JPH04278450A

JPH04278450A - バイオセンサー及び分析物を分析する方法

Info

Publication number: JPH04278450A
Application number: JP3238928A
Authority: JP
Inventors: Adam Heller; アダム・ヘラー; Ruben Maidan; ルビン・メイダン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-03-04
Filing date: 1991-08-27
Publication date: 1992-10-05
Also published as: US20110021895A1; US20120108930A1; US20080210557A1; US5356786A; CA2050057A1; US8414750B2; US20090137889A1; US8414749B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、改良センサーおよび溶
液中分析物濃度を分析評価するための感知システムに関
する。さらに詳細には、前記センサーおよび感知システ
ムでは、干渉物類が実質的にアッセイ（ａｓｓａｙ）に
干渉する前に選択的に干渉物を酸化することによって、
このような干渉物類を排除する。

【０００２】

【従来の技術】グルコースは、典型的に、グルコースオ
キシダーゼを用いる酵素電極類におけるグルコース濃度
の検出によってアッセイされる。酸化電位重複のため、
既存の酵素電極センサー類は、グルコースとアスコルビ
ン酸塩、尿酸塩、ビリルビン、システイン、およびアセ
トアミノフェノールのような他の電気的に酸化可能な種
類（以下“干渉物類”）の識別ができない。その結果、
これらの干渉性種、および同様に重複する酸化電位を有
するその他の種類は、血液試料中の正確なグルコースレ
ベルの分析を妨げる。

【０００３】当業者は、前記干渉物類が血液溶液中にお
ける正確なグルコース分析に影響を及ぼすことを防止す
る方法を探索してきた。Ｄａｐｐｅｎに対する米国特許
第４，０９８，５７４号は、一体型多層構成要素中で実
施したグルコース分析に対するフッ素イオンの干渉物類
は、その中に含有される試薬組成を４．５および６．０
の間のｐＨに緩衝することによって低下または排除する
ことができることを開示しているようである。Ｂｅｒｔ
ｉらに対する米国特許第４，２４７，２９７号は、ヒド
ラゾンおよび８−アミノ−１−ナフトール−５，７−ジ
スルホン酸からなる試験手段を使用することによって、
“干渉性の還元性物質類に高度に耐性の”試験系を特許
請求しているようである。

【０００４】当業者は、また、干渉物類の効果を低減す
る試みの一部として、高度に特異的なセンサー類を設計
することを試みてきた。Ｊａｎａｔａらに対する米国特
許第４，７７６，９４４号は、液体中における化学物質
の存在を検出するためのアドミタンス変調を利用する化
学選択性のセンサーシステムを開示しているようである
。また、市販の変形したグルコースセンサー類は、ろ過
膜類および静電反発膜類を利用して干渉物が分析物検出
層に到達するのを阻害する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記記載の改良にもか
かわらず、当業者は、未だ、干渉物類によって起きた不
正確性問題を適切に解決していない。

【０００６】本発明の一般的目的は、干渉物がアッセイ
の正確さに影響を及ぼす前にこの干渉物類を酸化するこ
とによって干渉物類の効果を最小とするかまたは排除す
る改良センサー類および感知方法類を提供することであ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】先行技術における課題は
、感知表面を有する感知構成要素からなる溶液中分析物
濃度検出のための新規センサーによって解決され、この
感知表面は、酸化剤存在下に複数の干渉物類を酸化可能
な触媒含有層によって実質的に包囲されているかまたは
被覆されていることを特徴とする。

【０００８】実施例において、パーオキシダーゼは触媒
であり、かつ、過酸化水素は酸化剤であった。感知構成
要素は、１個の電極およびこの電極に電気的に接触して
いる１個の分析物感知層からなる。分析物感知層は、オ
キシドレダクターゼからなる酵素からなる。適切なオキ
シドレダクターゼの例として、グルコース分析のための
グルコースオキシダーゼ、乳酸分析のための乳酸オキシ
ダーゼなどが挙げられる。

【０００９】センサーの一つの形態は、さらに第１層上
部に固定化された触媒含有層からなる上記の電極からな
る。この触媒含有層は酸化剤存在下において作用し、干
渉化合物類が感知構成要素に到達する前にこの干渉化合
物類を酸化する。このようにして、感知構成要素は、干
渉物類の干渉的影響から保護される。

【００１０】触媒含有層はそれ自体アッセイに悪影響を
及ぼすことがあるので、触媒含有層が感知構成要素に干
渉しないように防止することは有益である。この干渉を
防止するためのひとつの方法は、触媒含有層がもはや干
渉しないように作用条件を調節することを含む。これと
は別に、触媒含有層が分析物感知層に透過することを分
析物感知層と触媒含有層との間の障壁薄層が阻害し、そ
れによって、この触媒含有層が分析物感知構成要素に接
触することを阻害することができる。さらにまた、この
分析物感知層は触媒含有層によって非透過性となるよう
に架橋され、それによって、触媒含有層がこの分析物感
知構成要素に接触することを阻害する。

【００１１】酸化剤自体がいくつかの状況では望ましく
ないので、酸化剤のインサイチュウ産生を記載した方法
が提供されている。このようにして、酸化剤は、別々の
層中の別々の酵素によって産生されるか、または、分析
物感知層中に用いられたのと同一酵素によって産生され
る。酸化剤産生酵素は、分析物感知層、触媒含有層と混
合されるか、またはそれ自体、別の層であることもでき
る。

【００１２】以下に本発明の実施態様を列挙する。

【００１３】（実施態様１）　　感知表面を有する感知
構成要素からなる溶液中分析物濃度検出のための新規セ
ンサーで、この感知表面が、酸化剤存在下に複数の干渉
物類を酸化可能な触媒含有層によって実質的に被覆され
ていることを特徴とするセンサー。

【００１４】（実施態様２）　　前記感知構成要素が電
極からなる実施態様１のセンサー。

【００１５】（実施態様３）　　前記感知構成要素が前
記電極と電気的に接触している分析物感知層からなる実
施態様２のセンサー。

【００１６】（実施態様４）　　前記分析物感知層が酵
素からなる実施態様３のセンサー。

【００１７】（実施態様５）　　前記酵素がオキシドレ
ダクターゼからなる実施態様４のセンサー。

【００１８】（実施態様６）　　前記酵素が、グルコー
スオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、キサンチンオキシ
ダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ピルビン酸オキ
シダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ類、Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼ類、アルコールオキシダーゼ、ウレアーゼ
、尿酸オキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、グリコ
ール酸（ｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）オキシダーゼ、または
ザルコシンオキシダーゼからなる実施態様４のセンサー
。

【００１９】（実施態様７）　　前記酵素がグルコース
オキシダーゼからなる実施態様４のセンサー。

【００２０】（実施態様８）　　前記センサーが、グル
コース、乳酸、キサンチン、コレステロール、ピルビン
酸塩、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、アルコール、尿素
、尿酸塩、アルデヒド、グリコール酸（ｇｌｙｃｏｌｌ
ａｔｅ）またはザルコシンを検出可能である実施態様１
のセンサー。

【００２１】（実施態様９）　　前記センサーが、グル
コースを検出可能である実施態様１のセンサー。

【００２２】（実施態様１０）　　前記触媒が酵素かな
らる実施態様１のセンサー。

【００２３】（実施態様１１）　　前記酵素が天然の酵
素または合成酵素である実施態様１０のセンサー。

【００２４】（実施態様１２）　　前記天然酵素が、ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼ（“ＰＯＤ”）、チ
トクロームｃパーオキシダーゼ、クロロパーオキシダー
ゼ、ラクトパーオキシダーゼ、甲状腺パーオキシダーゼ
、ジャパニーズラディッシュパーオキシダーゼａ、ジャ
パニーズラディッシュパーオキシダーゼｂ、ジャパニー
ズラディッシュパーオキシダーゼｃ、ミエロパーオキシ
ダーゼ、ＮＡＤＨパーオキシダーゼ、ターニップ（かぶ
）パーオキシダーゼＡ１，ターニップ（かぶ）パーオキ
シダーゼＡ２、ターニップ（かぶ）パーオキシダーゼＢ
、ターニップ（かぶ）パーオキシダーゼＤまたはグルタ
チオンパーオキシダーゼである実施態様１１のセンサー
。

【００２５】（実施態様１３）　　前記触媒がＰＯＤか
らなる実施態様１１のセンサー。

【００２６】（実施態様１４）　　前記合成酵素が鉄（
ＩＩＩ）ポルフィリン類からなる実施態様１１のセンサ
ー。

【００２７】（実施態様１５）　　前記触媒含有層が液
体である実施態様１のセンサー。

【００２８】（実施態様１６）　　前記触媒含有層が膜
に包含されている実施態様１５のセンサー。

【００２９】（実施態様１７）　　前記膜が透過膜であ
る実施態様１６のセンサー。

【００３０】（実施態様１８）　　前記触媒含有層が固
定化されている実施態様１のセンサー。

【００３１】（実施態様１９）　　前記触媒含有層が感
知構成要素上に塗布されている実施態様１８のセンサー
。

【００３２】（実施態様２０）　　前記触媒含有層が架
橋剤によって架橋されている実施態様１のセンサー。

【００３３】（実施態様２１）　　前記架橋された触媒
含有層がゲルを形成する実施態様２０のセンサー。

【００３４】（実施態様２２）　　前記架橋剤がグルタ
ールアルデヒド、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、または塩
化シアヌリルである実施態様２０のセンサー。

【００３５】（実施態様２３）　　前記架橋が前記触媒
内のオリゴサッカリド群のＮａＩＯ４　による酸化によ
りアルデヒド類を形成し、ポリアクリルアミドマトリッ
クス中におけるヒドラジド基類へのこのアルデヒド類の
結合によって行われる実施態様１のセンサー。

【００３６】（実施態様２４）　　さらに酸化剤を提供
するオキシダーゼ酵素からなる実施態様１のセンサー。

【００３７】（実施態様２５）　　前記オキシダーゼ酵
素がオキシダーゼ酵素含有層内部に包含される実施態様
２４のセンサー。

【００３８】（実施態様２６）　　前記オキシダーゼ酵
素含有層が前記触媒含有層を被覆する実施態様２５のセ
ンサー。

【００３９】（実施態様２７）　　前記オキシダーゼ酵
素が前記分析物感知層内部の酵素である実施態様２４の
センサー。

【００４０】（実施態様２８）　　前記オキシダーゼ酵
素が触媒含有層と混合される実施態様２４のセンサー。

【００４１】（実施態様２９）　　前記オキシダーゼ酵
素が、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、キ
サンチンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
ピルビン酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、
ウレアーゼ、尿酸オキシダーゼ、グルコール酸オキシダ
ーゼ、またはザルコシンオキシダーゼである実施態様２
４のセンサー。

【００４２】（実施態様３０）　　前記オキシダーゼ酵
素が、グルコースオキシダーゼまたは乳酸オキシダーゼ
である実施態様２４のセンサー。

【００４３】（実施態様３１）　　前記オキシダーゼ酵
素が液体である実施態様２４のセンサー。

【００４４】（実施態様３２）　　前記オキシダーゼ酵
素が固定化されている実施態様２４のセンサー。

【００４５】（実施態様３３）　　前記オキシダーゼ酵
素が、グルタールアルデヒド、臭化シアン、過ヨウ素酸
塩、または塩化シアヌリルとの架橋によって固定化され
ている実施態様３２のセンサー。

【００４６】（実施態様３４）　　前記酸化剤がヒドロ
ペルオキシドからなる実施態様２４のセンサー。

【００４７】（実施態様３５）　　前記酸化剤が過酸化
水素、メチルヒドロペルオキシドまたはエチルヒドロペ
ルオキシドである実施態様２４のセンサー。

【００４８】（実施態様３６）　　さらに、感知構成要
素および触媒含有層の間の電気的絶縁障壁からなる実施
態様１のセンサー。

【００４９】（実施態様３７）　　前記障壁がポリマー
類によって形成される膜である実施態様３６のセンサー
。

【００５０】（実施態様３８）　　前記ポリマー類がセ
ルロースアセテート、ポリカーボネート、または過フッ
素化膜類である実施態様３７のセンサー。

【００５１】（実施態様３９）　　前記感知構成要素が
実質的に前記触媒に非透過性とされている実施態様１の
センサー。

【００５２】（実施態様４０）　　前記感知構成要素が
、前記分析物感知層を架橋剤によって架橋することによ
って実質的に前記触媒に非透過性とされている実施態様
３のセンサー。

【００５３】（実施態様４１）　　前記架橋剤がグルタ
ールアルデヒド、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、または塩
化シアヌリルである実施態様４０のセンサー。

【００５４】（実施態様４２）　　干渉物類が分析物セ
ンサーの感知表面に到達するのを防止する方法で、酸化
剤の存在下において複数の干渉物類酸化可能な触媒含有
層で前記センサーの感知表面を被覆することからなる方
法。

【００５５】（実施態様４３）　　複数の干渉物類を含
有する溶液中における分析物濃度を検出する方法で、酸
化剤を前記溶液に添加すること、前記感知構成要素に接
触する前に前記干渉物類が前記触媒含有層によって実質
的に酸化されるように前記溶液中に実施態様１のセンサ
ーを浸漬すること、および前記溶液中分析物濃度を検出
する段階からなる方法。

【００５６】（実施態様４４）　　前記センサーが電気
化学的に分析物濃度を測定する実施態様４３の方法。

【００５７】（実施態様４５）　　電圧が前記センサー
に対してかけられる実施態様４５の方法。

【００５８】（実施態様４６）　　前記分析物の濃度が
前記センサーを介して流れる電流の量に比例する実施態
様４５の方法。

【００５９】（実施態様４７）　　前記電圧が、触媒が
前記電流に還元電流を課すことを防止する実施態様４６
の方法。

【００６０】（実施態様４８）　　前記電圧が増加して
触媒が前記電流に還元電流を課すことを防止する実施態
様４７の方法。

【００６１】（実施態様４９）　　前記電圧が４００ｍ
Ｖ未満である実施態様４８の方法。

【００６２】（実施態様５０）　　前記電圧が４００ｍ
Ｖを越えている実施態様４８の方法。

【００６３】（実施態様５１）　　前記酸化剤がヒドロ
ペルオキシドからなる実施態様４３の方法。

【００６４】（実施態様５２）　　前記ヒドロペルオキ
シドが、過酸化水素、メチルヒドロペルオキシドまたは
エチルヒドロペルオキシドである実施態様５１の方法。

【００６５】（実施態様５３）　　前記酸化剤が過酸化
水素からなる実施態様４３の方法。

【００６６】（実施態様５４）　　前記干渉物が前記触
媒存在下において前記酸化剤によって酸化される水素ド
ナー化合物からなる実施態様４３の方法。

【００６７】（実施態様５５）　　前記干渉物がフェノ
ール類、アミノフェノール類、ジアミン類、インドフェ
ノール類、ロイコダイ類、アスコルビン酸塩またはアミ
ノ酸類である実施態様５４の方法。

【００６８】（実施態様５６）　　前記干渉物類アスコ
ルビン酸塩、尿酸塩、アセトアミノフェン、システイン
、またはビリルビンからなる実施態様５４の方法。

【００６９】

【実施例】本装置は、固体電極材料を被覆する触媒およ
び電子リレー類（すなわち、メディエータ類）の２層以
上の層で構成された電気化学的分析物センサーである。本出願の内容において、“分析物”とは、分析され、検
出され、またはある方法で測定される物質を意味する（
本実施例において、グルコースは分析物である）。同様
に、“干渉物”とは、あらゆる所望の分析、検出または
測定過程に干渉する物質である。

【００７０】好適な電極材料はガラスカーボンであるが
、グラファイト、プラチナ、パラジウム、酸化スズ、伝
導性有機塩類などのようないかなるその他の電極材料で
あっても良い。典型的には、ワイアがこの電極材料に電
気的に接触する。材料の種々の層が、この電極材料の露
出表面に塗布される。数例において、電極材料自体が分
析物を感知しかつ検出することが可能であるが、しかし
、ほとんどの場合、特殊感知層または化学的改質がこの
電極材料に適用されなければならない。

【００７１】分析物感知層（図１，２または３における
第１層）は、この特定の分析物のための感知構成要素を
含有しており、電極材料と緊密に接触している。本出願
の目的のため、“分析物感知層”という用語は、分析物
分析のために有用なシグナルを検出しかつ送信するため
に必要な感知構成要素を包含すると広く解釈されるべき
であると意図されている。通常、この層は、この層中に
組み込まれた電子リレーを介して、または、拡散性の酸
化還元メディエータ類を介して、電極と電気的に接触し
ている酵素を含有している。これとは別に、この層は、
遊離酵素の代わりに酵素を含有する細胞または組織を含
むことができる。いかなる公知の方法をも用いて、分析
物感知層を電極と電気化学的に接触させることができる
。このようなひとつの方法は、Ｄａｖｉｓ等に対する米
国特許第４，７５８，２３２号に記載されている。

【００７２】適切な分析物感知層酵素類は、デヒドロゲ
ナーゼ類またはオキシダーゼ類のようなオキシドレダク
ターゼ類である。適切酵素の例として、グルコース分析
のためのグルコースオキシダーゼ、乳酸分析のための乳
酸オキシダーゼ、キサンチン分析のためのキサンチンオ
キシダーゼ、コレステロール分析のためのコレステロー
ルオキシダーゼ、ピルビン酸分析のためのピルビン酸オ
キシダーゼ、Ｌ−アミノ酸分析のためのＬ−アミノ酸オ
キシダーゼ類、Ｄ−アミノ酸分析のためのＤ−アミノ酸
オキシダーゼ類、アルコール分析のためのアルコールオ
キシダーゼ、尿素分析のためのウレアーゼ、グルコール
酸（ｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）分析のためのグリコール酸
オキシダーゼ、ザルコシン分析のためのザルコシンオキ
シダーゼ、およびその他の類似酵素類が挙げられる。好
適な実施例の詳細な説明において、グルコースオキシダ
ーゼ（ＧＯＤ）は、グルコースの分析のために使用され
る。

【００７３】適切なメディエータ類は、金属イオン類、
伝導性有機塩類、キノン類およびそれらの誘導体類、フ
ェロセン類およびそれらの誘導体類のような有機金属錯
体類、または遷移金属類およびそれらの誘導体類のよう
なポリピリジン錯体類のような電気化学的に活性の化合
物類である。酵素シェルに付着しかつそれを電気的に伝
導性とする同一型の化合物類は、電子リレーとして挙動
するであろう。好適な実施例の詳細な記載では、オスミ
ウムビス（ビピリジン）クロリドのポリ（ビニルピリジ
ン）錯体を基剤とするレドックスポリマーが電子リレー
である。このポリマーは、架橋剤、ポリ（エチレングリ
コール）ジグリシジルエーテルを用いかつエポキシレド
ックスゲルを形成する酵素及び電極表面と緊密に接触さ
せられる。

【００７４】本装置の触媒含有層は、干渉物排除構成要
素を含有している。この層の基本的成分は、下記の反応
を媒介することができる触媒である。

【００７５】この一般的反応において、水素ドナーであるＡＨ２　は
干渉性化合物であり、過酸化水素によって実質的にもは
や電気化学的に活性ではない非干渉性化合物−“Ａ”に
酸化される。酸化後、この非干渉性化合物“Ａ”は分析
物感知層にまで拡散するが、化合物“Ａ”がもはや電気
化学的に活性でないので分析に干渉しない。触媒は、ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼのような天然の酵素
であるかまたはパーオキシダーゼに対するあるモデル化
合物（例えば、鉄（ＩＩＩ）ポルフィリン類）のような
合成または半合成触媒である。この好適な実施例の詳細
な記載では、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）が触媒として使用される。

【００７６】ＰＯＤは、上記式の触媒として良好に作用
する酵素である。ＰＯＤ酵素は、水素ドナー（ＡＨ２　
）に対して低い特異性を有している。フェノール類、ア
ミノフェノール類、ジアミン類、インドフェノール類、
ロイコダイ類、アスコルビン酸塩類およびアミノ酸類の
ような多くの化合物類が、そのようなものとして活性で
ある。さらに重要であるのは、アスコルビン酸塩、尿酸
塩、アセトアミノフェン、ビリルビン、またはシステイ
ンのような生理液体中に存在する干渉物類が、ＰＯＤ存
在下において過酸化水素によって迅速に酸化されること
である。したがって、ＰＯＤ含有層は、Ｈ２　Ｏ２　に
暴露されたときに電極周辺からこれらの化合物類を排除
するであろう。適切な触媒の存在下において過酸化水素
によって酸化されたその他全ての干渉化合物は、この触
媒を用いて急速に除去されるであろうと予想される。

【００７７】最適には、この触媒が、干渉物類が分析物
感知層に到達する前に触媒と緊密に接触するような方法
で分析物感知層を被覆すべきである（図２参照）。本触
媒は、２つの方法を用いてこのように分析物感知層を被
覆するように配置されることができる：（１）透過膜に
よって第１層付近に含有された可溶性触媒を用いること
。

【００７８】（２）分析物感知層を被覆する不溶性触媒
を用いること。

【００７９】方法（２）において、本触媒は、不溶性マ
トリックスに付着されるかまたは架橋剤によって架橋さ
れもはや可溶性ではないゲル様構造を形成する。このパ
ーオキシダーゼ型の酵素類の場合には、２官能性のまた
は多官能性の試薬類のようなタンパク質架橋剤類が使用
できる。２官能性試薬類は、分子間架橋によって酵素類
を不溶性とするために使用される。酵素固定化のために
適した架橋剤として、グルタールアルデヒド、臭化シア
ン、過ヨウ素酸塩、または塩化シアヌリルが挙げられる
。好適な実施例の詳細な記載では、ホースラディッシュ
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）が２つの異なる方法で架橋
される。

【００８０】（１）架橋剤としてグルタールアルデヒド
を用いること。または（２）ＰＯＤグルコ酵素中のオリゴサッカリド群をＮａ
ＩＯ４　で酸化後、ポリアクリルアミドマトリックス中
において形成されたアルデヒド類をヒドラジド基に対し
て結合し、ヒドラゾン類を形成すること。

【００８１】干渉化合物が触媒含有層（第２層）に到達
すると過酸化水素によって酸化され、従って、それが分
析物感知層（第１層）に到達することおよびその後の電
気化学的検出を防止する。過酸化水素は、２つの方法の
ひとつで存在する。

【００８２】（１）アッセイ（ａｓｓａｙ）溶液に添加
するか、または（２）下記の式：に従って、酸化剤属の酵素によってインサイチュで産生
される。

【００８３】適切な対応する基質類が分析試料中に存在
する限り、過酸化水素を産生可能な１種以上の酵素類が
Ｈ２　Ｏ２　発生層中に含まれる。適切な酵素類の例と
して、グルコースを基質とするグルコースオキシダーゼ
、乳酸を基質とする乳酸オキシダーゼ、キサンチンを基
質とするキサンチンオキシダーゼ、ピルビン酸を基質と
するピルビン酸オキシゲナーゼ、アミノ酸を基質とする
アミノ酸オキシダーゼ、コリンを基質とするコリンオキ
シダーゼ、アルコールを基質とするアルコールオキシダ
ーゼ、アスコルビン酸塩を基質とするアスコルビン酸オ
キシダーゼ、尿酸を基質とする尿酸オキシダーゼ、アル
デヒドを基質とするアルデヒドオキシダーゼ、ザルコシ
ンを基質とするザルコシンオキシダーゼなどがある。

【００８４】過酸化水素発生酵素は、分析物感知層中で
分析酵素として使用されているのと同じ酵素であること
もできる。例えば、グルコースセンサーの場合、グルコ
ースオキシダーゼの一部は、電子リレーを介した電極に
よってグルコースの酸化を媒介し、それによって、グル
コースの分析を行う。残りのグルコースオキシダーゼは
酵素によるグルコースの酸化を媒介しそれによって過酸
化水素を発生し、その後干渉物の排除のため触媒含有層
中で使用されるであろう。

【００８５】この過酸化水素発生酵素は第３層（図３，
第　ＩＩＩ層）中に含まれ、および／またはそれは触媒
含有層と混合できるかまたは分析物感知層中に混合され
るであろう。この過酸化水素発生酵素は、好適には、干
渉物排除触媒の周辺に位置する。この酵素は、また、膜
によって含有される可溶性酵素としてまたは先の層に付
着された不溶性酵素として使用できる。好適な実施例（
実施例３）の詳細な記載では、乳酸オキシダーゼは、下
記の式による過酸化水素発生酵素として使用される：こ
の実施例では、架橋試薬としてグルタールアルデヒドを
用い、乳酸オキシダーゼ（ＬＯＤ）はパーオキシダーゼ
層の上部に固定化される。

【００８６】このようにして調製された多層電極類は、
全ての異なる種類の電気化学的感知方法のために使用で
きる。免疫電極類ならびにアンペロメトリ、ポテンシオ
メトリ、コンダクトメトリまたはインピディメトリ装置
が、干渉物排除層の使用によって恩恵を受ける。実証の
ため、電極類は、アンペロメトリ感知装置として使用さ
れている。

【００８７】測定は、電解質を含有する媒体中でおよび
３電極構成を用いて行う。多層電極は作用電極として用
い、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）またはＡｇ／ＡｇＣｌ
は標準電極として用い、および金属ワイアは対向電極と
して用いる。これとは別に、２電極構成を用いることが
できる（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌを標準および対向電極
の双方に用いる）。

【００８８】好適な実施例の詳細な記載では、多層電極
が作用電極として用いられ、飽和カロメル電極（ＳＣＥ
）が標準電極として用いられ、およびプラチナワイアが
電解質含有ガラスセル中において対向電極として用いら
れる。

【００８９】このセルは分析試料を含有するか、または
この試料を後の時点でセル中に注入できる。電気化学電
位は、標準電極に対して作用電極に適用され、そして、
流れる電流は時間の関数として測定される。電気化学電
位の選択は、酵素特性ならびにメディエータまたは電子
リレーに依存している。

【００９０】測定電流は、一般に、酸化される種の濃度
に比例している。（干渉物除去）触媒含有層が活性でな
いときには、分析物および干渉種の双方が酸化されてい
る。従って、測定電流は両濃度に比例し、そして、読み
取り値は誤読み取り値である。触媒含有層が活性である
ときには、触媒含有層中で干渉物類が酵素的に酸化され
そして分析物感知層に到達しない。後者の場合、測定さ
れる電流は、分析物濃度のみに比例している。

【００９１】ある作用条件下において、パーオキシダー
ゼ酵素（または代替え酵素）は過酸化水素の電気化学的
減少に介在することができる。この電気化学的反応は、
また、分析物感知構成要素（第１層）中で使用される同
一の電子リレーによって媒介される。この過程によって
、分析物の酸化電流上に還元電流が課されることになり
、真の電流はもはや分析物濃度に比例していないであろ
う。これは、望ましくない状況であり、それは下記の２
つの方法のひとつで防止されることができる。

【００９２】（１）還元過程がもはや進行しないような
方法で作用電極電位をより酸化的にすることによる；一
方、酸化はまだ進行しているであろう。

【００９３】（２）触媒（パーオキシダーゼ）および電
子リレーの間の電気的接触を防止することによる。

【００９４】上記方法（２）におけるように電気接触を
防止することは、下記のいずれかによって達成される。

【００９５】（１）分析物感知層と触媒含有層との間に
薄い電気絶縁障壁層を設けること。この障壁は、セルロ
ースアセテートまたはその他のセルロース誘導体類、ポ
リカーボネート類または過フッ素化膜などのような種々
のフィルムまたは膜形成ポリマー類から作製されること
ができる。図６は、オシミウム基剤グルコース感知層お
よび触媒含有層およびグルコース感知層の間の障壁層を
有する多層電極の略図を示している。

【００９６】（２）分析物感知層をさらに架橋させるこ
とによってパーオキシダーゼ酵素に対してそれをさらに
非透過性とする。もしパーオキシダーゼ触媒がもはや透
過できないならば、電子リレーとパーオキシダーゼの間
に全く電気接触がなくなり、そして、還元電流は全く観
察されないであろう。グルタールアルデヒド、臭化シア
ン、過ヨウ素酸塩、塩化シアヌリルのようなあらゆるタ
ンパク質架橋剤が使用でき、このタンパク質を分析物感
知層中で架橋する。

【００９７】下記の特定の実験例は、本発明の実施方法
を例示したものであるが、本発明を限定するものとは見
なしてはならない。

【００９８】実施例１　　ガラスカーボンロッド１片｛長さ１０ｍｍ，直径３
ｍｍ，Ｖ２５ビトレアウスカーボン（Ｖｉｔｒｏｕｓ　
　Ｃａｒｂｏｎ）、アトマージックケメタルズ（Ａｔｏ
ｍｅｒｇｉｃ　　Ｃｈｅｍｅｔａｌｓ　　Ｃｏｒｐ．）
、ファーミントン（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ）、Ｎ．Ｙ．
｝を、絶縁エポキシ樹脂｛クイックスティク（Ｑｕｉｃ
ｋ　　Ｓｔｉｃｋ）−ＧＣエレクトロニクス（Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｎｉｃｓ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ｝でガ
ラス管中に密封した。銅線ワイアを、電気伝導性の銀エ
ポキシ｛エポテック（Ｅｐｏ−ｔｅｋ）Ｈ２０Ｅ｝、エ
ポキシテクノロジー（Ｅｐｏｘｙ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ）社、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．）によって
、このロッドの後端に付着させた。ガラス管の先端は、
なめらかな表面が得られるまでサンドペーパー（粒度６
００）で研磨し、ガラスカーボンの３ｍｍディスクを露
出した（電極表面）。電極表面を、アルミナ粉末（５．
０，１．０および０．３マイクロメータ粒子径）で順次
研磨し、前処理した。各研磨段階の後電極表面を脱イオ
ン水で洗浄し、３分間超音波処理し、そして窒素気流下
に乾燥した。

【００９９】オスミウムレドックスポリマー（“Ｐｏｓ
−ＥＡ”）の合成　　シス−ビス−（２，２′−ビピリジン−Ｎ，Ｎ′）
ジクロロオスミウム（ＩＩ）［Ｌａｙ，Ｐ．Ａ．；Ｓａ
ｒｇｅｓｏｎ，Ａ．Ｍ．；Ｔａｕｂｅ，Ｈ．，インオー
ガニックシンセシス（Ｉｎｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．），第
２４巻，１９８６，２９１−３０６頁］（０．４９４ｇ
，０．８６４ｍｍｏｌ）およびポリ（４−ビニルピリジ
ン）｛ＰＶＰ，ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ）−Ｗｏｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＭＷ５０，００
０｝（０．４３０ｇ，４．０９ミリ当量）をエチレング
ルコール１８ｍｌ中で２時間還流しながら窒素下に加熱
した。室温に冷却後、ジメチルホルムアミド３０ｍＬお
よび２−ブロモエチルアミンヒドロブロミド１．５ｇ（
７．３ミリモル）を添加し、この溶液を４５℃で１晩撹
拌した。本溶液を急速撹拌アセトン中に注ぎ、粗ポリマ
ーを沈澱させた。吸湿性の沈澱物を採取し、Ｈ２　Ｏに
溶解ろ過し、そしてＮＨ４　ＰＦ６　溶液の添加によっ
てＰＦ６　塩として沈澱させた。この乾燥ＰＦ６　塩（
０．４９ｇ）を次にアセトニトリル２０ｍｌ中に溶解し
、Ｈ２　Ｏ５０ｍｌで希釈し、そして２時間アニオン交
換ビーズ（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ａｇ１−Ｘ
４、塩化物形）上に注いだ。この溶液をろ過し、次に真
空下に約１０ｍｌになるまで蒸発させた。濃縮ＨＣｌを
次に添加し本溶液をｐＨ２とし、この溶液を急速撹拌ア
セトニトリル中に滴下した。この沈澱物をろ過しそして
真空デシケータ内で乾燥させた。

【０１００】分析物（グルコース）感知層（第１層）の
調製は、オスミウムレドックスポリマー（ＰＯｓ−ＥＡ
）２ｍｇ／ｍｌ、ポリエチレングリコールジグリシジル
エーテル｛ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ
）　　ＭＷ４００｝０．１２ｍｇ／ｍｌ、およびｐＨ７
．８　　ＨＥＰＥＳ緩衝液５ｍＭ中グルコースオキシダ
ーゼ｛シグマ（Ｓｉｇｍａ）タイプＸ、セントルイス、
ミズーリ、１２８単位／ｍｇ｝１ｍｇ／ｍｌ溶液を含有
する溶液を調製することからなる。本溶液の１μｌの１
滴を電極表面に適用した。電極は、真空デシケータ中に
室温で４８時間放置し設置した。

【０１０１】グルコース感知層は、さらに、この電極を
０．２５％グルタールアルデヒド溶液中に５秒間浸漬し
架橋させ、その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２，０．１
モル（“Ｍ”））によって洗浄した。この段階の目的は
、電子リレーと次層中のパーオキシダーゼの電気化学的
接触を防止することにある。

【０１０２】触媒（ＰＯＤ）含有層（第２層）は、障壁
層上部にＰＯＤ｛シグマ（Ｓｉｇｍａ）、タイプＩ、８
５単位／ｍｇ｝溶液（５ｍｇ／ｍｌグルタールアルデヒ
ド含有０．１Ｍリン酸緩衝ｐＨ７．２中１００ｍｇ／ｍ
ｌ）５マイクロリットルを付着させることによって調製
し、２時間放置、設置した。

【０１０３】電気化学的測定は、プリンストンアプライ
ドリサーチモデル（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　　Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｍｏｄｅｌ）２７３ポテ
ンシオスタット／ガルバノスタットによって実施し、そ
して、ｘ−ｙ−ｔチャートリコーダに記録した。測定は
、３電極構成を用いて電解質溶液（０．１Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ７．２および０．１Ｍ　　ＮａＣｌ）５ｍｌ含
有セル中で行った。多層電極は作用電極として使用し、
飽和カロメル電極（ＳＣＥ）は標準電極として使用し、
およびプラチナワイアは対向電極として使用した。作用
電極の電位は、ＳＣＥ電極に対して４００ｍＶに保持し
、流れる電流は時間の関数として測定した。グルコース
または干渉物のストック溶液５マイクロリットルを電解
質溶液に添加し急速に混合した。干渉物化合物類（アス
コルビン酸塩、尿酸塩、ビリルビンおよびアセトアミノ
フェン）のストック溶液をあらたに調製したが、その理
由は、このような化合物類は放置すると分解する傾向が
あるからである。

【０１０４】図４は、上記記載のセンサーを用いた実験
結果を示している。この実験において、グルコース（最
終濃度２．０ｍＭ）およびアスコルビン酸塩（最終濃度
０．１ｍＭ）を別々に別々の電解質溶液に添加し、急速
に混合した。図４（ａ）は、過酸化水素不在下において
測定した電流を示している。図４（ｂ）は、過酸化水素
存在下において測定した電流を示している（０．１ｍＭ
）。

【０１０５】図５は、異なる干渉物類に対する類似実験
の結果を示している。この実験では、グルコース（最終
濃度２．０ｍＭ）およびアセトアミノフェン（タイレノ
ール（Ｔｙｒｅｎｏｌ））（最終濃度０．１ｍＭ）を別
々に別々の電解質溶液に添加し、急速に混合した。図５
（ａ）は、過酸化水素不在下における電流を示している
。図５（ｂ）は、過酸化水素存在下において測定した電
流を示している（０．１ｍＭ）。

【０１０６】図４および図５に示したように、Ｈ２　Ｏ
２　が存在するときに干渉物からの誤信号が実質的に低
下する。このグルコース信号は、干渉物を排除する触媒
含有層によって影響を受けない。同様の結果が、尿酸ま
たはビリルビンをアスコルビン酸塩またはタイレノール
の代わりに使用した際に得られる。また、類似の結果が
干渉物混合物を使用した際に得られる。類似の結果が、
触媒（パーオキシダーゼ）含有層の存在下において過酸
化水素によって酸化される他の干渉物類（システインの
ような）からも得られるであろうと予測されている。図
４および図５に示した結果は、グルコースおよび干渉物
を別々に添加した実験からのものである。グルコースお
よび１種以上の干渉物類を含有する混合物をＨ２　Ｏ２
　存在下に注入した際には、測定電流はグルコースのみ
の注入で測定されたものに等しい。このことは、干渉物
排除触媒層が予測されたように作用しかつ複数の干渉物
類が電気活性層に到達することを妨げることを示唆して
いる。

【０１０７】実施例１に記載の操作が、過酸化水素を外
部源から分析物溶液に添加した場合媒体中で実施する好
適な態様であると予測されている。本方法の適用の例と
して、試料の臨床分析（エクスビボ）または工業工程に
おける試料の分析のための用途が挙げられる。

【０１０８】実施例２　　実施例１に記載のように電極を調製した。触媒含有
層の上部に、乳酸オキシダーゼ（ＬＯＤ）含有過酸化水
素発生層を、それをグルタールアルデヒドによって架橋
することによって固定化した（図３）。この層は、ＬＯ
Ｄ｛フィンシュガー（Ｆｉｎｎｓｕｇａｒ）、Ｓｃｈａ
ｕｍｂｕｒｇ、イリノイ、３３単位／ｍｇ｝溶液（５ｍ
ｇ／ｍｌグルタールアルデヒド含有０．１Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ７．２中１００ｍｇ／ｍｌ）をＰＯＤ層の上部に
５マイクロリットル付着させることによって、調製した
。このセンサーを次に２時間放置し、設置した。

【０１０９】この電極の実験的使用は、緩衝物類に対す
る酸化剤として乳酸が過酸化水素に置換しているという
条件で、実施例１記載と同様とした。従って、過酸化水
素は分析物溶液に添加しなかった。この電極で得られた
結果は、実施例１に記載の結果と類似であった。

【０１１０】実施例２に記載の操作は、外部源から過酸
化水素を添加することが望ましくない場合媒体中で実施
するために好適な態様であると予想される。このような
適用の実施例は、インビボ測定、小量の分析物溶液（例
えば、血液滴）の分析のためのディスポーザブルセンサ
ー類としての使用、または工業用発酵槽または反応炉工
程類における使用のためである。

【０１１１】実施例３　　電極表面前処理および分析物感知層調製のため、実
施例１に記載のように電極を調製した。この層は、グル
タールアルデヒドによってさらに架橋することもなくま
たは障壁層によって被覆することもなかった。触媒含有
層は、ＰＯＤをヒドラチドポリマーマトリックス上にＰ
ＯＤを固定化することによって分析物感知層の上部に直
接被覆した。特に、触媒含有層は下記のように固定化し
た。溶液（Ａ）は、水に溶解したポリアクリルアミドヒ
ドラジド（水溶性、シグマ＃Ｐ９９０５）５ｍｇ／ｍｌ
からなる。溶液（Ｂ）は、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶
液１００マイクロリットル中に溶解したパーオキシダー
ゼ２ｍｇ（シグマ、タイプＶＩ、２６０単位／ｍｇ）か
らなった。過ヨウ素酸ナトリウム（１２ｍｇ／ｍｌ溶液
の５０マイクロリットル）を溶液（Ｂ）に添加し、この
溶液を暗所で２時間、室温（２０−２５℃）でインキュ
ベートした。

【０１１２】インキュベーション後、溶液（Ａ）からの
７．５マイクロリットルを溶液（Ｂ）に添加し、この混
合物の１０マイクロリットルをグルコース感知層の上部
に適用した。電極は２時間放置設置し、その後使用した
。

【０１１３】溶液（Ａ）および（Ｂ）を用いる上記記載
の方法は、グルタールアルデヒド（または類似化合物）
などを用いる類似の操作と互換性がある。溶液（Ａ）お
よび（Ｂ）を用いる方法は、接触する化合物類をより少
なく分解する傾向があるので、他の方法に比べてより穏
和である傾向がある。

【０１１４】この電極の実験的使用は、より高い酸化電
位（対ＳＣＥ４００ｍＶの代わりに対ＳＣＥ５００ｍＶ
）を作用電極に適用するという条件で、実施例１に記載
と同様に行った。この電極で得られた結果は、実施例１
に記載の結果と類似していた。

【０１１５】実施例３に記載の操作は短時間に実施する
必要があるに過ぎないセンサーのための好適な態様であ
る。このセンサーは、その用途のためにより多くの酸化
電位を必要とする傾向がある。使用した高電位は、感知
構成要素電極の有用寿命を低下させる傾向がある。この
操作の利点は、実施例１に概略した操作に比べて１段階
少ない段階を必要とするので、適用がより簡単である（
すなわち、この操作は、分析物感知層および触媒含有層
の間に中間層を適用することを包含していない）。

【０１１６】上記３つの全実施例中で述べた本発明の干
渉物排除効果は、電気活性層を酸化産物による不活化か
ら保護することによるセンサーの長期安定性に及ぼす有
益な影響によって増強される。特に、尿酸イオンの除去
は、このセンサー類の長期安定性に有益な影響をもたら
す傾向がある。

【０１１７】さらに、本発明の種々の面の改質および別
の態様が、本明細書を参考にして当業者に明らかであろ
う。従って、本明細書は単に例示のためとして見なされ
るべきであり、当業者に対して本発明を実施する一般的
方法を教示する目的のためにある。本文に示し記載した
本発明の形態は、現在好適な態様として考えられるべき
である。構成要素類および材料類は、本文に例示され記
載されたものと置換でき、部分および工程は逆転でき、
および本発明の本明細書の有益性を把握した後の当業者
に全て明らかであるように、本発明の特徴はそれぞれ独
立して利用できる。下記の特許請求の範囲に記載の本発
明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、本文
に記載の構成要素および本文に記載の方法の段階および
その段階の順序を変更することが可能である。同様に、
反応物の異性体類および同族体類を使用でき、それでも
なおかつ本発明の範囲内にとどまることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】電極表面に分析物（グルコース）感知層（第Ｉ
層）を有する電気化学的グルコースバイオセンサーの略
図である。

【図２】干渉物を排除する触媒含有層を有する電気化学
的グルコースバイオセンサーの略図である。この装置は
、前記グルコース感知構成要素を被覆するパーオキシダ
ーゼ触媒含有層を有する（第ＩＩ層）。

【図３】干渉物を排除する触媒含有層および酸化剤（過
酸化水素）発生層を有する電気化学的グルコースバイオ
センサーの略図である。この装置は、触媒含有層を被覆
する乳酸オキシダーゼの層（第　ＩＩＩ層）を有してい
る。第　ＩＩＩ層の目的は、乳酸及び酸素を使用し、触媒含
有層に必要な過酸化水素を発生することである。

【図４】実施例１に記載の型の電極で実施する測定の結
果を示したものである。アスコルビン酸塩（０．１ミリ
モル（“ｍＭ”））およびグルコース（２ｍＭ）の添加
によって得られた信号類（時間の関数としての電流）を
、過酸化水素不在下では“ａ”で示し、過酸化水素（０
．１ｍＭ）添加において“ｂ”で示した。

【図５】実施例１に記載の型の電極で実施する測定の結
果を示したものである。タイレノール（Ｔｙｌｅｎｏｌ
）（アセトアミノフェン、０．１ミリモル）およびグル
コース（２ｍＭ）の添加によって得られた信号類（時間
の関数としての電流）を、過酸化水素不在下では“ａ”
で示し、過酸化水素（０．１ｍＭ）添加において“ｂ”
で示した。

【図６】オスミウム基剤グルコース感知層、触媒含有層
（干渉物排除層、すなわち固定化パーオキシダーゼ）お
よび分析物（グルコース）感知層を有する多層電極の略
図である。◆

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　電極と；前記電極と電気的に接触して
いるオキシドレダクターゼ（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａ
ｓｅ）を含む感知表面と；前記電極に電気的に接触して
いない触媒を含む干渉物類−除去表面と、前記触媒が酸
化剤の存在下で複数の干渉物類の酸化を触媒することと
；を備えたバイオセンサー。
【請求項２】　　前記触媒が機械的バリヤーによって前
記電極との電気的接触を守られている請求項１のバイオ
センサー。
【請求項３】　　感知表面と干渉物類−除去表面におけ
る相対酸化環元電位を設定して、オキシドレダクターゼ
と電極との電気的接触は遂行するが、しかし、触媒と電
極との電気的接触は有用な動作電圧領域では阻止する請
求項１のバイオセンサー。
【請求項４】　　前記機械的バリヤーが感知表面と干渉
物類−除去表面との間の絶縁バリヤー層を含む請求項２
のバイオセンサー。
【請求項５】　　前記機械的バリヤーが感知表面内の架
橋ポリマーを含む請求項２のバイオセンサー。
【請求項６】　　前記オキシドレダクターゼが、グルコ
ースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、キサンチンオキ
シダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ピルビン酸オ
キシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ類、Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼ類、アルコールオキシダーゼ、尿酸オキ
シダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、グリコール酸（ｇ
ｌｙｃｏｌｌａｔｅ）オキシダーゼ、またはザルコシン
オキシダーゼからなる請求項４記載のバイオセンサー。
【請求項７】　　前記触媒が、ホースラディッシュパー
オキシダーゼ、チトクロームｃパーオキシダーゼ、クロ
ロパーオキシダーゼ、ラクトパーオキシダーゼ、甲状腺
パーオキシダーゼ、ジャパニーズラディッシュパーオキ
シダーゼａ、ジャパニーズラディッシュパーオキシダー
ゼｂ、ジャパニーズラディッシュパーオキシダーゼｃ、
ミエロパーオキシダーゼ、ＮＡＤＨパーオキシダーゼ、
ターニップ（かぶ）パーオキシダーゼＡ１，ターニップ
（かぶ）パーオキシダーゼＡ２、ターニップ（かぶ）パ
ーオキシダーゼＢ、ターニップ（かぶ）パーオキシダー
ゼＤ、グルタチオンパーオキシダーゼ、または鉄（ＩＩ
Ｉ）ポルフィリン類である請求項１ないし６のいずれか
１項に記載のバイオセンサー。
【請求項８】　　前記オキシドレダクターゼがグルコー
ス・オキシダーゼである請求項６のバイオセンサー。
【請求項９】　　前記触媒がホースラディッシュ・パー
オキシダーゼを含む請求項７のバイオセンサー。
【請求項１０】　　テストサンプルにおける複数の干渉
物類の存在下での分析物を検出する、次の諸工程を含む
方法。酸化剤をサンプルに添加する工程と、干渉物類が
干渉物類−除去表面によって実質的に酸化されるように
、前記サンプル中に請求項１ないし９のいずれか１項に
記載のセンサーを浸漬する工程と、感知表面によって分
析物を検出する工程。