こるので
、二本鎖核酸の存在下においてのみＥＴＭが集中する。遷移金属複合体ＥＴＭの
挿入は技術的に既知である。同様に、主溝または小溝結合部分、例えば、メチレ
ンブルーを本態様において使用してもよい。
【０２１５】 同様に、本発明のシステムは非共有結合により付着したＥＴＭを利用し得るが
、これは一般的に Napier et al., Bioconj. Chem. 8: 906 (1997)（特に参照に
より本明細書に取込む）に記載されている。この態様において、ＤＮＡ存在の結
果としてある分子のレドックス状態が変化することは（すなわち、ルテニウム複
合体によるグアニン酸化）、同様に伝導性オリゴマーを含んでなるＳＡＭを用い
検出することができる。
【０２１６】 再度、このシステムの構成は検出に用いたメカニズムに依存する。多様なメカ
ニズム−１のシステムが図２７に描かれており、この図は直接検出法（すなわち
、ＥＴＭを含んでなる標的配列）および間接検出法（ラベルプローブ使用）を示
している。
【０２１７】 多様なメカニズム−２のシステムが図１６に描かれており、これも再度直接検
出法（すなわち、ＥＴＭを含んでなる標的配列）および間接検出法（ラベルプロ
ーブ使用）を示している。
【０２１８】 好適な態様において、ラベルプローブは図面に一般的に描写するように、標的
配列に直接ハイブリッド形成する。これらの態様において、該標的配列は、要求
されるわけではないが、好ましくは捕獲エクステンダープローブなどの捕獲プロ
ーブを用い、表面上に固定化する。次いで、ラベルプローブを用い、伝導性オリ
ゴマーを含んでなる単層の表面にＥＴＭが接近するようにする。好適な態様にお
いては、多重ラベルプローブを使用する；すなわち、ラベルプローブは標的配列
にハイブリッド形成する部分が多数の異なるプローブと異なるように設計し、そ
の結果、シグナルの増幅が起こるようにする。多重ラベルプローブはどの標的配
列に対しても結合し得るからである。かくして、図面に描写するように、ｎは少
なくとも１の整数である。所望の感度、標的配列の長さ、ラベルプローブ当たり
のＥＴＭの数、などにより、ｎの好適な範囲は１ないし５０であり、約１ないし
約２０が特に好ましく、約２ないし約５がとりわけ好ましい。さらに、“一般的
な”ラベルプローブが望ましいならば、以下に一般的に記載するように、アンプ
リファイアープローブとともにラベルエクステンダープローブを使用することが
できる。
【０２１９】 上記のように、本態様においては一般的に、システムの構成とラベルプローブ
は、ＥＴＭが単層表面にできるだけ接近して集まるように設計される。
【０２２０】 好適な態様において、ラベルプローブは標的配列に間接的にハイブリッド形成
する。すなわち、本発明はシグナル増幅技術と電極上の電子移動検出との新しい
組合わせにおける用途を見出すものであり、図面に一般的に図示するように、サ
ンドイッチハイブリッド形成アッセイに特に有用である。これらの態様において
、本発明のアンプリファイアープローブはサンプル中の標的配列に直接的または
間接的に結合する。アンプリファイアープローブはラベルプローブの結合に利用
し得る比較的多数の増幅配列を含むので、検出し得るシグナルが有意に増加し、
標的の検出限界を有意に改善することができる。これらのラベルおよびアンプリ
ファイアープローブ、また本明細書に記載の検出法は実質的に既知の核酸ハイブ
リッド形成方式、例えば、標的が直接固相に結合する方式、あるいは標的が１個
以上の核酸に結合し、それが次いで固相に結合するサンドイッチハイブリッド形
成アッセイにおける方式に使用することができる。
【０２２１】 本発明のアッセイ複合体は電極を用いて検出する。 本明細書での“電極”は、電子装置に接続したとき、電流または電荷を感知し
、それをシグナルに変換し得る構成物を意味する。あるいは、電極とは溶液中の
種に電位を与える得る、および／または種にまたは種から電子を受け渡しし得る
構成物と定義し得る。このように、電極とは本明細書に記載のＥＴＭである。好
適な電極は技術上既知であり、これらに限定されるものではないが、ある種の金
属およびその酸化物、例えば、金、白金、パラジウム、シリコン、アルミニウム
；金属酸化物電極、例えば、酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、酸化スズインジ
ウム、酸化パラジウム、酸化けい素、酸化アルミニウム、酸化モリブデン（Ｍｏ 2 Ｏ6）、酸化タングステン（ＷＯ3）および酸化ルテニウム；および炭素（ガラ ス状電極、黒鉛およびカーボンペースト）などを包含する。好適な電極は金、け
い素、白金、炭素および金属酸化物電極などであり、金が特に好ましい。
【０２２２】 本明細書に記載の電極は平らな表面として図示しているが、これは電極の可能
な一形状であって、図式化を目的とするのみのものである。電極の形状は使用さ
れる検出法により変わる。例えば、平面状の電極は光検出法に好適であり、ある
いは合成および検出のために処理可能な位置を必要として連なった核酸を調製す
る場合に好適である。あるいは、伝導性オリゴマーと内部表面に結合した核酸を
含んでなるＳＡＭの場合には、単一プローブ分析のために、電極をチューブの形
状とすることができる。これは少容量のサンプルに露出すべき核酸の表面積を最
大とするのを可能にする。
【０２２３】 検出電極は伝導性オリゴマーを含んでなる自己集合単層（ＳＡＭ）を含んでな
る。本明細書での“単層”または“自己集合単層”または“ＳＡＭ”とは、表面
上に自動的に化学吸着した分子の比較的秩序だった集合体を意味し、そこでは分
子が互いに略平行に、かつ、表面に対し大まかに垂直に方向づけられている。分
子それぞれは官能基を含み、それが表面に接着し、また、一部が単層中の隣接す
る分子と相互作用し、比較的秩序だった配列を形成する。“まじりあった”単層
は不均質の単層からなるが、すなわち、そこでは少なくとも２つの異なる分子が
単層を作り上げている。ＳＡＭは伝導性オリゴマーのみであっても、あるいは伝
導性オリゴマーと絶縁体の混合物であってもよい。本明細書に概説するように、
オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成効率は、分析対象物が電極から少し離れ
ている場合に増大する。同様に、標的分析対象物を包含する生体分子の電極への
非特異的結合が、単層の存在する場合、一般に減少する。このように、単層は電
極表面から離れている核酸の維持を容易にする。さらに、単層は電極表面から離
れている荷電種を保持するのに役立つ。このように、この層は電極とＥＴＭ間ま
たは電極と溶媒内の荷電種間の電気的接触を防止するのに役立つ。かかる接触は
サンプル内に存在する可能性のある荷電種を介して、直接の“短絡”または間接
の短絡に至る。したがって、単層は、好ましくは電極表面上の均一層にきっちり
と詰込み、“ホール”が存在するのを最少にする。このように、単層は電極への
溶媒接近をブロックする物理的障壁として作用する。
【０２２４】 好適な態様において、単層は伝導性オリゴマーを含んでなる。本明細書におい
て“伝導性オリゴマー”は実質的に伝導性のオリゴマーを意味し、好ましくは線
状であり、そのある態様では文献上“分子線”という。本明細書において“実質
的に伝導性”とは該オリゴマーが１００Ｈｚで電子を移動し得ることを意味する
。一般に、伝導性オリゴマーは、伝導性オリゴマーの単量体単位間のように、実
質的に重なり合うπ−軌道、すなわち、共役π−軌道を有するが、伝導性オリゴ
マーは１つ以上のシグマ（σ）結合をも含んでいる。さらに、伝導性オリゴマー
は会合したＥＴＭへの電子の注入またはＥＴＭからの受け入れ能力によって機能
的に定義することもできる。さらに、伝導性オリゴマーは本明細書に定義した絶
縁体よりもより伝導性である。さらに、本発明の伝導性オリゴマーは電気活性ポ
リマーとは区別すべきもので、これはそれ自体で電子を供与または受容できるも
のである。
【０２２５】 好適な態様において、伝導性オリゴマーは約１０-6ないし１０4Ω-1ｃｍ-1の 伝導性Ｓを有し、好ましくは約１０-5ないし１０3Ω-1ｃｍ-1であって、これら のＳ値は約２０Åないし約２００Åの範囲の分子から計算される。以下に記載す
るように、絶縁体は約１０-7Ω-1ｃｍ-1以下の伝導性Ｓ、好ましくは１０-8Ω-1 ｃｍ-1より低い値を有する。一般的には、Gardner et al., Sensors and Actuat
ors A51 (1995) 57-66 (参照により本明細書に取込む) を参照されたい。
【０２２６】 伝導性オリゴマーの所望の性質は、高い伝導性、本発明組成物の合成と使用の
ために有機溶媒および／または水への十分な溶解性、および反応に対する好適な
化学的抵抗などであるが、該反応が起こるのは、１）結合リガンド合成の際（す
なわち、核酸合成であって、本発明の構成物合成に際し、伝導性オリゴマーを含
むヌクレオシドを核酸シンセサイザーに加える際）、２）伝導性オリゴマーが電
極に付着する際、または３）結合アッセイの際、である。さらに、自己集合単層
の形成を促進する伝導性オリゴマーが好ましい。
【０２２７】 本発明のオリゴマーは、本明細書に記載のように、少なくとも２つの単量体サ
ブユニットを含む。下記に詳しく説明するが、オリゴマーには、ホモおよびヘテ
ロオリゴマーがあり、ポリマーも含む。
【０２２８】 好ましい実施態様では、導電性オリゴマーは、構造１３に示した構造を持つ： 構造１３
【化１３】 当業者には理解されるとおり、ここに示した構造は全て、更なる原子または構
造を有し得る。即ち、構造１３の導電性オリゴマーは、電極、遷移金属錯体、有
機ＥＴＭ、およびメタロセンなどのＥＴＭに、および核酸等の結合配位子に、ま
たはこれら数種に結合させることができる。特記しない限り、ここに示した導電
性オリゴマーは、その左側で電極に結合させる。つまり、構造１３の場合は、左
側の“Ｙ”を本明細書に記載の電極につなげる。導電性オリゴマーを結合配位子
に結合させるとき、右側の“Ｙ”は、存在するならば、直接的にまたは本発明に
記載のリンカーを用いて、核酸などの結合配位子に結合させる。
【０２２９】 本実施態様では、Ｙは芳香族基であり、ｎは１から５０の整数であり、gは１ または０のいずれかであり、ｅは０から１０の整数であり、ｍは０または１であ
る。gが１のとき、Ｂ−Ｄは、隣接する結合(本書中ではＡ 共役結合＠と称す) と共役し得る結合であり、好ましくは、アセチレン、アルケン、置換アルケン、
アミド、アゾ、−Ｃ＝Ｎ−(−Ｎ＝Ｃ−、−ＣＲ＝Ｎ−および−Ｎ＝ＣＲ−を含 む)、−Ｓi＝Ｓi−および−Ｓi＝Ｃ−(−Ｃ＝Ｓi−、−Ｓi＝ＣＲ−および−Ｃ Ｒ＝Ｓi−を含む)から選択される。gが０のとき、ｅは好ましくは１であり、Ｄ は好ましくはカルボニルまたはヘテロ原子部であり、このヘテロ原子は、酸素、
硫黄、窒素、ケイ素またはリンから選択される。そのため、適切なヘテロ原子部
には、−ＮＨおよび−ＮＲ、式中、Ｒは本明細書に定義のとおりである；置換硫
黄；スルホニル(−ＳＯ2−)スルホキシド(−ＳＯ−)；酸化ホスフィン(−ＰＯ−
および−ＲＰＯ−)；およびチオホスフィン(−ＰＳ−および−ＲＰＳ−)がある が、これらに限定されない。しかしながら、下記に概略説明するとおり、導電性
オリゴマーを金電極に結合させるような場合、硫黄誘導体は好ましくない。
【０２３０】 “芳香族基”またはその均等物とは、本書では、一般に５から１４の炭素原子
を含む芳香族単環式または多環式炭化水素部(より大きい多環式環構造を作るこ ともできるが)およびそれらの炭素環式ケトンまたはチオケトン誘導体で、その 遊離の原子価を持つ炭素原子が芳香族環の一員であるものを意味する。芳香族環
には、アリーレン基および２つ以上の原子を除いた芳香族基がある。本願の目的
には、芳香族は複素環を含む。“複素環”または“ヘテロアリール”とは、１か
ら５個の指定炭素原子を、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素およびケイ素から選
択されるヘテロ原子で置換した、そしてその遊離の原子価を持つ原子が芳香族環
の一員である芳香族基、およびそれらの複素環式ケトンおよびチオケトン誘導体
を意味する。従って、複素環には、チエニル、フリル、ピロリル、ピリミジニル
、オキサリル、インドリル、プリニル、キノリル、イソキノリル、チアゾリル、
イミドジル等がある。
【０２３１】 重要なのは、導電性オリゴマーのＹ芳香族基が異なっていてもよいこと、即ち
、導電性オリゴマーがヘテロオリゴマーであり得ることである。つまり、導電性
オリゴマーは、単一型のＹ基または複数型のＹ基のオリゴマーを含むことができ
る。
【０２３２】 芳香族基は、本書中で一般にＲで表す置換基で置換できる。Ｒ基は、必要に応
じて加え、導電性オリゴマーのパッキングに影響を及ぼすことができる、即ち、
Ｒ基を用いて単層におけるオリゴマーの会合を変化させることができる。Ｒ基を
加えて、１)オリゴマーまたはオリゴマーを含む組成物の溶解度を変える；２)シ
ステムの共役または電子化学電位を変える；および３)単層表面の電荷または特 性を変えることもできる。
【０２３３】 好ましい実施態様では、導電性オリゴマーが３つのサブユニットより大きいと
き、Ｒ基は、溶液合成を行う場合の溶解度を高めるのに好ましい。しかしながら
、Ｒ基およびその位置は、下記のように、表面上、特に単層内での導電性オリゴ
マーのパッキングへの影響を最小限にするよう選択される。一般に、単層内では
小さいＲ基のみが使用され、大きいＲ基は一般に単層表面上にある。そのため、
例えば、単層内の導電性オリゴマー部分にメチル基を付けて溶解度を高めるのが
好ましく、例えば、Ｃ３からＣ１０のより長いアルコキシ基を単層表面上に付け
るのが好ましい。一般に、本明細書に記載のシステムでは、このことは、一般に
、立体的に重要なＲ基は、単層を形成する分子の平均長さによるが、最初の２つ
または３つのオリゴマーサブユニットのいずれにも結合させないことを意味する
。
【０２３４】 適切なＲ基には、水素、アルキル、アルコール、芳香族、アミノ、アミド、ニ
トロ、エーテル、エステル、アルデヒド、スルホニル、ケイ素部、ハロゲン、硫
黄含有部、リン含有部、およびエチレングリコールがあるが、これらに限定され
ない。本明細書に示した構造では、Ｒは、その位置が置換されていない場合は水
素である。ある位置では、２つの置換基、ＲおよびＲ'が可能であり、その場合 、ＲおよびＲ'基は同一であるかまたは異なっているかのいずれかでよい。
【０２３５】 “アルキル基”またはその均等物とは、直鎖状または分枝状アルキル基を意味
し、直鎖アルキル基が好ましい。分枝状ならば、１箇所以上の、特記しなければ
任意の位置で枝分かれしている。このアルキル基は、約１から約３０の炭素原子
(Ｃ１−Ｃ３０)の範囲であり得、好ましい実施態様では、約１から約２０の炭素
原子(Ｃ１−Ｃ２０)を利用し、約Ｃ１から約Ｃ１２ないしＣ１５が好ましく、Ｃ
１ないしＣ５が特に好ましいが、ある実施態様では、アルキル基は、もっと大き
くてもよい。アルキル基の定義の中に含まれるものには、Ｃ５およびＣ６環など
のシクロアルキル基や、窒素、酸素、硫黄、またはリンを持つ複素環式環もある
。アルキルはまた、好ましくは硫黄、酸素、窒素およびケイ素のヘテロ原子を持
つヘテロアルキルも含む。アルキルは、置換アルキル基も含む。“置換アルキル
基”とは、更に上記定義の１以上の置換基部“Ｒ”を含むアルキル基を意味する
。
【０２３６】 “アミノ基”またはその均等物とは、−ＮＨ2、−ＮＨＲおよび−ＮＲ2基を意
味し、Ｒは本明細書に定義のとおりである。
【０２３７】 “ニトロ基”とは、−ＮＯ2基を意味する。
【０２３８】 “硫黄含有部”とは、硫黄原子を含有する化合物を意味し、チア−、チオ−お
よびスルホ−化合物、チオール(−ＳＨおよび−ＳＲ)、スルフィド(−ＲＳＲ−)
、スルホキシド(−Ｒ−ＳＯ−Ｒ−)、スルフォン(−Ｒ−ＳＯ2−Ｒ−)、ジスル フィド(−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−)およびスルフォニルエステル(−Ｒ−ＳＯ2−Ｏ−Ｒ
−)、があるが、これらに限定されない。“リン含有部”は、リンを含有する化 合物を意味し、ホスフィンおよびホスフェートがあるが、これらに限定されない
。“シリコン含有部”とは、シリコン含有化合物を意味する。
【０２３９】 “エーテル”とは、−Ｏ−Ｒ−基を意味する。好ましいエーテルはアルコキシ
基であり、−Ｏ−(ＣＨ2) 2ＣＨ3および−Ｏ−(ＣＨ2)4ＣＨ3が好ましい。
【０２４０】 “エステル”とは、−ＣＯＯＲ基を意味する。
【０２４１】 “ハロゲン”とは、臭素、ヨウ素、塩素またはフッ素を意味する。好ましい置
換アルキルは、部分的にまたは全体的にハロゲン化したアルキル、例えばＣＦ3 等である。
【０２４２】 “アルデヒド”とは、−ＲＣＯＨ基を意味する。
【０２４３】 “アルコール”とは、−ＯＨ基およびアルキルアルコール−ＲＯＨを意味する
。
【０２４４】 “アミド”とは、−ＲＣＯＮＨ−またはＲＣＯＮＲ−基を意味する。
【０２４５】 “エチレングリコール”または“(ポリ)エチレングリコール”とは、−(Ｏ− ＣＨ2−ＣＨ2)n−基を意味するが、エチレン基の各炭素原子は、一重にまたは二
重に置換されていてもよく、即ち、−(Ｏ−ＣＲ2−ＣＲ2)n−、但しＲは上記定 義のとおりである、であってよい。酸素の位置に他のヘテロ原子を持つエチレン
グリコール誘導体(即ち、−(Ｎ−ＣＨ2−ＣＨ2)n−または−(Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2) n −または置換基を持つ)も好ましい。
【０２４６】 好ましい置換基には、メチル、エチル、プロピル、−Ｏ−(ＣＨ2)2ＣＨ3およ び−Ｏ−(ＣＨ2)4ＣＨ3などのアルコキシ基およびエチレングリコールおよびそ れらの誘導体があるが、これらに限定されない。
【０２４７】 好ましい芳香族基には、フェニル、ナフチル、ナフタレン、アントラセン、フ
ェナントロリン、ピロール、ピリジン、チオフェン、ポルフィリンおよび縮合環
誘導体を含むこれらそれぞれの誘導体があるが、これらに限定されない。
【０２４８】 本明細書に示した導電性オリゴマーでは、gが１のとき、Ｂ−Ｄは２つの原子 または化学部分をつなげる結合である。好ましい実施態様では、Ｂ−Ｄは、重複
または共役π軌道を含有する共役結合である。
【０２４９】 好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン(−Ｃ≡Ｃ−、アルキンまたはエチンとも 呼ばれる)、アルケン(−ＣＨ＝ＣＨ−、エチレンとも呼ばれる)、置換アルケン(
−ＣＲ＝ＣＲ−、−ＣＨ＝ＣＲ−および−ＣＲ＝ＣＨ−)、アミド(−ＮＨ−ＣＯ
−および−ＮＲ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−および−ＣＯ−ＮＲ−)、アゾ(−
Ｎ＝Ｎ−)、エステルおよびチオエステル(−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、ＣＳ−
Ｏ−および−Ｏ−ＣＳ−)および他の共役結合(−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＲ＝Ｎ−、−
Ｎ＝ＣＨ−および−Ｎ＝ＣＲ−)、(−ＳiＨ＝ＳiＨ−、−ＳiＲ＝ＳiＨ−、−Ｓ
iＨ＝ＳiＲ−、およびＳiＲ＝ＳiＲ−)、(−ＳiＨ＝ＣＨ−、−ＳiＲ＝ＣＨ−、
−ＳiＨ＝ＣＲ−、−ＳiＲ＝ＣＲ−、−ＣＨ＝ＳiＨ−、−ＣＲ＝ＳiＨ−、−Ｃ
Ｈ＝ＳiＲ−および−ＣＲ＝ＳiＲ−)などから選択される。特に好ましいＢ−Ｄ 結合は、アセチレン、アルケン、アミドおよびこれら３種の置換誘導体およびア
ゾである。とりわけ好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン、アルケンおよびアミド
である。二重結合に結合させたオリゴマー成分は、トランスまたはシス配置、ま
たは混合型であってよい。そのため、ＢまたはＤのいずれかは、炭素、窒素また
はケイ素を含むことができる。置換基は、上記Ｒのところで定義したとおりであ
る。
【０２５０】 構造１３導電性オリゴマーのg＝０のとき、ｅは好ましくは１であり、Ｄ部分 は上記定義のカルボニルまたはヘテロ原子部分であり得る。
【０２５１】 上記Ｙ環のように、どの単一導電性オリゴマー内でも、Ｂ−Ｄ結合(またはg＝
０のときＤ部分)は、全て同じでもよく、または少なくとも１つが異なっていて もよい。例えば、ｍが０のとき、末端Ｂ−Ｄ結合は、アミド結合であることがで
き、残りのＢ−Ｄ結合はアセチレン結合であることができる。一般に、アミド結
合が存在するとき、アミド結合はできるだけ少ない方が好ましいが、ある実施態
様では、全てのＢ−Ｄ結合がアミド結合である。よって、上記Ｙ環のところで概
略説明したとおり、上記単層内ではある型のＢ−Ｄ結合が導電性オリゴマー中に
存在でき、単層レベル上では別の型のＢ−Ｄ結合があるので、核酸が導電性オリ
ゴマーを介して結合している場合、核酸ハイブリダイゼーションにより大きな柔
軟性を与えることができる。
【０２５２】 本明細書に示した構造中、ｎは１から５０の整数であるが、より長いオリゴマ
ーもまた使用できる(例えば、Schumm et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 19
94 33(13): 1360参照)。理論に縛られることなく、表面上で効率のよい核酸のハ
イブリダイゼーションのためには、ハイブリダイゼーションが表面から少し離れ
て起こるらしい、即ち、ハイブリダイゼーション速度は、特に２００から３００
塩基対の長いオリゴヌクレオチドの場合、表面からの距離の関数として上昇する
と思われる。従って、核酸が導電性オリゴマーを介して結合しているとき、以下
でより詳しく記すように、導電性オリゴマーの長さは、その核酸の最も近いヌク
レオチドが電極表面から約６Åから約１００Å(但し、５００Åまでの距離が使 用できる)に位置するような長さであり、約１５Åから約６０Åが好ましく、約 ２５Åから約６０Åも好ましい。従って、ｎは芳香族基のサイズ応じて変わるが
、一般に、約１から約２０であって、約２から約１５が好ましく、約３から約１
０が特に好ましい。
【０２５３】 本明細書に示した構造中、ｍは０または１のいずれかである。つまり、ｍが０
のとき、導電性オリゴマーの末端には、Ｂ−Ｄ結合またはＤ部分があり、即ち、
Ｄ原子が直接的かまたはリンカーを介するかのいずれかで核酸に結合している。
ある実施態様では、例えば、導電性オリゴマーを核酸のリボース−ホスフェート
主鎖のホスフェートに結合させるとき、導電性オリゴマーと核酸の間に結合させ
たリンカーなどの別の原子があってもよい。更に、下記に概略説明するとおり、
Ｄ原子は、アミノ修飾リボースの窒素原子であり得る。あるいは、ｍが１のとき
、導電性オリゴマーの末端にはＹ、芳香族基があり、即ち、その芳香族基は、核
酸またはリンカーに結合している。
【０２５４】 当業者には明らかなように、多数の導電性オリゴマーが利用できる。これらは
、例えば、縮合芳香族環または、−(ＣＦ2)n−、−(ＣＨＦ)n−および−(ＣＦＲ
)n−などのテフロン( 登録商標 )様オリゴマーを含む化合物などの当分野で知られ
ている他の導電性オリゴマーと同じく、構造１や構造８式の範囲内にある導電性
オリゴマーを含む。例えば、Schumm et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:
1361 (1994); Grosshenny et al., Platinum Metals Rev. 40 (1): 26-35 (199
6); Tour, Chem. Rev. 96: 537-553 (1996); Hsung et al., Organometallics 1
4: 4808-4815 (1995);およびここに引用されている文献参照、これらは全てはっ
きりと出典明示により本明細書に組込まれている。
【０２５５】 本実施態様の特に好ましい導電性オリゴマーは、下記である： 構造１４
【化１４】 構造１４は、gが１のときの構造１３である。構造１４の好ましい実施態様に は、ｅが０であり、Ｙがピロールまたは置換ピロールであるもの；ｅが０であり
、Ｙがチオフェンまたは置換チオフェンであるもの；ｅが０であり、Ｙがフラン
または置換フランであるもの；ｅが０であり、Ｙがフェニルまたは置換フェニル
であるもの；ｅが０であり、Ｙがピリジンまたは置換ピリジンであるもの；ｅが
１であり、Ｂ−Ｄがアセチレンであり、Ｙがフェニルまたは置換フェニルである
もの(例えば、下記構造１６参照)がある。構造１４の好ましい実施態様はまた、
下記構造１５に示した、ｅが１である場合のものである：
【０２５６】 構造１５
【化１５】 構造１５の好ましい実施態様は、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ
−Ｄがアゾであるもの；Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアセ
チレンであるもの；Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアルケン
であるもの；Ｙがピリジンまたは置換ピリジンであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであ
るもの；Ｙがチオフェンまたは置換チオフェンであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであ
るもの；Ｙがフランまたは置換フランであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；
Ｙがチオフェンまたはフラン(または置換チオフェンまたはフラン)であり、Ｂ−
Ｄがアルケンおよびアセチレン交互の結合であるものである。
【０２５７】 本明細書に示した構造の殆どが構造１５の導電性オリゴマーを利用している。
しかしながら、どの構造１５オリゴマーも、本明細書中の他の構造、即ち構造１
３または２０オリゴマー、または他の導電性オリゴマーで置換でき、かかる構造
１５の使用は、本発明の範囲を限定する意味を持たない。
【０２５８】 構造１５の特に好ましい実施態様は、下記の構造１６、１７、１８および１９
を含む： 構造１６
【化１６】 構造１６の特に好ましい実施態様には、ｎが２であり、ｍが１であり、Ｒが水
素であるもの；ｎが３であり、ｍが０であり、Ｒが水素であるもの、および溶解
度を高めるためのＲ基の使用がある。
【０２５９】 構造１７
【化１７】 構造１７のようにＢ−Ｄ結合がアミド結合であるとき、導電性オリゴマーは、
擬似ペプチドオリゴマーである。構造１７中のアミド結合は、カルボニルを左側
にして、即ち、ＣＯＮＨ−で示すが、逆、即ち−ＮＨＣＯ−も使用できる。構造
１７の特に好ましい実施態様には、ｎが２であり、ｍが１であり、Ｒが水素であ
るもの；ｎが３であり、ｍが０であり、Ｒが水素であるもの(この実施態様では 、末端窒素(Ｄ原子)はアミノ修飾リボースの窒素であり得る)、および溶解度を 高めるためのＲ基の使用がある。
【０２６０】 構造１８
【化１８】 構造１８の好ましい実施態様には、第１のｎが２であり、第２のｎが１であり
、ｍが０であり、全てのＲ基が水素であるもの、または溶解度を高めるためのＲ
基の使用がある。
【０２６１】 構造１９
【化１９】 構造１９の好ましい実施態様には、第１のｎが３であり、第２のｎが１−３で
あり、ｍが０または１のいずれかであるもの、および溶解度を高めるためのＲ基
の使用がある。
【０２６２】 好ましい実施態様では、導電性オリゴマーは、構造２０で示した構造を持つ： 構造２０
【化２０】 この実施態様では、Ｃは炭素原子であり、ｎは１から５０の整数であり、ｍは
０または１であり、Ｊは酸素、窒素、ケイ素、リン、硫黄、カルボニルまたはス
ルホキシドからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｇはアルカン、アルケ
ンまたはアセチレンから選択される結合であって、２つの炭素原子と一緒になっ
てＣ−Ｇ−Ｃ基がアルケン(−ＣＨ＝ＣＨ−)、置換アルケン(−ＣＲ＝ＣＲ−)ま
たはそれらの混合物(−ＣＨ＝ＣＲまたは−ＣＲ＝ＣＨ−)、アセチレン(−Ｃ≡ Ｃ−)またはアルカン(−ＣＲ2−ＣＲ2−、Ｒは水素または本明細書に記載の置換
基のいずれかである)であるようにする。各サブユニットのＧ結合は、他のサブ ユニットのＧ結合と同一かまたは異なっていてもよく、つまり、アルケンとアセ
チレン結合が交互にあるオリゴマーが使用できる。しかしながら、Ｇがアルカン
結合であるとき、オリゴマー中のアルカン結合数は最小に維持すべきであり、導
電性オリゴマー当りシグマ結合約６以下が好ましい。アルケン結合が好ましく、
本明細書に総括的に示しているが、アルカンおよびアセチレン結合は、当業者に
は明らかなように、本明細書に記載したどの構造または実施態様でも置換できる
。
【０２６３】 ある実施態様では、例えば、ＥＴＭが存在しないとき、ｍ＝０ならば少なくと
も１つのＧ結合はアルカン結合である。
【０２６４】 好ましい実施態様では、構造２０のｍは０である。特に好ましい実施態様では
、構造２１に示したように、ｍは０であり、Ｇはアルケン結合である： 構造２１
【化２１】 構造２１のアルケンオリゴマーおよび本明細書に示した別のものは、一般に、
好ましいトランス配置で示しているが、シスまたはトランスとシスの混合したオ
リゴマーも使用できる。上記のように、Ｒ基を加えて、電極上での組成物のパッ
キング、オリゴマーの親水性または疎水性、およびオリゴマーの柔軟性、即ち、
回転、ねじれ、または縦の柔軟性を変えることができる。ｎは上記定義のとおり
である。
【０２６５】 好ましい実施態様では、Ｒは水素であるが、Ｒはアルキル基およびポリエチレ
ングリコールまたは誘導体であってもよい。
【０２６６】 別の実施態様では、導電性オリゴマーは、異なる型のオリゴマー、例えば、構
造１３や２０の混合物であってもよい。
【０２６７】 加えて、特に機構２のシステムで使用するために、この単層は導電性オリゴマ
ーを含んでおり、少なくとも単層中の導電性オリゴマーのいくつかの末端は電子
的にさらされている。本明細書中の“電子的にさらされた”とは、末端に近接し
てＥＴＭを置くとき、および適切なシグナル開始後に、ＥＴＭの存在に依存した
シグナルが検出され得ることを意味する。導電性オリゴマーは末端基を有してい
ても有していなくてもよい。従って、好ましい実施態様では、余分な末端基がな
く、導電性オリゴマーはその末端が、例えばアセチレン結合などのＢ−Ｄ結合の
ような基の1つで終る構造を示す。あるいは、好ましい実施態様では、本明細書 中でしばしば“Ｑ”として示す末端基を加える。末端基はいくつかの理由により
、例えば、ＥＴＭの検出用の導電性オリゴマーの電子的利用可能性を改善するた
めに、またはＳＡＭの表面を例えば非特異的結合を防ぐなどの他の事由によって
変えるために、使用することができる。例えば、標的アナライトが核酸である場
合、それらは核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである場合、ハイブリダイゼーションを
促進するために、核酸を表面の下に引くのに反発するか、妨げるように、陰性荷
電表面を形成するように、末端で陰性に荷電した基であり得る。好ましい不動態
化剤末端基は、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ3等のアルキル基、および
、(ポリ)エチレングリコールのような(ポリ)アルキルオキサイドを含み、−ＯＣ
Ｈ2ＣＨ2ＯＨ、−(ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ)2Ｈ、−(ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ)3Ｈ、および−(Ｏ ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4Ｈが好ましい。
【０２６８】 一実施態様において、異なるタイプの末端基を有する導電性オリゴマーの混合
物を使用することが可能である。従って、例えば、いくつかの末端基は検出を容
易にし、いくつかは非特異的結合を防止し得る。
【０２６９】 単層は異なる導電性オリゴマー種を含み得るが、適度に同一なＳＡＭが形成さ
れ得るように、異なる種を選択するのが好ましいことが、理解されるであろう。
従って、例えば、核酸などの捕捉結合配位子を導電性オリゴマーを用いて電極に
共有結合させるとき、１つのタイプの導電性オリゴマーを使用して核酸を結合さ
せ、別のタイプの機能によりＥＴＭを検出することは可能である。同様に、異な
る長さの導電性オリゴマーの混合物を単層に有して、非特異的シグナルの減少を
促進するのが望ましい。従って、例えば、好ましい実施態様は、単層の残部の表
面下、つまり使用されているなら、絶縁層の下で、または他の導電性オリゴマー
の特定のフラクション下で終わる導電性オリゴマーを利用する。同様に、異なる
導電性オリゴマーを使用して、単層の形成を容易にしたり、別の特性を持つ単層
をつくることもできる。
【０２７０】 好ましい実施態様において、単層はさらに絶縁部を含み得る。本明細書におけ
る“絶縁体”とは、実質的に非導電性オリゴマーを意味し、好ましくは線状であ
る。本明細書において、“実質的に非導電性”とは、絶縁体が１００Ｈｚで電子
を伝達しないことを意味する。絶縁体を介した電子伝達の比率は、好ましくは本
明細書に記載の導電性オリゴマーを介した比率よりも遅い。
【０２７１】 好ましい実施態様において、絶縁体は、約１０−７Ω−１cm−１以下の導電率
Ｓを有し、約１０−８Ω−１cm−１より低いのが好ましい。一般にGardner et a
l.前掲を参照。
【０２７２】 通常、絶縁体はシグマ結合を有する、アルキルまたはヘテロアルキルオリゴマ
ーまたは部分であるが、いずれの具体的な絶縁体分子も芳香族基または１以上の
共役結合を含み得る。本明細書において“ヘテロアルキル”とは、少なくとも１
つのヘテロ原子、つまり鎖に含まれた窒素、酸素、硫黄、リン、シリコンまたは
ホウ素を有するアルキル基を意味する。あるいは、絶縁体は、好ましくは電子伝
達を実質的に阻害するかまたは遅らせる１以上のヘテロ原子または結合を添加し
た導電性オリゴマーと非常に類似であり得る。
【０２７３】 適切な絶縁体は当業者に既知であり、−(ＣＨ２)ｎ−、−(ＣＲＨ)ｎ−および
−(ＣＲ２)ｎ−、エチレングリコールまたは酸素の代わりの他のヘテロ原子、つ
まり窒素または硫黄(電極が金のとき、硫黄誘導体は好ましくない)を用いる誘導
体を含むが、これらに限定しない。
【０２７４】 導電性オリゴマーについて、絶縁体は本明細書に定義のＲ基で置換され得、電
極でのその部分または導電性オリゴマーのパッキング、絶縁体の親水性または疎
水性、および絶縁体の柔軟性、すなわち回転の、捩れのまたは縦の柔軟性を変え
る。例えば、分枝アルキル基を使用し得る。同様に、上記概説のように絶縁体は
特に単層の表面に作用する末端基を含み得る。
【０２７５】 単層をつくる種の長さは必要に応じて変化する。上記に概説のように、標的分
析物の結合(例えば、核酸のハイブリダイゼーション)は、表面から離れてより有
効であるように見える。捕捉結合配位子が結合する種(下記に概説のように、こ れらは絶縁体または導電性オリゴマーのいずれかであり得る)は、基本的に単層 を形成する種と同じ長さかそれらより長く、捕捉結合配位子がハイブリダイゼー
ションのための溶媒により接近可能となる。いくつかの実施態様において、捕捉
結合配位子が結合する導電性オリゴマーは単層より短い。
【０２７６】 当業者には明らかなように、単層をつくる異なる種の、実際の組合せと比率は
、広範に変化し得、メカニズム−１または−２のどちらが使用されるかに依存す
る。一般に、３つの成分システムがメカニズム−２のシステムに好ましく、第１
の種は、種を含有する捕捉結合配位子(標的分析物が核酸であるとき、捕捉プロ ーブと称する)を含み、絶縁体または導電性オリゴマーのいずれかを介して電極 に結合している。第２の種は導電性オリゴマーであり、第３の種は絶縁体である
。この実施態様において、第１の種は約９０％から約１％を含み得、約２０％か
ら約４０％が好ましい。標的分析物が核酸のとき、約３０％から約４０％が短い
オリゴヌクレオチド標的に特に好ましく、約１０％から約２０％が長い標的に好
ましい。第２の種は約１％から約９０％を含み得、約２０％から約９０％が好ま
しく、約４０％から約６０％が特に好ましい。第３の種は約１％から約９０％を
含み得、約２０％から約４０％が好ましく、約１５％から約３０％が特に好まし
い。第１：第２：第３の種の好ましい比率は、短い標的については２：２：１、
長い標的については１：３：１であり、全チオール濃度(下記に充分に概説する ように、これらの種を結合させるのに使用するとき)は、５００μMから１mMの範
囲および８３３μMが好ましい。
【０２７７】 あるいは、２つの成分システムが使用され得る。一実施態様において、メカニ
ズム−１またはメカニズム−２のシステムで使用する、２つの成分は第１および
第２の種である。この実施態様において、第１の種は約１％から約９０％を含み
得、約１０％から約４０％が好ましく、約１０％から約４０％が特に好ましい。
第２の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約６０％が好ましく、約
２０％から約４０％が特に好ましい。あるいは、メカニズム−１のシステムのた
めの２つの成分は、第１および第３の種である。この実施態様において、第１の
種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約４０％が好ましく、約１０％
から約４０％が特に好ましい。第２の種は約１％から約９０％を含み得、約１０
％から約６０％が好ましく、約２０％から約４０％が特に好ましい。
【０２７８】 導電性オリゴマーと絶縁体の電極への共有結合は、様々な方法で達成され、使
用する電極および絶縁体と導電性オリゴマーの組成物に依存する。結合リンカー
(絶縁体と導電性オリゴマーを含み得る)は、核酸の種(捕捉および検出プローブ)
を電極に共有結合するのに使用するが、同様の方法で結合する。例えば、結合リ
ンカーの一方の端または末端がヌクレオシドまたは核酸に結合し、もう一方が電
極に結合する。いくつかの実施態様において、結合リンカーが末端以外の位置で
結合するか、またはさらに、分枝結合リンカーが一方の末端で電極に結合し、他
の末端で２つ以上のヌクレオシドに結合するのが望ましいが、これは好ましくな
い。同様に、一般に構造２３−２５に記載されるように、結合リンカーは２つの
部位で電極に結合し得る。一般に構造２２でＡとして下記に示すように、あるタ
イプのリンカーが使用される。構造２２において、“Ｘ”は導電性オリゴマー、
“Ｉ”は絶縁体であり、斜線の表面は電極である：
【０２７９】
【化２２】
【０２８０】 本実施態様において、Ａはリンカーまたは原子である。“Ａ”の選択は、電極
の特徴に一部依存する。従って、例えば、Ａは、金電極を使用する場合、硫黄部
である。あるいは、酸化金属電極を使用するとき、Ａはオキサイドの酸素に結合
したシリコン(シラン)部である(例えば、Chen et al., Langmuir 10: 3332-3337
(1994); Lenhard et al., J. Electroanal. Chem. 78: 195-201 (1977)参照、 両方とも出典明示により本明細書の一部とする)。炭素ベースの電極を使用する とき、Ａはアミノ部である(好ましくは、１級アミン；例えば、Deinhammer et a
l., Langmuir 10: 1306-1313 (1994)参照)。従って、好ましいＡ部は、シラン部
、硫黄部(アルキル硫黄部を含む)およびアミノ部を含むが、これらに限定されな
い。好ましい実施態様において、当分野で既知のようなレドックスポリマーとの
エポキシドタイプ結合は使用しない。
【０２８１】 本明細書には一つの部分としてしか記載していないが、絶縁体および導電性オ
リゴマーは、１個以上の“Ａ”部で電極と結合し得る；“Ａ”部は同一または異
なり得る。従って、例えば、電極が金電極であり、“Ａ”が硫黄原子または部分
であるとき、一般に下記構造２３、２４および２５に記載のように、複数の硫黄
原子が、電極に導電性オリゴマーを結合させるのに使用し得る。当業者に認めら
れるように、このような他の構造が製造できる。構造２３、２４および２５にお
いて、Ａ部は硫黄原子だけであるが、置換硫黄部も使用し得る。
【０２８２】
【化２３】
【０２８３】
【化２４】
【０２８４】
【化２５】
【０２８５】 構造２５と同様に、３つの硫黄部が電極に結合している一つの炭素原子で終了
する導電性オリゴマーを有することが可能であることも留意すべきである。さら
に本明細書に必ずしも記載されていないが、導電性オリゴマーと絶縁体はまた“
Ｑ”末端基を含み得る。
【０２８６】 好ましい実施態様において、電極は金電極であり、結合は当分野で既知のよう
に硫黄結合を介しており、すなわち、Ａ部は硫黄原子または部分である。金−硫
黄結合の正確な特徴は知られていないが、この結合は本発明の目的で、共有結合
と考える。代表的な構造は構造１５の導電性オリゴマーを用いて構造２５に記載
するが、本明細書に記載のすべての構造について、いずれの導電性オリゴマーま
たは導電性オリゴマーの組合せも使用し得る。同様にいずれの導電性オリゴマー
または絶縁体も本明細書に記載の末端基を含み得る。構造２６は、“Ａ”リンカ
ーが硫黄原子のみを含むように記載しているが、他の原子も存在し得る(すなわ ち、硫黄から導電性オリゴマーへのまたは置換基へのリンカー)。さらに、構造 ２６はＹ芳香族基に結合した硫黄原子を示すが、当業者には明らかなように、Ｂ
−Ｄ基（つまり、アセチレン）にも同様に結合し得る。
【０２８７】
【化２６】
【０２８８】 一般に、２セットの電極を使用するとき、または１セットの電極を使用し(す なわち、ＳＡＭを含む検出電極を高い電気泳動電圧(すなわち、８００または９ ００mV以上)で使用せず、チオール結合の酸化およびＳＡＭの損失を生じ得る)、
下記に一般に示すような、低い電気泳動電圧を使用するとき、チオール結合が好
ましい。
【０２８９】 好ましい実施態様において、電極は炭素電極、すなわち、ガラス状炭素電極で
あり、結合はアミン基の窒素原子を介している。代表的な構造を構造２７に示す
。また別の原子が存在し得、すなわち、ＺタイプリンカーおよびＸまたは末端基
であり得る。
【０２９０】
【化２７】
【０２９１】
【化２８】
【０２９２】 構造２８において、酸素原子は酸化金属電極のオキサイド由来である。Ｓｉ原
子は他の原子を含み得る、すなわち、置換基を含むシリコン部であり得る。ＳＡ
Ｍについて他の電極への他の結合は、当業者に既知である。参照、例えば、Napi
er et al., Langmuir, 1997。酸化インジウムスズ電極への結合に関して、およ びまた酸化インジウムスズ電極へのリン酸塩の化学吸着に関して(H. Holden Tho
rpe, CHI conference, May 4-5, 1998による講演)。
【０２９３】 好ましい実施態様において、電極はアッセイ錯体を電極に固定させる捕捉プロ
ーブ(メカニズム−１またはメカニズム−２のシステムのいずれかで使用される)
または、検出プローブ(メカニズム−１のシステムの)を含む。捕捉プローブは検
出に使用されないので、捕捉プローブは結合リンカーを用いて結合し得、下記の
ような、導電性オリゴマーまたは絶縁体のいずれかを含み得る。メカニズム−１
のシステムで使用される検出プローブは、導電性オリゴマーを用いて結合する。
【０２９４】 捕捉プローブ核酸は、“結合リンカー”を介して電極に共有結合し、該結合リ
ンカーは、導電性オリゴマー(メカニズム１−のシステムに必要な)または絶縁体
のいずれかであり得る。本明細書において“共有結合”とは、２つの部分が、シ
グマ結合、ｐｉ結合および配位結合を含む少なくとも１つの結合によって結合す
ることを意味する。
【０２９５】 従って、結合リンカーの一方の端は核酸に結合し(または他の結合配位子)、も
う一方の端(当業者には明らかであるが、いずれかに的確な末端である必要なな い)は電極に結合する。従って、本明細書に記載のいずれの構造もさらに、末端 基として核酸を有効に含み得る。従って、本発明は、一般的に下記の構造２９に
記載されるように電極に共有結合する核酸を含む組成物を提供する。
【０２９６】
【化２９】
【０２９７】 構造２９において、左側の斜線記号は、電極を表す。本明細書に定義するよう
に、Ｘは導電性オリゴマーであり、Ｉは絶縁体である。Ｆ１は、電極および導電
性オリゴマーまたは絶縁体の共有結合をもたらす結合であり、本明細書に記載さ
れ、例えば下記に“Ａ”と定義されるように、結合、原子またはリンカーを含む
。Ｆ２は核酸に導電性オリゴマーまたは絶縁体を共有結合させる結合であり、本
明細書に記載のように結合、原子または結合であり得る。Ｆ２は導電性オリゴマ
ーの一部、絶縁体の一部、核酸の一部であり得、または例えば本明細書で“Ｚ”
について定義するように両方に外因性であり得る。
【０２９８】 好ましい実施態様において、捕捉プローブ核酸は、導電性オリゴマーを介して
電極に共有結合する。核酸と導電性オリゴマーの共有結合は、いくつかの方法で
達成し得る。好ましい実施態様において、結合は、ヌクレオシドの塩基への結合
を介して、核酸の主鎖backboneへの結合(リボース、ホスフェートまたは核酸類 似体主鎖の類似基のいずれかへ)を介して、または下記に示すように遷移金属配 位子を介する。下記に概説される技術は、一般に天然に存在する核酸について記
載しているが、当業者には明らかなように、同様の技術が核酸類似体を用いて、
およびいくつかの場合では他の結合配位子を用いて使用される。
【０２９９】 好ましい実施態様において、導電性オリゴマーを核酸のヌクレオシドの塩基に
結合させる。これは、下記のように、オリゴマーによっていくつかの方法で行わ
れる。一実施態様において、オリゴマーを末端ヌクレオシド、つまり核酸の３’
または５’ヌクレオシドのいずれかに結合させる。あるいは、導電性オリゴマー
を内部ヌクレオシドに結合させる。
【０３００】 塩基への結合点は、塩基によって変わる。通常、どの位置にも結合可能である
。いくつかの実施態様において、例えば、ＥＴＭを含有するプローブをハイブリ
ダイゼーション(つまり、メカニズム−１のシステム)に使用するとき、相補性塩
基との水素結合に関与しない位置に結合させるのが好ましい。そのため、例えば
、一般に、ウリジン、シトシンおよびチミンなどのピリミジンの５または６位に
結合させる。アデニンやグアニンなどのプリンの場合、好ましくは８位で連結さ
せる。非標準塩基には、それに相当な位置で結合させるのが好ましい。
【０３０１】 一実施態様では、直接結合であり、即ち、導電性オリゴマーと塩基との間にな
んの原子も挟まない。この実施態様では、例えば、末端アセチレン結合を有する
導電性オリゴマーを塩基に直接結合させる。構造３０はこの結合の例であり、構
造１５の導電性オリゴマーと塩基としてウリジンを用いているが、当業者ならば
明らかなように、他の塩基および導電性オリゴマーも使用できる：
【０３０２】
【化３０】
【０３０３】 本明細書に示したペントース構造には、水素、ヒドロキシ、ホスフェートまた
はアミノ基などの他の基が結合していることに留意すべきである。更に、本明細
書に示したこのペントースおよびヌクレオシド構造は、通常表現の鏡像として非
慣用的に示す。更に、ペントースおよびヌクレオシド構造はまた、任意の位置に
、例えば、合成中に必要に応じて、保護基などの新たな基を含有できる。 ｐ79
【０３０４】 加えて、塩基は、必要に応じて、更なる修飾を含むこともあり、即ち、カルボ
ニルまたはアミン基を変更したり、保護することもできる。
【０３０５】 別の実施態様では、結合は、一般に、塩基としてウリジンおよび構造１５のオ
リゴマーを用いる構造３１に示したように、アミドおよびアミン結合を含む、多
くの異なるＺ−リンカーを介する：
【０３０６】
【化３１】
【０３０７】 この実施態様では、Ｚはリンカーである。好ましくは、Ｚは約１から約１０原
子の短いリンカーであり、１から５原子が好ましく、アルケン、アルキニル、ア
ミン、アミド、アゾ、イミンなどの結合を含有してもよく、含有しなくてもよい
。リンカーは当分野では知られており、例えば、よく知られているとおり、ホモ
またはヘテロ二官能性リンカーである(1994 Pierce Chemical Company catalog,
technical section on cross-linker, pages 155-200参照、出典明示により本 明細書の一部とする)。好ましいＺリンカーには、アルキル基（置換アルキル基 およびヘテロ原子部分を含有するアルキル基を含む）があるが、これらに限定さ
れず、好ましいのは、短いアルキル基、エステル、アミド、アミン、エポキシ基
およびエチレングリコールおよび誘導体であり、特に好ましいのは、プロピル、
アセチレンおよびＣ２アルケンである。Ｚはまた、スルホン基であってもよく、
下記のようにスルホンアミド結合を形成する。
【０３０８】 好ましい実施態様では、核酸と導電性オリゴマーの結合は、核酸主鎖への結合
を介して行う。これは、リボース−ホスフェート主鎖のリボースへの結合または
主鎖のホスフェートへの結合、または類似主鎖の他の基への結合を含む多くの方
法で実施できる。
【０３０９】 予備事項として、下記に十分説明するように、本実施態様における結合部位は
、３'または５'末端ヌクレオチド、または内部ヌクレオチドであると理解される
べきである。
【０３１０】 好ましい実施態様では、導電性オリゴマーをリボース−ホスフェート主鎖のリ
ボースへ結合させる。これは、幾つかの方法で実施できる。当分野では知られて
いるように、リボースの２'または３'位のいずれかにアミノ基、硫黄基、ケイ素
基、リン基またはオキソ基で修飾したヌクレオシドを作成できる(Imazawa et al
., J. Org. Chem., 44: 2039 (1979); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42 (4): 7
14 (1977); Verheyden et al., J. Org. Chem. 36 (2): 250 (1971); McGee et
al., J. Org. Chem. 61: 781-785 (199); Mikhailopulo et al., Liebigs. Ann.
Chem. 513-519 (1993); McGee et al., Nucleosides & Nucleotides 14 (6): 1
329 (1995)、全て出典明示により本明細書の一部とする)。次いで、導電性オリ ゴマーを加えるためにこれらの修飾ヌクレオシドを用いる。
【０３１１】 好ましい実施態様は、アミノ修飾ヌクレオシドを利用する。このとき、これら
のアミノ修飾リボースを用いて、導電性オリゴマーに対してアミドまたはアミン
結合を形成できる。好ましい実施態様では、アミノ基を直接リボースに結合させ
るが、当業者には明らかであるように、“Ｚ”について記載したような短いリン
カーをアミノ基とリボースとの間に与えることができる。
【０３１２】 好ましい実施態様では、リボースに結合させるためにアミド結合を使用する。
好ましくは、構造１３〜１５の導電性オリゴマーを用いるならば、ｍが０である
ので、導電性オリゴマーの末端はアミド結合である。この実施態様では、アミノ
修飾リボースのアミノ基の窒素は、導電性オリゴマーの“Ｄ”原子である。よっ
て、本実施態様の好ましい結合を、構造３２に示す(構造１３の導電性オリゴマ ーを用いる)。
【０３１３】
【化３２】
【０３１４】 当業者には明らかなように、構造３２は、アミド結合として固定された末端結
合を有する。
【０３１５】 好ましい実施態様では、ヘテロ原子結合、即ち、オキソ、アミン、硫黄等を用
いる。好ましい実施態様はアミン結合を利用する。また、アミド結合について上
記で概説したとおり、アミン結合の場合も構造３の導電性オリゴマーを用いると
、アミノ修飾リボースの窒素が導電性オリゴマーの“Ｄ”原子であり得る。よっ
て、例えば、構造３３および３４は、それぞれ構造１３および２１の導電性オリ
ゴマーを持つヌクレオシドを示し、ヘテロ原子として窒素を用いているが、他の
ヘテロ原子を使用することもできる：
【０３１６】
【化３３】
【０３１７】 構造３３では、好ましくは、ｍもｔも０ではない。ここで好ましいＺはメチレ
ン基またはその他の脂肪族アルキルリンカーである。この位置にある１、２また
は３つの炭素は特に合成の際に有用である。
【０３１８】
【化３４】
【０３１９】 構造３４では、Ｚは上記定義のとおりである。適切なリンカーには、メチレン
およびエチレンがある。
【０３２０】 別の実施態様では、導電性オリゴマーを、核酸のリボース−ホスフェート主鎖
(または類似体)のホスフェートを介して核酸に共有結合させる。この実施態様で
は、結合は直接的か、またはリンカーまたはアミド結合を利用する。構造３５は
、直接結合を示しており、構造３６は、アミド結合を介した結合を示している( 両方とも、構造１３の導電性オリゴマーを利用しているが、構造２０の導電性オ
リゴマーも可能である)。構造３５および３６は、３'位の導電性オリゴマーを示
しているが、５'位も可能である。更に、構造３５および３６とも、天然のホス ホジエステル結合を示しているが、当業者には明らかなように、ホスホジエステ
ル結合の非標準類似体も使用できる。
【０３２１】
【化３５】
【０３２２】 構造３５中、末端にＹが存在する(即ちｍ＝１)場合、Ｚは存在しない(即ち、 ｔ＝０)のが好ましい。末端にＹが存在しない場合、Ｚは存在するのが好ましい 。
【０３２３】 構造３６は、末端Ｂ−Ｄ結合がアミド結合であり、末端にＹが存在せず、Ｚが
上記定義のリンカーである好ましい実施態様を示す。
【０３２４】
【化３６】
【０３２５】 好ましい実施態様では、導電性オリゴマーは、遷移金属配位子を介して核酸に
共有結合する。本実施態様では、導電性オリゴマーを遷移金属に１以上の配位原
子を提供する配位子に共有結合させる。一実施態様では、下記構造３７に総括的
に示したように、導電性オリゴマーが結合する配位子には、核酸も結合している
。あるいは、下記構造３８に総括的に示したように、導電性オリゴマーは１つの
配位子に結合しており、核酸は別の配位子に結合している。よって、遷移金属の
存在下で導電性オリゴマーは核酸に共有結合する。これらの構造はいずれも構造
１３の導電性オリゴマーを示しているが、その他のオリゴマーを利用する こともできる。構造３７および３８は、２つの代表的な構造を示す：
【０３２６】
【化３７】
【０３２７】
【化３８】
【０３２８】 核酸を結びつけるために金属イオンを用いると、システムの内部制御または測
定として機能し、表面上の利用可能な核酸の数を測定できる。しかしながら、当
業者には明らかなように、金属イオンを用いて核酸を導電性オリゴマーに結びつ
ける場合、下記のように、システムの残部で使用されるＥＴＭのレドックス電位
とは異なるレドックス電位を、この金属イオン錯体が有しているのが、通常望ま
しい。これは、標的配列の存在から捕捉プローブの存在を区別し得るために一般
に決まっている。これは同定、測定および／または定量化に有用である。従って
、電極での捕捉プローブの量をハイブリダイズされた二本鎖の核酸の量と比較し
て、サンプル中の標的配列の量を定量化することができる。これはセンサーまた
はシステムの内部制御として機能するのに非常に重要である。これにより、標的
を添加する前または後のいずれにおいても、同様のしかし異なる制御システムに
頼るよりも、検出に用いられる同じ分子について測定が可能となる。従って、検
出に使用される実際の分子はいかなる実験の前にも定量化し得る。これは以前の
方法より重要な利点である。
【０３２９】 好ましい実施態様において、捕捉プローブ核酸を絶縁体を介して電極に共有結
合させる。アルキル基などの絶縁体への核酸の結合はよく知られており、これら
の部分を含有する主鎖のリボースまたはホスフェートを含む塩基または主鎖、ま
たは核酸類似体の別の主鎖に結合する。
【０３３０】 好ましい実施態様において、表面に１以上の異なる捕捉プローブの種があり得
る。いくつかの実施態様において、下記に充分に記載するように、一つのタイプ
の捕捉プローブ、または一つのタイプの捕捉プローブエクステンダ（extender）
があり得る。あるいは、異なる捕捉プローブまたは多数の異なる捕捉エクステン
ダプローブを有する一つの捕捉プローブを使用できる。同様に、比較的短いプロ
ーブ配列を含み、例えば、補充リンカーなどのシステムの成分を“結び付ける（
tack down）”のに使用できる、補助的捕捉プローブを使用して、表面のＥＴＭ
濃度を上げるのが望ましい(特にメカニズム−２のシステムにおける核酸分析物 および結合配位子の場合において)。
【０３３１】 従って、本発明は単層および捕捉および／または検出プローブを含む少なくと
も１つの検出電極を含み、標的分析物検出システムに有用な基質を提供する。
【０３３２】 本発明の組成物は、一般に、下記に概説のように、一般に当分野で既知の方法
を使用して合成する。当業者に認められるように、下記に概説の多くの方法は、
リボース−ホスフェート主鎖を含む核酸に関する。しかしながら、上記に概説の
ように、多くの別の核酸類似体を使用し得、そのいくつかは主鎖にリボースまた
はホスフェートを含まない。これらの実施態様において、塩基以外の位置での結
合に関して、結合は、主鎖に依存して、当業者に認められるように行う。従って
、例えば、結合はＰＮＡ主鎖の炭素原子で、下記に記載のように、またはＰＮＡ
のいずれかの末端で行うことができる。
【０３３３】 本組成物はいくつかの方法で製造し得る。好ましい方法は最初にヌクレオシド
に結合した導電性オリゴマーを、更にヌクレオシドを添加して捕捉プローブを形
成し、続いて電極へ結合させて、合成する。あるいは、全捕捉プローブを製造し
、次いで、完全な導電性オリゴマーを添加し、続いて電極に結合する。あるいは
、導電性オリゴマーの単層(そのいくつかは、捕捉プローブの結合のための官能 基を有する)を最初に電極に結合し、続いて捕捉プローブを結合する。後者の二 つの方法は、使用する導電性オリゴマーが、溶媒中でおよび慣用的核酸合成の条
件下で安定でないとき、好ましいことがある。
【０３３４】 好ましい実施態様において、本発明の組成物は、最初に、ヌクレオシドに共有
結合した導電性オリゴマーを形成し、続いて、さらにヌクレオシドを添加して捕
捉プローブ核酸を形成し、導電性オリゴマーを電極へ添加することを含む最後の
工程により製造される。
【０３３５】 導電性オリゴマーのヌクレオシドへの結合はいくつかの方法で行い得る。好ま
しい実施態様において、全てまたは一部の導電性オリゴマーを、最初に合成し( 一般に、電極への結合のために官能基を末端に有する)、これを次いでヌクレオ シドに結合させる。次いで、さらにヌクレオシドを必要に応じて添加し、最後の
工程で一般に電極へ結合させる。あるいは、オリゴマー単位を一度にヌクレオシ
ドに添加し、さらにヌクレオシドを添加し電極へ結合させる。多くの代表的な合
成をＷＯ９８／２０１６２の図面に示し、出典明示により本明細書の一部とする
。
【０３３６】 次いで、導電性オリゴマーを、本明細書に記載のように結合した、１個(また はそれ以上の)オリゴマー単位を含み得るヌクレオシドに結合させる。
【０３３７】 好ましい実施態様において、結合はリボース−ホスフェート主鎖のリボースに
である。従って、アミドおよびアミン結合を介した結合は可能である（参照、Ｗ
Ｏ９８／２０１６２の図１および２）。好ましい実施態様において、リボースに
結合した窒素と導電性オリゴマーの芳香族環の間に、少なくとも一つのメチレン
基または他の短い脂肪族アルキル基(Ｚ基として)が存在する。代表的な合成をＷ
Ｏ９８／２０１６２の図１６に示す。
【０３３８】 あるいは、結合はリボース−ホスフェート主鎖のホスフェートを介している。
二つの合成の図式の例をＷＯ９８／２０１６２の図４および図５に示す。両方の
図はリボースの３'位での結合を示すが、結合はまた２'位を介してもなし得る。
図５において、Ｚはエチレンリンカーであるが、同業者に認められるように、他
のリンカーも同様に使用し得る。
【０３３９】 好ましい実施態様において、結合は塩基を介している。一般的な図式を、ヌク
レオシドとしてウリジンを、そしてフェニレン−アセチレン導電性オリゴマーを
使用してＷＯ９８／２０１６２の図３に記載する。同業者に認められるように、
アミド結合も、当分野で既知の方法を使用して、可能である。好ましい実施態様
において、保護基を、ＷＯ９８／２０１６２の図１０および１１に一般的に概説
のように、導電性オリゴマーの付加の前に塩基に添加してもよい。加えて、パラ
ジウム交差結合反応を変えて、二量体化問題を防止することもできる；すなわち
、二つの導電性オリゴマーが、塩基に結合せず、むしろ二量体化する。
【０３４０】 あるいは、塩基への結合を、一単位のオリゴマーを有するヌクレオシドを製造
し、続いて他を添加することによりなし得る。
【０３４１】 修飾ヌクレオシドを製造し、保護して活性化したら、電極への結合の前に、標
準合成法(Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Pres
s, Oxford, UK 1984; Eckstein)により、成長しているオリゴヌクレオチドに、 幾通りかの方法でそれらを包含させ得る。
【０３４２】 一実施態様において、１またはそれ以上の修飾ヌクレオシドを三ホスフェート
形態に変形させ、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に、酵素ＤＮＡポリメラー
ゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Taq ＤＮＡポリメ ラーゼ、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを用いるなど、標準分子生物学手
法を用いて包含させる。３'修飾ヌクレオシドの核酸への包含には、末端デオキ シヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用し得る。(Ratliff, Terminal deoxy
nucleotidyltransferase.In The Enzymes, Vol. 14A. P. D. Boyer ed. pp 105-
118. Academic Press, San Diego, CA 1981)。従って、本発明は、共有結合した
ＥＴＭを含むデオキシリボヌクレオシド三ホスフェートを提供する。好ましい実
施態様は、一般に下記構造４０および４１に示すように、リボース（好ましくは
２'位で）などの塩基または主鎖へのＥＴＭ結合を利用する。
【０３４３】
【化３９】
【０３４４】
【化４０】
【０３４５】 従って、いくつかの実施態様において、でＥＴＭを含む核酸をその場で産生さ
せることができる。例えば、標的配列の末端をさらす、すなわち非ハイブリダイ
ズするように、標的配列は捕捉プローブ(例えば、表面上の)にハイブリダイズし
得る。酵素とＥＴＭで標識した三ホスフェートヌクレオチドの添加により、その
場での標識の製造が可能となる。同様にポリメラーゼにより認識される標識ヌク
レオチドを用いると、増幅と検出が同時に行い得る；つまりその場で標的配列が
生成する。
【０３４６】 好ましい実施態様において、修飾ヌクレオシドをホスホルアミデイトまたはＨ
−ホスホネート形に変換し、これを次いでオリゴヌクレオチド合成の固相または
溶液合成に使用する。この方法で、リボースでの(すなわち、アミノ−またはチ オール−修飾ヌクレオシド)または塩基での結合用の、修飾ヌクレオチドをオリ ゴヌクレオチドに内部位置または５'末端で包含させる。これは、一般に、二つ の方法の一つで行う。第１に、リボースの５'位を４',４−ジメトキシトリチル(
ＤＭＴ)で保護し、続いて２−シアノエトキシ−ビス−ジイソプロピルアミノホ スフィンとジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド存在下で反応させるか、ま
たは２'−シアノエトキシホスフィンクロロジイソプロピルアミノと反応させ、 当分野で既知のようにホスホルアミデイトを得る；しかしながら、他の方法を当
業者に認められるように使用し得る。Gait 前掲; Caruthers, Science 230: 281
(1985)参照、両方とも出典明示により本明細書の一部とする。
【０３４７】 基の３'末端への結合のために、好ましい方法は制御孔ガラス(ＣＰＧ)または 他のオリゴマー支持体への修飾ヌクレオシド（またはヌクレオシド代替物）の結
合を使用する。この実施態様において、修飾ヌクレオシドを５'末端でＤＭＴで 保護し、次いで、無水コハク酸と活性化しながら反応させる。得られるスクシニ
ル化合物をＣＰＧまたは当分野で既知の他のオリゴマー支持体に結合させる。更
に、修飾しているか、またはしていないホスホルアミデイトヌクレオシドを、脱
保護後に５'末端に結合させる。従って、本発明はＣＰＧのような固体オリゴマ ー支持体に結合したヌクレオシドに共有結合した導電性オリゴマーまたは絶縁体
、および本発明のヌクレオシドのホスホルアミデイト誘導体を提供する。
【０３４８】 本発明はさらにＥＴＭを含む補充リンカーを有する標識プローブの製造方法を
提供する。当業者には明らかなように、これらの合成反応は補充リンカーの特徴
とＥＴＭの結合方法に依存する。核酸補充リンカーについて、標識プローブは、
本明細書で概説したように、１以上の位置でＥＴＭを包含させて一般につくられ
る。遷移金属錯体をＥＴＭとして使用する場合、合成はいくつかの方法で行われ
る。好ましい実施態様において、配位子、続いて遷移金属イオンをヌクレオシド
に添加し、次いで、遷移金属錯体が結合しているヌクレオシドをオリゴヌクレオ
チドに添加する、つまり、核酸合成機に添加する。あるいは、配位子を結合させ
、続いて成長しているオリゴヌクレオチド鎖に包含させ、金属イオンを添加する
。
【０３４９】 好ましい実施態様において、ＥＴＭをリボース−ホスフェート主鎖のリボース
に結合させる。これは、導電性オリゴマーについて本明細書に概説したように通
常行われ、本明細書およびＰＣＴ公開ＷＯ９５/１５９７１に記載のように、ア ミノ−修飾またはオキソ−修飾ヌクレオシドを使用して、リボースの２'または ３'位に行う。次いで、配位子として、例えば金属イオンの結合のための遷移金 属配位子として、または、例えばアミド結合を介した、他の配位子または有機Ｅ
ＴＭの結合に使用できる化学的官能基として、当分野で認められるように、アミ
ノ基を使用し得る。例えば、例として、リボースを介して結合した種々のＥＴＭ
を有するヌクレオシドの合成を記載する。
【０３５０】 好ましい実施態様において、ＥＴＭはリボース−ホスフェート主鎖のホスフェ
ートに結合する。本明細書に概説のように、これは、ホスホルアミデイト結合の
ようなホスホジエステル類似体を使用して行われ、(一般に、ＰＣＴ公開ＷＯ９ ５/１５９７１参照)、またはＷＯ９８／２０１６２の図４および５に記載のもの
と同様の方法で行うこともでき、ここで、導電性オリゴマーは実施例で概説する
ように、遷移金属配位子または錯体もしくは有機ＥＴＭに置き換わる。
【０３５１】 別の主鎖、例えば、ペプチド核酸または別のホスフェート結合への結合は、当
業者に認められるように行う。
【０３５２】 好ましい実施態様において、ＥＴＭはヌクレオシドの塩基に結合する。これは
、種々の方法でなし得る。一実施態様において、天然に存在するか、または本明
細書に記載ように添加した(例えば、図参照)塩基のアミノ基を、遷移金属錯体の
配位子として、または例えば、アミド結合を介して他の配位子をまたは有機ＥＴ
Ｍを添加するのに使用できる化学的官能基として使用する。これは、当業者に認
められるように行う。あるいは、ヘテロ環式環に結合したハロゲン原子を含むヌ
クレオシドは商品として入手可能である。アセチレン結合配位子は、一般的に既
知のように、ハロゲン化塩基を使用して添加し得る；例えば、Tzalis et al., T
etrahedron Lett. 36(34): 6017-6020 (1995); Tzalis et al., Tetrahedron Le
tt. 36(2): 3489-3490 (1995); およびTzalis et al., Chem. Communications (
投稿中) 1996参照、全て出典明示により本明細書の一部とする。また、塩基への
アセチレン結合を介して結合したメタロセン（この場合では、フェロセン）の合
成を記載した図面および実施例も参照。
【０３５３】 一実施態様において、ヌクレオシドを、核酸に包含させた遷移金属配位子を有
して製造し、次いで、遷移金属イオンおよび残りの必要な配位子を当分野で既知
のように添加する。別の実施態様において、遷移金属イオンおよび付加的配位子
を、核酸への包含前に添加する。
【０３５４】 本発明の核酸を、共有結合した結合リンカー（つまり、絶縁体または導電性オ
リゴマーのいずれか）を有して製造し、結合リンカーを電極に結合させる。本方
法は、使用する電極のタイプによって変化する。本明細書に記載のように、結合
リンカーは一般に末端“Ａ”リンカーを有して製造され、電極への結合を促進す
る。本適用の目的のために、硫黄−金結合は共有結合とみなす。
【０３５５】 好ましい実施態様において、導電性オリゴマー、絶縁体および結合リンカーは
硫黄結合を介して電極に共有結合する。しかしながら、驚くべきことに、分子の
金電極への結合に使用する慣用的保護基は、一般に、本明細書に記載の組成物の
合成およびオリゴヌクレオチド合成反応への包含の両方への使用に理想的でない
。従って、本発明は、図に記載のようなエチルピリジンおよびトリメチルシリル
エチルを含む、普通でない保護保護基を使用した、導電性オリゴマーの金電極へ
の結合の新規方法を提供する。しかしながら、当業者が理解するように、導電性
オリゴマーが核酸を含まないとき、アセチル基などの慣用的保護基を使用し得る
。参照、Greene et al.、前掲。
【０３５６】 これは、いくつかの方法でなし得る。好ましい実施態様において、電極への結
合のために硫黄原子を含む導電性オリゴマーのサブユニットをエチル−ピリジン
またはトリメチルシリルエチル基で保護する。前者に関して、これは一般に硫黄
原子(好ましくはスルフヒドリルの形で)を含むサブユニットをビニルピリジン基
またはビニルトリメチルシリルエチル基と、エチルピリジン基またはトリメチル
シリルエチル基が硫黄原子に添加されるような条件下で接触させることにより行
う。
【０３５７】 このサブユニットはまた、一般に、付加的サブユニットの結合のために官能部
を含み、従って、付加的サブユニットが結合して導電性オリゴマーを形成する。
次いで、導電性オリゴマーをヌクレオシドに結合させ、付加的ヌクレオシドが結
合する。保護基を次いで除去し、硫黄−金共有結合を行う。あるいは、導電性オ
リゴマーの全てまたは一部を製造し、次いで、保護硫黄原子を含むサブユニット
を添加するか、硫黄原子を添加して、保護する。導電性オリゴマーを次いでヌク
レオシドに結合させ、付加的ヌクレオチドを結合させる。あるいは、核酸に結合
した導電性オリゴマーを製造し、次いで保護硫黄原子を含むサブユニットを添加
するか、硫黄原子を添加して、保護する。あるいは、エチルピリジン保護基を上
記のように使用してもよいが、１以上の工程の後に除去し、ジスルフィドのよう
な標準的な保護基に置き換える。このように、エチルピリジンまたはトリメチル
シリルエチル基は、合成反応のいくつかで保護基として作用し得、次いで、除去
して慣用的保護基に置き換えられる。
【０３５８】 本明細書の導電性ポリマーの“サブユニット”は、硫黄原子が結合する導電性
オリゴマーの少なくとも一部を意味するが、導電性オリゴマーの付加的成分の添
加を可能にする官能基、または導電性オリゴマーの付加的成分を含む付加的原子
も存在し得る。従って、例えば、構造１３のオリゴマーを使用するとき、サブユ
ニットは少なくとも第１Ｙ基を含む。
【０３５９】 好ましい方法は、１)一般に、ビニルピリジンまたはトリメチルシリルエチル 基をスルフヒドリルに添加して行う、導電性オリゴマーの第１サブユニットに結
合した硫黄原子への、エチルピリジンまたはトリメチルシリルエチル保護基の添
加；２)導電性オリゴマーの形成のための付加的サブユニットの添加；３)少なく
とも第１ヌクレオシドの導電性オリゴマーへの添加；４)核酸を形成するための 付加的ヌクレオシドの第１ヌクレオシドへの添加；４)導電性オリゴマーの金電 極への結合を含む。これはまた実施例に記載のように、ヌクレオシドの不存在下
でも行い得る。
【０３６０】 上記の方法は、金電極への絶縁分子の結合にも使用し得る。
【０３６１】 好ましい実施態様において、導電性オリゴマー（および選択的に絶縁体）を含
む単層を電極に添加する。一般に、添加の化学は、導電性オリゴマーの電極への
添加と類似か同じであり、即ち、金電極への結合に硫黄原子を使用するなどであ
る。核酸に共有結合した導電性オリゴマーに加えて、単層を含む組成物を、少な
くとも５つの方法の一つでなし得る：(１)単層の添加、続く結合リンカー−核酸
錯体の連続的添加；(２)結合リンカー−核酸錯体の添加、続く単層の添加；(３)
単層と結合リンカー−核酸錯体の同時添加；(４)完全な核酸の結合に適した官能
部で終了している結合リンカーを含む単層の形成(１,２または３のいずれかを使
用した)；または(５)核酸合成に適した官能部で終了している結合リンカーを含 む単層の形成、即ち、核酸を当分野で既知のように単層表面で合成する。このよ
うな適当な官能部は、ホスホルアミデイト添加のためのヌクレオシド、アミノ基
、カルボキシル基、保護硫黄部、またはヒドロキシル基を含むが、これらに限定
されない。例としては、好ましい方法(１)を用いた金電極上の単層の形成を記載
する。
【０３６２】 好ましい実施態様において、核酸はペプチド核酸または類似体である。この実
施態様において、本発明は、少なくとも一つの共有結合したＥＴＭまたは結合リ
ンカーを有するペプチド核酸を提供する。好ましい実施態様において、これらの
部分はＰＮＡの単量体サブユニットに共有結合する。本明細書の“ＰＮＡの単量
体サブユニット”は、−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ(ＣＯＣＨ2−塩基)−ＣＨ2−ＣＯ
−単量体またはＰＮＡの誘導体(ここでは“ヌクレオシド”の定義内に含まれる)
を意味する。例えば、ＰＮＡ主鎖の炭素原子の数を変え得る；一般に、ＰＮＡ誘
導体の数を記載したNielsen et al., Chem. Soc. Rev. 1997, 73頁参照、出典明
示により本明細書の一部とする。同様に、塩基を主鎖に結合させるアミド結合を
変え得る；ホスホロアミドおよびスルファーアミド結合を使用し得る。あるいは
部分を内部単量体サブユニットに結合する。本明細書で“内部”は、単量体サブ
ユニットがＮ−末端単量体サブユニットまたはＣ−末端単量体サブユニットでな
いことを意味する。本実施態様において、部分を単量体サブユニットの塩基また
は主鎖に結合できる。塩基の結合は、本明細書に概説のように、または文献から
既知のように行う。一般に、部分を塩基に添加し、これを次いで本明細書に概説
のようにＰＮＡに包含させる。塩基は、化学置換基の添加前またはその後に、Ｐ
ＮＡ合成反応への包含に必要なように保護されているか、包含されるように誘導
体化されている。塩基の保護および誘導体化は、ＷＯ９８／２０１６２の図２４
−２７に示す。塩基を次いでＷＯ９８／２０１６２の図２８に示すように、単量
体サブユニットに包含できる。ＷＯ９８／２０１６２の図２９および３０は、二
つの異なる化学置換基、ＥＴＭおよび塩基で結合した導電性オリゴマーを示す。
図２９は、ウラシル塩基に結合したフェロセンでのＰＮＡ単量体サブユニットの
代表的合成を示す。図３０は、ウラシル塩基に結合した３ユニット導電性オリゴ
マーの合成を記載する。
【０３６３】 好ましい実施態様において、部分はＰＮＡ単量体の主鎖に共有結合する。結合
は、一般に、単量体サブユニットの非置換炭素原子の一つ、好ましくは主鎖のα
−炭素に行われるが、１または２位の炭素、または塩基を主鎖に結合させるアミ
ド結合のα−炭素での結合もなし得る。ＰＮＡ類似体の場合、他の炭素または原
子も同様に置換し得る。好ましい実施態様において、部分を、α−炭素原子に末
端単量体サブユニットまたは内部の末端単量体サブユニットへ添加する。
【０３６４】 この実施態様において、修飾単量体サブユニットを、ＥＴＭ、結合リンカーま
たはその結合のための官能基で合成し、次いで塩基を添加し、修飾単量体を成長
しているＰＮＡ鎖に包含させ得る。ＷＯ９８／２０１６２の図３１は、ＰＮＡ単
量体サブユニットの主鎖に共有結合した導電性オリゴマーの合成を記載し、ＷＯ
９８／２０１６２の図３２は単量体サブユニットの主鎖に結合したフェロセンの
合成を記載する。
【０３６５】 製造した共有結合部分を有する単量体サブユニットを、Will et al., Tetrahe
dron 51(44): 12069-12082 (1995)およびVanderlaan et al., Tett. Let. 38: 2
249-2252 (1987)（両方ともその全体を出典明示により本明細書の一部とする） に概説のような方法を使用して、ＰＮＡに包含させる。これらの方法は、ペプチ
ド核酸への化学置換基の添加を、化学置換基を破壊させることなく可能にする。
【０３６６】 当業者に認められるように、電極は、核酸、導電性オリゴマーおよび絶縁体の
任意の組み合わせを有するように製造し得る。
【０３６７】 本発明の組成物は、更に、一個以上の標識を任意の位置で含み得る。本明細書
での“標識”は、化合物の検出を可能にするために結合した元素(例えば、アイ ソトープ)または化学化合物を意味する。好ましい標識は放射活性同位体標識、 着色または蛍光色素である。標識は、任意の位置で化合物に包含し得る。加えて
、本発明の組成物は、架橋剤のような他の部分も含み得、標的−プローブ錯体の
架橋を促進する。例えば、Lukhtanov et al., Nucl. Acids. Res. 24(4): 683 (
1996)およびTabone et al., Biochem. 33: 375 (1994)参照、両方とも出典明示 により本明細書の一部とする。
【０３６８】 メカニズム−１のシステムを使用するとき、検出プローブを電極に、捕捉プロ
ーブについて上記のように共有結合する。検出プローブは、図に示すように、実
質的に標的配列(直接検出)の一部に相補的であるか、または標識プローブ(サン ドイッチアッセイ)の一部に相補的である。
【０３６９】 本明細書に概説した全ての方法について、使用する方法によって、反応しない
プライマーを除去するか、反応しないプライマーを検出しないような検出システ
ムをつくる必要がある。例えば、全てにシステムについて、サイズの差異に基づ
いた反応しないプライマーの除去が行われ、またはいくつかの場合において、分
離タグを用いて、ビーズのような固体支持体に結合させることにより行われる。
さらに、ＰＣＲ、ＳＤＡおよびＮＡＳＢＡについて、非拡張プライマーが例えば
電極上の捕捉プローブによって結合しないように、検出特異性は非プライマーの
新たに合成された鎖の一部を利用する。あるいは、例えば、ＣＰＴにおいて、第
１プローブ配列は、分離タグ(例えば、ビオチン)または配列(例えば、独特の配 列)を含み得、反応しないプライマーと開裂した第１プローブ配列の結合をもた らす；第２プローブ配列(直接検出の)での標識の使用、または電極での捕捉また
は検出プローブへの結合の基盤としての第２プローブ配列の使用により、反応し
ないプローブを確実に検出しない。同様に、ＬＣＲにおいて、捕捉のための１つ
のプライマーを使用し、標識包含(直接検出)または検出特異性のいずれかのため
にもう一方を使用すると、検出は単に、修飾プライマーに対して行われる。
【０３７０】 一旦製造されると、組成物は本明細書に記載のように、多くに適用されて使用
される。特に、本発明の組成物は、ハイブリダイゼーションアッセイで使用され
る。当業者には明らかなように、電極は、核酸の単一の種、つまり単一核酸配列
または多数の核酸の種を有するようにつくられ得る。
【０３７１】 加えて、本明細書に概説のように、電極のような固体支持体の使用は、これら
の遺伝子プローブの配列形での使用を可能にする。オリゴヌクレオチド配列の使
用は、当分野で既知である。加えて、電極内に位置を“アドレッシング”するた
め、および電極の表面修飾のための方法は既知である。従って、好ましい実施態
様において、異なる核酸の配列は、電極の下に置かれ、その各々は導電性リンカ
ーを介して電極に共有結合する。この実施態様において、オリゴヌクレオチドの
多くの異なる種のプローブは、１から数千に広く変化し得、好ましくは約４から
約１００,０００、および特に好ましくは約１０から約１０,０００である。
【０３７２】 一旦、本発明のアッセイ複合体（最小でも標的配列とＥＴＭとを含む）が調製
されると、電子的開始によって検出が進む。メカニズムまたは理論で限定する意
図はないが、検出はＥＴＭから電極への電子伝達に基づいている。
【０３７３】 電子伝達の検出、即ちＥＴＭの存在下は、一般的に好ましい電圧で電子的に開
始される。電位がアッセイ複合体に適用される。適用電位における厳密なコント
ロールおよび変形は、電位および３電極システム（１つの対照、１つのサンプル
（すなわち作動）、１つの逆電極）または２電極システム（１つのサンプル、１
つの逆電極）を介している。このことで応用電位がシステムのピーク電子伝達電
位にマッチされる。このシステムは、一部がＥＴＭの選択に、一部が用いた導電
性オリゴマーに、単層の組成および完全性、対照電極に使用の型に依存している
ものである。記載のように、フェロセンが好ましいＥＴＭである。
【０３７４】 好ましい実施態様において、同時還元剤または同時酸化剤（合せて、同時レド
ックス剤）が追加の電子源として用いられる（参照、Sato et al., Bull. Chem.
Soc. Jpn 66:1032(1993); Uosaki et al., Electrochimica Acta 36:1799 (199
1);および Alleman et al., J. Phys. Chem 100:17050(1996)、出典明示により 本明細書の一部とする）。
【０３７５】 好ましい実施態様において、溶液中の入力源が電子伝達の開始に用いられる。
好ましくは、直流電流を用いてまたは拡散が制限されない交流周波数で開始およ
び検出がなされるときである。一般に、当業者はよくわかるように、好まし実施
態様で“ホール”含有の単層を用いると、システムの短絡が回避できる。これは
いくつかの一般的な方法で行うことができる。好ましい実施態様において、入力
電極源は、標識プローブのＥＴＭよりも低いか同じレドックス電位を有する。こ
のように、入力電子源のレドックス電位以上の電圧において、ＥＴＭおよび入力
電子源が酸化されて電子を与え得る。ＥＴＭは電極に電子を与え、入力源がＥＴ
Ｍに与える。例えば、実施例中に記載した本発明の組成物に結合したＥＴＭとし
て、フェロセンは、水溶液中で大略２００ｍＶのレドックス電位を有する（フェ
ロセンが結合してもの、結合の方法およびなんらかの置換基の存在によって非常
に変化する）。電子源のフェロシアニドは、同様に約２００ｍＶのレドックス電
位を有する。従って、約２００ｍＶまたはそれ以上の電圧において、フェロセン
はフェリセニウムの変わり、電子を電極に伝達する。フェリシアニドを酸化して
電子をＥＴＭに伝達することができる。この方法において、電子源（または同時
還元剤）はシステムに生じたシグナルを増幅するために働き、電子源分子が核酸
に結合したＥＴＭに電子を迅速に、かつ繰り返して伝達する。電子の供与・受容
の速度は、同時還元剤の拡散の速度すなわち同時還元剤とＥＴＭとの間の電子伝
達に制限される。電子伝達は濃度および大きさなどの影響を受ける。
【０３７６】 他方、ＥＴＭよりも低いレドックス電位を有する入力電子源が用いられる。Ｅ
ＴＭのレドックス電位よりも低いが、電子源のレドックスよりも高い電圧におい
て、フェロシアニドなどの入力源は酸化され得ず、ＥＴＭに電子を与え得ない。
すなわち電子伝達が起きない。フェロセンが酸化されると、電子の伝達経路がで
きる。
【０３７７】 他の好ましい実施態様において、入力電子源は、標識プローブＥＴＭよりも高
いレドックス電位を有する。例えば、電子源のルミノールは大略７２０ｍＶのレ
ドックス電位を有する。ＥＴＭのレドックス電位よりも低い電圧、すなわち２０
０−７２０ｍＶにおいては、電圧がルミノールのレドックス電位よりも低いので
、ＥＴＭはルミノール電子源から電子を受けることができない。しかし、ルミノ
ールのレドックス電位またはそれ以上で、ルミノールはＥＴＭに電子を伝達し、
迅速かつ反復の電子伝達を可能とする。この方法において、電子源（または同時
還元剤）はシステムで生じたシグナルを増幅するのに働き、電子源分子は標識プ
ローブのＥＴＭに迅速にかつ反復して電子を供与する。
【０３７８】 ルミノールは酸化に際して化学的発光種になるという別の利点もあり（参照Ji
rka et al.,Analytica Chemica Acta 284:345(1993))、ＥＴＭから電極への電子
伝達の光学的検出が可能となる。ルミノールが電極に直接接触しない限り、すな
わち電極への効率的な電子伝達経路がないようなＥＴＭの存在において、アッセ
イ複合体上のＥＴＭに電子を伝達することのみによりルミノールは酸化される。
ＥＴＭが存在していない（即ち、標的配列が本発明の組成物をハイブリダイズし
ない場合）と、ルミナールは顕著に酸化されないで、ルミノールからの低い光子
放出および低い（もしあれば）シグナル放出をもたらす。標的の存在で非常に大
きいシグナルが生じる。このように光子放出によるルミノール酸化の測定は、電
極に電子を与えるＥＴＭの能力についての間接的な測定となる。さらに、光子検
出は一般的に電子検出よりも感度がよいので、システムの感度が増大する。最初
の結果から、発光が過酸化水素濃度、ｐＨおよびルミノール濃度（これは直線的
ではない）に依存していることが示唆される。
【０３７９】 適切な電子源分子は周知であり、フェリシアニドやルミノールが含まれるが、
これらに限定されない。
【０３８０】 他方、出力電子受容体を用いることができる。すなわち上記反応を逆に行う。
電極から電子を受けるメタロセンなどのＥＴＭを用いる。電子を迅速に繰り返し
受ける出力電子受容体でメタロセンをメタリセニウムに変える。この実施態様で
、コバルトイセニウムが好ましいＥＴＭである。
【０３８１】 単層の表面のＥＴＭの存在は、種々の方法によって検出することができる。光
学的検出には、これらに限定されるものではないが、例えばフルオレッセンス、
ホスホレッセンス、ルミニセンス、ケミルミニセンス、エレクトロルミニセンス
および屈折率がある。電子的検出には、これらに限定されるものではないが、ア
ンペロメトリー、ボルタメトリー、キャパシタンス、インピーダンスがある。こ
れらの方法には、交流または直流の電流に基づく時間・周波数依存法、パルス法
、ロックイン法、フィルター法（高パス、低パス、バンドパス）および時間分解
フルオレセンスなどの時間分解法がある。
【０３８２】 １つの実施態様において、ＥＴＭから電極への電子の効率的な伝達は、ＥＴＭ
のレドックス状態での定型的変化をもたらす。ビピリジン、ピリジン、イミダゾ
ール環含有のルテニウム複合体を含む多くのＥＴＭでもって、レドックス状態に
おけるこれらの変化はスペクトルの変化に関連している。吸収の顕著な相違がこ
れらの分子について還元状態と酸化状態の間にみられる。例えば、参照、Fabbri
zzi et al.,Chem.Soc.Rev.1995 pp192-202。これらの相違は、分子光度計あるい
は光電子増倍管を用いて監視することができる。
【０３８３】 この実施態様において、電子供与体および受容体には、光学活性化すなわち開
始について上記したすべての誘導体が含まれる。好ましい電子供与体および受容
体は電子伝達を高感度で監視し得るレドックスについて大きいスペクタル変化を
特徴としている。好ましい例に、Ru(NH3)4pyおよびRu(bpy)zimがある。吸収によ
って監視される供給体または受容体のみが理想のスペクトル特性を有しているこ
とが理解されるべきである。
【０３８４】 好ましい実施態様において、電子伝達は蛍光定量で検出される。ルテニウムな
どの遷移金属複合体の多くが明白な蛍光性を有する。従って、核酸に結合した電
子供与体と受容体とのレドックス状態の電荷は、Ｒｕ（４，７−ビフェニル2− フェナントロリン）3 2+などによる蛍光を用いて、感度よく監視することができ る。この化合物の生成は、標準的蛍光検出法によって容易に測定することができ
る。例えば、レーザー誘発蛍光は、標準的細胞蛍光定量、オンライン蛍光定量で
のフロー（例えばクロマトグラフィーに結合したもの）あるいは９６ウエル・イ
ムノアッセイについて市販されているものに類似の多サンプル“プレートリーダ
ー”で記録することができる。
【０３８５】 他方、蛍光は、溶液中の結合配位子または光学繊維に結合した核酸プローブで
光学結合センサーを用いて測定することができる。蛍光は光学繊維に結合した光
学増倍管または他の光検出器を用いて監視することができる。これについての有
利な点は、検出に用いられるサンプル量が極めて少量でよいことである。
【０３８６】 さらに、Molecular Dynamicから販売されているFluorlmagerなどの走査蛍光検
出器が固体表面に並んだ修飾核酸分子の蛍光を監視するのに非常に適している。
このシステムの利点は、何千もの別異の核酸プローブでカバーされたチップを一
度に用いて多数電子伝達プローブを走査できることである。
【０３８７】 多くの遷移金属複合体が大きいStokesシフトでもって蛍光を現す。適当な例と
して、ルテニウムなどの遷移金属のビスおよびトリスフェナントロリン複合体、
およびビスおよびトリビピリジン複合体がある（参照、Juris, A., Balzani, V.
, et al. Coord. Chem. Rev., V.84, p.85-277, 1988）。好ましい例では、効率
的な蛍光（合理的に高い量子収量）および低い再構築エネルギーを示す。これら
には、Ｒｕ（４，７−ビフェニル2−フェナントロリン）3 2+、Ｒｕ（４，４’−
ジフェニル２，２’−ビピリジン）3 2+および白金複合体がある（参照、Cumming
s et al., J. Am. Chem. Soc. 118:1949-1960(1996)、出典明示により本明細書 の一部とする）。他方、ハイブリダイゼーションに関連する蛍光の低下は、これ
らのシステムを用いて測定できる。
【０３８８】 別の実施態様において、電子化学発光が電子伝達検出の基礎として用いられる
。Ｒｕ2+(bpy)3などのＥＴＭのいくつかで直接発光に励起状態の低下がおきる。
この性質の変化は、核酸ハイブリダイゼーションに関連しており、簡単な光学増
倍管で監視することができる。（参照、Blackburn, G.F. Clin. Chem. 37:1534-
1539(1991);および Juris et al., 上記）。
【０３８９】 好ましい実施態様において、電子検出に、アンペロメトリー、ボルタメトリー
、キャパシタンスおよびインピーダンスなどが用いられる。好ましい技法として
、これらに限定されるものでないが、電解重量分析、クーロメトリー（制御電位
クーロメトリーおよび一定カレント・クーロメトリーを含む）、ボルタメトリー
（サイクルボルタメトリー、パルスボルタメトリー（正常パルスボルタメトリー
、スクエア波ボルタメトリー、示差パルスボルタメトリー、オステリオウング・
スクエア波ボルタメトリー、静電量パルス法）、ストリッピング分析（アニオン
ストリッピング、カチオンストリッピング、スクエア波ストリッピングボルタメ
トリー）、伝導分析（電子的伝導、直接分析）、時間依存電子化学分析（クロノ
アンペロメトリー、クロノポテンショメトリー、サイクルクロノアンペロメトリ
ー、サイクルクロノポテンショメトリー、交流ポログラフィー、クロノガルバメ
トリー、クロノクロメトリー）、交流インピーダンス法、キャパシタンス法、交
流ボランタメトリー、光学電子化学法がある。
【０３９０】 好ましい実施態様において、電子伝達の監視はアンペロメトリー検出で行われ
る。この検出法において、望む標的遺伝子を含有するサンプル中の核酸結合電極
と対照（逆）電極との間の電位（単離された対照電極と比較して）が利用される
。相違する効率の電子伝達が標的核酸の存在または不存在によって生じる。すな
わち標的核酸の存在また不存在、および従って標識プローブ、が異なる電流をお
こす。
【０３９１】 アンペロメトリーで電子伝達を測定する器具は、感度のよい電流検出を含み、
電圧電位を制御する手段、常にポテンシオスタットを含む。この電圧は標識プロ
ーブ上の電子供与複合体の電位を参照することにより最適化される。電子供与複
合体には、鉄、オスミウム、白金、コバルト、レニウム、レテニウムの複合体に
ついて上記のものが含まれ、鉄複合体が最も好ましい。
【０３９２】 好ましい実施態様において、他の電子検出法が用いられる。例えばポテンシオ
メトリー（すなわちボルタメトリー）には、非ファラデー法（ネット電流なし）
が含まれ、ｐＨや他のイオン検出器において通常用いられる。同様のセンサーが
ＥＴＭと電極との間の電子伝達を監視するために用いられる。さらに、絶縁体（
抵抗など）および導電体（導電、インピーダンス、キャピシタンス）などの他の
性質がＥＴＭと電極との間の電子伝達を監視するために用いられる。また、電流
を生じるいかなるシステム（電子伝達など）も小さい磁場を生じ、ある実施態様
で監視され得る。
【０３９３】 本発明の組成物で見られる電子伝達の速い速度がもたらす一つの利点は、時間
分解が吸収、蛍光あるいは電子流などによるモニターにおけるシグナル対ノイズ
結果を一般的に高め得ることである。本発明の電子伝達の速い速度は、高度のシ
グナルと電子伝達開始・完了間の定型的遅延とをもたらす。特定の遅延のシグナ
ルを増幅することにより、電子伝達のパルス開始および“ロックイン”増幅検出
およびフェーリエ変換がなされる。
【０３９４】 好ましい実施態様において、電子伝達は交流電流（ＡＣ）法を用いて始められ
る。理論に拘束されることなく、電極に連結したＥＴＭは、つながっている抵抗
とコンデンサーを流れる交流電圧に同様に反応する。基本的に、これらの抵抗と
コンデンサーとして働く複合体の性質を測定し得る方法は、検出の基本とするこ
とができる。驚くべきことに、従来からの電気化学理論、例えば、Laviron et a
l., J. Electroanal. Chem. 97:135(1979) および Laviron et al., J. Electro
anal. Chem. 105:35(1979)（出典明示により本明細書の一部とする）は、非常に
小さいＥAC（１０mV以下）および比較的多数の分子を除き、本明細書に記載のシ
ステムのモデルとはならない。すなわち、交流電流（Ｉ）は、Lavironの式に正 確には記載されていない。このことは、この理論が電子の限界のない源とシンク
を想定していることに部分的には由来するものであり、これは本発明のシステム
には当てはまらない。
【０３９５】 従って、Nernstの式と最初の原理を用いて、結果に密接に適合するモデルを開
発するために、別の式をつくりだした。これは次の通りである。Nernst式、下記
の式１は、同じ酸化電位ですべての分子が酸化されるわけでないので、与えられ
た電圧と温度における酸化分子（Ｏ）の還元分子（Ｒ）に対する比（分子数＝ｎ
）を示す。 式１
【数１】 （１） ＥDOは電極電位、Ｅ0は金属複合体の形式的電位、Ｒはガス定数、ＴはKelvin度 数での温度、ｎは伝達された電子の数、Ｆはファラデー定数、［Ｏ］は酸化分子
の温度、［Ｒ］は還元分子の濃度である。
【０３９６】 Nernst式は式２および３に書き改めることができる。 式２
【数２】 （２） ＥDOは電位の直流素子である。 式３
【数３】 （３）
【０３９７】 式３は式４、５、６に、単純化のために１に等しい濃度に正常化することによ
り書き改めることができる。次に分子の全数を掛けることを要す。 式４ ［Ｏ］＋［Ｒ］＝１ 式５ ［Ｏ］＝１−［Ｒ］ 式６ ［Ｒ］＝１−［Ｏ］
【０３９８】 式５および６を式３に挿入し、ｎＦ/ＲＴが３８.９Ｖ-1に等しいことから、ｎ
＝１とすると、[Ｏ]および[Ｒ]をそれぞれ定義する式７および８は次の通りであ
る。 式７
【数４】 （４） 式８
【数５】 （５）
【０３９９】 交流ファラデー電流の発生を考慮して、与えられる電位での[Ｏ]/[Ｒ]比を検 定しなければならない。応用ＥACを有する特定のＥDCは、本明細書で一般的に記
載されるように、ＥACの最大値で、表面の電圧がＥDC＋ＥACになるので、より多
くの分子が酸化状態になり、ＥACの最小値で、電圧が低くなるのでより還元され
る。従って、与えられたＥDCでの交流電流（ＡＣ）は、Nernst曲線と同様に交流
および直流電圧の両方によって検出される。特定的に交流サイクル最小での酸化
分子の数を交流サイクル最大時の値から引くと、その交流サイクルにおける全変
化が式９に記載のように得られる。次いで２で割ると、交流振幅が得られる。 式９
【数６】 式１０で交流電流が得られる。 式１０
【数７】 （６）
【０４００】 式１１に示すように、全交流電流は、レドックス分子数Ｃ）、ファラデー定数
（Ｆ）、交流周波数（ω）、０.５（交流振幅を考慮するため）、式７に上記し た比率から導かれる。交流電圧は大略、平均振幅ＥAC２/πである。 式１１
【数８】 （７）
【０４０１】 式１１を用いて、過電位（交流電圧）を増して、シュミレーションを行った。
WO98/20162の図２２Ａはそのシュミレーションの１つを示す。図２２Ｂは従来理
論に基づくシュミレーションを示す。図２３Ａおよび２３Ｂは、シュミレーショ
ンで、WO98/20162の実施例７のＥｃ−ｗｉｒｅをプロットして、実際の実験デー
タを表したものであり、モデルが実験結果によく一致していることが分かる。あ
る場合には電流が予測よりも小さいが、大抵は改善され得るフェロセン変性によ
るものであることが分かる。しかし、電子伝達速度の影響も機器による因子も、
式１１に組み入れられてない。電子伝達速度は、応用周波数に近いか、それより
低いと、重要である。このように真のｉACは下記の式１２に示すような３因子の
関数である。 式１２ ｉAC＝ｆ(Nernst因子)ｆ(ｋET)ｆ(機器因子)
【０４０２】 これらの式は、交流素子および直流素子を含む入力シグナルを利用するシステ
ムにおける期待交流電流をモデル化し、予測できる。上記したように、驚くべき
ことに従来の理論は、非常に低電圧の場合以外は、これらのシステムをまったく
モデル化しない。
【０４０３】 一般に、非特異的結合標識プローブ/ＥＴＭは、ＥＴＭを含む標識プローブが 正確な方向に特異的に結合したときよりも、インピーダンスに相違を示す（すな
わち、高いインピーダンス）。好ましい実施態様において、非特異的結合物質を
洗い落とすと、無限大の効果的なインピーダンスをもたらす。このように、一般
的に下記するように交流検出はいくつかの利点があり、それには、感受性の増加
およびバックグラウンドのノイズを拙除する能力が含まれる。特に、インピーダ
ンスの変化（例えばバルクインピーダンスを含む）を、ＥＴＭ含有プローブの非
特異的結合と標的特異的アッセイ複合体形成の差として監視できる。
【０４０４】 従って、ＡＣ開始および検出方法を用いると、システムの周波数応答がＥＴＭ
存在の結果として変化する。“周波数応答”は、電極とＥＴＭとの間の電子伝達
の結果としてのシグナル修飾を意味する。この修飾はシグナル周波数に従って相
違する。周波数応答には、1以上の周波数での交流電流、位相シフト、直流オフ セット電圧、ファラデーインピーダンス等が含まれる。
【０４０５】 標的配列およびＥＴＭを含むアッセイ複合体がつくられると、第１入力電子シ
グナルはシステムに用いられ、好ましくは少なくともサンプル電極（本発明の複
合体を含む）および逆電極を介してシステムに用いられ、電極とＥＴＭとの電子
伝達が開始される。電極システムも対照および実施電極に適用される電圧で用い
られる。第１入力シグナルは少なくとも１つの交流素子を含む。交流素子は変化
し得る振幅と周波数である。一般的に、本発明方法での使用において、交流振幅
は約１ｍＶ−１.１Ｖであり、約１０ｍＶ−８００ｍＶが好ましく、特に約１０ −５００ｍＶが好ましい。交流周波数は約０.０１Ｈｚ−１００ＫＨｚであり、 約１０Ｈｚ−１０ＭＨｚが好ましく、約１００Ｈｚ−２０ＭＨｚが特に好ましい
。
【０４０６】 交流と直流シグナルとの組み合わせ使用は、驚くべき感受性とシグナル最大化
を含む種々の利点がある。
【０４０７】 好ましい実施態様において第１入力シグナルは交流素子および直流素子を含む
。すなわち、サンプルと逆電極直流オフセット電圧は、ＥＴＭ（例えば、フェロ
センを用いると、掃引は一般に０から５００ｍＶ）（あるいは、作動電極をグラ
ウンドすると、対照電極は０から−５００ｍＶで掃引される）の電子化学的電位
を介して掃引される。この掃引はシステムの最大応答が見られる直流電圧を同定
するのに用いられる。これは一般にＥＴＭの電子化学的電位かその周辺である。
この電圧が測定されると、掃引または１以上のユニホーム直流オンセット電圧が
用いられる。直流オンセット電圧は約−１Ｖから＋１.１Ｖであり、約−５００ ｍＶから＋８００ｍＶが望ましく、約−３００から５００ｍＶが特に望ましい。
好ましい実施態様において直流オンセット電圧はゼロではない。直流オンセット
電圧のトップで、変化し得る振幅および周波数のシグナル交流素子が適用される
。もしＥＴＭが存在して交流摂動に応答し得ると、電極とＥＴＭとの間の電子伝
達によって、交流電流が生じる。
【０４０８】 確立したシステムにおいて、ＥＴＭ（即ち標的配列の存在する）核酸の有無を
識別するのに、単一の入力シグナルを用いて十分である。他方、複数の入力シグ
ナルも適応される。これには、多くの種類があり、多重周波数、、多重交流振幅
あるいはこれらの組合せが用いられる。
【０４０９】 このように好ましい実施態様において、多重直流オンセット電圧を用いると、
直流電圧掃引が好ましい。これは単一の周波数または２以上の周波数で行われれ
る。
【０４１０】 好ましい実施態様において、交流振幅は変更することができる。理論にとらわ
れることなく、振幅を上げると推進力が増すようである。高い振幅は高い過電位
をもたらし、電子伝達に速い速度を与える。一般的に同じシステムがその周波数
での高い過電位の使用を介して単一の周波数での応答を改善する（すなわち、よ
り早い出力シグナル）。振幅が高周波数で増すと、システムを通しての電子伝達
の速度を増し、感受性が大きくなる。さらに、例えば、これは、適当な空間のあ
る配置を有さないような遅いシステムでの応答を惹起するのに用いられる。
【０４１１】 好ましい実施態様において、システムの測定は、少なくとも２つの単離した振
幅または過電位でなされる。複数の振幅が好ましい。上記したように、振幅変化
の結果としての応答の変化は、システムの同定、校正および定量の基礎を形成す
る。さらに１以上の交流周波数が同様に用いることができる。
【０４１２】 好ましい実施態様において、交流周波数は様々である。相違する周波数におい
て、異なる分子が異なる方法で応答する。当業者は分かるように、周波数が増す
と出力電流は一般に増加する。しかし、電極とＥＴＭに電子が行き来する速度よ
りも周波数が大きいときは、高い周波数は出力シグナルの喪失または低下をもた
らす。ある時点で周波数がＥＴＭと電極との間の電子伝達の速度よりも大きくな
り、出力シグナルも低下する。
【０４１３】 ある実施態様において、検出に単一周波数における出力シグナルの単一測定を
用いる。すなわち、標的配列の不存在と従ってＥＴＭを含む標識プローブの不存
在でのシステムの周波数応答はあらかじめ測定でき、特定の高周波数で非常に低
い。この情報を用いると、特定の周波数応答がアッセイ複合体の存在を示す。す
なわち、特定の周波数でのすべての応答はアッセイ複合体を特徴付ける。単一入
力高周波数を用いることのみが必要であり、すべての周波数応答のなんらかの変
化は、分析物が存在すること、標的配列が存在することを示す。
【０４１４】 さらに交流技法を用いると、ＥＴＭ以外の物質によるすべての単一周波数での
バックグラウンドシグナルの顕著な低下をもたらす。すなわち、望まないシグナ
ルの“閉め出し”または“濾去”である。溶液中の電荷キャリヤーすなわちレド
ックス活性分子の周波数応答が、その拡散係数および電荷伝達係数によって制限
される。従って、高周波数では、電荷キャリヤーはその電荷を電極に伝達するの
に十分速く拡散し得ず、および／または電荷伝達速度が十分に速くない。このこ
とは、適切な単層を用いない場合あるいは部分的または不完全な単層を用いる場
合、すなわち溶媒が電極に到達し得ない場合に著しい。すでに概記したように、
直流技法において、電極に溶媒が到達し得る“ホール”の存在は、システムの“
短絡”溶媒電荷キャリヤーをもたらすことがある。すなわち、電極への到達およ
びバックグラウンドシグナルの生成である。しかし、現在の交流技法を利用する
と、１以上の周波数が選ばれて、単層の存在・不存在にかかわらず溶液中の１以
上の電荷キャリアーの周波数応答を防ぐ。このことは血液などの多くの生物体液
が、アンペロメトリー検出を妨害し得るレドックス活性分子を顕著な量で含有し
ているので、特に意味がある。
【０４１５】 好ましい実施態様において、システムの測定は少なくとも２つの単離された周
波数で行われ、複数の周波数の測定が好ましい。複数の周波数には走査がある。
例えば交流電流は、１−２０Ｈｚなどの低い入力周波数で、１０−１００ｋＨｚ
などの高い周波数での出力シグナルに対する応答と比較すると、ＥＴＭの存在の
有無による周波数応答の相違を示す。好ましい実施態様において、周波数は少な
くとも２、好ましくは約５、さらに好ましくは少なくとも約１０周波数で測定さ
れる。
【０４１６】 電子伝達を開始するために入力シグナルを伝導した後に、出力シグナルが受け
られ、すなわち検出される。出力シグナルの存在および増大は多くの因子に依存
する。すなわち、入力シグナルの過電位／振幅；入力交流シグナルの周波数；介
在媒体の組成物；直流オンセット；システムの環境；ＥＴＭの性質；溶媒；塩の
種類と濃度である。１つの与えられた入力シグナルにおいて、出力シグナルの存
在および増大は、一般的にＥＴＭの存在の有無、単層表面からのＥＴＭの位置と
距離および入力シグナルの性質に依存する。いくつかの実施態様において、標識
プローブの非特異的結合と標識プローブを含む標的特異的アッセイ複合体の形成
との相違をインピーダンスに基づき識別することは、可能である。
【０４１７】 好ましい実施態様において、出力シグナルは交流電流を含む。上記したように
、出力電流の大きさはパラメーターの数に依存する。これらのパラメーターを変
えると、数においてシステムが最適化される。
【０４１８】 本発明で生じる交流電流は一般的に、約１femptoamp−約１milliampにあり、 約５０femptoamp−約１００microampが好ましく、約１picoamp−約１microampが
特に好ましい。
【０４１９】 好ましい実施態様において、出力シグナルは入力シグナルに比較すると交流素
子でシフトする位相である。理論にとらわれることなしに、本発明のシステムを
充分にユニホームにすると、位相シフトの検出が可能となるようである。すなわ
ち、本発明の電子伝達が起きるバイオ複合体は、均質に交流入力と反応し、これ
は標準の電子素子と同じであり、位相シフトが測定できる。このことは、ＥＴＭ
の存在の有無の検出の基礎として、および／または標識プローブを含む標的特異
的アッセイ複合体の存在とシステム成分に対する物質の非特異的結合との差異と
して働く。
【０４２０】 出力シグナルはＥＴＭの存在を特徴とする。すなわち出力シグナルは、標識プ
ローブとＥＴＭを含む標的特異的アッセイ複合体の存在を特徴とする。好ましい
実施態様において、検出の基礎は、アッセイ複合体の形成の結果としてのシステ
ムのファラデーインピーダンスの相違にある。ファラデーインピーデンスは、電
極とＥＴＭの系のインピーデンスである。ファラデーインピーデンスはバルクす
なわち２電子インピーデンスとまったく異なり、バルクインピーデンスは電極間
のバルク溶液のインピーデンスである。多くの因子がバルクインピーデンスに作
用しないファラデーインピーデンスを変えることができ、その逆も可能である。
このように核酸を含む本系のアッセイ複合体は一定のファラデーインピーデンス
を有し、これはＥＴＭと電極の距離、その電子的性質、介在媒体の組成物などに
依存している。本発明方法で重要なことは、ＥＴＭと電極との間のファラデーイ
ンピーダンスが、ＥＴＭを含む標識プローブが電極に特異的または非特異的に結
合するかどうかにより非常に異なることである。
【０４２１】 従って、本発明はさらに、交流検出法を用いて核酸検出のための装置を提供す
る。この装置は、少なくとも第1測定すなわちサンプル電極および第2測定すなわ
ち逆電極を有する試験室を含む。３電極系も用いられる。第1および第2電極は試
験サンプル受け領域に接触し、液体試験サンプルの存在下で、2つの電極は電子 的に接触し得る。
【０４２２】 好ましい実施態様において、第1測定電極は、取付リンカー、および上述の導 電性オリゴマーを含む単層を介して共有結合した一本鎖核酸捕獲プローブを含む
。
【０４２３】 装置は、試験室すなわち測定電極に電気的に連結した交流電圧源を含む。好ま
しくは、交流電圧源はオフセット電圧も同様に放出し得る。
【０４２４】 好ましい実施態様において、装置はさらに、入力シグナルと出力シグナルとを
比較し得るプロセッサーを含む。プロセッサーは電極に結合しており、出力シグ
ナルを受けるように配置され、表面ヌクレオシドの存在を検出する。 従って本発明の組成物は、種々の研究、臨床、品質管理、野外試験などに用い
られる。
【０４２５】 好ましい実施態様において、これらのプローブは遺伝子診断に使用される。例
えば、本明細書中に開示した技術を使用して、プローブを、例えば、非茸腫結腸
癌遺伝子、ＢＲＣＡ１胸部癌遺伝子、各種の癌関連遺伝子であるＰ５３、アルツ
ハイマー病の最大リスク指標であるアポＥ４遺伝子、などの標的配列を検出する
ために調製し、患者の前駆症状スクリーニング、全身性繊維症遺伝子変異、ある
いはその他の当技術分野で周知のすべてを容易にすることができる。
【０４２６】 別の実施態様では、ウイルスおよびバクテリアの検出は、本発明の複合体を使
用して実施できる。この実施態様では、プローブは、各種ウイルスおよびバクテ
リアから標的配列を検出するためにデザインされる。例えば、現今の血液スクリ
ーニングは坑ＨＩＶ抗体の検出に依存している。本明細書中に開示した方法は、
臨床サンプルのＨＩＶ核酸配列、殊に高度に保存性のＨＩＶ配列を検出する直接
スクリーニングを可能とする。さらにこれは、坑ウイルス治療の効果を評価する
改良方法として、患者の体内を循環しているウイルスを直接モニターすることを
可能とする。同様に、リューケミア関連ウイルス、ＨＬＴＶ−IやＨＬＴＶ−II をこの方法で検出することができる。バクテリア感染症、例えば、結核、クリミ
ディアおよび他の性的伝染症も、例えば標的配列としてリボソーマルＲＮＡ（ｒ
ＲＮＡ）を使用して検出できる。
【０４２７】 好ましいある実施態様では、本発明の各核酸は、水あるいは食品サンプルのス
クリーニングにおいて毒性バクテリアのプローブとしても使用される。例えば、
各サンプルは、バクテリアを溶解処理してその核酸（殊にｒＲＮＡ）を遊離させ
、次いでバクテリア株を認識するようにプローブをデザインする。但し、該バク
テリアは、Salmonella, Campylobacter, Vibrio cholerae, Leishmania, 腸毒 性のE. Coli株、およびレジオネア病バクテリア、などの病原性株を含むがそれ らに限定はされない。同様にして、本発明の組成物を使用して生体治癒戦術を、
評価できる。
【０４２８】 さらなる実施態様では、犠牲者や容疑者から採取したサンプルについて、犯罪
−現場を一致させる法医学的「ＤＮＡ指紋鑑定」に使用される。
【０４２９】 さらなる実施態様では、あるアレイ配列のプローブは、ハイブリダイゼーショ
ンによる配列決定に使用される。
【０４３０】 このように、本発明は、ある実施態様においては、ハイブリダイズしていない
プローブを除去することなく標的配列を検出し得る、極めて特異的で感受性の高
いプローブを提供するものである。これは、自動化遺伝子プローブアッセイの形
成に有用である。
【０４３１】 あるいは、本発明の組成物は、ＰＣＲにおける成功した遺伝子増幅を検出する
のに有用であり、かくして成功したＰＣＲ反応を標的配列の存在または不存在の
指標とすることができる。ＰＣＲはこのような手法で数種の方法に使用される。
例えば、ある実施態様では、このＰＣＲ反応は当技術分野で知られているように
して実施され、次いで、標的核酸とＥＴＭとを含む本発明の組成物に加え、導電
性オリゴマーを介して電極に共有結合させ、続いて標的配列を検出する。あるい
は、ＥＴＭで標識化したヌクレオチドを用い、電極の存在下にまたは続いて電極
を加えるかのいずれかで、導電性オリゴマー及び標的核酸とともにＰＣＲを実施
する。ＥＴＭを含有するＰＣＲ生成物の電極組成物との結合は、電子移動により
検出される。最終的に、導電性ポリマーを介して電極に結合した核酸は、ＥＴＭ
で標識化した第二プライマーの添加により、ＰＣＲプライマーの１種となるだろ
う。伸長させると、ＥＴＭおよび共有結合した電極を有する２本鎖核酸を生じる
。このような方法で、本発明は各標的配列のＰＣＲ検出に使用される。
【０４３２】 好ましいある実施態様では、これらの配列はｍＲＮＡ検出に使用される。好ま
しいある実施態様は、これらのｍＲＮＡの３’ポリアデニル化末端近くにハイブ
リダイズする捕獲プローブまたは捕獲伸長プローブのいずれかを利用するもので
ある。これにより、標的結合プローブの１種、即ち、ｍＲＮＡ標的のポリ−Ａ末
端と結合するポリ−Ｔ部分を含有するプローブ、を標的に使用することが可能と
なる。一般的に、このプローブは、好ましくは非ポリ−Ｔであり、検出プローブ
（または他のプローブ）と結合する第二部分、を含有する。これにより、１種標
的結合プローブの調製、および、異種プローブ合成実施量の減少が可能となる。
【０４３３】 好ましいある実施態様では、制限酵素およびライゲーション手法を使用するこ
とにより、「ユニバーサル」アレイ配列の創製が可能となる。この実施態様では
、第７図に一般的に示した、制限エンドヌクレアーゼ末端を含む捕獲プローブを
含む単層である。核酸の相補的部分を利用することにより、「粘着性末端」を残
しつつ、制限エンドヌクレアーゼ部位のすべてを含むアレイ配列が調製される。
これらの制限エンドヌクレアーゼの１種またはそれ以上で標的サンプルを処理す
ることにより、それらの標的をアレイ配列に結合させることが可能となる。これ
は、標的の配列を知らなくても実施できる。それらの標的は、所望により、標準
的手法例えばリガーゼを用いてライゲートされ得、そして標準的標識または本発
明方法のいずれかを使用して標的配列を検出できる。
【０４３４】 本発明は、核酸類を感受性よく検出し得る方法を提供するものである。好まし
い実施態様では、約１０×１０6以下、好ましくは約１０×１０5以下、より好ま
しくは約１０×１０4以下、特に好ましくは約１０×１０3以下、最も好ましくは
約１０×１０2以下の分子が検出される。これは標的配列とレポーター分子との １：１相関を推認するものであり、もし各標的配列に対して１以上のレポーター
分子（即ち、電子伝達分子）を使用すれば、感受性がより高くなるはずであるこ
とは、当業者には明かであろう。
【０４３５】 現今、検出限界は刊行物発表されたＤＮＡを介しての電子伝達率に基づいて評
価されており、それは大まかに言って、８ベースペア分離につき１×１０6電子 ／秒／デュープレックスであり（Meade et al., Angw. Chem. Eng. Ed., 34:352
(1995)参照) 、高い推進力、約１００ｋＨｚのＡＣ振動数を可能とするもので ある。予試験結果が示しているように、これらのシステムを介しての電子伝達は
、極めて効率的であり、ほぼ１００×１０3電子／秒に達し、非常に僅かの分子 に対しても有力でフェムトアンプな感受性をもたらす。
【０４３６】 本明細書中に概説した方法以外にも、本発明はさらに、組成物、一般的には本
発明の実用化に有用なキット類を提供するものである。これらのキットは、各プ
ライマー及び酵素類を任意の試薬や緩衝剤とともに含有し、さらなる酵素類やプ
ライマー類、ｄＮＴＰおよび／または各ＮＴＰ（置換されたヌクレオチド類を含
む）、緩衝剤、塩類、阻害剤、その他を含有する組成物を含むものである。これ
らのキットは、所望により該キットの使用方法の指示書を含み得る。
【０４３７】 以下の実施例は、上記本発明の使用方法をより詳しく記述しようとするもので
あり、また、本発明の各種態様を実施するために最良と思われる方法を記載する
ものである。これらの実施例は、如何なる意味においても本発明の真の範囲を限
定しようとするものではなく、例示説明の目的で記載したものと理解されるべき
である。本明細書中に引用したすべての参照文献は、参照によりそれらの全部を
本書中の記載として導入する。
【０４３８】 実施例 実施例１ ２’位でフェロセンにより修飾したヌクレオシドの合成
【０４３９】 Ｎ６の製造を記載する。
【０４４０】 化合物Ｎ６．フェロセン（２０ｇ、１０８mmol）および４−ブロモブチルクロ
リド（２０ｇ、１０８mmol）を、４５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、次いで
無水ＡｌＣｌ3（１４．７ｇ、１１mmol）を加える。反応混合物を室温で１時間 ４０分攪拌し、次いで６００ｍＬの氷を加えて急冷する。有機層を分離し、水層
が中性（ｐＨ＝５）近くになるまで水洗する。有機層はＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濃
縮する。粗製生成物を、５０／５０ヘキサン／ジクロロメタン、続いて３０／７
０ヘキサン／ジクロロメタン／により３００ｇｍのシリカゲル上で溶出するフラ
ッシュクロマトグラフィーで精製し、標題の化合物を２６．４ｇｍ（７３％）得
る。
【０４４１】 化合物Ｎ２．化合物Ｎ１（６ｇ、１８mmol）を丸底フラスコ中のトルエン１２
０ｍＬに溶解する。亜鉛（３５．９ｇ、５５mmol）、塩化水銀（３．３ｇ、１２
mmol）および水（１００ｍＬ）を順次加える。それからＨＣｌ溶液（１２Ｍ、８
０ｍＬ）を滴下する。反応混合物を１６時間室温で攪拌する。有機層を分離し、
水（２×１００ｍＬ）で洗い、濃縮する。さらに２７０ｇｍのシリカゲル上でフ
ラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン）によって精製し、目的の化合物を褐色
の固形物として（３．３ｇ、５８％）得る。
【０４４２】 化合物Ｎ３．乾燥ＤＭＦ４００ｍＬ中にアデノシン１３．６ｇｍ（５１mmol）
を含む混合物を氷水浴中で１０分間冷却してから、ＮａＨ（６０％）３．０ｇｍ
（７６mmol）を加える。反応混合物を０℃で１時間攪拌してから、化合物Ｎ２（
１６．４ｇ、５１mmol）を加える。次いで、温度を緩やかに上げて３０℃とし、
反応混合物をこの温度に４時間保持してから、氷１００ｍｌで急冷する。溶媒を
真空で蒸発させる。得られたゴム状物を水３００ｍＬと酢酸エチル３００ｍＬと
に溶解する。水層を完全に抽出する（酢酸エチル３×３００ｍＬ）。集めた有機
抽出物を濃縮し、粗製生成物を、２７０ｇのシリカゲル上でフラッシュクロマト
グラフィーで精製する。このカラムを２０％酢酸エチル／ジクロロメタン、５０
％酢酸エチル／ジクロロメタン、７０％酢酸エチル／ジクロロメタン、酢酸エチ
ル、１％メタノール／酢酸エチル、３％メタノール／酢酸エチル、および５％メ
タノール／酢酸エチルで溶出する。所望の画分を濃縮して目的化合物（６．５ｇ
、２５％）得る。
【０４４３】 化合物Ｎ４．化合物Ｎ３（６．５ｇ、１２．８mmol）を乾燥ピリジン１５０ｍ
Ｌ中に溶解し、ＴＭＳＣｌ（５．６ｇ、５１．２mmol）を加える。反応混合物を
室温で１．５時間攪拌する。次いで、フェノキシアセチルクロリド（３．３ｇ、
１９．２mmol）を０℃で加える。次いで、反応混合物を室温で４時間攪拌し、０
℃で水１００ｍＬを加えて急冷する。溶媒を減圧下に除去し、粗製ゴム状物をさ
らに９０ｇのシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー精製する。（１％メ
タノール／ジクロロメタン）（２．３ｇ、２８％）
【０４４４】 化合物Ｎ５．化合物Ｎ４（２．２ｇ、３．４mmol）およびＤＭＡＰ（２００ｍ
ｇ、１．６mmol）を乾燥ピリジン１５０ｍＬ中に溶解し、ＤＭＴＣｌ（１．４ｇ
、４．１mmol）を加える。反応混合物を室温で１夜、アルゴン気流中で攪拌する
。溶媒を減圧下に除去し、残査を２５０ｍＬのジクロロメタンに溶解する。有機
溶液を５％ＮａＨＣＯ3溶液（３×２５０ｍＬ）で洗い、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し 、それから濃縮する。さらに５５ｇのシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフ
ィー（１％ＴＥＡ／５０％ヘキサン／ジクロロメタン）によって精製し、目的の
化合物（１．３ｇ、４１％）を得る。
【０４４５】 化合物Ｎ６．ジクロロメタン１５０ｍＬ中にＮ５（３．３０ｇｍ、３．５０mm
ol）を含有する溶液中に、ジイソプロピルエチルアミン（４．８７ｍＬ、８．０
eq.)およびＤＭＡＰの触媒量（２００mg）を加える。混合物を０℃に保ち、Ｎ，
Ｎ−ジイソプロピルアミノ シアノエチル フォスフォンアミジン酸クロリド（
２．３４ｍＬ、１０．４８mmol）を加える。反応混合物を加温し、室温で１夜攪
拌する。ジクロロメタン１５０ｍＬおよび５％ＮａＨＣＯ3水溶液２５０ｍＬを 加えて希釈したのち、有機層を分離し、５％ＮａＨＣＯ3（２５０ｍＬ）で洗い 、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、それから濃縮する。粗製生成物を６６ｇのシリカゲル
を１％ＴＥＡヘキサン溶液を用いて充填したフラッシュカラムで精製する。溶出
溶媒は、１％ＴＥＡヘキサン溶液（５００ｍＬ）、１％ＴＥＡおよび１０％ジク
ロロメタンのヘキサン溶液（５００ｍＬ）、１％ＴＥＡおよび２０％ジクロロメ
タンのヘキサン溶液（５００ｍＬ）、１％ＴＥＡおよび５０％ジクロロメタンの
ヘキサン溶液（５００ｍＬ）である。目的化合物を含む画分を集め、濃縮して、
目的の化合物（３ｇｍ、７５％）を得る。
【０４４６】 実施例２「 分枝した」ヌクレオシドの合成
【０４４７】 図１１Ａに示す、Ｎ１７の製造を記載する。
【０４４８】 化合物Ｎ１４の合成．第三級ブチルジメチルシリルクロリド（３３．３８g、 ０．２２mol）のジクロロメタン３００ｍＬ溶液中に、イミダゾール（３７．６ ９ｇ、０．５５mol）を加える。直ちに大量の沈殿が生成する。２−ブロモエタ ノール（２７．６８ｇ、０．２２mol）を室温でゆっくり加える。反応混合物を この温度で３時間攪拌する。有機層を水（２００ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ3（２ ×２５０ｍＬ）、および水（２００ｍＬ）で洗う。溶媒を除去し、標題の化合物
５２．５２ｇを得る（９９％）。
【０４４９】 化合物Ｎ１５の合成．ＤＭＦ１．０Ｌ中にアデノシン（４０g、０．１５mol）
を分散させた液中に、０℃でＮａＨ（６０％鉱物油溶液を８．９８ｇｍ、０．２
２mol）を加える。混合物を０℃で１時間攪拌し、Ｎ１４（３５．７９ｇｍ、０ ．１５mol）を加える。反応混合物を３０℃で１夜攪拌する。氷水１００ｍＬを 加えて急冷する。溶媒を高真空下に除去する。残留する泡状物を８００ｍｌの酢
酸エチルと水７００ｍＬの混合液に溶解させる。水層をさらに酢酸エチル（３×
２００ｍＬ）で抽出する。集めた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮する。粗
製生成物を、３００ｇのシリカゲルを１％ＴＥＡヘキサン溶液を用いて充填した
フラッシュカラムで精製する。溶出溶媒は、ジクロロメタン（５００ｍＬ）、３
％ＭｅＯＨジクロロメタン溶液（５００ｍＬ）、５％ＭｅＯＨジクロロメタン溶
液（５００ｍＬ）、８％ＭｅＯＨジクロロメタン溶液（２０００ｍＬ）である。
目的の画分を集め、濃縮して、標題の化合物１１．７０ｇ（１９％）を得る。
【０４５０】 化合物Ｎ１６の合成．０℃に冷却したＮ１５（１１．５０ｇｍ、２７．１７mm
ol）の乾燥ピリジン３００ｍＬ溶液中に、トリメチルシリルクロリド（１３．７
１ｍＬ、０．１１mol、４．０）を加える。混合物を０℃で４０分間攪拌する。 フェノキシアセチルクロリド（９．３８ｍＬ、６７．９３mmol）を加える。反応
混合物を０℃で２．５時間攪拌する。混合物を次いでジクロロメタン７００ｍＬ
と水１００ｍＬの混合液に移す。混合物をよく振り混ぜ、有機層を分離する。５
％ＮａＨＣＯ3（２×３００ｍＬ）で２回洗浄したのち、ジクロロメタンをロー トベーパーで除去する。残査に水２００ｍＬを加え、得られたピリジン混合物を
室温で２時間攪拌する。次いで、溶媒を高真空下に除去する。ゴム状生成物をピ
リジン１００ｍＬとともに共留蒸発させる。残査を乾燥ピリジン２５０ｍＬ中に
０℃で溶解させ、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１１．０２gｍ、３ ２．６０mmol）を加える。反応物を室温で１夜攪拌する。溶液をジクロロメタン
７００ｍＬと５％ＮａＨＣＯ3５００ｍＬとの混合液に移す。よく振り混ぜたの ち、有機層を分離し、さらに５％ＮａＨＣＯ3（２×２００ｍＬ）で洗浄し、次 いで濃縮する。粗製生成物を、２７０ｇのシリカゲルを１％ＴＥＡ／３０％ＣＨ 2 Ｃｌ2／ヘキサン溶液を用いて充填したフラッシュカラムで精製する。溶出溶媒
は、１％ＴＥＡ／５０％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサン（１０００ｍＬ）、１％ＴＥＡ／
ＣＨ2Ｃｌ2（２０００ｍＬ）である。目的生成物を含有する画分を集め、濃縮し
て、標題の化合物１０．０ｇ（４３％）を得る。
【０４５１】 化合物Ｎ１７の合成．Ｎ１６（１０．０ｇｍ、１１．６０mmol）のジクロロメ
タン３００ｍＬ溶液中に、ジイソプロピルエチルアミン（１６．２ｍＬ）および
触媒量のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（２００mg)を加える。混合物を氷水 浴中で冷却し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ シアノエチル フォスフォンア
ミジン酸クロリド（７．７８ｍＬ、３４．８２mmol）を加える。反応混合物を室
温で１夜攪拌する。反応混合物にジクロロメタン２５０ｍＬおよび５％ＮａＨＣ
Ｏ3２５０ｍＬを加えて希釈する。よく振り混ぜたのち、有機層を分離し、同量 の５％ＮａＨＣＯ3水溶液でもう一度洗い、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮する。 粗製生成物を１２０ｇのシリカゲルを１％ＴＥＡおよび１０％ジクロロメタンの
ヘキサン溶液使用して充填したフラッシュカラムで精製する。溶出溶媒は、１％
ＴＥＡおよび１０％ジクロロメタンのヘキサン溶液（５００ｍＬ）、１％ＴＥＡ
および２０％ジクロロメタンのヘキサン溶液（５００ｍＬ）、および、１％ＴＥ
Ａおよび４０％ジクロロメタンのヘキサン溶液（１５００ｍＬ）である。該当画
分を集め、濃縮して、最終目的物（７．３７ｇｍ、６０％）を得る。
【０４５２】 分枝に使用する他の２種のヌクレオチドの合成を、Ｌｅｖ保護基を用いる場合
について図１１Ｂおよび１１Ｃに示す。これらの分枝ヌクレオチドは、リボース
（Ｎ１７）よりむしろフォスフェートから分枝し、いくらか良い結果を生じるよ
うである。
【０４５３】 実施例３ ＥＴＭを含有するトリフォスフェートヌクレオチドの合成
【０４５４】 ＡＦＴＰの合成を記載する。
【０４５５】 Ｎ３（１．００ｇ、１．９７mmol）を１５ｍＬのトリエチルフォスフェートに
溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（０．６９ｍＬ、３．９mmol）を加える。
混合物を０℃に保ちながら、フォスフェラスオキシクロリド（０．４５ｇ、２．
９３mmol）を加える。反応混合物を０℃で４時間、次に４℃で１夜攪拌する。ビ
ス（トリブチル）アンモニウムフォスフェート（３．２４ｇ、５．９１mmol）を
加え、反応混合物を０℃で６時間、次に４℃で１夜攪拌する。反応液中に生成し
た白色沈殿を濾去する。濾液を水（２０ｍＬ）で処理すると、黄色の沈殿が生成
する。沈殿を濾取し高真空下に乾燥し、標題化合物の黄色固形物０．６３ｇを得
る。
【０４５６】 実施例４ フォスフェートを介してフェロセンを結合しているヌクレオシドの合成
【０４５７】 Ｙ６３の合成を記載する。
【０４５８】 Ｃ１０２の合成：１０．５ｇｍ（３２．７mmol）のＮ２、１６ｇｍの酢酸カリ
ウム、および３５０ｍｌのＤＭＦからなる反応混合物を、１００℃で２．５時間
攪拌する。反応混合物を室温まで放冷し、次いで４００ｍｌのエーテルと８００
ｍｌの水の混合液中に注ぎ込む。混合物を振り混ぜ、有機層を分離する。水層を
２回エーテルで抽出する。エーテル抽出液を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥し
、次いでカラムクロマトグラフィーのために濃縮する。シリカゲル（１６０ｇｍ
）を１％ＴＥＡ／ヘキサンを用いて充填する。粗製物を負荷し、カラムを１％Ｔ
ＥＡ／０−１００％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンで溶出する。目的物を含有する画分を
集め、濃縮してＣ１０２を５．８ｇ（５９．１％）得る。
【０４５９】 Ｙ６１の合成：Ｃ１０２を５．１ｇｍ（１７．０mmol）含有するフラスコにジ
オキサン３０ｍｌを加える。この溶液に１ＭのＮａＯＨ少量を２．５時間を要し
て、または加水分解が完了するまで加える。加水分解後、生成物をヘキサンで抽
出する。集めた抽出液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、クロマトグラフィーのため
に濃縮する。シリカゲル（１００ｇｍ）を１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いて
充填する。粗製物溶液を負荷し、カラムを１０％ないし５０％ＥｔＯＡｃのヘキ
サン溶液で溶出する。目的物を含有する画分を集め、濃縮してＹ６１を４．２０
ｇｍ（９６．１％）得る。
【０４６０】 Ｙ６２の合成：Ｙ６１を４．１０ｇｍ（１５．９mmol）含有するフラスコに、
ジクロロメタン２００ｍｌ、７．７２ｍｌのＤＩＰＥＡ、および４．２４ｇｍ（
１５．９mmol）のビス（ジイソプロピルアミノ）クロロフォスフィンを加える。
この反応混合物をアルゴンの存在下に１夜攪拌する。反応混合物をもとの容量の
３分の１に濃縮したのち、ヘキサン２００ｍｌを加え、次いで反応混合物を再度
もとの容量の３分の１に濃縮する。この操作をもう一度繰り返す。沈殿した塩を
濾去し、溶液を濃縮して粗製のＹ６２を８．２４ｇｍ得る。この生成物は、さら
に精製することなく次の段階に使用する。
【０４６１】 Ｙ６３の合成：Ｎ−ＰＡＣデオキシ−アデノシン１．０ｇｍ（１．４５mmol）
、１．７７ｇの粗製Ｙ６２、および１２５ｍｇのＮ，Ｎ−ジイソプロピルアンモ
ニウムテトラゾリド、および１００ｍｌのジクロロメタンを含有する反応混合物
。この反応混合物を室温で１夜攪拌する。次いで、この反応混合物を１００ｍｌ
のＣＨ2Ｃｌ2および１００ｍの５％ＮａＨＣＯ3溶液で希釈する。有機相を分離 し、硫酸ナトリウム上で乾燥する。次いで、溶液をカラムクロマトグラフィーの
ために濃縮する。シリカゲル（３５ｇｍ）を１０％ＴＥＡ／ヘキサンを用いて充
填する。粗製物を１％ＴＥＡ／１０−４０％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンで溶出する。
生成物を含有する画分を集め、濃縮して標題生成物０．２５ｇｍを得る。
【０４６２】 実施例５ エチレングリコール末端化ワイヤーＷ７１の合成
【０４６３】 Ｗ５５の合成：フラスコに、第３級ブチルジフェニルクロロシラン７．５ｇｍ
（２７．３mmol）、トリ（エチレングリコール）２５．０ｇｍ（１６６．５mmol
）、および乾燥ＤＭＦ５０ｍｌをアルゴン雰囲気下に加える。混合物を攪拌し、
氷水浴中で冷却する。このフラスコに、別の漏斗から５．１ｇｍ（３０．０mmol
）のＡｇＮＯ3をＤＭＦ８０ｍｌに溶かした澄明な溶液を滴下する。添加完了後 、混合物を室温に温まるまで放置し、さらに３０分間攪拌する。褐色のＡｇＣｌ
沈殿を濾取し、ＤＭＦ（３×１０ｍＬ）で洗浄する。減圧下に溶媒を除去すると
、粘凋なシロップ様液体生成物が得られるので、これを約８０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2 に溶解する。溶液を水（６×１００ｍＬ）で洗浄し、未反応の原料物質、即ちト
リス（エチレングリコール）を除去し、次いでＮａ2ＳＯ4上で乾燥する。ＣＨ2 Ｃｌ2を除去すると、〜１０．５ｇの粗製物が得られ、このものを５０％ＣＨ2Ｃ
ｌ2／ヘキサンを用いて充填したシリカゲル１０４ｇを含有するカラムで精製す る。このカラムは３−５％ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2で溶出する。目的物を含有する
画分を集め、濃縮し、精製した標題生成物８．０１ｇｍ（７５．５％）を得る。
【０４６４】 Ｗ６８の合成：８．０１ｇｍ（２０．６０mmol）のＷ５５を含有するフラスコ
に、８．５６ｇｍ（２５．８mmol）のＣＢｒ4および６０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を加 える。混合物を氷水浴中で攪拌する。この溶液にゆっくりと８．１１ｇｍ（３１
．０mmol）のＰＰｈ3を含むＣＨ2Ｃｌ2１５ｍｌ溶液を加える。混合物を０℃で 約３５分間攪拌し、そして室温に温まるまで放置する。混合物の容積を約１０．
０ｍｌまで減らし、エーテル７５ｍｌを加える。沈殿を濾取し、エーテル２×７
５で洗浄する。エーテルを留去すると約１５ｇの粗製物が得られるのでこれを精
製に用いる。ヘキサンを用いてシリカゲル（１０５ｇｍ）を充填する。サンプル
溶液を負荷したのち、カラムを５０％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサン、次いでＣＨ2Ｃｌ2 で溶出する。目的の画分を集め、濃縮し、精製した標題生成物８．５６ｇｍ（７
２．０％）を得る。
【０４６５】 Ｗ６９の合成：５．２ｇｍ（２３．６mmol）の４−ヨードフェノールを含有す
る乾燥ＤＭＦ５０ｍｌ溶液を、Ａｒ下氷水浴中で冷却する。この混合液に１．０
ｇｍのＮａＨ（鉱物油中６０％、２５．５mmol）を少しづつ加える。混合物を約
５分間同温度で攪拌し、さらに室温で３０分間攪拌する。８．６８ｇｍ（１９．
２mmol）のＷ６８を含有するＤＭＦ２０ｍｌ溶液を、アルゴン雰囲気でフラスコ
に加える。このフラスコをアルミニウムホイルで覆い、混合物を５０℃で１２時
間攪拌する。ＤＭＦを減圧下に除去する。残査を３００ｍｌの酢酸エチルに溶解
し、溶液を水（６×５０ｍＬ）で洗浄する。酢酸エチルを減圧下に除去し、残査
を精製のために、３０％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンで充填した１００ｇのシリカゲル
カラム中に負荷する。カラムを３０−１００％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンで溶出する
。目的生成物を含有する画分を集め、濃縮し、標題生成物９．５ｇｍ（８４．０
％）を得る。
【０４６６】 Ｗ７０の合成：６．８９ｇｍ（１１．６mmol）のＷ６９を含有する１００ｍｌ
容丸底フラスコに、３０ｍｌのＴＢＡＦ ＴＨＦ溶液を加える。溶液を室温で５
時間攪拌する。ＴＨＦを除去し、残査をＣＨ2Ｃｌ2１５０ｍｌに溶解する。溶液
をＨ2Ｏ（４×２５ｍＬ）で洗浄する。溶媒を除去すると１０．５ｇｍの半固体 が得られる。５０％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンを用いてシリカゲル（６５ｇｍ）を充
填する。サンプル溶液を負荷したのち、カラムを０−３％ＣＨ3ＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ 2 で溶出する。各画分をＴＬＣ（ＣＨ3ＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2＝５：９５）で同定する
。目的生成物を含有する画分を集め、濃縮し、標題生成物４．１０ｇｍ（９９．
０％）を得る。
【０４６７】 Ｗ７１の合成：１．１２ｇｍ（３．１８mmol）のＷ７０、０．２３ｇ（０．８
８mmol）のＰＰｈ3、１１０ｍｇ（０．１９mmol）のＰｄ（ｄｂａ）2、１１０ｍ
ｇ（０．５７mmol）のＣｕｌ、および０．７５ｇ（３．２mmol）のＹ４（１ユニ
ットワイヤー）をフラスコに加える。このフラスコにアルゴンをフラッシュし、
次いで乾燥ＤＭＦ６５ｍｌ、続けてジイソプロピルアミン２５ｍｌを導入する。
混合物を５５℃で２．５時間攪拌する。全溶媒を減圧下に除去する。残査をＣＨ 2 Ｃｌ2１００ｍｌに溶解し、溶液を飽和ＥＤＴＡ溶液（２×１００ｍＬ）で完全
に洗浄する。ＣＨ2Ｃｌ2を除去すると２．３ｇ粗製物が得られる。５０％ＣＨ2 Ｃｌ2／ヘキサンを用いてシリカゲル（３０ｇｍ）を充填し、サンプル溶液を負 荷したのち、カラムを１０％酢酸エチル／ＣＨ2Ｃｌ2で溶出する。目的生成物を
含有する画分を濃縮し、標題生成物１．３５ｇｍ（２．９４mmol）を得る。この
ものはさらに熱ヘキサン溶液から再結晶して精製すると無色結晶となる。
【０４６８】 実施例６ 絶縁体に結合したヌクレオシドの合成
【０４６９】 Ｃ１０８の合成：フラスコに、２’−アミノ−５’−Ｏ−ＤＭＴウリジン２．
０ｇｍ（３．６７mmol）、１．６３ｇｍ（３．８１mmol）のＣ４４、ＴＥＡ５ｍ
ｌ、およびジクロロメタン１００ｍｌを加える。この反応混合物を室温で７２時
間攪拌する。溶媒を除去し、少量のＣＨ2Ｃｌ2に溶解する。２％ＣＨ3ＯＨ／１ ％ＴＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2を用いてシリカゲル（３５ｇｍ）を充填し、サンプル溶液
を負荷したのち、カラムを同溶媒系で溶出する。目的物を含有する画分を集め、
濃縮し、標題生成物２．５ｇｍ（８０．４％）を得る。
【０４７０】 Ｃ１０９の合成：フラスコに、２．４ｇｍ（２．８０mmol）のＣ１０８、ジイ
ソプロピルエチルアミン４ｍｌ、およびＣＨ2Ｃｌ2８０ｍｌを、アルゴンの存在
下に加える。この反応混合物を氷水浴で冷却する。一度冷却後、２−シアノエチ
ルジイソプロピルクロロ−フォスフォルアミド２．１０ｇｍ（８．８３mmol）を
加える。次いで混合物を１夜攪拌する。反応混合物を１０ｍｌのメタノールおよ
び１５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を加えて希釈する。この混合物を５％ＮＨＣＯ3溶液 で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、次いでカラムクロマトグラフィーのため
に濃縮する。１％ＴＥＡおよびヘキサンを用いてシリカゲル６５ｇｍを充填する
。粗製物を負荷し、カラムを１％ＴＥＡ／０−２０％ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンで溶
出する。目的物を含有する画分を集め、濃縮し、標題生成物２．６９ｇｍ（９０
．９％）を得る。
【０４７１】 実施例７ 各種ＥＴＭ結合物の比較
【０４７２】 図１に示した各種ＥＴＭ結合物を比較した。表１に示すように検出プローブは
電極表面に結合させた（表中ワイヤーを含む配列）。ポジティブ（即ち検出プロ
ーブに相補的なプローブ）およびネガティブ（即ち検出プローブに相補的でない
プローブ）コントロール標識プローブを添加した。
【０４７３】 本発明の各種組成物を含有する電極を調製し、ＡＣ検出法に使用した。実験は
下記のようなランであった。ワーキング（サンプル）電極と対照電極との間のＤ
Ｃオフセット電圧を、フェロセンの電気化学的ポテンシャルで消去すると、典型
的には０ないし５００ｍＶであった。ＤＣオフセットのトップで、振幅および振
動数可変のＡＣシグナルを適用した。励起振動数におけるＡＣ電流をＤＣオフセ
ットに対してプロットした。
【０４７４】 その結果を表２に示すが、Ｙ６３、VIおよびIV化合物が最良結果を示した。
【０４７５】
【表１】 不明：ポジティブコントロールとネガティブコントロールとの間に相違がない。
ＮＤ：測定せず。
【０４７６】 異なる金属錯体を含むオリゴヌクレオチドの表
【表２】
【表３】
【０４７７】 実施例８ 本発明の好ましい実施態様
【０４７８】 各種の系を実験し、以下に概要を示したように、いずれも好適に実施できた。
全化合物を図１９で参照した。一般的にこれらの系は以下のように実施した。前
述したように、電極、結合リンカーを介して付着させたキャプチャープローブ、
導電性オリゴマー、および絶縁体を含む、各表面を調製した。この系の、標的配
列、キャプチャーエクステンダープローブ、および標識プローブを含む、他の構
成成分は、混入し、一般的に９０℃で５分間アニール処理し、その後１時間で室
温まで放冷した。混合物を次いで電極に加え、ＡＣ検出を実施した。
【０４７９】 キャプチャープローブ、キャプチャーエクステンダープローブ、非標識標的配 列、及び標識プローブ ： 実施例１６の方法を使用して、２５塩基配列を含むキャプチャープローブＤ１
１２を、導電性オリゴマーＹ５およびＭ４４絶縁体と、２：２：１の割合で混合
した。２４塩基配列を含み完全にＤ１１２キャプチャープローブと相補的であり
、２４塩基配列を含み完全に２ｔａｒ標的と相補的な、シングルベースにより分
離したキャプチャーエクステンダープローブＤ１７９を、２ｔａｒ標的とともに
加える。このＤ１７９分子は、電極に最も近い末端にフェロセンを保持（塩基に
対しＣ１５連結を用いて）している。結合リンカーが導電性オリゴマーである場
合、この位置またはそれに近接する位置にＥＴＭを使用すると、Ｄ１７９分子の
存在の証明を可能とする。この位置のフェロセンは、検出に用いた各ＥＴＭとは
異なるレドックスポテンシャルを有する。標的配列のある部分と完全に相補的な
１８塩基配列、１３塩基配列のリンカー、および枝分かれ配位を用いて結合して
いる４つのフェロセンを含む、標識プローブＤ３０９（デンドリマー）を加える
。代表的なスキャンを図２０Ａに示す。２ｔａｒ標的を加えなかった場合、代表
的なスキャンを図２０Ｂに示す。
【０４８０】 キャプチャープローブおよび標識した標的配列の使用 実施例Ａ ：上記したように、キャプチャープローブＤ９４を、Ｙ５およびＭ４４
導電性オリゴマーとともに、２：２：１の割合で、合計チオール濃度８３３μＭ
で、電極上に加える。Ｄ９４キャプチャープローブと完全に相補的な１５塩基配
列、１４塩基リンカー配列、およびＮ６化合物を介して連結している６つのフェ
ロセン、を含む標的配列（Ｄ３３６）を使用した。代表的なスキャンを図２０Ｃ
に示す。標的配列とのホモロジーを有しない、異なるキャプチャープローブ、Ｄ
１０９の使用は、ネガティブコントロールとして働く：代表的なスキャンを図２
０Ｄに示す。
【０４８１】実施例Ｂ ：上記したように、キャプチャープローブＤ９４を、Ｙ５およびＭ４４
導電性オリゴマーとともに、２：２：１の割合で、合計チオール濃度８３３μＭ
で、電極上に加える。Ｄ９４キャプチャープローブと完全に相補的な１５塩基配
列、Ｎ６化合物を介して連結している６つのフェロセンにフックしているＣ１３
１エチレングリコールリンカー、を含む標的配列（Ｄ４２９）を使用した。代表
的なスキャンを図２０Ｅに示す。標的配列とのホモロジーを有しない、異なるキ
ャプチャープローブ、Ｄ１０９の使用は、ネガティブコントロールとして働く：
代表的なスキャンを図２０Ｆに示す。
【０４８２】 キャプチャープローブ、キャプチャーエクステンダープローブ、非標識標的配 列、および、標的結合配列と各ＥＴＭとの間に長いリンカーを有する２種の標識 プローブの使用 上記したように、キャプチャープローブＤ１１２、Ｙ５導電性オリゴマー、Ｍ
４４絶縁体、およびキャプチャーエクステンダープローブＤ１７９を使用する。
２種の標識プローブ：標的配列のある部分と完全に相補的な１８塩基配列、１５
塩基配列リンカー、および図２３に示すようにＮ６連結を用いて結合している６
つのフェロセン、を含むＤ２９５、を加える。Ｄ２９７は、その１８塩基配列が
標的配列の他の部分とハイブリダイズしていること以外は同一である。代表的な
スキャンを図２０Ｇに示す。２ｔａｒ標的を加えなかった場合、代表的なスキャ
ンを図２０Ｈに示す。
【０４８３】 キャプチャープローブ、キャプチャーエクステンダープローブ、非標識標的配 列、および、標的結合配列と各ＥＴＭとの間に短いリンカーを有する２種の標識 プローブの使用 上記したように、キャプチャープローブＤ１１２、Ｙ５導電性オリゴマー、Ｍ
４４絶縁体、およびキャプチャーエクステンダープローブＤ１７９を使用する。
２種の標識プローブ：標的配列のある部分と完全に相補的な１８塩基配列、５塩
基配列リンカー、および図２３に示すようにＮ６連結を用いて結合している６つ
のフェロセン、を含むＤ２９６、を加える。Ｄ２９８は、その１８塩基配列が標
的配列の他の部分とハイブリダイズしていること以外は同一である。代表的なス
キャンを図２０Ｉに示す。２ｔａｒ標的を加えなかった場合、代表的なスキャン
を図２０Ｊに示す。
【０４８４】 ２種のキャプチャープローブ、２種のキャプチャーエクステンダープローブ、 非標識大型標的配列、および、標的結合配列と各ＥＴＭとの間に長いリンカーを 有する２種の標識プローブの使用 このテストは、ｒＲＮＡ検出を目的とした。上記したように、Ｙ５導電性オリ
ゴマー、Ｍ４４絶縁体、および、２種のキャプチャー配列Ｄ４１７およびＥＵ１
と相補的な１種の表面プローブＤ３５０を使用した。Ｄ３５０、Ｙ５及びＭ４４
は、０．５：４．５：１の比率で加えた。２種のキャプチャーエクステンダープ
ローブ：Ｄ３５０キャプチャープローブと相補的な１６塩基、および標的配列と
相補的な２１塩基を有するＤ４１７、および、Ｄ３５０キャプチャープローブと
相補的な１６塩基、および標的配列の他の部分と相補的な２３塩基を有するＥＵ
１、を使用した。 ２種の標識プローブ：標的配列のある部分と完全に相補的な３０塩基配列、図１
９に示す３グレン（ＧＬＥＮ）を含むリンカー（ポリエチレングリコールを含む
）、およびＮ６を用いて結合している６つのフェロセン、を含むＤ４６８、を加
える。Ｄ４４９は、その２８塩基配列が標的配列の他の部分とハイブリダイズし
ていること以外は同一であリ、使用したポリエチレングリコールリンカー（Ｃ１
３１）はそれより短い。代表的なスキャンを図２０Ｋに示す。
【０４８５】 キャプチャープローブ、非標識標的、および、標識プローブの使用 実施例Ａ ：キャプチャープローブＤ１１２、Ｙ５導電性オリゴマー、およびＭ４
４絶縁体を、とともに、２：２：１の割合で、合計チオール濃度８３３μＭで、
電極上に置く。Ｄ１１２と相補的な配列を含む標的配列ＭＴ１を加え、さらに標
識プローブＤ３５８と相補的な２０塩基配列を合わせた：この場合、標識プロー
ブＤ３５８は、電極へ導入する前に標的配列に加えた。この標識プローブは、図
２３に示すように、Ｎ６連結を用いて結合している６つのフェロセンを含有する
。代表的なスキャンを図２０Ｌに示す。ＭＴ１を、キャプチャープローブと相補
的でないＮＣ１１２で置き換えると、シグナルは発生しない。同様に、ＭＴ１を
除くとしぐなるを発生しない。
【０４８６】実施例Ｂ ：キャプチャープローブＤ３３４、Ｙ５導電性オリゴマー、およびＭ４
４絶縁体を、とともに、２：２：１の割合で、合計チオール濃度８３３μＭで、
電極上に置く。キャプチャープローブと相補的な配列を含む標的配列ＬＰ２８０
を加え、標識プローブＤ３３５と相補的な２０塩基配列を合わせ合わせた：この
場合、標識プローブＤ３３５は、電極へ導入する前に標的に加えた。この標識プ
ローブは、図２３に示すように、Ｎ６連結を用いて結合している６つのフェロセ
ンを含有する。代表的なスキャンを図２０Ｍに示す。ＬＰ２８０を、ＬＮ２８０
プローブ（標識プローブとは相補的であるが、キャプチャープローブとは相補的
でない）で置き換えると、シグナルは発生しない。
【０４８７】 実施例９：本発明を使用するPCR反応の追跡 PCR反応の追跡は、標的配列としてHIV配列を使用して行った。多段階反応を行い
、 O〜30 または 50 サイクルで停止した。この場合において、当業者に分かる はずであるが、センスプライマーはETM(本明細書中に記載のN６連結を使用する)
を含み、ETMを含むトリホスフェートヌクレオチドを使用し、非プライマー配列 を標識することができる。表面プローブは、プライマー配列にすぐ隣接した非プ
ライマー配列の16個のヌクレオチドにハイブリダイズするように構築した。即ち
、標識されたプライマー配列は、表面プローブに結合しない。このために、増幅
配列が表面プローブに結合するような増幅がおきる場合にのみ、隣接したETMの 検出を行う。
【０４８８】 この場合における標的配列は、完全なHIV-1ゲノムを含み、pBluescript Il-KS
(+)上のSstl 部位に挿入されたゲンバンク（Genbank）寄託番号 K03455またはM3
8432をもつHXB2 クローンから誘導されたpBH10-R3の8.9 kbのSstl断片を含有す るプラスミドpBKBH10Sである(NIH AIDS リサーチ・アンド・リファレンス・リー
ジェント・プログラム- McKesson Bioservices, Rockville MD)。この挿入は、T
７プロモーターからの転写がセンスRNAを産生するように指向されている。
【０４８９】 この「センス」プライマー、D353は以下のとおりである；5'-(N6)A(N6)AGGGCT
GTTGGAAATGTGG-3’。「アンチセンス」プライマー、D351は以下のとおりである: 5'-TGTTGGCTCTGGTCTGCTCTGA-3'）。以下のものは、反応の期待PCR産物であって
、これは140 bpを含む； 5'-(N6)A(N6)AGGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAGATTGTACTGAGAGACAG GCT 3'-TTTTTCCCGACAACCTTTACACCTTTCCTTCCTGTGGTTTACTTTCTAACATGACTCTCTGTCCGA AATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGGAAGGCCAGGGAATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGC TTAAAAAATCCCTTCTAGACCGGAAGGATGTTCCCTTCCGGTCCCTTAAAAGAAGTCTCGTCTGGTCTCG CAACA-3' GTTTG-5' 。
【０４９０】 表面の捕獲プローブである、D459（センスプライマーに全く重ならない）は、
以下のとおりである: 5'-TTGGTGTCCTTCCTTU-4単位ワイヤー(C11)-3'。
【０４９１】 PCR反応条件は標準であった: TAQ 10X 緩衝液でのTAQポリメラーゼ。プライマ
ー（1μM）を、テンプレートの6×103, 6×106または 6×107分子に添加した。 反応条件は、90ーCで30秒、57℃で30秒、57℃で30秒および70℃で1分間であった 。
【０４９２】 電極は、直径0.127mmの純金ワイヤーの一端を溶融し、球を形成して作成した 。電極をアクアレジア（aqua regia）中に浸漬し、テーン（tehn）を水ですすい
だ。SAMは、電極を導入する前に５分間50℃で加熱した貯蔵水溶液中（37：39：2
4THF：ACN：水の中に全チオール１mMで、1.3：4.0：7D459：H6：M44）に電極を 浸漬することによって沈殿される。電極を加え、次いでその直後に室温にし、15
分間置いた。次いで、電極をM44（全チオール濃度400μＭで、37：39：24THF：A
CN：水中）に移した。電極を室温で５分間M44中に置き、次の加熱サイクルを適 用した：70℃で１分間、続いて55℃で30秒、このサイクルをもう２回繰り返し、
0.3℃の勾配にかけ、10分間、室温で浸漬しながら室温まで下げた。電極をM44溶
液から取出し、2XSSCですすぎ、以下のようにハイブリダイズした。PCR産物を6X
SSC (FCSなし)に調整した。コントロールも6XSSCに調整した。ハイブリダイゼー
ションを、6XSSCで2回すすいだ後、室温で、少なくとも1.5時間行った。ACV条件
は以下のようにした: Ag/AgCI 参照電極とPt補助電極を用い、NaCIO4を電解溶液
として使用した。ACV 測定を以下のように行った: v=10 Hz, e=25 mV、スキャン
範囲 -100 mV から 500 mV。データは図26に示した。
【０４９３】 実施例１０：電極表面でのライゲーション HIV配列の検索のために、実験計画を、図２１に示した。基本的には、表面プ ローブD368（5'-(H2)CCTTCCTTTCCACAU単位ワイヤー(C11)-4）を、全チオール濃 度833μＭを用いて、Ｄ368：Ｈ6：Ｍ44を１：４：１の比で、Ｍ44およびＨ6を含
む電極に取り付けた。ライゲーションプローブであるHIVLIG（5'-CCACCAGATCTTC
CCTAAAAAATTAGCCTGTCTCTCTCAGTACAATCTTTCATTTGGTGT-3'）および標的配列HIVCOM
P（5'-ATGTGGAAAGAAAGGACACCAATTGAAAGATTGTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAGAT
CTGG-3'）をリガーゼと共に添加し、反応を開始させた。反応条件は以下のよう であった：HIVCOMPにアニーリングしたHIVLIG（10μＭ）を、電極表面（6XSSCで
）に、80分間ハイブリダイズした。表面をリガーゼ緩衝液中ですすいだ。リガー
ゼ（T４）および緩衝液を添加し、２時間、室温でインキュベートした。トライ トン（Triton）Ｘ（10-4Ｍ）を70℃で添加し、新規に形成したハイブリダイゼー
ション複合体を変性させ、新規に形成した長い表面プローブ(HIVLIGプローブに ライゲートしたD368を含む)を生成させる。D456のシグナル化プローブ（5'-(N6)
G(N6)CT(N60C(N60G(N6)C(N6)TTCTGCACCGTAAGCCATCAAAGATTGTACTGAG-3'）の付加 を検出した。D456プローブは、HIVLIGプローブにハイブリダイズするように設計
された；これは結合しなかった表面プローブは検出されない。
【０４９４】 実施例１１ エチレングリコールリンカー含有捕獲プローブの使用 ０、４および８エチレングリコール単位を含むｒＲＮＡアッセイ用捕獲プロー
ブを４つの別々の電極表面で試験した。表面１は２：１比率のＨ６：Ｍ４４を含
み、総チオール濃度は５００μＭであった。表面２は２：２：１比率のＤ５６８
／Ｈ６／Ｍ４４を含み、総チオール濃度は８３３μＭであった。表面３は２：２
：１比率のＤ５７０／Ｈ６／Ｍ４４を含み、総チオール濃度は８３３μＭであっ
た。Ｄ５６８は5’-GTC AAT GAG CAA AGG TAT TAA (P282)-3’を含む捕獲プロー
ブであった。Ｐ２８２はチオールであった。Ｄ５６９は４つのエチレングリコー
ル単位：5’-GTC AAT GAG CAA AGG TAT TAA (C131) (P282)-3’を含む捕獲プロ ーブであった。Ｄ５７０は８エチレングリコール単位：5’-GTC AAT GAG CAA AG
G TAT TAA (C131) (C131) (P282)-3’を含む捕獲プローブであった。Ｈ６（保護
形）は下記の通りであった：（ＣＨ3）3Ｓｉ−（ＣＨ2）2−Ｓ−（Ｃ6Ｈ5）−Ｃ ＝ Ｃ−（Ｃ6Ｈ5）−Ｃ＝ＣＨ。Ｍ４４はＭ４３と同じであり、下記の通りであっ
た：ＨＳ−（ＣＨ2）1 1−（ＯＣＨ2ＣＨ3）3−ＯＨ。Ｄ４８３標識プローブはｒ
ＲＮＡ標的の第２部分とハイブリダイズし、下記の通りであった：5’-(N6)C(N6
) G(N6C (N6)GG CCT (N6)C(N6) G(N6)C (N6)(C131)(C131) (C131)(C131)T TAA T
AC CTT TGC TC-3’。Ｄ４９５はネガティブコントロールであり、下記の通りで あった：5’-GAC CAG CTA GGG ATC GTC GCC TAG GTGAG(C131) (C131)(C131)(C13
1) (N6)G(N6) CT(N6) C(N6)G (N6)C(N6)-3’。結果は下記の通りであった：
【０４９５】 表面１： Ｄ４８３ 〜０ （捕捉プローブ存在せず） Ｄ４９５ ０ 表面２： Ｄ４８３ １２６ｎＡ Ｄ４９５ １.２９ｎＡ 表面３： Ｄ４８３ １９.３９ｎＡ Ｄ４９５ １.５１ｎＡ 表面４： Ｄ４８３ ８４ｎＡ Ｄ４９５ １.９７ｎＡ 示されるように、システムは十分働く。
【０４９６】 実施例１２ ｒＲＮＡの検出および異なる量のＥＴＭの比較 今日までで最も感受性のｒＲＮＡ検出は、１：３.５：１.５の比率で混合され
、８３３μＭ総チオール濃度で沈着しているＤ３５０／Ｈ６／Ｍ４４表面を使用
する。Ｄ３５０は１５量体ＤＮＡの４単位ワイヤー；Ｈ６は２単位ワイヤー；そ
してＭ４４はエチレングリコール停止アルカリ鎖である。標的分子をセンサー表
面に１ヶ所以上で拘束した場合、良好な検出限界がみられる。今日まで、二つの
拘束点が使用されている。Ｄ４１７拘束配列（４２量体）およびＥＵ１捕獲配列
（６２量体）は１６Ｓ ｒＲＮＡを表面上のＤ３５０に結合させた。ｒＲＮＡに
予めアニールされた一連の９個の標識プローブ（Ｄ４４９、Ｄ４６９、Ｄ４８９
、Ｄ４９０、Ｄ４９１、Ｄ４７６、Ｄ４７５およびＤ４７７）は電気化学的シグ
ナルを提供した。これらの標識プローブ（シグナル伝達分子）は６または８のＮ
６またはＹ６３タイプフェロセンを有する。取りつけ（tack-down）領域の側面 に位置する標識プローブを、２０または４０フェロセンを含む標識プローブと置
き換えた（同時に１端）。更に、取りつけ領域の中心の領域に結合する標識プロ
ーブを２０または４０フェロセンを含む標識プローブと置き換えた。２つの６−
フェロセン含有標識プローブを２つの４０−フェロセン含有標識プローブと置き
換えたとき、ポジティブシグナルが１２倍増加した。非特異的シグナルも同様に
増加し、シグナル対ノイズ比の１.５倍の増加が示された。現在使用されている 最良のシステムはｒＲＮＡを２ヶ所で取りつけ、３’取りつけ点の側面の４０−
フェロセン標識プローブを使用し、ｒＲＮＡ分子の残りの面を６−フェロセン含
有標識プローブに結合させた。更なる取りつけ点および標識プローブの複数性が
意図される。
【０４９７】 典型的実験的プロトコールは下記の通りである： 表面誘導体化：２０μＬの沈着溶液（４３.２％ＴＨＦ、４５.９％ＡＣＮ、１０
.９％Ｈ2０中、総チオール濃度８３３μＭで１：３.５：１.５のＤ３５０：Ｈ６
：Ｍ４４）を密封した０.５ミリリットルエッペンドルフ試験管で５０℃で５分 加熱した。溶解した金ボール電極を溶液に挿入し、次いで直ぐに室温に移動させ
、１５分インキュベートした。次いで、電極を３７％ＴＨ、３９％ＡＣＮ、２４
％Ｈ2０中の〜２００μＬの４００μＭ Ｍ４４に移し、室温で５分、４０℃で ２分、２分３０℃、次いで更に１５分室温でインキュベートした。次いで、電極
を短く２×ＳＳＣ（水性緩衝化塩溶液）に浸し、下記のようにハイブリダイズし
た。
【０４９８】 ハイブリダイゼーション溶液は、７０℃で３０秒加熱し、次いで２２℃で〜３
８秒にわたり冷却することによりアニールした。分子は全て標的濃度の２倍で、
３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§μＭのｒＲＮＡ、１.０μＭの捕獲配列および３μＭの標識プロ
ーブを含む４×ＳＳＣ中であった。アニーリング後、溶液をウシ胎児血清で１：
１に希釈し、濃度を半分にし、溶媒を５０％ＦＣＳで２×ＳＳＣに変えた。モデ
ル化合物での最近の実験が、ウシ血清アルブミンでの１.２の希釈が望ましいこ とがあることを示しているのは注意すべきである：非特異的得結合の減少も同様
であるが、サンプル濃度は希釈せず、ポジティブシグナルは１.５の因数まで促 進された。これはしかしｒＲＮＡ標的を使用して起こらなかった。溶液をハイブ
リダイゼーションのために２０μＬ量に等分した。
【０４９９】 ハイブリダイゼーションを下記のように行った：上記のように２×ＳＳＣに浸
した後、誘導体化電極を２０μＬハイブリダイゼーション溶液含有エッペンドル
フ試験管に入れた。室温で１０分ハイブリダイズさせた。
【０５００】 測定直前に電極を短く室温で２×ＳＳＣに浸した。次いで、それを１Ｍ Ｎａ
ＣｌＯ4電解質に移し、電流ボルタモグラムの変化を、１０Ｈｚ周波数および２ ５ｍＶ中心からピーク振幅の電流を変えながら適応して取った。
【０５０１】 １０の基本的実験を行った（括弧内のシステム構成要素）： システム１。ｒＲＮＡを１点のみに取りつけた（Ｄ４４９＋Ｄ４１７（ＥＵ２）
＋Ｄ４６８ システム２。ｒＲＮＡを２点で取りつけた システム３。２点の取りつけに加えて第２の取りつけ点の側面領域を各々指向す
る２個の２０フェロセン含有標識プローブ システム４。２点の取りつけに加えて第２の取りつけ点の側面領域を各々指向す
る２個の４０フェロセン含有標識プローブ システム５。２点の取りつけに加えて第１の取りつけ点の側面領域を各々指向す
る２個の２０フェロセン含有標識プローブ システム６。２点の取りつけに加えて第１の取りつけ点の側面領域を各々指向す
る２個の４０フェロセン含有標識プローブ システム７。２点の取りつけに加えて２０フェロセン含有中心領域（即ち、二つ
の取りつけ点の間の領域）に結合する２５塩基含有標識プローブ システム８。２点の取りつけに加えて４０フェロセン含有中心領域（即ち、二つ
の取りつけ点の間の領域）に結合する２５塩基含有標識プローブ システム９。２点の取りつけに加えて２０フェロセン含有中心領域（即ち、二つ
の取りつけ点の間の領域）に結合する４０塩基含有標識プローブ システム１０。２点の取りつけに加えて４０フェロセン含有中心領域（即ち、二
つの取りつけ点の間の領域）に結合する４０塩基含有標識プローブ 結果は図２２に示す。結果から、大標的の複数点拘束が１点拘束より良好であ
ることが明らかである。多くのＥＴＭがより大きなシグナルをもたらすが、より
結合エネルギーを必要とする；標的用の３５塩基の認識。
【０５０２】 実施例１３ フェロセンの異なる配置の直接比較 フェロセンの異なる配置の比較を、図２３に概説のように行った。図２３Ａ、
２３Ｂ、２３Ｃおよび２３Ｄは数個の標識プローブの配向を模式的に記載する。
Ｄ９４は下記の通りであった：5’-ACC ATG CAC ACA GA(C11)-3’。Ｄ１０９は 下記の通りであった：5’-CTG CGG TTA TTA AC(C11)-3’。“＋”表面はＤ９４ ：Ｈ６：Ｍ４４の２：２：１の比率であり、総チオール濃度は８３３μＭであっ
た。“−”表面はＤ１０９：Ｈ６：Ｍ４４の２：２：１の比率であり、総チオー
ル濃度は８３３μＭであった。Ｄ５４８構造は下記の通りであった：5’-(N38)(
N38)(N38) (N38)(N38)(N38) (N38)(N38)(N38) ATC TGT GTC CAT GGT-3’。各Ｎ ３８は5’-(H2)(C23)-3’であった。Ｄ５４９構造は下記の通りであった：5’-(
N38)(N38)(N38) (N38)(N38)(N38) (N38)(N38)(N38) ATC TGT GTC CAT GGT-3’。
各Ｎ３８は5’-(H2)(C23)(C23)-3’であった。Ｄ５５０構造は下記の通りであっ
た：5’-(N38)(N38)(N38) (N38)AT CTG TGT CCA TGG T-3’。各Ｎ３８は5’-(H2
)(C23)(C23)-3’であった。Ｄ５５１構造は下記の通りであった：5’-(n38)(N38
)(N38) (N38)ATCTG TGT CAA TGG T-3’。各Ｎ３８は5’-(H2)(C23)(C23)(C23)(C
23)-3’であった。５’ Ｎ３８は第２の修飾のための二つの部位を有する。代 表的模式図を図２３Ｅに示す。 図に示す結果は、Ｄ５５１標識プローブが優れたシグナル対ノイズ比で最高の
シグナルを提供することを示す。
【０５０３】 実施例１７ 両方補充されたリンカーおよびＥＴＭとしてのフェロセンポリマー 本システムは図２３に示す。Ｄ４０５は：5’-(C23)(C23)(C23) (C23)(C23)(C
23) (C23)(C23)(C23) (C23)AT CTG TGT CCA TGG T-3’の構造を有した。システ ムは二つの表面で流した：“＋”表面はＤ９４：Ｈ６：Ｍ４４の２：２：１の比
率で、総チオール濃度８３３μＭであった。“−”表面はＤ１０９：Ｈ６：Ｍ４
４の２：２：１の比率で、総チオール濃度８３３μＭであった。図２５Ｂに示す
結果は、システムが相補的捕獲プローブの存在下で良好なシグナルを提供するこ
とを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ-１Ｏは、本発明の多くの種々の組成物を示す。その結果 は、実施例１および２に示す。図１Ａは、Ｐ２９０としても言及しているＩを示
す。図１Ｂは、Ｐ２９１としても言及しているＩＩを示す。図１ＣはＷ３１とし
ても言及しているIIIを示す。図１ＤはＮ６としても言及しているＩＶを示す。 図１Ｅは、Ｐ２９２としても言及しているＶを示す。図１Ｆは、Ｃ２３としても
言及しているＩＩを示す。図１Ｇは、Ｃ１５としても言及しているＶＩＩを示す
。図１Ｈは、Ｃ９５としても言及しているＶIIIを示す。図１Ｉは、Ｙ６３を示 す。図１Ｊは、本発明の他の化合物を示す。図１Ｋは、Ｎ１１を示す。図１Ｌは
、ホスホラミダイト基およびＤＭＴ保護基を有するＣ１３１を示す。図１Ｍは、
ホスホラミダイト基およびＤＭＴ保護基をも有するＷ３８を示す。図１Ｎは、伸
張オリゴヌクレオチド鎖へそれを組込むと、ＤＭＴ保護された酸素の両方の位置
での付加が生じ、“枝分かれ”を生じさせ得る商業的に利用可能な成分を示す。
図１Ｏは、非核酸リンカーとして役割をするホスホラミダイト基およびＤＭＴ保
護基をも有するｇｌｅｎを示す。図１Ａから１Ｇおよび１Ｊは、容易に添加され
るホスホラミダイトおよび保護基(すなわち、ＤＭＴ)なしに示している。
【図２】 図２は、フェロセンの場合に、ＥＴＭによるヌクレオシド(アデ ノシンの場合)への、リボースへのオキソ連結を介する好ましい結合であり、本 発明のＮ６化合物を形成する合成スキームを示す。
【図３】 図３は、図２と同様である。但し、ヌクレオシドは、シチジンで
あり、本発明のＷ３８化合物を形成する。
【図４】 図４は、このフェロセンの場合におけるＥＴＭによるリン酸を介
するヌクレオシドへの好ましい結合の合成スキームであり、本発明のＹ６３化合
物を形成する。
【図５】 図５は、このアデノシンの場合における三リン酸ヌクレオチドの
合成スキームであり、このフェロセンの場合オキソ連結を介しリボースへのＥＴ
Ｍの結合を伴う。
【図６】 図６は、一級アミンを用い官能化した核酸を事前形成のＳＡＭへ
の添加のための活性化カルボン酸の使用を示す。
【図７】 図７は、制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を利用する、“普遍”
型遺伝子チップの使用のスキームを示す。
【図８】 図８Ａおよび図８Ｂは、５'位または任意の位置に導電性オリゴ マーの添加に使用し得る導電性オリゴマーの２つのリン酸結合を示す。
【図９】 図９は、電極への結合用ヌクレオシドのリボースに対する絶縁体
(Ｃ１０９)の合成を示す。
【図１０】 図１０は、エチレングリコール末端化導電性オリゴマーの合成
スキームを示す。
【図１１】 図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、ＥＴＭポリマーを加え得る
３種の“分枝”点(塩基としてアデノシンを用いる各場合)の合成を示す。図１１
Ａは、本発明のＮ１７化合物の合成を示す。図１１Ｂは、Ｗ９０化合物の合成を
示し、図１１ＣはＮ３８化合物の合成を示す。
【図１２】 図１２は、Ｎ１７“分枝”点ヌクレオシドを用い、核酸中への
多数のＥＴＭの同時組込みの合成スキームである。
【図１３】 図１３は、当分野に既知の３つの分枝点(２つの分枝点も可能 である。例えば図１Ｎ参照。)を用いる場合、“分枝”点ホスホラミダイトを用 い、多数のＥＴＭの核酸への同時供与の別法のスキームを示す。
【図１４】 図１４は、典型的なヘアピン構造を示す。５００は、標的結合
配列であり、５１０はループ配列であり、５２０は自己相補領域(self compleme
ntary region)であり、５３０は、検出プローブに実質的に相補的であり、そし て５３０は“接着末端”であり、すなわち、プローブの任意の他の部分とはハイ
ブリダイズしない、ＥＴＭを含む部分である。
【図１５】 図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、電極に結合する標的配列の
３つの好ましい実施態様を示す。図１５Ａは、結合リンカー１０６を介して連結
する捕捉プローブ１００にハイブリダイズする標的配列１２０を示す。それは本
明細書で概略する通り、導電性オリゴマーか絶縁体の何れかとなり得る。電極１
０５は、不動態化剤１０７の単層を含み、それは導電性オリゴマー(本明細書中 では１０８として示す)および／または絶縁体(本明細書中では１０９として示す
)を含み得る。図に示した全実施態様に関するかぎり、当業者には明らかである が、ｎは少なくとも１である整数であり、通常好ましくはないが、そのシステム
は捕捉プローブとして全く使用できない(すなわち、ｎは０である)。ｎの上限は
、標的配列の長さおよび必要な感度に依存する。図１５Ｂは、標的配列１２０の
第一部分にハイブリダイズする第一部分１１１および捕捉プローブ１００にハイ
ブリダイズする第二部分を有する単一捕捉エクステンダープローブ１１０の使用
を示す。図１５Ｃは、２つの捕捉エクステンダープローブ１１０および１３０の
使用を示す。第一捕捉エクステンダープローブ１１０は、標的配列１２０の第一
部分にハイブリダイズする第一部分１１１および補足プローブ１００の第一部分
１０２にハイブリダイズする第二部分１１２を有する。第二捕捉エクステンダー
プローブ１３０は、標的配列１２０の第二部分にハイブリダイズする第一部分１
３２および捕捉プローブ１００の第二部分１０１にハイブリダイズする第二部分
１３１を有する。当業者に明らかなように、任意のこれら結合配置は、図１６の
態様を含む任意の他のシステムを用い使用し得る。
【図１６】 図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄ、１６Ｅ、１６Ｆおよび１
６Ｇは、本発明の幾つかの態様を示す。本明細書中で考察するように両者を種々
異なる割合で用い得るし、また絶縁体は完全に欠失していてもよいのであるが、
本明細書中に示したすべての単層では、導電性オリゴマー１０８と絶縁体１０７
の両方が、おおよそ１：１の割合で存在するように示している。加えて、当業者
には明らかなように、これらのどの構造も、特定の標的配列を繰り返し得、すな
わち、長い標的配列の場合、形成された多アッセイ複合体が存在し得る。加えて
、図１５の任意の電極結合態様は、任意のこれらシステムに使用され得る。 図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｄは、ＥＴＭ１３５を含む標的配列１２０を有し
、本明細書において考察するように、これらは、例えば、ＥＴＭで修飾したヌク
レオチドを用いるＰＣＲ反応の間に酵素学的添加され得、標的配列を通して実質
的にランダムに組込まれるか、または標的配列の末端に加えられる。図１６Ｃは
、標的配列１２０の種々の部分にハイブリダイズする２種の捕捉プローブ１００
および１００'の使用を示す。当業者には明らかなように、この実施態様で２つ の捕捉プローブの５'-３'方向は異なる。 図１６Ｃは、標的配列１２０に直接ハイブリダイズする標識プローブ１４５の
使用を示す。図１６Ｃは、標的配列１２０の部分にハイブリダイズする第一部分
１４１、ＥＴＭ１３５を含む第二部分１４２を含む標識プローブ１４５の使用を
示す。 図１６Ｅ、１６Ｆおよび１６Ｇは、標的には直接ハイブリダイズしないが、む
しろ、直接的(図１６Ｅ)または間接的(図１６Ｆおよび１６Ｇ)に標的配列にハイ
ブリダイズする増幅プローブにハイブリダイズする標識プローブ１４５を用いる
システムを示す。増幅プローブ１５０を用いる図１６Ｅは、標的配列１２０にハ
イブリダイズする第一部分１５１および標識プローブの第一部分１４１にハイブ
リダイズする少なくとも１つの第二部分１５２、すなわち、増幅配列を有する。
図１６Ｆは同じである。但し、標的配列１２０にハイブリダイズする第一部分１
６１および増幅プローブ１５０の第一部分１５１にハイブリダイズする第二部分
１６２を含む第一標識エクステンダープローブ１６０を用いる。増幅プローブ１
５０の第二部分１５２は、標識プローブ１４０の第一部分１４１にハイブリダイ
ズし、それはＥＴＭ１３５を含む補充リンカー１４２をも含む。図１６Ｇは、第
二標識エクステンダープローブ１７０を加え、標的配列１２０の部分にハイブリ
ダイズする第一部分１７１および増幅プローブの部分にハイブリダイズする第二
部分を有する。 図１６Ｈは、多標識プローブを利用するシステムを示す。標識プローブ１４０
の第一部分１４１は、補充リンカー１４２のすべてまたは一部にハイブリダイズ
し得る。
【図１７】 図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｄおよび１７Ｅは、標識プローブの種
々の可能な配置およびＥＴＭの結合を示す。図１７Ａ-Ｃでは、補充リンカーは 核酸であり、図１７Ｄおよび１７Ｅでは、そうではない。Ａ＝ヌクレオチド置換
；Ｂ＝塩基への結合；Ｃ＝リボースへの結合；Ｄ＝リン酸への結合；Ｅ＝塩基、
リボースまたはリン酸(または他のバックボーン類似体)に結合したメタロセンポ
リマー(本発明に記載の通り、同様にこれは他のＥＴＭのポリマーであり得る。)
；Ｆ＝塩基、リボースまたはリン酸(または他のバックボーン)を介して結合する
デンドライマー構造；Ｇ＝“枝分かれ”構造を介する、塩基、リボースまたはリ
ン酸(他のバックボーン類似体)を通しての結合；Ｈ＝メタロセン(または他のＥ ＴＭ)ポリマーの結合；Ｉ＝デンドライマー構造を介する結合；Ｊ＝標準リンカ ーを用いる結合。
【図１８】 図１８は、ステムループプローブを用いる改良を示す。表面結
合プローブ上にトーショナルストレイン(torsional strain)を作成するため、こ
れが望ましく、それは、結合効率およびある場合には熱力学的安定性の増加が見
られる。この場合、表面結合プローブは、捕捉プローブ１００、第一ステムルー
プ配列５５０、標的結合配列５６０、および第一ステムループ配列に実質的に相
補的である第二ステムループ配列５７０を含む。直接または間接的に何れかで標
識プローブ１４５を用いＥＴＭ１３５を含み得る標的配列１２０の添加において
、表面の標的の有効濃度が増加する。
【図１９】 図１９Ａ-１９ＡＡは、実施例１に用いる幾つかの配列を示す 。
【図２０】 図２０Ａ-２０Ｏは、実施例１に示す実験の典型的な走査を示 す。特記しなければ、全走査は、開始電圧-０．１１Ｖで、最終電圧０．５Ｖで あり、１０ｍＶごとに点をとり、０．０２５の振幅、１０Ｈｚの頻度、サンプル
時間１秒、静置時間２秒である。図２０Ａは、ピークポテンシャル０．１６０Ｖ
、ピーク電流１．０９２×１０-8Ａ、およびピークＡ７．５６３×１０-10ＶＡ を有する。図２０Ｃは、ピークポテンシャル０．１９０Ｖ、ピーク電流２．０４
６×１０-7Ａおよびピーク面積２．０４６×１０-8ＶＡを有する。図２０ｄは、
ピークポテンシャル０．１９０Ｖ、ピーク電流３．５５２×１０-8Ａおよびピー
クＡ３．５６８×１０-9ＶＡを有する。図２０Ｅは、ピークポテンシャル０．１
９０Ｖ、ピーク電流２．３７６２×１０-7Ａおよびピーク面積２．５９４×１０ -8 Ａを有する。図２０Ｆは、ピークポテンシャル０．１８０Ｖ、ピーク電流２．
９９２×１０-8Ａおよびピーク面積２．７０９×１０-9ＶＡを有する。図２０Ｇ
は、ピークポテンシャル０．１５０Ｖ、ピーク電流１．４９４×１０-7Ａおよび
ピーク面積１．１×１０-8ＶＡを有する。図２０Ｈは、ピークポテンシャル０．
１６０Ｖ、ピーク電流１．９６７×１０-8Ａおよびピーク面積１．４４３×１０ -9 ＶＡを有する。図２０Ｉは、ピークポテンシャル０．１５０Ｖ、ピーク電流８
．０３１×１０-8Ａおよびピーク面積６．０３３×１０-9ＶＡを有する。図２０
Ｊは、ピークポテンシャル０．１５０Ｖ、ピーク電流８．８７１×１０-9Ａおよ
びピーク面積５．５１×１０-10ＶＡを有する。図２０Ｌは、ピークポテンシャ ル０．１４０Ｖ、ピーク電流２．４４９×１０-8Ａおよびピーク面積１．７０６
×１０-9ＶＡを有する。図２０Ｍは、ピークポテンシャル０．１５０Ｖ、ピーク
電流６．６３７×１０-8Ａおよびピーク面積７．３３５×１０-9ＶＡを有する。
図２０Ｎは、ピークポテンシャル０．１４０Ｖ、ピーク電流２．８７７×１０-9 Ａおよびピーク面積２．０５６×１０-10Ａを有する。
【図２１】 図２１は、実施例１３のライゲーション鎖反応(ＬＣＲ)実験を
示す。
【図２２】 図２２Ａおよび２２Ｂは、実施例１２の結果を示す。“ハイブ
リッドコード”はシステム番号について言及し、＋および−はｒＲＮＡ標的の存
在または非存在について言及する。
【図２３】 図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、２３Ｄ、２３Ｅおよび２３Ｆは、
実施例１３の組成物および結果を示す。
【図２４】 図２４Ａおよび図２４Ｂは、実施例１３の組成物および結果を
示す。
【図２５】 図２５Ａおよび２５Ｂは、実施例８の２つの実験のセットアッ
プを示す。
【図２６】 図２６は、実施例９に解説するＰＣＲ実験の結果を示している
。
【図２７】 図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ、２７Ｄ、２７Ｅおよび２７Ｆは、
幾つかの“機構−１”検出システムを示す。図２７Ａは、導電性オリゴマーを介
して電極１０５に連結する検出プローブ３００にハイブリダイズする標的配列１
２０の部分を示す。ハイブリダイゼーション複合体は、標的配列または検出プロ
ーブ３００の何れかに共有結合するか、または非共有結合(すなわち、ハイブリ ダイゼーションインディケーター)し得るＥＴＭ１３５を含む。本明細書中で解 説するように任意の形の不動化剤を使用し得るけれども、単層は絶縁体１０７で
示される。明らかなように、標識プローブ１４５が検出プローブ３００にハイブ
リダイズするため、これは捕捉プローブとしての役割をし得るが、図２７Ｂは、
電極１０５に結合リンカー１０６を介して連結する捕捉プローブ１００の使用を
示す。標識プローブ１４５は、標的配列１２０の部分にハイブリダイズする第一
部分１４１および検出プローブ３００にハイブリダイズする第二部分１４２を含
む。図２７Ｃは、標的配列１２０にハイブリダイズする第一部分１５１(標識エ クステンダープローブを同様に用い得る。)および検出プローブ３００に直接ハ イブリダイズする増幅配列１５２を含む分枝状増幅プローブ１５０の使用を示す
。標的配列は、図１５に示すような捕捉プローブを用いる電極に付加的に結合し
得る。図２７Ｄは、直線状増幅プローブ１５０を用いる同様の場合を示す。図２
７Ｅは同様のシステムを示すが、増幅配列１５２にハイブリダイズする第一部分
１４１および検出プローブ３００にハイブリダイズする第二部分１４２を含む標
識プローブ１４５を使用する。図２７Ｆは、直線状増幅プローブ１５０を用いる
以外は同じであるものを示す。
【図２８】 図２８は、本発明のＬＣＲ実施態様を示す。第一プローブ核酸
２００および第二プローブ核酸２１０を、一本鎖標的配列１２０の第一および第
二標的ドメインにハイブリダイズする。プローブを、通常ライゲーションを介し
て結合し、連結プローブ２２０を形成する。第一ハイブリダイゼーション複合体
２２５を変性させ、その方法を繰り返し、連結プローブ２２０のプールを生ずる
。連結していないプローブ２００および２１０を当分野に知られているように除
去し、次いで、連結プローブ２２０を検出プローブ３００にハイブリダイズし、
本明細書中に示したように検出した。当業者には明らかなように、示した標的ド
メインは直接隣接し、すなわち連続するが、次いでヌクレオチドおよびポリメラ
ーゼを用い埋めるギャップをも用い得る。加えて、プローブは、明らかなように
非共有結合もまた用い得るけれども、結合ＥＴＭ１３５で示される。
【図２９】 図２９は、本発明の他のＬＣＲ実施態様を示す。第一プローブ
核酸２００および第二プローブ核酸２１０を、一本鎖標的配列１２０の第一およ
び第二標的ドメインにハイブリダイズする。第三プローブ核酸２００および第四
プローブ核酸２１０を、相補的一本鎖標的配列１２５の第三および第四標的ドメ
インにハイブリダイズする。プローブを、通常ライゲーションで結合し、結合プ
ローブ２２０および２２１を形成する。ハイブリダイゼーション複合体２２５お
よび２２６を変性し、当該方法を繰り返し、連結プローブ２２０および２２１の
プールを作成する。非連結プローブ２００、２０１、２１０および２１１を当分
野に既知のように除去し、次いで、連結プローブ２２０および２２１を検出プロ
ーブ３００にハイブリダイズし、本明細書に記載するように検出した。当業者に
は明らかなように、示した標的ドメインは直接隣接し、すなわち連続するが、次
いでヌクレオチドおよびポリメラーゼを用い埋めるギャップをも用い得る。加え
て、プローブは、明らかなように非共有結合ＥＴＭもまた用い得るけれども、結
合ＥＴＭで示される。
【図３０】 図３０は、本発明の好ましいＣＰＴ実施態様を示す；図３０は
、“機構−１”検出システムを示すが、当業者には明らかなように、“機構−２
”システムを同様に用い得る。第一プローブ配列１０、切断容易連結１１および
第二プローブ配列１２を含み、ＥＴＭ１３と２つ供給結合するプライマリープロ
ーブ１を、標的配列１２０に加え、ハイブリダイゼーション複合体６を形成する
。図３０は、２つのＥＴＭを示す一方、あるプローブ配列のみが、ＥＴＭに共有
結合的に標識され得る。更に、付加的プローブ配列および付加的切断容易連結を
もまた用い得る。用いる結合条件に応じて、切断容易連結１１を、結合し、標的
配列１２０にハイブリダイズする２つのプローブ配列１０および１２を残す。次
いで、これらのプローブ配列を解離し、プローブ配列１０および１２および標的
配列１２０を残す。次いで、標的配列を遊離化し、付加的プライマリープローブ
１とハイブリダイズし、反応を繰り返し、プローブ配列のプールを作成する。非
切断プライマリープローブを本明細書に記載のように除去し、プローブ配列のプ
ールを、所望の不動化剤１０７の層ならびに導電性オリゴマー１０８を介して共
有結合する検出プローブ３００および３０２と共に電極１０５に加える。検出プ
ローブおよびプローブ配列によりハイブリダイゼーション複合体３０を形成する
。検出プローブを電極において混合するか、または分離アドレス１０１および１
０２となり得る。ハイブリダイゼーションインディケーター形の付加的ＥＴＭを
所望により加え得る。次いで、電子伝達が、本明細書中において示したように開
始される。加えて、この図は、可溶性反応を示す一方、プライマリープローブが
本明細書に示すように固体支持体に結合し得る。
【図３１】 図３１は、一本鎖捕捉配列を用いる付加的ＣＰＴ実施態様を示
す。第一捕捉配列１４、第一プローブ配列１０、切断容易連結１１および第二プ
ローブ配列１２を含み、ＥＴＭ１３５と共有結合するプライマリープローブ１を
、標的配列１２４に加え、ハイブリダイゼーション複合物６を形成する。好まし
くは、捕捉配列１４は、可能であるが標的にハイブリダイズしない。図３１は、
１つのみの供給結合ＥＴＭを示す一方、他のプローブ配列１２は、ＥＴＭと共有
結合的に標識され得る。更に、付加的なプローブ配列および付加的な切断容易連
結をもまた使用し得る。用いる切断条件に応じて、切断容易連結１１を切断し、
標的配列１２０にハイブリダイズする２つのプローブ配列１０および１２を残す
。次いで、これら配列を解離し、プローブ１４-１０および１２ならびに標的配 列５を残す。次いで、標的配列を遊離化し、付加的プライマリープローブ１とハ
イブリダイズし、反応を繰り返し、プローブ配列のプールを作成する。非切断プ
ライマリープローブを本明細書に記載のように除去し、プローブ配列のプールを
、所望の不動化剤１０７の層ならびに導電性オリゴマー１０８を介して共有結合
する実質的に相補的な捕捉配列２４および実質的に相補的な第一プローブ配列２
０を含む検出プローブと共に電極１０５に加える。捕捉配列用のプローブを含む
のみの検出プローブ３０４をも示す。検出プローブおよびプローブ配列によりハ
イブリダイゼーション複合体３０を形成する。ハイブリダイゼーションインディ
ケーター形の付加的ＥＴＭを所望により加え得る。次いで、電子伝達が、本明細
書中において示したように開始される。加えて、この図は、可溶性反応を示す一
方、プライマリープローブが本明細書に示すように固体支持体に結合し得る。
【図３２】 図３２は、ＣＰＴ適用の２つの捕捉配列の使用を示す。第一捕
捉配列１４、第一プローブ配列１０、切断容易連結１１、第二プローブ配列１２
、および第二捕捉配列１５を含み、ＥＴＭ１３５と２つ共有結合するプライマリ
ープローブ１を、標的配列１２０に加え、ハイブリダイゼーション複合物６を形
成する。好ましくは、捕捉配列１４は、可能であるが標的にハイブリダイズしな
い。図３２は、２つの供給結合ＥＴＭを示す一方、１つのみか、または全くない
。更に、付加的なプローブ配列および付加的な切断容易連結をもまた使用し得る
。用いる切断条件に応じて、切断容易連結１１を切断し、標的配列１２０にハイ
ブリダイズする付随捕捉配列１４-１０および１２-１５を有する２つのプローブ
配列を残す。次いで、これら配列を解離し、プローブ／捕捉配列１４-１０およ び１２-１５ならびに標的配列１２０を残す。次いで、標的配列を遊離化し、付 加的プライマリープローブ１とハイブリダイズし、反応を繰り返し、プローブ配
列のプールを作成する。非切断プライマリープローブを、実質的に相補的な、第
一捕捉配列２４、第一プローブ配列２０、切断容易連結２５、第二プローブ配列
２２および第二捕捉配列２６である配列を含む実質的に相補的中和プローブ４０
の添加により中性化する。当業者には明らかなように、相補的な切断容易連結２
５は、核酸である切断容易連結を利用する実施態様において必要とされるのみで
ある。示したように、中和プローブ４０はまた電極に結合し得る。プローブ配列
のプールを、所望の不動化剤１０７の層ならびに導電性オリゴマー１０８を介し
て共有結合する実質的に相補的な捕捉配列２４および実質的に相補的な第一プロ
ーブ配列２０、および実質的に相補的な捕捉配列２２および実質的に相補的な第
一プローブ配列２６を含む検出プローブと共に電極１０５に加える。検出プロー
ブおよびプローブ配列によりハイブリダイゼーション複合体３０を形成する。ハ
イブリダイゼーションインディケーター形の付加的ＥＴＭを所望により加え得る
。次いで、電子伝達が、本明細書中において示したように開始される。加えて、
この図は、可溶性反応を示す一方、プライマリープローブが本明細書に示すよう
に固体支持体に結合し得る。
【図３３】 図３３は同様の反応を示し、プライマリープローブ１の場合、
分離配列２１０を用い切断されていない切断容易プローブを除去する。第一プロ
ーブ配列１０、第一切断容易連結１１、分離配列２１０、第二切断容易連結１１
および第二プローブ配列１２を含み、ＥＴＭ１３と２つ共有結合するプライマリ
ープローブ１を標的配列１２に加え、ハイブリダイセ-ション複合体６を形成す る。他の配置は、示したこれらのものを含む。図３３は２つのＥＴＭを示す一方
、１つのみのプローブ配列はＥＴＭに共有結合的に標識される。更に、付加的プ
ローブ配列および付加的切断容易連結をもまた用い得る。用いる切断条件に応じ
て、切断容易連結１１を切断し、標的配列１２０にハイブリダイズする２つのプ
ローブ配列１０および１２ならびに分離配列２１０を残す。他の態様では、分離
配列は、標的とハイブリダイズせず、例えば、プローブの末端のときであり、こ
れは、好ましくのは遺伝的“分離ビーズ”を任意の標的と使用し得る場合である
。次いで、これらプローブ配列を解離し、プローブ１０および１２ならびに分離
配列２１０および標的配列１２０を残す。次いで、標的配列を遊離化し、付加的
プライマリープローブ１とハイブリダイズし、反応を繰り返し、プローブ配列の
プールを作成する。非切断プライマリープローブを、固体支持体ビーズ２００を
リンカーを通常介して結合する実質的に相補的な分離配列２１２に加えることに
より除去する。次いで、このビーズを切断されていないプローブ１および切断さ
れた分離配列２１０に結合し、溶液中に切断されたプローブ配列のみを残す。プ
ローブ配列のプールを、所望の不動化剤１０７の層ならびに導電性オリゴマー１
０８を介して共有結合する検出プローブ３００および３０２と共に電極１０５に
加える。検出プローブおよびプローブ配列によりハイブリダイゼーション複合体
を形成する。検出プローブを電極において混合するか、または分離アドレス１０
１および１０２となり得る。ハイブリダイゼーションインディケーター形の付加
的ＥＴＭを所望により加え得る。次いで、電子伝達が、本明細書中において示し
たように開始される。
【図３４】 図３４は、固体支持体結合プライマリー切断容易プローブの使
用を示す。プライマリープローブ１に結合した固体支持体ビーズ２０００を標的
配列１２０に加え、ハイブリダイゼージョン複合体６を形成する。プライマリー
プローブは、所望の付加的配列１６(必要ならば第一切断容易連結ハイブリッド の安定化に使用し得る。)、第一切断容易連結１１、第一プローブ配列１０、第 二切断容易連結１１および第二プローブ配列１２を含み得る。図３４は、共有結
合ＥＴＭを利用しない一方、１つまたはそれ以上のプローブ配列を標識し得る。
更に、付加的プローブ配列および付加的切断容易連結をも使用し得る。用いる切
断条件に応じて、切断容易連結１１を切断し、標的配列１２０にハイブリダイズ
する２つのプローブ配列１０および１２を残す。次いで、これら配列を解離し、
プローブ配列１０および１２ならびに標的配列１２０を残す。次いで、標的配列
を遊離化し、付加的プライマリープローブ１とハイブリダイズし、反応を繰り返
し、プローブ配列のプールを作成する。非切断プライマリープローブを、ビーズ
を除去することにより除去し、プローブ配列のプールを、所望の不動化剤１０７
の層ならびに導電性オリゴマー１０８を介して共有結合する検出プローブ３００
および３０２と共に電極１０５に加える。検出プローブおよびプローブ配列によ
りハイブリダイゼーション複合体３０を形成する。検出プローブを電極において
混合するか、または分離アドレス１０１および１０２となり得る。次いで、ハイ
ブリダイゼーションインディケーター形態のＥＴＭを加え、次いで、電子伝達が
、本明細書中において示したように開始される。
【図３５】 図３５は、ビーズ結合プライマリーおよびセカンダリープロー
ブの使用を示す。２つ(またはそれ以上)の形のビーズを用いる。第一の形は、第
一切断容易連結１１、第一セカンダリープローブ配列６０、第二切断容易連結１
１および第二セカンダリープローブ配列７０を含み、セカンダリー切断容易プロ
ーブ２に結合する固体支持体２５０である。更に、示すように、第一切断容易連
結１１、第一セカンダリープローブ配列８０、第二切断容易連結１１および第二
セカンダリープローブ配列９０を含む第二セカンダリー切断用プローブを好まし
くは用い得る。２セットのビーズが好ましくは用いられ得るが、同じビーズ上で
あると図３５は示している。プライマリープローブビーズ２６０は、第一切断容
易連結１１、第一プローブ配列１０、第二切断容易連結１１および第二プローブ
配列１２を含むプライマリープローブ１に結合する。上記したように、プローブ
は、所望の付加的配列(本明細書中では１６として示す)か、または付加的プロー
ブ配列もしくは切断容易連結を含み得る。ビーズ２５０および２６０を標的配列
１２０に加える。プライマリープローブにより、標的１２０を有するハイブリダ
イゼーション複合体６を形成する。図３５は、共有結合ＥＴＭを利用しない一方
、任意またはすべてのプローブ配列を標識し得る。用いる切断条件に応じて、切
断容易連結１１を切断し、標的配列１２０にハイブリダイズする２つのプローブ
配列１０および１２を残す。次いで、これら配列を解離し、プローブ配列１０お
よび１２ならびに標的配列１２０を残す。次いで、標的配列を遊離化し、付加的
プライマリープローブ１とハイブリダイズし、反応を繰り返し、プローブ配列の
プールを作成する。次いで、プライマリープローブ配列を遊離化し、セカンダリ
ービーズ２５０に分散させる。それらは、セカンダリープローブにハイブリダイ
ズする次の“標的”としての役割をし得、付加的ハイブリダイゼーション複合体
７および８形成する。切断、その後の、第一プローブ配列“標的”からセカンダ
リープローブ配列を解離することにより、検出され得るセカンダリープローブの
プールを生ずる。非切断プローブを、ビーズを除去することにより除去し、プロ
ーブ配列のプールを、所望の不動化剤１０７の層ならびに導電性オリゴマー１０
８を介して共有結合する検出プローブ６２、７２、８２および９２と共に電極１
０５に加える。図３５はこれを示さないが、同様にプライマリープローブ配列用
の検出プローブとなり得る。検出プローブおよびプローブ配列によりハイブリダ
イセ-ション複合体を形成する。検出プローブを電極において混合するか、また は分離アドレスとなり得る。次いで、ハイブリダイゼーションインディケーター
形態のＥＴＭを加え、次いで、電子伝達が、本明細書中において示したように開
始される。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月２６日（２０００．４．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０７８，１０２ (32)優先日 平成10年３月16日(1998．3．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０８４，４２５ (32)優先日 平成10年５月６日(1998．5．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０８４，５０９ (32)優先日 平成10年５月６日(1998．5．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／１３５，１８３ (32)優先日 平成10年８月17日(1998．8．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA17 QA18 QA19 QQ03 QQ42 QQ52 QQ53 QR08 QR14 QR20 QR42 QR56 QR62 QR63 QS02 QS25 QS34 QX04

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第一標的核酸配列の検出方法であって、 ａ）少なくとも第一プライマー核酸を第一標的配列とハイブリダイズさせて第一
    ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、 ｂ）当該第一ハイブリダイゼーション複合体を第一酵素と接触させて修飾第一プ
    ライマー核酸を形成させること、 ｃ）当該第一ハイブリダイゼーション複合体を解離(disassociating)させること
    、 ｄ）少なくとも１種のＥＴＭと当該修飾第一プライマー核酸とを含む第一アッセ
    イ複合体を形成させること、但しこのとき、当該第一アッセイ複合体は電極に共
    有的に結合しており、さらに、 ｅ）当該標的配列の存在の指標として、当該ＥＴＭと当該電極との間の電子移動
    を検出すること、 を含む方法。
  2. 【請求項２】 段階ｄ）に先立ち、段階ａ）から段階ｃ）までを繰り返す、
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 ａ）少なくとも第二プライマー核酸を、第一標的配列と実質
    的に相補的である第二標的配列とハイブリダイズさせて第二ハイブリダイゼーシ
    ョン複合体を形成させること、 ｂ）当該第二ハイブリダイゼーション複合体を当該第一酵素と接触させて修飾第
    二プライマー核酸を形成させること、 ｃ）当該第二ハイブリダイゼーション複合体を解離(disassociating)させること
    、さらに、 ｄ）少なくとも１種のＥＴＭと当該修飾第二プライマー核酸とを含む第二アッセ
    イ複合体を形成させること、但しこのとき、当該第二アッセイ複合体は電極に共
    有的に結合している、 をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 段階ｄ）に先立ち、段階ａ）から段階ｃ）までを繰り返す、
    請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 当該第一酵素がＤＮＡポリメラーゼを含むものであり、当該
    修飾が当該プライマーの延長を含み、そのようにしてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
    ＣＲ）を起こす、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 当該第一酵素がリガーゼを含むものであり、当該修飾が、当
    該第一標的配列の第一ドメインとハイブリダイズする当該第一プライマーと、当
    該第一標的配列の第二隣接ドメインとハイブリダイズする第三プライマーとのラ
    イゲーションを含み、そのようにしてリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を起こす、請
    求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 当該第一酵素がリガーゼを含むものであり、当該修飾が、当
    該第二標的配列の第一ドメインとハイブリダイズする当該第二プライマーと、当
    該第二標的配列の第二隣接ドメインとハイブリダイズする第四プライマーとのラ
    イゲーションを含み、そのようにしてリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を起こす、請
    求項３，４または７に記載の方法。
  8. 【請求項８】 当該第一プライマーが、第一プローブ配列、第一切断容易連
    結および第二プローブ配列を含むものであり、そこで当該第一酵素は当該第一切
    断容易連結を開裂させて当該第一および第二プローブ配列を分離させ、そして当
    該第一ハイブリダイゼーション複合体を解離させて当該第一標的配列を無傷で残
    し、そのようにして循環プローブテクノロジー（ＣＰＴ）反応を起こす、請求項
    １または２に記載の方法。
  9. 【請求項９】 当該第二プライマーが、第三プローブ配列、第二切断容易連
    結および第四プローブ配列を含み、そこで当該第一酵素は当該第二切断容易連結
    を開裂させて当該第三および第４プローブ配列を分離させ、そして当該第二ハイ
    ブリダイゼーション複合体を解離させて当該第二標的配列を無傷で残し、そのよ
    うにして循環プローブテクノロジー（ＣＰＴ）反応を起こす、請求項３，４また
    は９に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 当該第一酵素が、当該第一プライマーを伸長させるポリメ
    ラーゼであり、当該修飾第一プライマーが新合成第一鎖を含むものであり、当該
    方法がさらに、 ａ）当該伸長した第一プライマーをニック化して当該第一標的配列を無傷で残す
    ニック化酵素を含む第二酵素を加えること、さらに、 ｂ）当該ポリメラーゼを用いて当該ニックから伸長させ、そのようにして当該新
    合成第一鎖を変位させ、新合成第二鎖を生成させること、 を含み、そのようにして鎖変位増殖（ＳＤＡ）を起こす、請求項１または２に記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】 当該第一酵素が、当該第二プライマーを伸長させるポリメ
    ラーゼであり、当該修飾第一プライマーが新合成第三鎖を含むものであり、当該
    方法がさらに、 ａ）当該伸長した第二プライマーを分断して当該第二標的配列を無傷で残すニッ
    ク化酵素を含む第二酵素を加えること、さらに、 ｂ）当該ポリメラーゼを用いて当該ニックから伸長させ、そのようにして当該新
    合成第三鎖を変位させ、新合成第四鎖を生成させること、 を含み、そのようにして鎖変位増殖（ＳＤＡ）を起こす、請求項３、４または１
    ０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 当該第一標的配列がＲＮＡ標的配列であり、当該第一プラ
    イマー核酸がＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡプライマーであり、
    当該第一酵素が当該第一プライマーを伸長させて新合成第一ＤＮＡ鎖を形成させ
    る逆転写酵素であり、当該方法がさらに、 ａ）当該第一標的配列を分解(degrade)するＲＮＡ分解酵素を含む第二酵素を加 えること、 ｂ）当該新合成第一ＤＮＡ鎖にハイブリダイズする第三プライマーを加えること
    、 ｃ）当該第三プライマーを伸長させて新合成第二ＤＮＡ鎖を形成させるＤＮＡポ
    リメラーゼを含む第三酵素を加え、新合成ＤＮＡハイブリッドを形成させること
    、 ｄ）当該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを含む
    第四酵素を加え、当該ＤＮＡハイブリッドから少なくとも１種の新合成ＲＮＡ鎖
    を発生させること、 を含み、そのようにして核酸配列ベース増殖（ＮＡＳＢＡ）を起こす、請求項１
    または２に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 標的核酸配列の検出方法であって、 ａ）アンプリファイヤープローブおよび標的配列を含む第一ハイブリダイゼーシ
    ョン複合体、但し当該アンプリファイヤープローブは少なくとも２つの増殖配列
    を有している、を形成させること、 ｂ）少なくとも１つの標識プローブの第一部分を、少なくとも１つの増殖配列の
    全部または一部にハイブリダイズさせること、 ｃ）当該標識プローブの第二部分を、電極と導電性オリゴマーを介して共有的に
    結合している検出プローブにハイブリダイズさせ、少なくとも第一電子伝達部分
    （ＥＴＭ）を含有する第二ハイブリダイゼーション複合体を形成させること、さ
    らに、 ｄ）当該第一ＥＴＭと当該電極間の電子伝達を測定することにより当該標識プロ
    ーブを検出すること、 を含む方法。
  14. 【請求項１４】 標的核酸配列の検出方法であって、 ａ）アンプリファイヤープローブおよび標的配列を含む第一ハイブリダイゼーシ
    ョン複合体、但し当該アンプリファイヤープローブは少なくとも２つの増殖配列
    を有し、当該第一ハイブリダイゼーション複合体が導電性オリゴマーを含有する
    単一層を含む電極と共有的に結合しているものである、を形成させること、 ｂ）少なくとも１つの電子伝達部分（ＥＴＭ）を含有する少なくとも１つの標識
    プローブを、少なくとも１つの増殖配列の全部または一部にハイブリダイズさせ
    ること、 ｃ）当該第一ＥＴＭと当該電極間の電子伝達を測定することにより当該標識プロ
    ーブを検出すること、 を含む方法。
  15. 【請求項１５】 下記を含む、第一標的核酸配列検出用キット。 ａ）当該標的配列の少なくとも第一ドメインと実質的に相補的である少なくとも
    第一核酸プライマー、 ｂ）当該第一核酸プライマーを修飾する少なくとも第一酵素、および、 ｃ）導電性オリゴマーを介して共有的に当該電極と結合している少なくとも１つ
    の検出プローブを含む電極。
  16. 【請求項１６】 下記を含む、第一標的核酸配列検出用キット。 ａ）当該標的配列の少なくとも第一ドメインと実質的に相補的である少なくとも
    第一核酸プライマー、 ｂ）当該第一核酸プライマーを修飾する少なくとも第一酵素、および、 ｃ）導電性オリゴマーを含有する単一層を含む電極。
  17. 【請求項１７】 当該第一酵素が耐熱性のＤＮＡポリメラーゼである、ＰＣ
    Ｒ反応検出用の、請求項１５または１６に記載のキット。
  18. 【請求項１８】 当該第一酵素がリガーゼであり、当該キットが、当該第一
    標的配列の第一ドメインと実質的に相補的である第一核酸プライマー、および、
    当該第一標的配列の第二隣接ドメインと実質的に相補的である第三核酸プライマ
    ーを含む、ＬＣＲ反応検出用の、請求項１５または１６に記載のキット。
  19. 【請求項１９】 当該第一酵素がポリメラーゼであり、当該キットがさらに
    ニック化酵素を含む、鎖変位増殖（ＳＤＡ）反応検出用の、請求項１５または１
    ６に記載のキット。
  20. 【請求項２０】 当該第一酵素が逆転写酵素であり、当該キットがさらにＲ
    ＮＡ分解酵素を含む第二酵素、第三プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを含む第三
    酵素、およびＲＮＡポリメラーゼを含む第四酵素を含む、ＮＡＳＢＡ反応検出用
    の、請求項１５または１６に記載のキット。
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