JP2975603B2 - 標的およびバツクグラウンド捕獲法ならびにアフイニテイー検定用装置 - Google Patents
標的およびバツクグラウンド捕獲法ならびにアフイニテイー検定用装置Info
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、標的分子の捕獲に使用するための方法、試
薬、組成物、キツトおよび装置に関する。詳しくは、本
発明は臨床試料からデオキシリボ核酸（DNA）またはリ
ボ核酸（RNA）を捕獲するための方法、試薬、組成物お
よびキツトに関する。本発明の態様は、非放射性標識技
術および自動化に適合しうる臨床試料中の標的核酸の迅
速かつ高感度の検出方法を提供する。 （従来の技術） 以下の定義は本発明を理解しやすくするために提供さ
れる。本明細書で用いる“生物学的結合対”なる用語
は、自然親和力または結合能を示すあらゆる分子対を意
味する。本明細書で用いる“リガンド”なる用語は、生
物学的結合対の１つの分子を指し、そして“抗リガン
ド”または“レセプター”なる用語は、生物学的結合対
の他方の分子を指す。例えば、制限するものでないが、
本発明の態様は生物学的結合対が２本の相補的なポリ核
酸鎖である核酸ハイブリダイゼーシヨン検定に適用され
る。ポリ核酸鎖の一方はリガンドと呼ばれ、他方は抗リ
ガンドと呼ばれる。しかしながら、生物学的結合対には
抗原と抗体、薬物と薬物レセプター部位、および酵素と
酵素基質が包含される。 “プローブ”なる用語は、標的抗リガンドと選択的に
結合しうる既知性質のリガンドを意味する。核酸に適用
するとき、“プローブ”は標的鎖に相補的な塩基配列を
もつ核酸鎖を指す。 “標識”なる用語は検出可能な分子成分を意味し、例え
ば制限するものでないが、放射性同位体、酵素、発光物
質、および染料を包含する。“試薬”なる用語は広義に
使用され、検出可能な応答へ導く反応に関与するあらゆ
る分子成分を含む。“コフアクター（補助因子）”なる
用語は、試薬との反応に関与するあらゆる分子成分を含
み、広い意味で使用される。 “回収可能”なる用語は、媒体中に実質的に分散でき
且つ固定化、過、分配などによりその媒体から分離し
うる物質を説明するために広い意味で使用される。 “支持体”なる用語は、単独で使用する場合、フイル
ターや膜のような慣用支持体ならびに回収可能な支持体
を包含する。 リガンドと抗リガンドの結合に関して“可逆的”なる
用語は、リガンドと抗リガンドの全体的な化学的性質を
永久に変えることのない変化を加える際に、結合または
解離しうることを意味する。例えば制限するものではな
いが、可逆的結合はリガンドや抗リガンドを破壊しない
pH、温度およびイオン強度の変化により制御されるこの
種の結合および解離を包含するであろう。遺伝情報は生
細胞中の糸状のDNA分子に貯えられる。生体内におい
て、DNA分子は二重らせん構造をしており、それぞれのD
NA鎖はヌクレオチドの鎖である。各ヌクレオチドは４種
の塩基：すなわちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チ
ミン（Ｔ）、およびシトシン（Ｃ）のうちの１種により
特徴づけられる。これらの塩基は、官能基の向きによ
り、ある種の塩基対が引きつけ合つて水素結合により結
合するという意味で相補的である。一方のDNA鎖中のア
デニンは他方の相補鎖中のチミンと対合する。一方のDN
A鎖中のグアニンは他方の相補鎖中のシトシンと対合す
る。RNAでは、チミン塩基がウラシル（Ｕ）によつて置
換され、ウラシルは他方の相補鎖中のシトシンと対合す
る。 DNAは共有結合されたデオキシリボヌクレオチド鎖か
ら成り、そしてRNAは共有結合されたリボヌクレオチド
鎖から成る。生物の遺伝暗号は塩基対の配列中のDNA鎖
に担持される。 それぞれの核酸は、１つのヌクレオチドの糖の５′ヒ
ドロキシル基と隣接ヌクレオチドの糖の３′ヒドロキシ
ル基との間のホスホジエステル結合により結合される。
自然界に存在するDNAまたはRNAのそれぞれの線状鎖は、
遊離の５′ヒドロキシル基をもつ１つの末端と３′ヒド
ロキシル基をもつもう１つの末端を有する。ポリヌクレ
オチドの末端はそれぞれの遊離ヒドロキシル基に関連し
て５′末端または３′末端と呼ばれる。DNAおよびRNAの
相補鎖は、一方の鎖の３′末端が他方の鎖の５′末端に
配向および結合して逆平行複合体を形成している。 核酸ハイブリダイゼーシヨン検定は、２本の核酸鎖が
相補領域で対合する性質に基づいている。現在、核酸ハ
イブリダイゼーシヨン検定は完全なDNA分子、核酸混合
物または核酸フラグメント混合物中に存在する唯一のDN
AまたはRNA塩基配列もしくは特定遺伝子を検出および同
定するために主として使用されている。 組織または培養試料から抽出された全DNAまたはRNA中
の唯一のDNAまたはRNA配列もしくは特定遺伝子の同定
は、生理学的または病理学的症状の存在を示す。特に、
ヒトまたは動物組織から抽出された全DNAまたはRNA中の
唯一のDNAまたはRNA配列もしくは特定遺伝子の同定は鎌
状赤血球貧血のような遺伝病、組織適合性、癌および前
癌状態、または細菌やウイルス感染の存在を示す。細菌
培養物または細菌を含む組織から抽出された全DNAまた
はRNA中の唯一のDNAまたはRNA配列もしくは特定遺伝子
の同定は抗生物質耐性、毒素、ウイルスまたはプラスミ
ドの存在を示し、また細菌型の同定をもたらす。 従つて、核酸ハイブリダイゼーシヨン検定は病気の診
断および検査において大きな可能性を持つている。さら
に、核酸ハイブリダイゼーシヨン検定が植物の病因また
は毒素産生細菌を検出するために使用される農業および
食品加工の分野においてもその可能性が存在する。 最も広く使用される核酸ハイブリダイゼーシヨン検定
法の１つは、サザンブロツトフイルターハイブリダイゼ
ーシヨン法またはただ単にサザン法として知られるもの
である（Southern,E.,J.Mol.Biol.I,98、503、1975を参
照されたい）。サザン法は標的DNAまたはRNA配列を同定
するために使用される。この方法は一般にRNAまたはDNA
試料をニトロセルロースシートに固定することにより行
われる。固定化RNAまたはDNA試料は、標的配列に相補的
な塩基配列を有しかつ検出可能な放射性成分を含む放射
性標識プローブDNA鎖と接触させ、プローブとDNA試料と
のハイブリダイゼーシヨン（ハイブリツド形成）を起こ
させる。 ハイブリダイゼーシヨン法は一般に極めて特異的であ
る。もしも標識プローブとDNAまたはRNA試料とが実質的
に相補的な塩基対機構を共有しないならば、これらの２
本のヌクレオチド鎖は結合しないであろう。ハイブリダ
イゼーシヨンは所定の条件に応じて３〜48時間を要す
る。 しかしながら、実際問題として、検出の際に“バツク
グラウンドノイズ（background noise）”として現われ
る標識プローブと支持体の非特異的結合が常に存在す
る。バツクグラウンドノイズは検定感度を低減させる。
ハイブリダイズされないDNAプローブはその後洗い落と
される。ニトロセルロースシートはＸ線フイルムのシー
ト上に置いて露光される。Ｘ線フイルムはフイルムの露
光面を現像して、DNAプローブとハイブリダイズするが
故に目的の塩基対配列をもつDNAフラグメントを同定す
る。 サザン検定法と共に放射性標識剤を使用することによ
り、核酸検定を臨床試料に応用することが可能になつ
た。放射性崩壊は無関係のタンパク質および有機物質を
含む臨床試料においてでさえも検出可能である。しかし
ながら、無関係のタンパク質および有機物質の存在は、
プローブと支持体の非特異的結合の一因になる。さら
に、放射性標識技術の使用は、Ｘ線フイルム上のバンド
を視覚化するために長時間の露出を必要とする。一般的
なサザン法では露出のために１〜７日を要する。さら
に、放射性標識剤の使用は特別の実験室手段およびライ
センスが必要である。 放射性同位元素標識を使用する検定に関連した上記の
諸問題点は、非同位元素標識を使用する技術の開発へ導
いた。非同位元素標識の例には酵素、発光剤および染料
が含まれる。発光標識は外部エネルギー源による励起の
際に光を発し、励起エネルギー源に応じて次の種類：す
なわち高エネルギー粒子からエネルギーを得る放射線発
光標識；化学反応からエネルギーを得る化学発光標識；
励起エネルギーが生物学的系に適用される生物発光標
識；および赤外線、可視光線または紫外線の電磁線（フ
オトン）単位により励起にしうるフオトルミネツセンス
または螢光標識；に類別される。一般には、スミス（Sm
ith）ら、Ann.Clin.Biochem.,18:253、274（1981）を参
照されたい。 非放射性エネルギー源により励起可能な標識を使用す
る非同位元素検定法は、放射性同位元素標識を使用する
検定法に伴う健康への危険性およびライセンスの問題が
回避される。さらに、非同位元素検定法はＸ線フイルム
の使用に伴う長時間露出を避けて迅速な検出が保証され
ている。 しかしながら、非同位元素検定は信頼しうると見なす
に足る感度または検定特異性を持つていなかつた。発光
検定では、生物学的試料中に含まれるタンパク質および
他の分子の存在が励起光線の散乱を起こし、発光標識の
発光スペクトル中の光を吸収して発光プローブの消光を
もたらす。 酵素検定では、生物学的試料中に含まれるタンパク質
および他の分子の存在が酵素活性を阻害する。 同様に、比色定量検定では、生物学的試料に含まれる
タンパク質および他の物質のために色の変化が検出でき
ない。 本発明の態様は、支持体および磁性粒子を含めた回収
可能な支持体上での標的およびバツクグラウンドの捕獲
に関する。磁性粒子はDNA、RNA、ポリペプチドおよび一
定の配列をもつ多重単位分子のようなオリゴマーを含む
有機化合物の合成用支持体として提案された。例えば、
スチーブン・エー・ベンナー（Steven A.Benner）およ
びジエネテイツクス・インスチチユート（Genetics Ins
titute）の欧州特許出願第83112493.8号明細書を参照さ
れたい。しかしながら、磁性粒子は標的捕獲およびバツ
クグラウンド除去のための回収可能な支持体として提案
されたことはなかつた。 磁性粒子の他の利用には血液中の磁性流体、ノイバウ
アー（R.Neubauer）、IEEE transactions on magnetics
MAG−９、445（1973）を参照；生体分子の分離のため
の官能基の結合、ギアバー（I.Giaver）の米国特許第39
70518号明細書を参照；細胞表面レセプターの標識付
け、マーゲル（S.Margel）ら、Jour.Imm.Meth.28:28:34
1〜53（1979）を参照；治療中の磁性目標にするための
薬物への結合、センアイ（A.Senyei）ら、J.App.Phys.,
49（６）:3578（1978）、ウイーダー（K.Wieder）ら、P
ro.Soc.of Exp.Bio.Med.,58:141（1978）、モツバツハ
（K.Mosbach）およびシユレーダー（U.Shroeder）、FEB
S letters102:112（1979）を参照；ウイルス、細菌およ
び他の細胞の選択的分離、モルデー（R.Molday）ら、Na
ture 268:438（1977）を参照；および生物学的重合体用
のゲルアフイニテイークロマトグラフイーにおける担体
としての磁性粒子の使用、モスバツハ（K.Mosbach）お
よびアンダーソン（L.Anderson）、Nature 270:359（19
77）を参照；が含まれ、上記の文献は参照によりここに
引用される。 慣用の回収不可能な支持体上での標的の捕獲をもたら
す２プローブ系の使用は、Nucleic Acids Research,14
（12）:5037（1986）、“アフイニテイーに基づくハイ
ブリツド捕集による核酸ハイブリツドの迅速定量化（Fa
st Quantification of Nucleic Acid Hybrids by Affin
ity−Based Hybrid Collection）”と題するアン−クリ
スチン・シユエネン（Ann−Christine Syunen）、マ
ツチ・ラークソネン（Matti Laaksonen）およびハンス
・セダーランド（Hans Sderlund）により著された文
献中で提案された。 （発明の概要） 本発明は、試料中の標的核酸を試料中の非標的核酸か
ら分離する方法を提供する。この方法は、 （ａ） 試料を、標的と結合してプローブ−標的複合体
を形成する第１の核酸プローブを含む試薬と接触させ； （ｂ） 試料を、プローブ−標的複合体の第１の核酸プ
ローブと結合する支持体と接触させ； （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｄ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｅ） 標的を、支持体および結合した第１の核酸プロ
ーブから放出させ；そして （ｆ） 支持体および結合した第１の核酸プローブを、
標的が第２の媒体中に残るように第２の媒体から実質的
に分離する； の各工程を含む。 本発明はまた、試料中の標的核酸の存在を判定する方
法を提供する。この方法は、 （ａ） 試料を、標的と結合してプローブ−標的複合体
を形成する第１の核酸プローブを含む試薬と接触させ； （ｂ） 試料を、プローブ−標的複合体の第１の核酸プ
ローブと結合する支持体と接触させ； （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｄ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｅ） 標的を、支持体および結合した第１の核酸プロ
ーブから放出させ； （ｆ） 支持体および結合した第１の核酸プローブを、
標的が第２の媒体中に残るように、第２の媒体から実質
的に分離し；そして （ｇ） 第２の媒体中に存在する標的の存在を検出す
る； の各工程を含む。 本発明はまた、標的核酸について試料を検定する方法
を提供する。この方法は、 （ａ） 試料を、標的と結合してプローブ−標的複合体
を形成する第１の核酸プローブおよび少なくとも１つの
第２の核酸プローブを含む試薬と接触させ； （ｂ） 試料を、プローブ−標的複合体の第１の核酸プ
ローブと結合する支持体と接触させ； （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｄ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｅ） プローブ−標的複合体を第２の媒体中に放出さ
せ； （ｆ） 支持体を第２の媒体から実質的に分離し；そし
て （ｇ） プローブ−標的複合体を、標的の存在を示す第
２の核酸プローブの存在について監視する； の各工程を含む。 さらに本発明は、 （ｉ） 標的と結合してプローブ−標的複合体を形成す
るが非標的核酸には結合しない第１の核酸プローブを含
む試薬； （ii） プローブ−標的複合体の第１の核酸プローブと
結合する支持体；および （iii） 標的を第１の核酸プローブおよび支持体から
放出させるための試薬； を含む、試料中の標的核酸を試料中の非標的核酸から分
離するためのキットを提供する。 本発明の目的は、対象となる標的分子について検定を
行うための方法、試薬、組成物、キツトおよび装置を提
供することである。他の目的は以後に提示されるであろ
う。便宜上、制限するものではないが、本発明の態様は
標的捕獲、バツクグラウンド捕獲、およびこれらの組合
せの分野に分けることができる。 最初に標的捕獲について述べると、本発明の態様は標
的分子を分離するための捕獲／放出サイクルを特徴とす
る。この方法は標的分子を含む可能性のある試料媒体
を、プローブおよび第１支持体（結合条件下で少なくと
も１つのプローブと会合した又は会合しうる支持体）と
接触させることを含む。プローブは標的分子と選択的に
かつ可逆的に結合して、プローブ、標的分子および回収
可能な第１支持体から成る複合体を形成することができ
る。次に、支持体は試料媒体から分離して第２媒体と接
触させる。その後、支持体を放出条件に付して支持体か
ら標的分子を放出させ、そして支持体を第２媒体から分
離する。次いで、第２支持体を結合条件下に上記の第２
媒体と接触させる。第２支持体は標的分子と選択的に結
合しうる少なくとも１つのプローブと会合されるか、又
は会合することができる。結合条件下で、標的分子はそ
の後の処理のために第２支持体に会合したプローブと複
合体を形成する。 好ましくは、第１支持体は試料媒体中に実質上均質に
分散でき且つ試料媒体から物理的に分離・回収でき、あ
るいは試料媒体中で固定化しうるという意味で回収可能
である。 第１媒体からの第１支持体の分離は、第１支持体に非
特異的に結合した細胞破片を除去する。さらに、第２支
持体への標的分子の結合は、検出のために標的分子を濃
縮して更なる精製のための放出／捕獲サイクルを可能に
する。 本方法の別の態様は回収可能な支持体を特徴とする。
本方法は標的核酸を含む可能性のある試料を、プローブ
成分と会合した回収可能な支持体と接触させることを含
む。回収可能な支持体は試料媒体中に実質上均質に分散
できる。プローブ成分は例えばプローブ成分と回収可能
な支持体との共有結合により、または親和力会合、水素
結合あるいは非特異的会合により、回収可能な支持体と
会合させることができる。 支持体は多くの形状をとることができ、例えば支持体
含有試料媒体をふるいに通す際に回収しうる特定の形に
縮小したニトロセルロース；磁場をかけた際に試料媒体
中を移動しうるように、磁性粒子または類似物を含浸さ
せたニトロセルロース；過可能であるか、または電磁
性を示すビーズもしくは粒子；および水性媒体の表面に
分離するポリスチレンビーズが含まれる。 本発明の好適な態様は、試料媒体中に実質上均質に分
散する能力により特徴づけられる磁性ビーズから成る回
収可能な支持体を包含する。好ましくは、磁性ビーズは
プローブ成分と磁性支持体粒子との共有結合または会合
を容易にする一級アミン官能基を含む。好ましくは、磁
性支持体ビーズは単磁区磁石（single domain magnet）
であつて、残留磁気を示さない超常磁性である。第１プ
ローブは結合条件下で抗リガンドと特異的に結合しうる
プローブリガンド成分を含む。回収可能な支持体は試料
媒体中で実質上均質に分散でき、結合条件下にリガンド
と結合して標的−プローブ支持体複合体を形成しうる少
なくとも１つの抗リガンド成分を含む。次に、回収可能
な支持体と試料媒体とを分離して、試料媒体はさらに処
理される。 本発明の態様は、無関係の物質を含む臨床試料媒体か
ら標的分子を捕獲するのに適している。試料媒体をプロ
ーブまたは回収可能な支持体と接触させる順序は選択に
かかわる問題である。しかしながら、その選択は一方で
はプローブと標的との間の結合速度論、他方ではプロー
ブリガンドと支持体抗リガンドとの間の結合速度論によ
り影響される。 ポリヌクレオチド標的分子およびホモポリマーリガン
ドおよび抗リガンドに適用した場合、ホモポリマーリガ
ンドと抗リガンドの結合は一般にプローブと標的の結合
よりも速い。プローブの標的への結合は、プローブリガ
ンドが支持体抗リガンドと結合した後では立体的に妨害
される。好適な態様は試料媒体と試薬とを接触させ、そ
の混合物をハイブリダイゼーシヨン条件に置くことを包
含する。次に、回収可能な支持体は試薬と試料媒体の混
合物中に分散させて、プローブ−支持体複合体の形成に
先立つて標的−プローブ複合体を形成させる。 本発明の別の態様は多重プローブ系を特徴とする。好
ましくは、本方法は上記のような第１プローブおよび標
的分子に結合でき且つ検出可能な標的成分をもつ少なく
とも１種の第２プローブを包含する。第２プローブは標
的−（第１および第２）プローブ−支持体複合体を形成
することができる。試料媒体からの回収可能な支持体の
分離工程は、標的−（第１および第２）プローブ−支持
体複合体から無関係の物質を除くのみならず、標的分子
と結合しないすべての第２プローブも分離する。標的と
結合しない第２プローブはバツクグラウンドノイズの一
因になり、偽の信号が標的の存在を示すことになる。 更なる処理は、標的−（第１および第２）プローブ複
合体を回収可能な支持体から第２媒体中へ放出させ、次
いでその複合体を新たな支持体へ再結合させることを包
含する。回収可能な第１支持体は検定法を妨害しうる非
特異的結合物質を保持するかもしれない。従つて、回収
可能な支持体からの標的−プローブ複合体の放出および
回収可能な支持体の除去の後に、プローブリガンドと結
合しうる抗リガンド成分をもつ第２支持体を標的−プロ
ーブ複合体と結合条件下で接触せしめて、標的−プロー
ブ複合体のそれ以上の精製および濃縮のために標的−プ
ローブの結合または捕獲サイクルをさらに続行すること
ができる。 更なる処理はバツクグラウンド捕獲を包含する。本発
明の別の態様は、第２プローブが第２リガンド成分をも
つ方法を含む。この方法はさらに第２抗リガンド成分を
もつバツクグラウンド支持体を含む。第２リガンド成分
と第２抗リガンド成分は、第２プローブが標的分子に結
合しないときだけ、結合条件下で安定して結合できる。
この方法はさらに標的に結合しない第２プローブを含む
可能性のある媒体をバツクグラウンド支持体と結合条件
下で接触させることを含む。次に、バツクグラウンド支
持体は媒体から分離して未結合第２プローブを除き、そ
れによりバツクグラウンドノイズを池少させる。 “バツクグラウンド支持体”なる用語は通常の意味で
使用され、フイルター、膜および回収可能な支持体を包
含する。バツクグラウンド支持体への結合は解離可能で
ある必要はない。 好適な回収可能支持体には、例えば媒体中に分散でき
しかも媒体から分離しうる粒子、顆粒、ビーズまたはフ
イラメントが含まれるが、これらに限定されない。分離
方法としては、例えば過、遠心、沈澱、表面浮選、沈
降、または電磁場の導入などがある。 本発明方法はポリヌクレオチド標的分子に応用でき
る。好ましくは、第１および第２プローブは、標的また
はプローブが固定化されている場合とは対照的に、“溶
解した状態”でポリヌクレオチド標的と速やかに結合す
る。 溶液中に実質上分散しうる回収可能支持体は、回収可
能支持体とプローブとの相互作用（これは“溶解状態”
のハイブリダイゼーシヨンを模倣するものである）を可
能にする。溶解状態では、ハイブリダイゼーシヨンは約
３〜15分で完結する。本方法の迅速なハイブリダイゼー
シヨンと簡易さにより自動化が可能である。本方法は臨
床試料中に含まれる核酸配列を無関係の物質から分離す
ることができ、それにより本方法を非同位元素標識技術
に応用することが可能である。 標的分子がポリヌクレオチドである本方法の態様は、
試料媒体と試薬とを結合条件下で接触させることを含
む。その試薬には少なくとも１つの第１ポリヌクレオチ
ドプローブおよび少なくとも１つの第２ポリヌクレオチ
ドプローブが含まれる。第１プローブは標的分子と複合
体を形成することができ、第１ホモポリマーリガンド成
分を有する。第２プローブは第１プローブに結合した標
的分子と複合体を形成することができる。その第２プロ
ーブは第１プローブの第１ホモポリマーリガンドとは異
なる第２ホモポリマーリガンド成分をもつ標識成分を含
む。次に試薬および試料媒体はバツクグラウンド支持体
と標的捕獲支持体とに接触させる。バツクグラウンド支
持体は、第２プローブが標的と結合しない場合、その第
２プローブの第２ホモポリマーリガンド成分に結合しう
る少なくとも１つの第２ホモポリマー抗リガンド成分を
含む。標的捕獲支持体は第１プローブの第１ホモポリマ
ーリガンド成分に結合しうる少なくとも１つの第１ホモ
ポリマー成分を含む。バツクグラウンド支持体および標
的捕獲支持体はバツクグラウンドノイズを除き、さらに
標的捕獲支持体はその後の処理のために標的−（第１お
よび第２）プローブ複合体を濃縮し、且つ細胞破片から
その複合体を分離する。その後の処理には標的分子の存
在を示す標識成分の検出が含まれる。 今や、バツクグラウンド捕獲に関する本発明の態様を
より詳細に説明すると、１つの態様にはプローブと標的
が複合体を形成する方法が含まれる。次に、複合体を形
成しなかつたプローブが結合条件下で支持体と接触され
る。その支持体は未結合プローブと選択的に結合するこ
とができる。その後、支持体はプローブ−標的複合体か
ら分離される。 本発明のさらに別な態様は、その後の処理のために多
数の標的を分離する方法を包含する。 １つの態様には多数の支持体上の標的分子に特異的な
プローブの逐次付加および除去が含まれる。別の態様に
は試料を第１プローブ系列と接触させて、その標的およ
びプローブを多数の支持体上へ捕獲する方法が含まれ
る。第１プローブ系列は支持体と会合しうるリガンドを
含む。第１プローブ系列には、各標的分子に特異的な、
支持体と結合しうる、多数の標的すべてのためのプロー
ブが含まれる。支持体は互いから分離することができ、
その分離は支持体と共に分離される個々のタイプの標的
分子をもたらす。 本発明の別の態様は試薬組成物を包含する。試薬組成
物には第１プローブおよび第２プローブが含まれる。第
１プローブは標的分子と複合体を形成することができ、
結合条件下で抗リガンドと特異的に結合しうるプローブ
リガンド成分を含む。第２プローブは標的分子と複合体
を形成することができ、検出可能な標識成分を含む。こ
の試薬組成物は抗リガンド成分をもつ回収可能な支持体
と共に使用する場合、試料媒体中の標的を捕獲して検出
するのに使用される。 本試薬組成物の別の態様は、第２プローブが標的分子
に結合しない場合のみ、抗リガンドと安定して結合でき
る第２リガンド成分をもつ第２プローブを包含する。こ
の試薬組成物は、未結合第２プローブを含む可能性のあ
る試料を、第２抗リガンド成分をもつバツクグラウンド
支持体と接触させることにより、バツクグラウンドノイ
ズを減少させる。 別の態様は試料媒体中に実質的に均質分散でき且つプ
ローブ上のオリゴヌクレオチドリガンドと結合しうるオ
リゴヌクレオチド抗リガンドを有する支持体を含む。 支持体の好適な態様には、例えば分離可能な粒子、粗
粒、フイラメントおよびビーズが含まれる。分離手段に
は例えば沈殿、沈降、浮選、過、遠心よび電磁気など
が含まれ、これらに限定されない。 好適な態様は、実質的に均質分散でき且つ過や浮選
により媒体から分離できる直径が10〜100ミクロンのポ
リスチレンビーズを包含する。他の好適な態様は強磁性
ビーズを含む。BIO−MAGという商標名で市販されている
強磁性ビーズは実質的に水性媒体中に均質分散でき、し
かも電磁場により回収または固定化することができる。
この強磁性ビーズはアミン反応性被膜で覆われた鉄心を
含む。ビーズはほぼ球形であつて、１ミクロンの直径を
有する。ポリスチレンビーズおよび強磁性ビーズは抗リ
ガンド成分を含むように処理される。 本発明の別の態様は、生物学的結合対の一部である標
的分子について検定を行うためのキツトを包含する。標
的が特定の塩基配列をもつポリヌクレオチドである場
合、キツトは第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２
ポリヌクレオチドプローブを含む試薬を包含する。第１
および第２プローブは相互に排他的な標的部分と結合し
て、両プローブが標的に結合した複合体を形成すること
ができる。第１プローブは結合条件下で第１支持体と可
逆的に結合でき、第２プローブは検出可能な標識成分を
含む。キツトはさらに第１支持体を包含し、この支持体
は試料媒体からの選択的分離を可能にする標的−プロー
ブとの複合体を形成しうる。 本キツトの別の態様は第２プローブおよびバツクグラ
ウンド支持体を包含する。第２プローブは、標的と結合
しない時、バツクグラウンド支持体と選択的に結合する
ことができる。バツクグラウンド支持体は、非特異的に
結合した第２プローブを除くために、試薬を含有する媒
体から分離できる。 本発明の別の態様は、本方法に従つて検定を行うため
の装置を包含する。標的がポリヌクレオチドである場
合、その装置は試薬および標的を実質的に均質な混合状
態で収容するのに適した反応室を含む。試薬には第１お
よび第２ポリヌクレオチドプローブが含まれる。各プロ
ーブは相互に排他的な標的部分と結合して、両プローブ
が標的と結合した複合体を形成することができる。第１
プローブは結合条件下で第１支持体と可逆的に結合で
き、そして第２プローブは検出可能な標識成分を含む。
その装置はさらに、第１支持体を試薬および試料と接触
させて、第１プローブおよび標的−プローブ複合体をそ
の支持体に結合させるための手段を含む。その装置はさ
らに、支持体に結合した標的−プローブ複合体を形成す
べく試料、試薬および支持体を結合状態にするための手
段を含む。その装置はさらに、第１プローブを解離状態
にするための手段を含む。最後に、その装置は試料およ
び試薬から支持体を分離するための手段を含む。 “反応容器”なる用語は広義に使用され、例えば制限
するものでないがキユベツト、試験管、毛細管などを含
めたすべての収容手段を包含する。 試料、試薬および支持体を結合状態にしたり、あるい
は試薬および支持体を解離状態にするための適当な手段
は、例えばポリヌクレオチド鎖を選択的に変性またはア
ニーリングするために試料、試薬および支持体の温度を
上げたり下げたりしうる温度制御ヲ包含する。 試料または試薬から支持体を分離するための適当な手
段には、例えば磁性ビーズと共に使用される電磁石、固
着支持体に固定された繊維、ポリスチレン粗粒と共に使
用される遠心分離機などが含まれる。 本発明の別の態様は、標的と特異的に結合しなかつた
標識成分含有第２プローブを除くために、試薬および標
的をバツクグラウンド支持体と結合条件下で接触させる
ための手段を包含する。 発光標識成分と共に使用するのに適した本装置の態様
は適当な標識励起手段を含む。螢光標識成分と共に使用
される装置は、適当な波長範囲を定めるフイルターを備
えたレーザーまたは光線放射装置を含む。化学発光標識
成分と共に使用される装置は、反応室にコフアクターを
注入するための注入装置を含む。 今や、本発明の好適な態様を図示した図面、特に第１
図について見ると、標的ポリヌクレオチド鎖の検定のた
めに必要な試薬組成物と共に検定手順が模式図により示
されている。通常の検定法では多数の標的鎖が含まれ、
多数のプローブ鎖を使用して検定が行われるであろう。
しかしながら、簡略化して本発明を理解しやすくするた
めに、図面には限られた数のプローブ、支持体および標
的のみを示す。第１図は回収可能な支持体を使用する方
法に関する。 第１図に示す検定の工程１は、細胞を含む臨床試料に
より開始される。細胞は病原菌、遺伝病または望ましい
遺伝子特性を示す特に興味ある塩基配列を有する標的核
酸（DNAまたはRNA）を保有する可能性がある。その臨床
試料は大便、尿、唾液、膿、血清、血漿、眼レンズ液、
脊髄液、リンパ液、生殖器洗液などのような排泄物また
は生理学的液体から得られる。当分野で習熟した者は、
当分野で知られた方法により生検（バイオプシー）試料
を単一細胞懸濁液または小塊にすることができる。例え
ば、固体組織の生検試料はその生検試料を0.5M塩化ナト
リウム、10mM塩化マグネシウム、0.14Mリン酸緩衝液（p
H 6.8）および25mg/mlシクロヘキサミドの混合物中で撹
拌することにより、効果的に単一細胞懸濁液または細胞
小塊にすることができる。また、この工程において特定
の細胞型を示差遠心、密度勾配遠心または他の方法のよ
うな当分野で知られた方法により単離することもでき
る。 その後、細胞はそれらのDNAおよび／またはRNAを放出
させるべく処理される。化学的細胞溶解が当分野でよく
知られている。化学的細胞溶解は希薄アルカリ水溶液
（例えば0.1〜1.0M水酸化ナトリウム）を用いて行われ
る。そのアルカリはまたDNAやRNAを変性するのに役立
つ。その他の変性および細胞溶解剤には高温、有機試薬
（例えばアルコール、アミド、アミン、尿素、フエノー
ルおよびスルホキシド）、またはある種の無機イオン
（例えばトリフルオロ酢酸ナトリウム、トリクロロ酢酸
ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、イソチオシアン酸グ
アニジニウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、イ
ソチオシアン酸ナトリウムおよびイソチオシアン酸カリ
ウムのようなカオトロピズム塩）が含まれる。 臨床試料はまた種々の制限エンドヌクレアーゼの作用
によりDNAまたはRNAを分割して、比較的取り扱いやすい
セグメントにすることができる。試料処理工程の完了時
に、臨床試料は試料核酸、細胞破片および不純物を含有
する。過去においては、試料核酸は核酸をフイルターや
膜に非特異的に結合させ、その後フイルターや膜から細
胞破片と不純物を洗い落とすことにより、細胞破片と不
純物から分離された。しかしながら、実際には、若干の
細胞破片および若干の不純物ならびに標的以外の核酸が
フイルターや膜に非特異的に結合され、洗浄によつても
除去されずに残存する。 本発明の態様は、工程１に例示されるごとく、標的核
酸を保有する可能性のある試料を、プローブ成分と会合
した回収可能な支持体と接触させることを包含する。回
収可能な支持体は試料媒体中に実質的に均質分散しう
る。プローブ成分は、例えばプローブ成分と回収可能な
支持体との共有結合、親和力会合、水素結合または非特
異的会合により回収可能な支持体と会合することができ
る。 支持体は多くの形体をとることができ、例えば粒状形
体に縮小され且つ支持体含有試料媒体をふるいに通すと
き回収しうるニトロセルロース；磁場をかけた際にニト
ロセルロースが試料媒体中を移動できるように、磁性粒
子で含浸されたニトロセルロース；過できるか又は電
磁性を示すビーズまたは粒子；および水性媒体の表面に
分配されるポリスチレンビーズが含まれる。 本発明の好適な態様は、試料媒体中に実質的に均質分
散しうる能力により特徴づけられる磁性ビーズから成る
回収可能な支持体を包含する。好ましくは、磁性ビーズ
はプローブと磁性支持体粒子との共有結合または会合を
容易にする第１アミン官能基を含む。好ましくは、その
磁性支持体ビーズは単磁区磁石であり、残留磁気を示さ
ない超常磁性である。 粒子またはビーズは磁鉄鉱粒子から成りうるが、それ
らは反応性表面を有し且つ磁場に作用する能力を示す限
り、不純金属、合金または複合材料の形の他の磁性金属
または金属酸化物でありうる。個々に又は鉄との組合せ
で使用される他の材料には、コバルト、ニツケルおよび
ケイ素が含まれるが、これらに限定されない。磁鉄鉱ま
たは金属酸化物粒子の製法はバンデンベルグ（Vandenbe
rghe）ら、“超微細コバルトフエライトの製法および磁
性”、J.of Magnetism and Magnetic Materials,15〜1
8:1117〜18（1980）；マチエビツク（E.Matijevic）、
“単分散金属（含水）酸化物−−−コロイト科学の興味
ある分野”、Acc.Chem.Res.,14:22〜29（1981）に記載
されており、その内容は参照によりここに引用される。 本発明で使用するのに適した磁性ビーズには、アドバ
ンスト・マグネテイクス社（Advanced Magnetics,In
c.）からBIO−MAGという商標名で市販されている第１ア
ミン官能基含有磁性ビーズが含まれる。好適な磁性粒子
は非多孔質であるにもかかわらず、プローブ成分と会合
することができる。プローブ成分の会合に関与しない反
応性部位は遮断して他の試薬、不純物および細胞物質の
非特異的結合を防ぐことが好ましい。磁性粒子は好まし
くは実質的にコロイド状の懸濁物として存在する。試薬
および基質および粒子表面に会合したプローブ成分は、
その粒子を取り囲む溶液中に直接延在している。プロー
ブ成分は固体支持体に担持された反応と関連した速度で
はなくむしろ溶液中の反応に特徴的な速度および収率で
もつて、溶液中の溶存試薬および基質と反応する。さら
に、粒子サイズを減ずるにつれて、粒子の表面積対容積
の比が増加し、それにより磁性粒子の単位重量あたりよ
り多くの官能基およびプローブを結合させうる。 反応性アミン官能基を有するビーズは、ポリヌクレオ
チドをそのビーズに共有結合させるべくポリヌクレオチ
ドと反応させることができる。ビーズはリン酸ナトリウ
ム緩衝液中で10％グルタルアルデヒドと反応させ、続い
て実験プロトコールにおいてより詳しく説明する方法に
よりリン酸緩衝液中でリン酸化ポリヌクレオチドのエチ
レンジアミン付加物と反応させる。 さて工程２に戻ると、プローブ成分と会合した回収可
能支持体は臨床試料と接触させ、工程３に進んで結合条
件に置く。対象となる標的に特異的なプローブ成分は臨
床試料中に存在する標的鎖に結合される。試料および試
薬媒体中に分散した回収可能支持体は、あたかもそれら
が溶液中で遊離状態にあるように、プローブ成分と標的
をハイブリダイズさせることができる。 プローブと標的のハイブリダイゼーシヨンは約15分で
完結する。これとは対照的に、媒体中に分散する能力を
もたない支持体上にプローブまたは標的が固定化された
ハイブリダイゼーシヨンでは３〜48時間もの長時間を要
する。 無関係のDNA、RNA、細胞破片および不純物は支持体と
特異的に結合しない。しかしながら、実際的方法とし
て、少量の無関係のDNA、RNA、細胞破片および不純物は
回収可能支持体を含む反応容器内に置かれたすべての物
体に非特異的に結合することができ、現に結合する。本
発明の態様は、標的ポリヌクレオチドから無関係のDN
A、RNA、細胞破片および不純物を取り除くべく臨床試料
の更なる精製を容易にするものである。 第１図の工程４は臨床試料からの支持体の分離および
第２媒体中への支持体の懸濁を示す。従つて、第２媒体
は標的ポリヌクレオチド鎖と結合したプローブをもつ回
収可能支持体を含む。また、その支持体と非特異的に結
合した無関係のDNA、RNA、細胞破片および不純物も随伴
されるが、臨床試料中に初めに存在していた濃度よりも
かなり低い濃度である。当分野で習熟した者は、第２媒
体中に懸濁する前に支持体を洗浄することにより若干の
望ましくない物質を減らすことができることを認めるで
あろう。 第２媒体中に懸濁された回収可能支持体（会合プロー
ブおよび標的をもつ）は工程５に示すような変性に付さ
れ、それにより回収可能支持体のプローブ成分から標的
を解離させる。変性操作は回収可能支持体から非特異的
に結合した無関係のDNA、RNA、細胞破片または不純物を
放出させたり、放出させなかつたりする。しかしなが
ら、本方法の工程５は第１臨床試料媒体から初めに運ば
れた非特異的に結合した細胞破片、不純物、無関係のDN
AおよびRNAの多くを支持体と共に保有する第２媒体か
ら、回収可能支持体を分離させる。 工程６に示すように、新しい支持体が結合条件下で第
２媒体中に導入され、その回収可能支持体と会合したプ
ローブ成分上に標的ポリヌクレオチド鎖が再び捕獲され
る。当分野で習熟した者は、新しい支持体が非特異的に
結合したDNA、RNA、細胞破片および不純物をさらに精製
・除去する工程に循環させた後のもとの回収可能支持体
を実際に含みうることを認めるであろう。従つて、第２
媒体中に存在する不純物のみが、以前に支持体へ非特異
的に結合され、その後第１支持体から放出されて第２媒
体中に溶解または懸濁されたDNA、RNA、細胞破片および
不純物を包含する。 しかしながら、この種の不純物は回収可能な第２支持
体を第２媒体から分離し、そして再び回収可能な支持体
を別の媒体に導入し、変性し、古い支持体を分離するこ
とから成るサイクルを繰り返すことにより、標的ポリヌ
クレオチドからさらに除去することができる。当分野で
習熟した者は、溶液が除去されるかまたは収能容器へ添
加されるとき、本発明で説明した磁性ビーズは適所に保
持しやすく、また溶液から取り出しやすいことを認める
であろう。 “溶解状態の反応速度論（insolution kinetics）”
をまねた反応に関与する磁性ビーズの能力は、変性およ
び標的への結合のサイクルの完了を３〜15分で達成させ
る。 十分な精製および濃縮後に、標的は工程８に示すよう
な当分野で知られた発光または放射性検定法により検出
することができる。標的を含む媒体の精製は、細胞破片
および不純物の不在下での非同位標識成分の検出を可能
にする。 さて今や第２図に転ずると、第２図は多重プローブ法
を特徴としており、そこには可溶化剤および試薬の導入
により先の図面の臨床試料と同様に処理されるポリヌク
レオチド標的を含む臨床試料から始まる本検定法の別の
態様が示されている。第２図に示した検定法の試薬には
第１ポリヌクレオチドプローブ鎖（P1）および第２ポリ
ヌクレオチドプローブ鎖（P2）が含まれ、両プローブ
（P1およびP2）は標的と結合して標的との複合体を形成
することができる。第１プローブ（P1）は結合条件下に
回収可能支持体（S1）と会合しうる。第２プローブは検
出可能な少なくとも１つの標識成分を有している。図面
において、標識成分は星印により示される。変性条件下
での可溶化剤および試薬の導入後、臨床試料を含む溶液
は標的ポリヌクレオチド、第１および第２プローブの形
の試薬、細胞破片、可溶化剤、不純物および無関係のDN
AおよびRNAを含有するであろう。 工程２に示すように、第１および第２プローブ（P1お
よびP2）は標的の相互に排他的な部分と結合条件下で結
合する。溶解状態での両プローブ（P1およびP2）と標的
とのハイブリダイゼーシヨンは迅速であり、しかも固体
支持体との会合により妨害されない。第１および第２プ
ローブ鎖（P1およびP2）への標的の結合を確実にするた
めに、過剰のプローブが使用される。しかしながら、た
とえ過剰のプローブ（P1およびP2）が使用されないとし
ても、若干のプローブは標的を発見できずに試料媒体中
にハイブリダイズされないまま残存するであろう。ハイ
ブリダイズされなかつた標識成分含有第２プローブ
（P2）は、もしも検出中に存在するならば、バツクグラ
ウンドノイズの原因になるであろう。 第１プローブ（P1）は支持体上の抗リガンド成分と結
合しうるリガンドにより支持体（S1）と結合できる。リ
ガンド（L1）には例えばホモポリマーから成る尾部が含
まれる。支持体（S1）はリガンド（L1）を受容してそれ
と結合しうる抗リガンド（A1）を包含する。抗リガンド
（A1）には例えばプローブ（P1）のリガンド（L1）に相
補的なホモポリマーが含まれる。 さて工程３に転ずると、結合条件下で支持体（S1）の
抗リガンド成分（A1）は第１プローブ（P1）のリガンド
成分（L1）と会合または結合し、そしてその第１プロー
ブはそれ自体が標的と結合し且つ第２プローブ（P2）に
連結している。支持体はいろいろな形をとることができ
る。ビーズまたは粒状支持体は溶液中に分散され、溶解
状態に近い反応速度論を示す反応により標的−プローブ
との結合に加わることができる。さらに、回収可能なビ
ーズおよび粒状支持体は、より一般的なフイルターや膜
にもともと存在する目詰りの問題なしに、不溶性細胞破
片からプローブ−標的複合体を分離させうる。 しかしながら、一般的な膜、フイルターまたはセルロ
ース支持体も目詰りが問題とならないいくつかの用途に
おいて使用できる。溶液中でのプローブと標的との迅速
なハイブリダイゼーシヨンゆえに、固体の非ビーズ状ま
たは非粒状膜もしくはフイルター支持体を反応容器中に
組み入れることができる。試薬および試料の溶液は支持
体を通過して、標的が捕獲される。支持体（S1）は回収
可能な支持体として第２図に示される。 溶液中には標的−プローブ支持体複合体と共に未結合
の第１および第２プローブ成分、未結合標的、可溶化
剤、不純物および細胞破片が存在する。標識成分をもつ
未結合第２プローブ（P2）はノイズの原因となり、標的
の存在によく似た信号を発する。少量の無関係の細胞破
片、可溶化剤、不純物およびプローブも回収可能支持体
と非特異的に結合しうる。 工程４において、支持体（S1）は臨床試料媒体から分
離される。回収可能支持体を使用する場合、分離は反応
容器内に回収可能支持体を固定化することにより、また
は試料媒体から回収可能支持体を直接取り出すことによ
り達成しうる。当分野で習熟した者は、固定化支持体を
洗浄して望ましくない物質を減らすことができることを
認めるであろう。 さて工程５に転ずると、標的−プローブ支持体複合体
は実質的に無関係のRNA、DNA、可溶化剤、不純物および
細胞物質を含まず、従つて標的分子の存在を示す標識成
分の存在について監視することができる。しかしなが
ら、少量の無関係のDNA、RNA、可溶化剤、不純物および
細胞物質がまだ支持体（S1）と非特異的に結合している
かもしれない。さらに、標的と会合していないという意
味で未結合の第２プローブ（P2）もまた支持体（S1）と
非特異的に結合でき、非同位体標識成分からの信号に影
響を及ぼす。標識成分をもつ未結合第２プローブ（P2）
の存在はバツクグラウンドノイズの主な原因となり、そ
れにより検定法の正確度が減ぜられる。 従つて、別の工程５として、第１支持体（S1）を第２
媒体中に懸濁し、その第２媒体中で変性することにより
支持体（S1）を標的−プローブ複合体から分離すること
ができる。 変性後、工程６において、第１支持体（S1）は第２媒
体から分離され、第２支持体（S2）と置き換えられる。
第２支持体（S2）は第１プローブのリガンド成分（L1）
と結合しうる抗リガンド成分（A1）を含む。 工程７に移ると、標的−プローブ複合体は結合条件下
で第２支持体（S2）と再会合する。第１支持体（S1）の
除去は、その第１支持体（S1）と非特異的に結合した無
関係の物質、破片およびプローブを検定媒体から除去す
る。 工程８に示すように、標的−プローブ複合体を含む媒
体は標識の存在について検定される。しかしながら、検
定媒体をさらに精製することにより、第１支持体（S1）
に非特異的に結合され、その後第１支持体（S1）から第
２媒体中に溶解または解離された試料媒体由来の無関係
の物質およびバツクグラウンドの存在をさらに減ずるこ
とができる。 従つて、回収可能な第２支持体（S2）を第３媒体と接
触させ、その第３媒体を支持体から標的−プローブ複合
体を放出させる条件に至らせ、その後支持体を除去して
更なるサイクルを完結させることができる。サイクルの
回数は試料のタイプ、標識成分の種類、および検出装置
の感度に応じて選択されるだろう。異なるタイプの支持
体を異なる時点で使用してもよい。従つて、回収可能な
支持体を使用することにより初めに試料媒体または溶液
から標的−プローブ複合体を集めまたは濃縮し、こうし
て膜やフイルターに特有の目詰りの問題を避けることが
できる。第２または第３支持体は第１プローブ（P1）の
リガンド成分（L1）と結合する抗リガンド成分（A1）を
もつ膜またはフイルターを含むのが好ましい。膜または
フイルター支持体は標的−プローブ複合体を流動回収さ
せる処理工程を単純化することができる。 本発明の別の態様はバツクグラウンドノイズを減らす
のに特に適している。今や第３図を見ると、そこには第
２図に示した検定法の変法が示されている。第３図にお
いて、標的ポリヌクレオチドは第２図に記載のプローブ
成分と類似した第１および第２プローブ成分（P1および
P2）と複合体を形成している。しかしながら、第２プロ
ーブは第２リガンド（L2）を含む。その第２リガンド
（L2）には例えばホウ酸抗リガンドと複合体を形成する
単一末端リボヌクレオチド、相補的コポリマーと結合す
るコポリマー、アビジン抗リガンドに結合するビオチン
リガンド、または図示したようなホモポリマーリガンド
（L2）および相補的ホモポリマー抗リガンド（A2）が包
含される。 今や工程１に転ずると、第２プローブ（P2）が標的と
結合していない時だけその第２プローブ（P2）と選択的
に結合しうるバツクグラウンド支持体が、標的−プロー
ブ複合体を含む媒体と接触させられる。その媒体は遊離
の、会合していない第１および第２プローブ（P1および
P2）をさらに含む。バツクグラウンドノイズの原因とな
る標識された第２プローブ（P2）は、バツクグラウンド
支持体（B1）と会合した大過剰モルの抗リガンド成分
（A2）により、そのバツクグラウンド支持体（B1）と特
異的に結合する。未結合の標識プローブ（P2）とバツク
グラウンド支持体（B1）との結合後、工程２に示すよう
にバツクグラウンド支持体（B1）を媒体から除去する。
標的−プローブ複合体を含有する媒体は、バツクグラウ
ンドノイズの減少後、第２プローブ（P2）に保有された
標識の存在について検定される。あるいは、標的−プロ
ーブ複合体を含む媒体は更なる処理に付される。 更なる処理は第３図に示した工程１〜３、または第２
図に示した諸工程を繰り返すことによるバツクグラウン
ドの更なる減少を包含する。例えば、バツクグラウンド
減少工程は、第１および第２プローブのリガンドおよび
抗リガンド成分が干渉せず、且つ標的が表１および第２
プローブと複合体を形成するいずれかの時点で、第２図
に示すような臨床試料の処理に組み入れられる。 本方法の態様は第４図に模式図で示した装置を用いて
実施される。この装置は次のような主な要素：すなわち
少なくとも１つの収納容器、プローブと標的分子および
回収可能な支持体との会合を制御する手段、試料溶液か
ら回収可能支持体を分離する手段、および回収可能支持
体から標的分子を放出させる手段を包含する。これらの
主な要素は多種多様な形をとることができ、以下でさら
に詳しく説明する。 この装置はポリヌクレオチドを含む標的分子に関して
第２図および第３図で示した方法を適用して、例示目的
のために以下で説明されるであろう。こうして、ステー
シヨン１では、臨床試料が細胞物質を溶解して核酸を放
出させるために、可溶化剤（例えばカオトロピズム塩、
酵素および界面活性剤）と一緒に収納容器中に入れられ
る。その収容容器は細胞の破壊を容易にするための撹拌
部材を備えている。その収納容器は試料を入れるのに適
したどのような型の容器、管またはキユベツト（浅い水
ばち）であつてもよい。 自動分析用に設計された器械では、第４図に示した装
置は多数の収納容器を受容する手段を含むであろう。例
示目的のために、試料を含む収納容器は逐次分析され
る。こうして、収納容器は第１ステーシヨンへ、続いて
検定法の種々の工程が行われる後続のステーシヨンへ搬
送される。 各ステーシヨンは搬送手段により連結されている。搬
送手段には回転可能なターンテーブル、コンベアーベル
トなどが含まれる。臨床病院に設定する場合、搬送手段
は手動移動を含みうる。従つて、病院スタツフが患者か
ら組織試料を採取し、その試料を収納容器に入れる。組
織試料の破壊および可溶化剤と試薬類の初期混合を含め
た試料処理はベツドのそばで開始され、そしてその後の
処理のために収納容器を後続のステーシヨンへ移動させ
ながら継続されるであろう。ステーシヨンへの言及は例
示目的のためである。当分野で習熟した者は、いくつか
のステーシヨンまたは工程を組み合わせたり逆にしたり
しうることを認めるであろう。 さて第１ステーシヨンに戻ると、試料と可溶化剤を収
納容器に入れ、その中の撹拌部材により試料と可溶化剤
を完全に混合して細胞物質から核酸を放出させる。搬送
手段によりその収納容器をステーシヨン２へ運び、そこ
で収納容器は試薬を受け取る。 試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリ
ヌクレオチドプローブを含む。第１および第２プローブ
は標的ポリヌクレオチドと複合体を形成することがで
き、その際両プローブは標的の相互に排他的な部分と結
合する。第１プローブはまた結合条件下で回収可能な支
持体と結合しうる。第２ポリヌクレオチドプローブは検
出可能な標識成分を含む。試薬と核酸試料は加熱部材に
より変性され、その後ステーシヨン３に運ばれる。 ステーシヨン３において、収納容器は円により示され
る第１支持体を受け取る。第１支持体は適当な手段（撹
拌部材を含む）により試料媒体中に均質分散される。適
当な支持体の例にはポリスチレンビーズ、磁性ビーズお
よび他の粒状またはフイラメント状物質が含まれるが、
これらに限定されない。先に例示したように、第１支持
体はデオキシチミジン（dT）のポリヌクレオチド抗リガ
ンドを有する磁性ビーズでありうる。第１プローブは結
合またはハイブリダイセーシヨン条件下で第１支持体に
結合しうるデオキシアデノシン（dA）の尾部を含む。 ステーシヨン４へ移動すると、そこでは冷却部材で冷
却されることにより試料媒体にハイブリダイゼーシヨン
条件が課せられる。しかしながら、当分野で習熟した者
は塩濃度を変える手段が熱制御手段に容易に取つて代わ
り得ることを認めるであろう。こうして、標的ポリヌク
レオチドは第１および第２プローブと複合体を形成し、
さらに第１プローブのホモポリマーデオキシアデノシン
（dA）尾部が回収可能支持体のデオキシチミジン（dT）
ホモポリマーとハイブリダイズする。 ステーシヨン４からステーシヨン５へ収納容器は移動
し、そこで回収可能な支持体が磁性部材を活性化するこ
とにより収納容器の壁に固定化される。ポリスチレンビ
ーズを磁性ビーズの代わりに使用する場合、ポリスチレ
ンビーズは過または密度差により固定化されるであろ
う。試料媒体は大部分の無関係のDNA、RNA、可溶化剤、
細胞物質および不純物を保有し、廃棄される。固定化さ
れた回収可能支持体は無関係のDNA、RNA、可溶化剤、細
胞物質および不純物をさらに除くために洗浄される。 さらに、回収可能支持体は反応容器の壁に固定化され
るように例示されているが、磁性部材により回収可能支
持体を反応容器から取り出して、反応容器の壁に非特異
的に結合しやすい無関係のDNA、RNA、可溶化剤および細
胞物質を含む第１の反応容器を処分することもできる。 回収可能支持体は同一の収納容器か又は新たな収納容
器中の第２媒体に添加される。第２媒体中に回収可能支
持体を含む収納容器はステーシヨン６に送られる。 ステーシヨン６において、第２媒体は加熱部材を含む
適当な手段で変性条件に至らせる。この変性工程は回収
可能支持体の（dT）ホモポリマーから標的−第１および
第２プローブ複合体を遊離させる。無関係のDNA、RNA、
不純物および細胞物質を含む可能性のある第１支持体は
第２媒体から除去する。その後バツクグラウンド支持体
を第２媒体と接触せしめ、ステーシヨン７へ送る。 ステーシヨン７で第２媒体は冷却部材によりハイブリ
ダイゼーシヨン温度にする。バツクグラウンド支持体は
第２プローブに担持されたリガンドと特異的に結合しう
る第２抗リガンドを含む。例えば、制限するものではな
いが、第２プローブの末端ヌクレオチドは第２支持体に
担持されたホウ酸成分と特異的に結合するリボ誘導体と
して合成される。プローブ−標的複合体の一部として標
的に結合した第２プローブは、立体障害のために第３支
持体に担持されたホウ酸と結合しないだろう。しかしな
がら、未結合の第２プローブはホウ酸支持体と特異的に
結合するだろう。また、第２プローブは第２支持体上の
デオキシグアニン（dG）ホモポリマーリンカーと結合す
るデオキシシトシン（dC）のようなホモポリマーを含み
うる。ホモポリマーの長さは、標的−第１および第２プ
ローブと第２支持体との複合体が不安定であるが、第２
プローブ単独と第２支持体との複合体が反応パラメータ
ー内で安定であるように考案される。実際、未結合第２
プローブに対するバツクグラウンド支持体のバツクグラ
ウンド捕獲結合は不可逆的である。 次に、第２媒体およびバツクグラウンド支持体を含む
収納容器はステーシヨン８に搬送され、ここで標的−プ
ローブ複合体に結合していない第２プローブ鎖を有する
バツクグラウンド支持体が第２媒体から分離される。バ
ツクグラウンド支持体の分離により、媒体から非特異的
なバツクグラウンドノイズが除かれる。 先に述べたように、バツクグラウンド捕獲はビーズ上
で実施される。しかしながら、当分野で習熟した者は、
臨床試料からの標的−第１および第２プローブ複合体の
初期精製により全部または大部分の固体砕片が除かれ、
第２媒体が通過するフイルターまたは膜支持上にバツク
グラウンドが捕獲されることを認めるであろう。 ステーシヨン８から、バツクグラウンドの低減した標
的−プローブ複合体を含む精製媒体はステーシヨン９へ
送られる。ステーシヨン９で、加熱部材によりハイブリ
ダイゼーシヨン温度にした第２媒体を第３支持体（膜ま
たはフイルターとして図示される）と接触させる。第３
支持体は第１プローブの第１リガンド成分と結合する第
１抗リガンド成分を含有する。従つて、第１プローブの
第１リガンド成分がデオキシアデノシン（dA）のホモポ
リマーである場合、第３支持体はデオキシチミジン（d
T）のホモポリマーを含む。先に述べたように、第３支
持体は第２媒体が通過し得るフイルターまたは膜である
が、ビーズや粒子も使用できる。第３支持体は標的−第
１および第２プローブ複合体をさらに濃縮するのに役立
ち、そして第３支持体と特異的に結合しないバツクグラ
ウンドおよび妨害物質をさらに低減せしめる。ステーシ
ヨン10へ移ると、第３支持体は標的−第１および第２プ
ローブ複合体を濃縮し、それにより第２プローブに担持
された標識成分の検出が可能となる。 本発明は以下の一般方法および好適な態様の特徴を例
示する以下の実施例においてさらに詳述される。 I.方法 A.物質 全ての試薬は分析用またはそれ以上のものであつた。
BIO−MAGという商標名で市販されている官能性アミノ基
含有磁性ビーズはアドバンスト・マグネチツクス社（M
A.ケンブリツジ）から入手した。 本実施例において、全ての標識ヌクレオチドはニユー
イングランド・ヌクレアーから入手した。酵素ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（TDT）
はライフ・サイエンス社（フロリダ州セントピータース
バーグ）から入手した。オリゴヌクレオチドpdT10はフ
アーマシアPLバイオケミカルズから入手した。 B.プローブの合成 一般なプロトコールおよび方法を以下に説明する。第
６図を参照されたい。２つのプローブはスパイサー（Sp
icer.E.K.）およびノーブル（J.A.Noble）、J.of Biolo
gical Chem.257,55716〜55751（1982）に記載される構
築マツプ（第６図）に従つて、大腸菌（Escherichia co
li）のエンテロトキシン遺伝子elt A1のセンス鎖（sens
e strand）に構築された。 １組のプローブはその遺伝子配列の483位から始まつ
て30ヌクレオチド長だけ延びるように合成され、以後A4
83プローブと名づけた。第２プローブはその遺伝子配列
の532位から始まつて30ヌクレオチド長だけ延びるよう
に合成され、以後これをA532プローブと名づけた。第３
プローブはその遺伝子配列の726位から始まつて39ヌク
レオチド長だけ延びるように合成され、以後これをA726
プローブと名づけた。特定の塩基配列（５′→３′）を
以下の表Ｉに示す：上記プローブは当分野で利用し得る方法により合成され
た。ナンバリング方式はインテリジエネテイクス・シー
クエンス・バンクECO ELT A1から入手し得る768ヌクレ
オチド配列から適応させた。 プローブA726の３′末端の10個のＧ残基のうち、５′
末端へ向かう３個のグアニン塩基はトキシン遺伝子の３
個の相補的なシトシン塩基と結合することができる。３
個の連続したシトシンはDNA中に普通に見られる。10個
のグアニン塩基はオリゴdC−セルロースのような支持体
に担持されたポリＣ抗リガンドと結合し得るリガンドを
形成する。しかしながら、７個のグアニン塩基は37℃
で、特にプローブが標的と結合している場合は、立体障
害および標的−プローブ複合体の大きさのために、支持
体と安定な会合を形成しないだろう。プローブA726はタ
ーミナルトランスフエラーゼを用いてその３′末端へ約
３個の32P−dCおよび32P−dG残基をランダム付加するこ
とにより修飾した。 当分野で習熟した者は、他のプローブを別の標的分子
に対して容易に合成し得ることを認めるであろう。 C.調製 実施例１、２および３の標的はエンテロトキシン遺伝
子elt A1である。エンテロトキシン遺伝子elt A1はスタ
ンフオード大学から入手したプラスミドEWD−299の一部
として保有される。 実施例１において、エンテロトキシン産生菌をルリア
培地中で対数期まで増殖させた。その細菌を溶解し、プ
ラスミドEWD−299を単離した。プラスミドEWD−299は制
限酵素Xba IおよびHind IIIで消化した。475塩基長のフ
ラグメントを標的として使用し、１％アガロースゲルか
ら電気溶出により精製した。捕獲工程の効率を追跡する
ために、フラグメントは酵素ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて製造者の指示に従つて32P−ATPで５′末端標識
した。 実施例２および３では、エンテロトキシン産生菌およ
び野生型エンテロトキシン非産生大腸菌JM83を別々に対
数期まで増殖させた。野生型大腸菌は対照として役立
つ。エンテロトキシン産生菌と野生菌の抽出物は、カオ
トロピズム溶液中で細胞を実質上可溶化することにより
別々に調製した。こうして、ルリア培地中の細菌培養物
を5M濃度の固体グアニジニウムチオシアネート（GuSC
N）、0.3M濃度のトリス−HCl、および0.1濃度のEDTA（p
A7）に添加した。その後カオトロピズム−細菌溶液は10
0℃で５分間加熱し、冷却した。得られたエンテロトキ
シン産生菌抽出物は野生型エンテロトキシン非産生菌抽
出物で段階的に希釈した。細胞当たりのtoxプラスミド
の濃度および抽出物中の細胞数は慣用技法で測定した。
GuSCN中で可溶化したもとの抽出物は約109個/mlのエン
テロトキシン産生大腸菌および細胞当たり100個のプラ
スミドを含んでいた。 D.ビーズの合成 回収可能な支持体は磁性ビーズから製造した。他の回
収可能支持体には粒子、繊維、ポリスチレンビーズまた
は媒体から物理的に分離し得る他の物品が含まれる。磁
性ビーズは10塩基長のデオキシチミジンの付加物をもつ
ように合成され、その結果ビーズはデオキシアデノシン
を尾部に付加したプローブと容易に可逆的な方法で会合
することができる。 従つて、BIO−MAG（M4100）ビーズのようなアミン官
能基をもつビーズ100mlは４個の275ml Tフラスコ中で20
mMリン酸ナトリウム（pH6.7）により４回洗浄した。そ
の後ビーズは20mMリン酸ナトリウム中の１％グルタルア
ルデヒドで洗浄した。次いで、ビーズは20mMリン酸ナト
リウム（pH6.7）中の10％グルタルアルデヒド100mlと室
温で３時間反応させた。その後ビーズは20mMリン酸ナト
リウム（pH6.7）で十分に洗浄し、次に20mMリン酸塩（p
H7.6）で一回洗浄した。 別個に、精製したpdT10のエチレンジアミン（EDA）付
加物（EDA−dT10）をチュー（Chu,B.C.F.）、ウオール
（G.M.Wahl）、およびオーゲル（L.E.Orgel）、Nucleic
Acid Res.11,6513〜6529（1983）（参照によりここに
引用される）に従つて製造した。EDA−dT10の濃度は20m
Mリン酸塩（pH7.6）中10D/mlに調整した。 EDA−dT10は磁性ビーズの遊離アルデヒド基と反応さ
せるために磁性ビーズと混合した。EDA−dT10とビーズ
の混合物は複数の50mlポリプロピレン製チユーブに分割
して入れた。反応混合物とビーズを含むチユーブは回転
器の中に置き、室温で一晩撹拌した。 次に、ビーズは大型の275ml Tフラスコ中で滅菌20mM
リン酸塩（pH6.7）の洗液により５回洗浄して非共有結
合したEDA−dT10を除き、その洗液で希釈して200mlとし
た。 貯蔵のために、ビーズは20mMリン酸塩緩衝液（0.1％
アジ化ナトリウムおよび0.1％SDSを含む）中で数ケ月間
保存できる。ビーズ調製物は光を遮断して４℃で保存さ
れる。 その後、ビーズは非特異的結合部位を遮断するため
に、0.75Mリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.5％ラウロイ
ルサルコシンナトリウム、10μg/ml大腸菌DNA、0.5mg/m
lウシ血清アルブミン（BSA）（ヌクレアーゼ不含）およ
び5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）から成る緩衝液
（以後“プレハイブリダイゼーシヨン緩衝液”と呼ぶ）
中でプレハイブリダイゼーシヨンを行つた。標的捕獲法
でプローブとビーズを使用する前に、ビーズのプレハイ
ブリダイゼーシヨンを２回実施した。そのプレハイブリ
ダイゼーシヨン法はビーズを10倍容量のプレハイブリダ
イゼーシヨン緩衝液中に入れることを包含していた。 第１のプレハイブリダイゼーシヨン法は撹拌しながら
60℃で行つた。第２のプレハイブリダイゼーシヨン法は
渦巻きを起こさせながら室温で実施した。この溶液には
0.1％のイソアミルアルコールを消泡剤として添加し
た。 dT10−付加ビーズの結合能は次の方法により測定し
た。別々の容器中で、dT50およびdA50はそれぞれ32P−d
Tおよび32P−dAを用いて約106dpm/μｇの比活性（Sa）
になるまで５′末端標識した。次に、既知量の反応した
dT50のSaをトリクロロ酢酸沈降により正確に測定した。 次いで、100,000〜200,000dpm/mgの実質的に同一のSa
をもつ32P−dA50 5μｇおよび32P−dT50 5μｇはプレハ
イブリダイゼーシヨン緩衝液を含むチユーブに別々に加
えて1mlの容量とした。 プレハイブリダイズしたビーズはその既知試料容量を
４個のチユーブに入れた。４個のチユーブのうち２個は
それぞれ0.5mlの32P−dA50混合物を添加し、残りの２個
のチユーブはそれぞれ0.5mlの32P−dT50混合物を添加し
た。４つの溶液すべてはハイブリダイゼーシヨン条件に
５分間おいた。その後ビーズを固定化して洗浄し、次に
溶液の比活性を測定した。マイクログラムで測定した一
定量のビーズ調製物の総結合能Ｃは次式で表される： Ｃ＝Ｖ（Ａ−Ｔ）/X 上記式中Ｘは32P−dT50の比活性（cpm/mg）であり、
Ｖは全容量対試料容量の容量比であり、Ａは32P−dA溶
液中に懸濁したビーズの平均活性（cpm）であり、そし
てＴは32P−dT溶液中に懸濁したビーズの平均活性（cp
m）である。 当分野で習熟した者は他のビーズ、粒子、フイラメン
トなどを他のヌクレオチドコポリマーまたはホモポリマ
ーと共に使用できることを認めるであろう。例えば、ポ
リＡ付加ビーズは（精製したdT10のEDA付加物の代わり
に）20mMリン酸ナトリウム（pH 7.6）50ml中にポリＡ
（MW＞100,000）100mgを含有する溶液を使用することに
より製造された。 E.標的捕獲法 ビーズ調製物は標的ポリヌクレオチドを捕獲するため
に使用した。回収可能な支持体および可逆的捕獲を証明
する一般的な実験標的捕獲法を以下に説明するが、例示
目的のために（制限するものではない）第１プローブA4
83および第２プローブA532を使用してその捕獲法を論じ
るであろう。第１プローブA483は32P−dCTPおよび32P−
dGTPを用いて約1010dpm/mgの比放射能へランダムに３′
末端標識した。第２プローブA532は酵素ターミナルトラ
ンスフエラーゼを用いて約70個の末標識dA残基を尾部に
付加した。 まず初めに、標識プローブA483 200μg/mlと尾部付
加プローブA532 400μg/mlは、いろいろな量のエンテ
ロトキシン遺伝子の熱変性した475mer Xba I−Hind III
制限フラグメントと1.4M塩化ナトリウム中65℃で15分間
混合した。 次に、標的捕獲は標的とプローブ成分を含む媒体を、
dT10−磁性ビーズ（磁性ビーズに対する非特異的結合を
減じるためのプレハイブリダイゼーシヨン後に３μg/ml
のdA50結合能をもつビーズ）のアリコートと接触させる
ことにより開始した。磁性ビーズとプローブ−標的複合
体は5mlポリプロピレンチユーブ中でプレハイブリダイ
ゼーシヨン緩衝液0.1mlと共に室温で２〜５分間インキ
ユベーシヨンした。 チユーブはコーニング（Corning）チユーブ磁気分離
機に配置した。コーニングチユーブ磁気分離機は活性化
されると、ポリプロピレンチユーブを通して磁場を印加
し、その磁場により磁性ビーズがチユーブ内壁に固定化
される。磁性ビーズがポリプロピレンチューブの側壁に
固定化されているうちに、もとの媒体を取り出して捨て
た。 固定化されている間に、ビーズは消泡剤としてイソア
ミルアルコールを含むプレハイブリダイゼーシヨン緩衝
液0.6mlずつで３回洗浄した。プレハイブリダイゼーシ
ヨン緩衝液の添加後、チューブを磁場から移動させ、そ
の媒体を激しく渦巻き混合することによりビーズを再懸
濁させた。 次に、磁場を再度印加してビーズを固定化させ、プレ
ハイブリダイゼーシヨン緩衝液を捨てた。プレハイブリ
ダイゼーシヨン緩衝液の添加、ビーズの再懸濁、ビーズ
の固定化、およびプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液の
除去から成るサイクルは２回繰り返した。ビーズに保持
された標的−プローブ複合体は検出、バツクグラウンド
捕獲または更なる標的捕獲サイクルの追加工程を含めた
その後の処理のために利用可能である。 好適な標的捕獲法は標的−プローブ複合体の放出およ
び第２支持体への再捕獲を包含する。好ましくは、その
支持体は第１支持体と化学的に異なるものである。 標的−プローブ複合体の放出は次の一般方法により行
われる。最後のプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液の除
去後、ビーズを含むチユーブにプレハイブリダイゼーシ
ヨン緩衝液を加えた。ビーズは撹拌下に60℃で１〜２分
間インキユベーシヨンして、ビーズからプローブ−標的
複合体を放出させた。温度を60℃に維持したままで再び
磁性分離機を活性化させ、遊離の標的−プローブ複合体
を含む溶出液をチユーブから分離した。その溶出液は別
の回収可能支持体上に再捕獲されるか、または通常の支
持体上での最終捕獲に付される。当分野で習熟した者
は、標的−プローブ複合体の回収可能支持体（例えば本
実施例の磁性ビーズ）への捕獲およびその支持体からの
放出がハイブリダイゼーシヨンのバツクグラウンドを低
下させるために所望回数反復し得ることを認めるであろ
う。 標的−プローブ複合体の最終捕獲は、一般にdT−3000
を非特異的に結合させた又は共有結合させたニトロセル
ロースフイルターまたはナイロン膜上で実施された。従
つて、磁性ビーズに担持された標的−プローブ複合体
は、そのビーズをプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液中
60℃で２分間加熱することにより、磁性ビーズから放出
させた。ビーズを固定化し、溶出液を分離し、0.2ミク
ロンのアクロデイスク（ゲルマン社製）に通して磁性微
粒子を除去した。dT−3000を保有するニトロセルロース
フイルターは未標識プローブ上のdA尾部を選択し、結合
し、捕獲した。 標的−プローブ複合体の最終捕獲のために化学的に異
なる支持体を使用すると、前に使用した支持体に対して
高い親和力を有するバツクグラウンド分子の結合が回避
される。例えば、特定の支持体に対してもともと高い親
和力を有する低レベルの汚染物質は、支持体と繰り返し
結合してプローブ標的複合体と共に溶出されやすい。こ
のような低レベル汚染物質は非常に異なる組成の支持体
にそれらをさらすのと同程度に完全には同じ組成の回収
可能支持体の反復使用により希釈されない。低レベル汚
染物質はまた化学的に異なる手段を用いて標的−プロー
ブ複合体を支持体から放出させ、再捕獲することにより
減少させることができる。 F.バツクグラウンド捕獲法 バツクグラウンド捕獲法はバツクグラウンドノイズを
選択的に減少させて、標的の存在を示す真の信号の検出
を可能にする。バツクグラウンド捕獲は単一プローブ系
または２以上のプローブを使用する系に適用できる。例
えば、単一プローブを特徴とするバツクグラウンド捕獲
法において、そのプローブは標識成分とリガンドを含
む。プローブは標的と結合することができ、リガンドは
プローブが標的と結合していない時だけ支持体と安定し
た結合を形成することができる。 同様に、例えば、標的捕獲と関連して複数のプローブ
を特徴とするバツクグラウンド捕獲は２つのプローブを
含む。第１の標的捕獲プローブ（第１支持体と結合し得
る未標識リガンドを含む）は標的を捕獲するために使用
され、そして第２のバツクグラウンド捕獲プローブ（検
出可能ナ標識成分を含む）は第２バツクグラウンド支持
体と結合し得る第２リガンドを有する。バツクグラウン
ド捕獲は検定の信号対ノイズのデータを高めるための標
的捕獲に対する価値ある補足的方法である。 第１の標的捕獲プローブA532および第２のバツクグラ
ウンド捕獲プローブA726ならびに標的エンテロトキシン
遺伝子elt A1を使用する代表的なバツクグラウンド捕獲
法について以下に説明する。当分野で習熟した者は、証
明のために使用されるプローブが単に選択の問題である
にすぎないことを認めるであろう。他のプローブも当然
使用できる。 プローブA532は初期標的捕獲のために磁性ビーズに共
有結合されたdT10および最終標的捕獲のためにニトロセ
ルロースに非特異的に結合されたdT3000と可逆的に結合
しうる約100個のdA残基をその尾部に有していた。プロ
ーブA726はターミナルトランスフエラーゼを用いてその
３′末端に約３個の32P−dCおよび32P−dG残基をランダ
ム付加することにより標識した。プローブA726はそのプ
ローブが標的とハイブリダイズしない場合にdC−セルロ
ースと結合できる。 標的−第１および第２プローブ複合体を含有し且つ未
結合第２プローブを含む可能性のある溶液はdC−セルロ
ースと混合し、その混合物の温度を37℃に維持した。こ
の温度（37℃）はオリゴdCとdG7の解離温度よりも高
く、標的−第１および第２プローブ複合体のdC−セルロ
ースへの結合を防止する。この温度はまたオリゴdCとdG
10の解離温度よりも低く、dG尾部をもつ未結合第２プロ
ーブのdC−セルロースへの結合を促進する。さらに、標
的−第１および第２プローブ複合体は未結合第２プロー
ブよりもdC−セルロース支持体へのその接近において著
しく立体的に妨害される。第２プローブA726を含むdC−
セルロースは遠心により除かれるが、当業者は過のよ
うな他の方法も同様に使用できることを認めるであろ
う。残留溶出液は標的−第１および第２プローブ複合体
と濃度の低下した未結合標識第２プローブA726を含有す
る。 G.実施例 当分野で習熟した者は、回収可能支持体の製造、プロ
ーブの製造、標的捕獲およびバツクグラウンド捕獲のた
めの一般方法が特別な要求および目的に合うように変更
しうることを認めるであろう。以下の実施例は特に指定
しない限り上記に概略した一般的方法を包含する。 実施例 1. 磁性ビーズを使用する標的捕獲および検定 標的捕獲検定は２種のプローブと回収可能な磁性ビー
ズ支持体を用いて実施した。標的はエンテロトキシン産
生遺伝子elt A1のXba I−Hind IIIフラグメントを含ん
でいた。第１プローブは磁性ビーズ支持体のdT10残基と
結合しうる130個の非標識dA残基を尾部に付加したA532
30merオリゴヌクレオチドプローブであつた。第２プ
ローブは第１プローブのハイブリダイゼーシヨン位置か
ら20ヌクレオチド下流で同じ標的に結合し得るA483 30
merオリゴヌクレオチドプローブであつた。その第２プ
ローブは30merオリゴヌクレオチドに32P−dCTPおよび32
P−dGTPを末端付加して1010dpm/μｇの比放射能とする
ことにより標識した。 末端付加した第１プローブと標識した第２プローブは
1.4M塩化ナトリウム中でtox遺伝子の熱変性した457mer
制限フラグメントの可変量と65℃にて15分間インキユベ
ーシヨンした。非特異的に結合するバツクグラウンド対
照として、末端付加第１プローブと標識第２プローブは
標的の不在下に同一の溶液中でインキユベーシヨンし
た。特異的に結合する対照として、さらに２つの反応混
合物を調製した。第１の反応混合物は末端付加第１プロ
ーブと非標識第２プローブを含み、４μｇの変性大腸菌
DNAとインキユベーシヨンした。第２の反応混合物は末
端付加第１プローブと標識第２プローブを含み、標的DN
A不含の同一反応混合物中で10μｇの変性ヒトDNAとイン
キユベーシヨンした。 15分のハイブリダイゼーシヨン期間後、試料は0.75M
リン酸塩緩衝液（pH6.8）0.7ml中でdT−付加磁性ビーズ
と５分間インキユベーシヨンした。その後ビーズは磁気
的に固定化して前述の如く十分に洗浄した。標的−プロ
ーブ複合体は0.20Mリン酸塩緩衝液（pH6.8）0.6ml中60
℃でビーズから溶出した。第１群のビーズをその溶出液
および標的−プローブ複合体から分離した。第２群の磁
性ビーズを溶出液に添加し、結合条件に至らしめて標的
−プローブ複合体を再度捕獲させた。第２群のビーズを
洗浄し、標的をビーズから再溶出して、溶出液からビー
ズを分離した。 第３群のビーズは標的−プローブ複合体を含む溶出液
に加え、結合条件下に置いてビーズにもう一度標的−プ
ローブ複合体を捕獲させた。その後ビーズを十分に洗浄
し、前述の如く標的をビーズから溶出した。ビーズをそ
の溶出液から分離し、溶出液は2mm四方のスロツト中のd
T3000−ナイロン膜を通して標的−プローブ複合体を捕
獲させた。 dT3000ナイロン膜はハイブリ−スロツト装置（hybri
−slot apparatus;ベトレスダ・リサーチ・ラボラトリ
ー）を使用して２μｇのdT3000をナイロンに共有結合さ
せることにより作つた。簡単に述べると、dT3000（ライ
フ・サイエンス社製）は無塩トリス緩衝液中でGene−Sc
reenTm（ニユーイングランド・ヌクレアー社製）のよう
なナイロン膜上に直接点在させた。その膜を室温で10分
間乾燥し、次に赤外線ランプの下でさらに10分間乾燥し
た後、さらに10分間室温へ冷却した。ナイロン膜を備え
たフイルター装置はUV−トランスイルミネーター（フオ
トダイン社製）上で上下逆にし、40uW/cm2で２分間UV光
線に露光してdT3000をフイルターに架橋させた。 dT3000膜は次の溶液をこの膜に順次通すことによりプ
レハイブリダイズさせた： （１） １％SDS; （２） 0.5％SDS中の0.5mg/ml BSA;および最後に （３） プレハイブリダイゼーシヨン緩衝液 標的−プローブ複合体を含む可能性のあるdT3000−ナイ
ロン膜は0.2Mリン酸ナトリウムおよび5mM EDTAで洗浄し
た。このナイロン支持体は第２プローブの32P標識成分
の存在についてオーデイオラジオグラフイーで一晩監視
した。オーデイオラジオグラフイー後、バンドをフイル
ターから切り取つてベースシンチレーシヨン液体中で計
数した。tox遺伝子を含む制限フラグメント３フエムト
モル（10-15モル）を含有する溶液では2100および1400c
mpのカウント数であつた。tox遺伝子を含む制限フラグ
メント30アトモル（10-18モル）を含有する試料は62cpm
のカウント数であつた。 DNAを含まない第３試料は7cpmであつた。10μｇの熱
変性したヒトDNAを含有する第４試料は0cpmであつた。
４μｇの熱変性した大腸菌DNAを含有する第５試料は7cp
mであつた。この検定法の絶対感度は10-18モルのtox遺
伝子であると推定された。標識された標的−プローブ複
合体の全回収効率はインプツト（投入量）の１〜２％で
あると推定された。この検定法は良好な特異性を立証し
た。DNAを全く含まない試料中に標識プローブが存在し
ないのと同様に、ヒトDNAまたは大腸菌DNAを含む試料中
にも標識プローブは存在しない。実験プロトコールを繰
り返すことにより、約５％の全標的捕獲効率が得られ
た。この方法はハイブリダイズされない標識プローブの
初期レベル1011モルから約104モルへバツクグラウンド
を減少させた。バツクグラウンドの減少は捕獲効率の減
少を十分以上に補償する７ログ（log）の改善を示す。 実施例 2. 本実施例はバツクグラウンド捕獲と共に標的捕獲を特
徴とする。標的およびバツクグラウンド捕獲は標的捕獲
の処で述べた非標識の第１標的捕獲プローブA532、およ
び標識された第２バツクグラウンド捕獲プローブA726を
使用して行つた。 まず初めに、160ng/mlのdA−末端付加A532と40ng/ml
の32P−標識プローブA726を混合してプローブ混合物を
調製した。このプローブ混合物を可変量のエンテロトキ
シン産生遺伝子を含む細菌抽出物５μに加えた。抽出
物−プローブ混合物は22℃で15分間インキユベーシヨン
した。 15分のハイブリダイゼーシヨン期間後、試料を10倍容
量のプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液で希釈し、0.75
Mリン酸塩緩衝液（pH6.8）0.7ml中でdT−付加磁性ビー
ズと共に５分間インキユベーシヨンして標的捕獲を行つ
た。ビーズを磁気的に固定化して十分に洗浄した。標的
−第1/第２プローブ複合体を前述の如く第１支持体から
溶出し、第１支持体を除去した。 次に、標的−第1/第２プローブ複合体を含みまた未結
合の第２プローブを含む可能性のある溶出液はdC−セル
ロースと混合し、混合物の温度を37℃に維持した。この
温度（37℃）はオリゴdCとdG7の解離温度よりも高く、
そのために標的−第1/第２プローブ複合体がdC−セルロ
ースに結合するのを防止する。この温度はまたオリゴdC
とdG10の解離温度よりも低く保たれ、そのためにdG10尾
部をもつ未結合第２プローブがdC−セルロースに結合す
るのを促進する。標的−第1/第２プローブ複合体はdC−
セルロース支持体への接近において未結合第２プローブ
よりも著しく立体的に障害を受ける。dC−セルロースは
遠心により分離されたが、当業者は過のような他の方
法も同様に使用しうることを認めるであろう。 残存する溶出液は0.2ミクロンのアクロデイスク（ゲ
ルマン社製）を通して磁性微粒子およびセルロース微粒
子を除去した。その後、溶出液は22℃でdT3000を含むニ
トロセルロースフイルターに通した。ニトロセルロース
により最終標的捕獲を実施した。 下記の表２はバツクグラウンド捕獲の適用を示す： 1cpm以下にノイズを減少させることにより、試料中の極
少量の標的を検出することができる。 10-18モル程度に少ない量（これは臨床用途に必要と
される範囲内である）の標的も検出された。 １ラウンドの標的捕獲は約３ログのバツクグラウンド
を除去した。１ラウンドのバツクグラウンド捕獲は、初
回の標的捕獲で除去されなかつたバツクグラウンドを１
ログ減少させた。過による最終標的捕獲（第２ラウン
ドの標的捕獲）は、初めの２工程のどちらによつても除
去されなかつたバツクグラウンドを２ログ減少させた。
標的およびバツクグラウンド捕獲法は独立して作用し、
本実施例ではバツクグラウンドを約６ログまで減少させ
た。バツクグラウンド捕獲は、第１回目の標的捕獲後に
行う場合、よりよく作用すると思われる。明らかに、バ
ツクグラウンド捕獲は標的捕獲よりも試料中の不純物に
対してより一層感受性である。 標的捕獲後にバツクグラウンド捕獲を併用すること
は、いずれか一方の単独使用に比べてより大きな利点を
もたらす。 上記実施例は放射性標識成分について詳述したもので
あるが、本方法は非放射性標識成分を使用する検定法に
対して多大な影響を及ぼしうることが期待される。特
に、本方法は螢光剤や化学ルミネツセンス剤のような発
光標識成分に適用されるだろう。適当な螢光標識には、
例えばフルオロセイン、ピレン、アクリジン、スルホロ
ーダミン、エオシン、エリスロシンおよびそれらの誘導
体が含まれるが、これらに限定されない。適当な化学発
光剤には、例えばミクロペルオキシダーゼ、ルミノー
ル、イソルミノール、グルコースオキシダーゼ、アクリ
ジニウムエステルおよびそれらの誘導体が含まれる。 実施例 3. 以下の実施例は非放射性標識成分およびスパイクした
（spiked）生物学的媒体からの多重ラウンドの標的捕獲
を特徴とする。スパイクした生物学的媒体は医療現場で
臨床的に得られる試料と似ている。 エンテロトキシン産生大腸菌および野生型大腸菌の細
胞抽出物は前述のように調製した。臨床現場に類似した
環境におけるtox遺伝子の検出感度を測定するために、
トキシン産生菌の抽出物は前述の如く野生型大腸菌の抽
出物で希釈した。 次の物質は匿名の提供者から得られた：すなわちヒト
大便試料、牛乳、ヒト唾液、ヒトたん、ヒト全血、ヒト
血清、ヒト尿およびヒト精液。これらの臨床型試料は10
分間にわたり可溶化した。大便試料は固体であるために
5M GuSCN、0.3Mトリス−HCl（pH7.4）、0.1M EDTA（pH
7）、１％β−メルカプトエタノールの溶液中で可溶化
した。可溶化後、試料のアリコートを作り、各アリコー
トは既知量のトキシン産生大腸菌または野生型大腸菌の
いずれかでスパイクした。この混合物はその後粗過
（crude filtration;バイオラツド・エコノカラム）に
通して100℃で５分間加熱した。 残りの試料はその性状がより液状であつたので大便と
は異なる方法で処理した。液状試料を固体のGuSCNに加
えて最終濃度を5Mとした。固体のGuSCNはまた大便の場
合と同じ最終濃度とするために、十分量のトリス−HC
l、EDTAおよびβ−メルカプトエタノールを含んでい
た。次に試料のアリコートを作り、各アリコートは既知
量のトキシン産生大腸菌または野生型大腸菌でスパイク
した。この混合物は粗過に通し、100℃で５分間加熱
した。 実施例３のプローブの作製は前の実施例と相違してい
る。第１捕獲プローブはプラスミドpBR322を用いて作製
された。このプラスミドはHha IおよびHae IIIで制限
し、プラスミドフラグメントの末端にターミナルトラン
スフエラーゼを用いて約100個のdA残基を付加した。標
的プラスミドはpBR322と広範囲にわたつて相同である
（スパイサーおよびノーブル、JBC257、5716〜5721を参
照）。こうして、第１捕獲プローブは比較的大量にプラ
スミドpBR322の両鎖の多数のフラグメントから作製され
た。 第２標識プローブは標的エンテロトキシン遺伝子と特
異的に結合するように作られた。第２標識プローブはバ
クテリオフアージM13mp18にクローニングされたelt A1
遺伝子のEcoR I−Hind III制限フラグメントから作製さ
れた。大腸菌HB101にバクテリオフアージを感染させ、
中間対数期まで増殖させた。大腸菌を収獲し、バクテリ
オフアージを単離した。バクテリオフアージはベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズから入手しうるストツク・
ニツク−トランスレーシヨン・キツトを用いてビオチニ
ル化dCTP（エンゾ・バイオケミカルズ社製）でニツク−
トランスレーシヨンを行つた。約５％のヌクレオチドが
ビオチニルヌクレオチドで置換されて、ビオチン標識第
２プローブを形成した。 プローブ混合物は20mMトリス−HCl（pH7.4）および2m
M EDTA中で８μg/mlの第2M13−toxプローブと４μg/ml
の第1dA付加プローブとを混合することにより調製し
た。このプローブ混合物は100℃で10分間加熱してプロ
ーブを変性させた。 １容量のプローブ混合物は希釈段階の１容量の試料と
混合してハイブリダイゼーシヨン混合物を調製した。ハ
イブリダイゼーシヨン混合物はハイブリダイゼーシヨン
条件下に57℃で15分間維持した。その後、このハイブリ
ダイゼーシヨン混合物は10容量の遮断緩衝液（0.75Mリ
ン酸ナトリウム、pH8、0.5％ウラリルサルコシンナトリ
ウム、10mg/ml大腸菌DNA、0.5mg/mlウシ血清アルブミン
（BSA;ヌクレアーゼ不含）およびmM EDTA）で希釈し
た。このハイブリダイゼーシヨン混合物に前述の如く製
造したdT10付加磁性ビーズを加えた。ハイブリダイゼー
シヨン条件を22℃で約１分間維持した。その後、ビーズ
を磁気的に固定化することにより、ハイブリダイゼーシ
ヨン混合物から分離した。ビーズは15分の間に２回洗浄
して生物学的試料中の不純物とハイブリダイズされなか
つたビオチン標識第２プローブを除去した。 次に、約１分間で、第1/第２プローブ−標的複合体を
遮断緩衝液中65℃で磁性ビーズから溶出した。溶出液と
第１ビーズを分離した。 約７分間で、第1/第２プローブ−標的複合体は第２群
のビーズに可逆的に結合させ、その後再び解離させた。
第２群のdT10付加ビーズを希釈溶出液に加え、ハイブリ
ダイゼーシヨン条件を22℃で約１分維持した。その後ビ
ーズを洗つて遮断緩衝液中に再懸濁した。そのビーズ遮
断緩衝液混合物を65℃に高めて第1/第２プローブ−標的
複合体を放出させた。 ５分間にわたり、ニトロセルロース上で第1/第２プロ
ーブ−標的複合体の最終捕獲を実施した。第２ビーズか
らの溶出液はゲルマン・アクロデイスク（0.2ミクロ
ン）を通過させた。その後、dT3000ニトロセルロースフ
イルター（遮断緩衝液でプレハイブリダイズしたもの）
に22℃で第1/第２プローブ−標的複合体含有溶出液を通
過させた。 約30分間で、フイルターは第２プローブのビオチン標
識を検出すべくさらに処理した。検出に使用した緩衝液
の組成を以下の表３に示す。 まず初めに、第1/第２プローブ−標的複合体を保有す
るフイルターは検出緩衝液No.2中で約５分間インキユベ
ーシヨンした。次に、フイルターは検出緩衝液No.1a中
のストレプトアビジン−アルカリ性ホスフアターゼ（ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）の1:200希釈物中
で５分間インキユベーシヨンした。その後、フイルター
は検出緩衝液No.1で１分間に３回洗浄し、次いで検出緩
衝液No.3で１分間に２回洗浄した。 次に、５−ブロム−４−クロル−３−インドリルホス
フエート（BCIP）およびニトロブルーテトラゾリウム
（NBT）（キールケガード・アンド・ペリー社製）を検
出緩衝液No.3で12倍に希釈し、0.2ミクロンのアクロデ
イスクを通して過した。希釈したBCIP/NBT溶液をフイ
ルターに加え、37℃で15分間発色させた。 次に、フイルターは50mMトリス−HCl（pH7.4）および
10mM EDTA中で１分間インキユベーシヨンして反応を停
止させた。感度はフイルター上で視覚的に、またはCS93
0（島津サイエンテイフイツク社製）でデンシトメータ
ー走査することにより測定した。 本法の工程を以下の表４に示す。 表４は経過時間が１時間を越える例を説明したが、本
法は変更が可能であり、より短い時間で行うことができ
る。匹適する感度の非放射性プローブ検定は12時間〜７
日を要し、大量の試料調製物を必要とする。 本検定法の感度を以下の表５に示す。 本法は感度を改善するためにさらに改変することがで
きる。例えば、多段捕獲放出サイクルにおいて熱溶出お
よび化学的溶出を併用することにより、単一溶出、多段
熱溶出単独または多段化学的溶出単独に比べて信号対ノ
イズの比が５倍以上高まるであろう。 同じ放出法または溶出法を使用すると、支持体から同
じバツクグラウンドを放出させる傾向がある。しかしな
がら、異なる放出条件を使用すると、他の方法では溶出
されやすいバツクグラウンドが支持体に保持される傾向
がある。バツクグラウンドは２つの物理的または化学的
に異なる条件下で標的に対して全く同様にふるまうとは
考えられない。 磁性ビーズ上の標的−プローブ複合体の代表的な化学
溶出法は、ビーズを3M GuSCNと室温で１分間接触させる
ことである。熱溶出の例は先に説明した。 細菌を検出する能力はまたプローブをリボソームRNA
配列に向けることにより改善されるであろう。リボソー
ムRNA配列はゲノムDNAや臨床上重要なプラスミドDNAと
比較したとき細胞当たりの標的の1000倍増加を与える。 こうして、本発明は標的捕獲およびバツクグラウンド
減少ならびにアフイニテイ検定を実施するための装置を
特徴とする。好適な実施態様を例示し説明してきたが、
本発明は変更および修飾が可能であり、従つて説明した
細部に限定されるべきでなく、特許請求の範囲に含まれ
るこのような変更および修飾も本発明に包含されるべき
である。
薬、組成物、キツトおよび装置に関する。詳しくは、本
発明は臨床試料からデオキシリボ核酸（DNA）またはリ
ボ核酸（RNA）を捕獲するための方法、試薬、組成物お
よびキツトに関する。本発明の態様は、非放射性標識技
術および自動化に適合しうる臨床試料中の標的核酸の迅
速かつ高感度の検出方法を提供する。 （従来の技術） 以下の定義は本発明を理解しやすくするために提供さ
れる。本明細書で用いる“生物学的結合対”なる用語
は、自然親和力または結合能を示すあらゆる分子対を意
味する。本明細書で用いる“リガンド”なる用語は、生
物学的結合対の１つの分子を指し、そして“抗リガン
ド”または“レセプター”なる用語は、生物学的結合対
の他方の分子を指す。例えば、制限するものでないが、
本発明の態様は生物学的結合対が２本の相補的なポリ核
酸鎖である核酸ハイブリダイゼーシヨン検定に適用され
る。ポリ核酸鎖の一方はリガンドと呼ばれ、他方は抗リ
ガンドと呼ばれる。しかしながら、生物学的結合対には
抗原と抗体、薬物と薬物レセプター部位、および酵素と
酵素基質が包含される。 “プローブ”なる用語は、標的抗リガンドと選択的に
結合しうる既知性質のリガンドを意味する。核酸に適用
するとき、“プローブ”は標的鎖に相補的な塩基配列を
もつ核酸鎖を指す。 “標識”なる用語は検出可能な分子成分を意味し、例え
ば制限するものでないが、放射性同位体、酵素、発光物
質、および染料を包含する。“試薬”なる用語は広義に
使用され、検出可能な応答へ導く反応に関与するあらゆ
る分子成分を含む。“コフアクター（補助因子）”なる
用語は、試薬との反応に関与するあらゆる分子成分を含
み、広い意味で使用される。 “回収可能”なる用語は、媒体中に実質的に分散でき
且つ固定化、過、分配などによりその媒体から分離し
うる物質を説明するために広い意味で使用される。 “支持体”なる用語は、単独で使用する場合、フイル
ターや膜のような慣用支持体ならびに回収可能な支持体
を包含する。 リガンドと抗リガンドの結合に関して“可逆的”なる
用語は、リガンドと抗リガンドの全体的な化学的性質を
永久に変えることのない変化を加える際に、結合または
解離しうることを意味する。例えば制限するものではな
いが、可逆的結合はリガンドや抗リガンドを破壊しない
pH、温度およびイオン強度の変化により制御されるこの
種の結合および解離を包含するであろう。遺伝情報は生
細胞中の糸状のDNA分子に貯えられる。生体内におい
て、DNA分子は二重らせん構造をしており、それぞれのD
NA鎖はヌクレオチドの鎖である。各ヌクレオチドは４種
の塩基：すなわちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チ
ミン（Ｔ）、およびシトシン（Ｃ）のうちの１種により
特徴づけられる。これらの塩基は、官能基の向きによ
り、ある種の塩基対が引きつけ合つて水素結合により結
合するという意味で相補的である。一方のDNA鎖中のア
デニンは他方の相補鎖中のチミンと対合する。一方のDN
A鎖中のグアニンは他方の相補鎖中のシトシンと対合す
る。RNAでは、チミン塩基がウラシル（Ｕ）によつて置
換され、ウラシルは他方の相補鎖中のシトシンと対合す
る。 DNAは共有結合されたデオキシリボヌクレオチド鎖か
ら成り、そしてRNAは共有結合されたリボヌクレオチド
鎖から成る。生物の遺伝暗号は塩基対の配列中のDNA鎖
に担持される。 それぞれの核酸は、１つのヌクレオチドの糖の５′ヒ
ドロキシル基と隣接ヌクレオチドの糖の３′ヒドロキシ
ル基との間のホスホジエステル結合により結合される。
自然界に存在するDNAまたはRNAのそれぞれの線状鎖は、
遊離の５′ヒドロキシル基をもつ１つの末端と３′ヒド
ロキシル基をもつもう１つの末端を有する。ポリヌクレ
オチドの末端はそれぞれの遊離ヒドロキシル基に関連し
て５′末端または３′末端と呼ばれる。DNAおよびRNAの
相補鎖は、一方の鎖の３′末端が他方の鎖の５′末端に
配向および結合して逆平行複合体を形成している。 核酸ハイブリダイゼーシヨン検定は、２本の核酸鎖が
相補領域で対合する性質に基づいている。現在、核酸ハ
イブリダイゼーシヨン検定は完全なDNA分子、核酸混合
物または核酸フラグメント混合物中に存在する唯一のDN
AまたはRNA塩基配列もしくは特定遺伝子を検出および同
定するために主として使用されている。 組織または培養試料から抽出された全DNAまたはRNA中
の唯一のDNAまたはRNA配列もしくは特定遺伝子の同定
は、生理学的または病理学的症状の存在を示す。特に、
ヒトまたは動物組織から抽出された全DNAまたはRNA中の
唯一のDNAまたはRNA配列もしくは特定遺伝子の同定は鎌
状赤血球貧血のような遺伝病、組織適合性、癌および前
癌状態、または細菌やウイルス感染の存在を示す。細菌
培養物または細菌を含む組織から抽出された全DNAまた
はRNA中の唯一のDNAまたはRNA配列もしくは特定遺伝子
の同定は抗生物質耐性、毒素、ウイルスまたはプラスミ
ドの存在を示し、また細菌型の同定をもたらす。 従つて、核酸ハイブリダイゼーシヨン検定は病気の診
断および検査において大きな可能性を持つている。さら
に、核酸ハイブリダイゼーシヨン検定が植物の病因また
は毒素産生細菌を検出するために使用される農業および
食品加工の分野においてもその可能性が存在する。 最も広く使用される核酸ハイブリダイゼーシヨン検定
法の１つは、サザンブロツトフイルターハイブリダイゼ
ーシヨン法またはただ単にサザン法として知られるもの
である（Southern,E.,J.Mol.Biol.I,98、503、1975を参
照されたい）。サザン法は標的DNAまたはRNA配列を同定
するために使用される。この方法は一般にRNAまたはDNA
試料をニトロセルロースシートに固定することにより行
われる。固定化RNAまたはDNA試料は、標的配列に相補的
な塩基配列を有しかつ検出可能な放射性成分を含む放射
性標識プローブDNA鎖と接触させ、プローブとDNA試料と
のハイブリダイゼーシヨン（ハイブリツド形成）を起こ
させる。 ハイブリダイゼーシヨン法は一般に極めて特異的であ
る。もしも標識プローブとDNAまたはRNA試料とが実質的
に相補的な塩基対機構を共有しないならば、これらの２
本のヌクレオチド鎖は結合しないであろう。ハイブリダ
イゼーシヨンは所定の条件に応じて３〜48時間を要す
る。 しかしながら、実際問題として、検出の際に“バツク
グラウンドノイズ（background noise）”として現われ
る標識プローブと支持体の非特異的結合が常に存在す
る。バツクグラウンドノイズは検定感度を低減させる。
ハイブリダイズされないDNAプローブはその後洗い落と
される。ニトロセルロースシートはＸ線フイルムのシー
ト上に置いて露光される。Ｘ線フイルムはフイルムの露
光面を現像して、DNAプローブとハイブリダイズするが
故に目的の塩基対配列をもつDNAフラグメントを同定す
る。 サザン検定法と共に放射性標識剤を使用することによ
り、核酸検定を臨床試料に応用することが可能になつ
た。放射性崩壊は無関係のタンパク質および有機物質を
含む臨床試料においてでさえも検出可能である。しかし
ながら、無関係のタンパク質および有機物質の存在は、
プローブと支持体の非特異的結合の一因になる。さら
に、放射性標識技術の使用は、Ｘ線フイルム上のバンド
を視覚化するために長時間の露出を必要とする。一般的
なサザン法では露出のために１〜７日を要する。さら
に、放射性標識剤の使用は特別の実験室手段およびライ
センスが必要である。 放射性同位元素標識を使用する検定に関連した上記の
諸問題点は、非同位元素標識を使用する技術の開発へ導
いた。非同位元素標識の例には酵素、発光剤および染料
が含まれる。発光標識は外部エネルギー源による励起の
際に光を発し、励起エネルギー源に応じて次の種類：す
なわち高エネルギー粒子からエネルギーを得る放射線発
光標識；化学反応からエネルギーを得る化学発光標識；
励起エネルギーが生物学的系に適用される生物発光標
識；および赤外線、可視光線または紫外線の電磁線（フ
オトン）単位により励起にしうるフオトルミネツセンス
または螢光標識；に類別される。一般には、スミス（Sm
ith）ら、Ann.Clin.Biochem.,18:253、274（1981）を参
照されたい。 非放射性エネルギー源により励起可能な標識を使用す
る非同位元素検定法は、放射性同位元素標識を使用する
検定法に伴う健康への危険性およびライセンスの問題が
回避される。さらに、非同位元素検定法はＸ線フイルム
の使用に伴う長時間露出を避けて迅速な検出が保証され
ている。 しかしながら、非同位元素検定は信頼しうると見なす
に足る感度または検定特異性を持つていなかつた。発光
検定では、生物学的試料中に含まれるタンパク質および
他の分子の存在が励起光線の散乱を起こし、発光標識の
発光スペクトル中の光を吸収して発光プローブの消光を
もたらす。 酵素検定では、生物学的試料中に含まれるタンパク質
および他の分子の存在が酵素活性を阻害する。 同様に、比色定量検定では、生物学的試料に含まれる
タンパク質および他の物質のために色の変化が検出でき
ない。 本発明の態様は、支持体および磁性粒子を含めた回収
可能な支持体上での標的およびバツクグラウンドの捕獲
に関する。磁性粒子はDNA、RNA、ポリペプチドおよび一
定の配列をもつ多重単位分子のようなオリゴマーを含む
有機化合物の合成用支持体として提案された。例えば、
スチーブン・エー・ベンナー（Steven A.Benner）およ
びジエネテイツクス・インスチチユート（Genetics Ins
titute）の欧州特許出願第83112493.8号明細書を参照さ
れたい。しかしながら、磁性粒子は標的捕獲およびバツ
クグラウンド除去のための回収可能な支持体として提案
されたことはなかつた。 磁性粒子の他の利用には血液中の磁性流体、ノイバウ
アー（R.Neubauer）、IEEE transactions on magnetics
MAG−９、445（1973）を参照；生体分子の分離のため
の官能基の結合、ギアバー（I.Giaver）の米国特許第39
70518号明細書を参照；細胞表面レセプターの標識付
け、マーゲル（S.Margel）ら、Jour.Imm.Meth.28:28:34
1〜53（1979）を参照；治療中の磁性目標にするための
薬物への結合、センアイ（A.Senyei）ら、J.App.Phys.,
49（６）:3578（1978）、ウイーダー（K.Wieder）ら、P
ro.Soc.of Exp.Bio.Med.,58:141（1978）、モツバツハ
（K.Mosbach）およびシユレーダー（U.Shroeder）、FEB
S letters102:112（1979）を参照；ウイルス、細菌およ
び他の細胞の選択的分離、モルデー（R.Molday）ら、Na
ture 268:438（1977）を参照；および生物学的重合体用
のゲルアフイニテイークロマトグラフイーにおける担体
としての磁性粒子の使用、モスバツハ（K.Mosbach）お
よびアンダーソン（L.Anderson）、Nature 270:359（19
77）を参照；が含まれ、上記の文献は参照によりここに
引用される。 慣用の回収不可能な支持体上での標的の捕獲をもたら
す２プローブ系の使用は、Nucleic Acids Research,14
（12）:5037（1986）、“アフイニテイーに基づくハイ
ブリツド捕集による核酸ハイブリツドの迅速定量化（Fa
st Quantification of Nucleic Acid Hybrids by Affin
ity−Based Hybrid Collection）”と題するアン−クリ
スチン・シユエネン（Ann−Christine Syunen）、マ
ツチ・ラークソネン（Matti Laaksonen）およびハンス
・セダーランド（Hans Sderlund）により著された文
献中で提案された。 （発明の概要） 本発明は、試料中の標的核酸を試料中の非標的核酸か
ら分離する方法を提供する。この方法は、 （ａ） 試料を、標的と結合してプローブ−標的複合体
を形成する第１の核酸プローブを含む試薬と接触させ； （ｂ） 試料を、プローブ−標的複合体の第１の核酸プ
ローブと結合する支持体と接触させ； （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｄ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｅ） 標的を、支持体および結合した第１の核酸プロ
ーブから放出させ；そして （ｆ） 支持体および結合した第１の核酸プローブを、
標的が第２の媒体中に残るように第２の媒体から実質的
に分離する； の各工程を含む。 本発明はまた、試料中の標的核酸の存在を判定する方
法を提供する。この方法は、 （ａ） 試料を、標的と結合してプローブ−標的複合体
を形成する第１の核酸プローブを含む試薬と接触させ； （ｂ） 試料を、プローブ−標的複合体の第１の核酸プ
ローブと結合する支持体と接触させ； （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｄ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｅ） 標的を、支持体および結合した第１の核酸プロ
ーブから放出させ； （ｆ） 支持体および結合した第１の核酸プローブを、
標的が第２の媒体中に残るように、第２の媒体から実質
的に分離し；そして （ｇ） 第２の媒体中に存在する標的の存在を検出す
る； の各工程を含む。 本発明はまた、標的核酸について試料を検定する方法
を提供する。この方法は、 （ａ） 試料を、標的と結合してプローブ−標的複合体
を形成する第１の核酸プローブおよび少なくとも１つの
第２の核酸プローブを含む試薬と接触させ； （ｂ） 試料を、プローブ−標的複合体の第１の核酸プ
ローブと結合する支持体と接触させ； （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｄ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｅ） プローブ−標的複合体を第２の媒体中に放出さ
せ； （ｆ） 支持体を第２の媒体から実質的に分離し；そし
て （ｇ） プローブ−標的複合体を、標的の存在を示す第
２の核酸プローブの存在について監視する； の各工程を含む。 さらに本発明は、 （ｉ） 標的と結合してプローブ−標的複合体を形成す
るが非標的核酸には結合しない第１の核酸プローブを含
む試薬； （ii） プローブ−標的複合体の第１の核酸プローブと
結合する支持体；および （iii） 標的を第１の核酸プローブおよび支持体から
放出させるための試薬； を含む、試料中の標的核酸を試料中の非標的核酸から分
離するためのキットを提供する。 本発明の目的は、対象となる標的分子について検定を
行うための方法、試薬、組成物、キツトおよび装置を提
供することである。他の目的は以後に提示されるであろ
う。便宜上、制限するものではないが、本発明の態様は
標的捕獲、バツクグラウンド捕獲、およびこれらの組合
せの分野に分けることができる。 最初に標的捕獲について述べると、本発明の態様は標
的分子を分離するための捕獲／放出サイクルを特徴とす
る。この方法は標的分子を含む可能性のある試料媒体
を、プローブおよび第１支持体（結合条件下で少なくと
も１つのプローブと会合した又は会合しうる支持体）と
接触させることを含む。プローブは標的分子と選択的に
かつ可逆的に結合して、プローブ、標的分子および回収
可能な第１支持体から成る複合体を形成することができ
る。次に、支持体は試料媒体から分離して第２媒体と接
触させる。その後、支持体を放出条件に付して支持体か
ら標的分子を放出させ、そして支持体を第２媒体から分
離する。次いで、第２支持体を結合条件下に上記の第２
媒体と接触させる。第２支持体は標的分子と選択的に結
合しうる少なくとも１つのプローブと会合されるか、又
は会合することができる。結合条件下で、標的分子はそ
の後の処理のために第２支持体に会合したプローブと複
合体を形成する。 好ましくは、第１支持体は試料媒体中に実質上均質に
分散でき且つ試料媒体から物理的に分離・回収でき、あ
るいは試料媒体中で固定化しうるという意味で回収可能
である。 第１媒体からの第１支持体の分離は、第１支持体に非
特異的に結合した細胞破片を除去する。さらに、第２支
持体への標的分子の結合は、検出のために標的分子を濃
縮して更なる精製のための放出／捕獲サイクルを可能に
する。 本方法の別の態様は回収可能な支持体を特徴とする。
本方法は標的核酸を含む可能性のある試料を、プローブ
成分と会合した回収可能な支持体と接触させることを含
む。回収可能な支持体は試料媒体中に実質上均質に分散
できる。プローブ成分は例えばプローブ成分と回収可能
な支持体との共有結合により、または親和力会合、水素
結合あるいは非特異的会合により、回収可能な支持体と
会合させることができる。 支持体は多くの形状をとることができ、例えば支持体
含有試料媒体をふるいに通す際に回収しうる特定の形に
縮小したニトロセルロース；磁場をかけた際に試料媒体
中を移動しうるように、磁性粒子または類似物を含浸さ
せたニトロセルロース；過可能であるか、または電磁
性を示すビーズもしくは粒子；および水性媒体の表面に
分離するポリスチレンビーズが含まれる。 本発明の好適な態様は、試料媒体中に実質上均質に分
散する能力により特徴づけられる磁性ビーズから成る回
収可能な支持体を包含する。好ましくは、磁性ビーズは
プローブ成分と磁性支持体粒子との共有結合または会合
を容易にする一級アミン官能基を含む。好ましくは、磁
性支持体ビーズは単磁区磁石（single domain magnet）
であつて、残留磁気を示さない超常磁性である。第１プ
ローブは結合条件下で抗リガンドと特異的に結合しうる
プローブリガンド成分を含む。回収可能な支持体は試料
媒体中で実質上均質に分散でき、結合条件下にリガンド
と結合して標的−プローブ支持体複合体を形成しうる少
なくとも１つの抗リガンド成分を含む。次に、回収可能
な支持体と試料媒体とを分離して、試料媒体はさらに処
理される。 本発明の態様は、無関係の物質を含む臨床試料媒体か
ら標的分子を捕獲するのに適している。試料媒体をプロ
ーブまたは回収可能な支持体と接触させる順序は選択に
かかわる問題である。しかしながら、その選択は一方で
はプローブと標的との間の結合速度論、他方ではプロー
ブリガンドと支持体抗リガンドとの間の結合速度論によ
り影響される。 ポリヌクレオチド標的分子およびホモポリマーリガン
ドおよび抗リガンドに適用した場合、ホモポリマーリガ
ンドと抗リガンドの結合は一般にプローブと標的の結合
よりも速い。プローブの標的への結合は、プローブリガ
ンドが支持体抗リガンドと結合した後では立体的に妨害
される。好適な態様は試料媒体と試薬とを接触させ、そ
の混合物をハイブリダイゼーシヨン条件に置くことを包
含する。次に、回収可能な支持体は試薬と試料媒体の混
合物中に分散させて、プローブ−支持体複合体の形成に
先立つて標的−プローブ複合体を形成させる。 本発明の別の態様は多重プローブ系を特徴とする。好
ましくは、本方法は上記のような第１プローブおよび標
的分子に結合でき且つ検出可能な標的成分をもつ少なく
とも１種の第２プローブを包含する。第２プローブは標
的−（第１および第２）プローブ−支持体複合体を形成
することができる。試料媒体からの回収可能な支持体の
分離工程は、標的−（第１および第２）プローブ−支持
体複合体から無関係の物質を除くのみならず、標的分子
と結合しないすべての第２プローブも分離する。標的と
結合しない第２プローブはバツクグラウンドノイズの一
因になり、偽の信号が標的の存在を示すことになる。 更なる処理は、標的−（第１および第２）プローブ複
合体を回収可能な支持体から第２媒体中へ放出させ、次
いでその複合体を新たな支持体へ再結合させることを包
含する。回収可能な第１支持体は検定法を妨害しうる非
特異的結合物質を保持するかもしれない。従つて、回収
可能な支持体からの標的−プローブ複合体の放出および
回収可能な支持体の除去の後に、プローブリガンドと結
合しうる抗リガンド成分をもつ第２支持体を標的−プロ
ーブ複合体と結合条件下で接触せしめて、標的−プロー
ブ複合体のそれ以上の精製および濃縮のために標的−プ
ローブの結合または捕獲サイクルをさらに続行すること
ができる。 更なる処理はバツクグラウンド捕獲を包含する。本発
明の別の態様は、第２プローブが第２リガンド成分をも
つ方法を含む。この方法はさらに第２抗リガンド成分を
もつバツクグラウンド支持体を含む。第２リガンド成分
と第２抗リガンド成分は、第２プローブが標的分子に結
合しないときだけ、結合条件下で安定して結合できる。
この方法はさらに標的に結合しない第２プローブを含む
可能性のある媒体をバツクグラウンド支持体と結合条件
下で接触させることを含む。次に、バツクグラウンド支
持体は媒体から分離して未結合第２プローブを除き、そ
れによりバツクグラウンドノイズを池少させる。 “バツクグラウンド支持体”なる用語は通常の意味で
使用され、フイルター、膜および回収可能な支持体を包
含する。バツクグラウンド支持体への結合は解離可能で
ある必要はない。 好適な回収可能支持体には、例えば媒体中に分散でき
しかも媒体から分離しうる粒子、顆粒、ビーズまたはフ
イラメントが含まれるが、これらに限定されない。分離
方法としては、例えば過、遠心、沈澱、表面浮選、沈
降、または電磁場の導入などがある。 本発明方法はポリヌクレオチド標的分子に応用でき
る。好ましくは、第１および第２プローブは、標的また
はプローブが固定化されている場合とは対照的に、“溶
解した状態”でポリヌクレオチド標的と速やかに結合す
る。 溶液中に実質上分散しうる回収可能支持体は、回収可
能支持体とプローブとの相互作用（これは“溶解状態”
のハイブリダイゼーシヨンを模倣するものである）を可
能にする。溶解状態では、ハイブリダイゼーシヨンは約
３〜15分で完結する。本方法の迅速なハイブリダイゼー
シヨンと簡易さにより自動化が可能である。本方法は臨
床試料中に含まれる核酸配列を無関係の物質から分離す
ることができ、それにより本方法を非同位元素標識技術
に応用することが可能である。 標的分子がポリヌクレオチドである本方法の態様は、
試料媒体と試薬とを結合条件下で接触させることを含
む。その試薬には少なくとも１つの第１ポリヌクレオチ
ドプローブおよび少なくとも１つの第２ポリヌクレオチ
ドプローブが含まれる。第１プローブは標的分子と複合
体を形成することができ、第１ホモポリマーリガンド成
分を有する。第２プローブは第１プローブに結合した標
的分子と複合体を形成することができる。その第２プロ
ーブは第１プローブの第１ホモポリマーリガンドとは異
なる第２ホモポリマーリガンド成分をもつ標識成分を含
む。次に試薬および試料媒体はバツクグラウンド支持体
と標的捕獲支持体とに接触させる。バツクグラウンド支
持体は、第２プローブが標的と結合しない場合、その第
２プローブの第２ホモポリマーリガンド成分に結合しう
る少なくとも１つの第２ホモポリマー抗リガンド成分を
含む。標的捕獲支持体は第１プローブの第１ホモポリマ
ーリガンド成分に結合しうる少なくとも１つの第１ホモ
ポリマー成分を含む。バツクグラウンド支持体および標
的捕獲支持体はバツクグラウンドノイズを除き、さらに
標的捕獲支持体はその後の処理のために標的−（第１お
よび第２）プローブ複合体を濃縮し、且つ細胞破片から
その複合体を分離する。その後の処理には標的分子の存
在を示す標識成分の検出が含まれる。 今や、バツクグラウンド捕獲に関する本発明の態様を
より詳細に説明すると、１つの態様にはプローブと標的
が複合体を形成する方法が含まれる。次に、複合体を形
成しなかつたプローブが結合条件下で支持体と接触され
る。その支持体は未結合プローブと選択的に結合するこ
とができる。その後、支持体はプローブ−標的複合体か
ら分離される。 本発明のさらに別な態様は、その後の処理のために多
数の標的を分離する方法を包含する。 １つの態様には多数の支持体上の標的分子に特異的な
プローブの逐次付加および除去が含まれる。別の態様に
は試料を第１プローブ系列と接触させて、その標的およ
びプローブを多数の支持体上へ捕獲する方法が含まれ
る。第１プローブ系列は支持体と会合しうるリガンドを
含む。第１プローブ系列には、各標的分子に特異的な、
支持体と結合しうる、多数の標的すべてのためのプロー
ブが含まれる。支持体は互いから分離することができ、
その分離は支持体と共に分離される個々のタイプの標的
分子をもたらす。 本発明の別の態様は試薬組成物を包含する。試薬組成
物には第１プローブおよび第２プローブが含まれる。第
１プローブは標的分子と複合体を形成することができ、
結合条件下で抗リガンドと特異的に結合しうるプローブ
リガンド成分を含む。第２プローブは標的分子と複合体
を形成することができ、検出可能な標識成分を含む。こ
の試薬組成物は抗リガンド成分をもつ回収可能な支持体
と共に使用する場合、試料媒体中の標的を捕獲して検出
するのに使用される。 本試薬組成物の別の態様は、第２プローブが標的分子
に結合しない場合のみ、抗リガンドと安定して結合でき
る第２リガンド成分をもつ第２プローブを包含する。こ
の試薬組成物は、未結合第２プローブを含む可能性のあ
る試料を、第２抗リガンド成分をもつバツクグラウンド
支持体と接触させることにより、バツクグラウンドノイ
ズを減少させる。 別の態様は試料媒体中に実質的に均質分散でき且つプ
ローブ上のオリゴヌクレオチドリガンドと結合しうるオ
リゴヌクレオチド抗リガンドを有する支持体を含む。 支持体の好適な態様には、例えば分離可能な粒子、粗
粒、フイラメントおよびビーズが含まれる。分離手段に
は例えば沈殿、沈降、浮選、過、遠心よび電磁気など
が含まれ、これらに限定されない。 好適な態様は、実質的に均質分散でき且つ過や浮選
により媒体から分離できる直径が10〜100ミクロンのポ
リスチレンビーズを包含する。他の好適な態様は強磁性
ビーズを含む。BIO−MAGという商標名で市販されている
強磁性ビーズは実質的に水性媒体中に均質分散でき、し
かも電磁場により回収または固定化することができる。
この強磁性ビーズはアミン反応性被膜で覆われた鉄心を
含む。ビーズはほぼ球形であつて、１ミクロンの直径を
有する。ポリスチレンビーズおよび強磁性ビーズは抗リ
ガンド成分を含むように処理される。 本発明の別の態様は、生物学的結合対の一部である標
的分子について検定を行うためのキツトを包含する。標
的が特定の塩基配列をもつポリヌクレオチドである場
合、キツトは第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２
ポリヌクレオチドプローブを含む試薬を包含する。第１
および第２プローブは相互に排他的な標的部分と結合し
て、両プローブが標的に結合した複合体を形成すること
ができる。第１プローブは結合条件下で第１支持体と可
逆的に結合でき、第２プローブは検出可能な標識成分を
含む。キツトはさらに第１支持体を包含し、この支持体
は試料媒体からの選択的分離を可能にする標的−プロー
ブとの複合体を形成しうる。 本キツトの別の態様は第２プローブおよびバツクグラ
ウンド支持体を包含する。第２プローブは、標的と結合
しない時、バツクグラウンド支持体と選択的に結合する
ことができる。バツクグラウンド支持体は、非特異的に
結合した第２プローブを除くために、試薬を含有する媒
体から分離できる。 本発明の別の態様は、本方法に従つて検定を行うため
の装置を包含する。標的がポリヌクレオチドである場
合、その装置は試薬および標的を実質的に均質な混合状
態で収容するのに適した反応室を含む。試薬には第１お
よび第２ポリヌクレオチドプローブが含まれる。各プロ
ーブは相互に排他的な標的部分と結合して、両プローブ
が標的と結合した複合体を形成することができる。第１
プローブは結合条件下で第１支持体と可逆的に結合で
き、そして第２プローブは検出可能な標識成分を含む。
その装置はさらに、第１支持体を試薬および試料と接触
させて、第１プローブおよび標的−プローブ複合体をそ
の支持体に結合させるための手段を含む。その装置はさ
らに、支持体に結合した標的−プローブ複合体を形成す
べく試料、試薬および支持体を結合状態にするための手
段を含む。その装置はさらに、第１プローブを解離状態
にするための手段を含む。最後に、その装置は試料およ
び試薬から支持体を分離するための手段を含む。 “反応容器”なる用語は広義に使用され、例えば制限
するものでないがキユベツト、試験管、毛細管などを含
めたすべての収容手段を包含する。 試料、試薬および支持体を結合状態にしたり、あるい
は試薬および支持体を解離状態にするための適当な手段
は、例えばポリヌクレオチド鎖を選択的に変性またはア
ニーリングするために試料、試薬および支持体の温度を
上げたり下げたりしうる温度制御ヲ包含する。 試料または試薬から支持体を分離するための適当な手
段には、例えば磁性ビーズと共に使用される電磁石、固
着支持体に固定された繊維、ポリスチレン粗粒と共に使
用される遠心分離機などが含まれる。 本発明の別の態様は、標的と特異的に結合しなかつた
標識成分含有第２プローブを除くために、試薬および標
的をバツクグラウンド支持体と結合条件下で接触させる
ための手段を包含する。 発光標識成分と共に使用するのに適した本装置の態様
は適当な標識励起手段を含む。螢光標識成分と共に使用
される装置は、適当な波長範囲を定めるフイルターを備
えたレーザーまたは光線放射装置を含む。化学発光標識
成分と共に使用される装置は、反応室にコフアクターを
注入するための注入装置を含む。 今や、本発明の好適な態様を図示した図面、特に第１
図について見ると、標的ポリヌクレオチド鎖の検定のた
めに必要な試薬組成物と共に検定手順が模式図により示
されている。通常の検定法では多数の標的鎖が含まれ、
多数のプローブ鎖を使用して検定が行われるであろう。
しかしながら、簡略化して本発明を理解しやすくするた
めに、図面には限られた数のプローブ、支持体および標
的のみを示す。第１図は回収可能な支持体を使用する方
法に関する。 第１図に示す検定の工程１は、細胞を含む臨床試料に
より開始される。細胞は病原菌、遺伝病または望ましい
遺伝子特性を示す特に興味ある塩基配列を有する標的核
酸（DNAまたはRNA）を保有する可能性がある。その臨床
試料は大便、尿、唾液、膿、血清、血漿、眼レンズ液、
脊髄液、リンパ液、生殖器洗液などのような排泄物また
は生理学的液体から得られる。当分野で習熟した者は、
当分野で知られた方法により生検（バイオプシー）試料
を単一細胞懸濁液または小塊にすることができる。例え
ば、固体組織の生検試料はその生検試料を0.5M塩化ナト
リウム、10mM塩化マグネシウム、0.14Mリン酸緩衝液（p
H 6.8）および25mg/mlシクロヘキサミドの混合物中で撹
拌することにより、効果的に単一細胞懸濁液または細胞
小塊にすることができる。また、この工程において特定
の細胞型を示差遠心、密度勾配遠心または他の方法のよ
うな当分野で知られた方法により単離することもでき
る。 その後、細胞はそれらのDNAおよび／またはRNAを放出
させるべく処理される。化学的細胞溶解が当分野でよく
知られている。化学的細胞溶解は希薄アルカリ水溶液
（例えば0.1〜1.0M水酸化ナトリウム）を用いて行われ
る。そのアルカリはまたDNAやRNAを変性するのに役立
つ。その他の変性および細胞溶解剤には高温、有機試薬
（例えばアルコール、アミド、アミン、尿素、フエノー
ルおよびスルホキシド）、またはある種の無機イオン
（例えばトリフルオロ酢酸ナトリウム、トリクロロ酢酸
ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、イソチオシアン酸グ
アニジニウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、イ
ソチオシアン酸ナトリウムおよびイソチオシアン酸カリ
ウムのようなカオトロピズム塩）が含まれる。 臨床試料はまた種々の制限エンドヌクレアーゼの作用
によりDNAまたはRNAを分割して、比較的取り扱いやすい
セグメントにすることができる。試料処理工程の完了時
に、臨床試料は試料核酸、細胞破片および不純物を含有
する。過去においては、試料核酸は核酸をフイルターや
膜に非特異的に結合させ、その後フイルターや膜から細
胞破片と不純物を洗い落とすことにより、細胞破片と不
純物から分離された。しかしながら、実際には、若干の
細胞破片および若干の不純物ならびに標的以外の核酸が
フイルターや膜に非特異的に結合され、洗浄によつても
除去されずに残存する。 本発明の態様は、工程１に例示されるごとく、標的核
酸を保有する可能性のある試料を、プローブ成分と会合
した回収可能な支持体と接触させることを包含する。回
収可能な支持体は試料媒体中に実質的に均質分散しう
る。プローブ成分は、例えばプローブ成分と回収可能な
支持体との共有結合、親和力会合、水素結合または非特
異的会合により回収可能な支持体と会合することができ
る。 支持体は多くの形体をとることができ、例えば粒状形
体に縮小され且つ支持体含有試料媒体をふるいに通すと
き回収しうるニトロセルロース；磁場をかけた際にニト
ロセルロースが試料媒体中を移動できるように、磁性粒
子で含浸されたニトロセルロース；過できるか又は電
磁性を示すビーズまたは粒子；および水性媒体の表面に
分配されるポリスチレンビーズが含まれる。 本発明の好適な態様は、試料媒体中に実質的に均質分
散しうる能力により特徴づけられる磁性ビーズから成る
回収可能な支持体を包含する。好ましくは、磁性ビーズ
はプローブと磁性支持体粒子との共有結合または会合を
容易にする第１アミン官能基を含む。好ましくは、その
磁性支持体ビーズは単磁区磁石であり、残留磁気を示さ
ない超常磁性である。 粒子またはビーズは磁鉄鉱粒子から成りうるが、それ
らは反応性表面を有し且つ磁場に作用する能力を示す限
り、不純金属、合金または複合材料の形の他の磁性金属
または金属酸化物でありうる。個々に又は鉄との組合せ
で使用される他の材料には、コバルト、ニツケルおよび
ケイ素が含まれるが、これらに限定されない。磁鉄鉱ま
たは金属酸化物粒子の製法はバンデンベルグ（Vandenbe
rghe）ら、“超微細コバルトフエライトの製法および磁
性”、J.of Magnetism and Magnetic Materials,15〜1
8:1117〜18（1980）；マチエビツク（E.Matijevic）、
“単分散金属（含水）酸化物−−−コロイト科学の興味
ある分野”、Acc.Chem.Res.,14:22〜29（1981）に記載
されており、その内容は参照によりここに引用される。 本発明で使用するのに適した磁性ビーズには、アドバ
ンスト・マグネテイクス社（Advanced Magnetics,In
c.）からBIO−MAGという商標名で市販されている第１ア
ミン官能基含有磁性ビーズが含まれる。好適な磁性粒子
は非多孔質であるにもかかわらず、プローブ成分と会合
することができる。プローブ成分の会合に関与しない反
応性部位は遮断して他の試薬、不純物および細胞物質の
非特異的結合を防ぐことが好ましい。磁性粒子は好まし
くは実質的にコロイド状の懸濁物として存在する。試薬
および基質および粒子表面に会合したプローブ成分は、
その粒子を取り囲む溶液中に直接延在している。プロー
ブ成分は固体支持体に担持された反応と関連した速度で
はなくむしろ溶液中の反応に特徴的な速度および収率で
もつて、溶液中の溶存試薬および基質と反応する。さら
に、粒子サイズを減ずるにつれて、粒子の表面積対容積
の比が増加し、それにより磁性粒子の単位重量あたりよ
り多くの官能基およびプローブを結合させうる。 反応性アミン官能基を有するビーズは、ポリヌクレオ
チドをそのビーズに共有結合させるべくポリヌクレオチ
ドと反応させることができる。ビーズはリン酸ナトリウ
ム緩衝液中で10％グルタルアルデヒドと反応させ、続い
て実験プロトコールにおいてより詳しく説明する方法に
よりリン酸緩衝液中でリン酸化ポリヌクレオチドのエチ
レンジアミン付加物と反応させる。 さて工程２に戻ると、プローブ成分と会合した回収可
能支持体は臨床試料と接触させ、工程３に進んで結合条
件に置く。対象となる標的に特異的なプローブ成分は臨
床試料中に存在する標的鎖に結合される。試料および試
薬媒体中に分散した回収可能支持体は、あたかもそれら
が溶液中で遊離状態にあるように、プローブ成分と標的
をハイブリダイズさせることができる。 プローブと標的のハイブリダイゼーシヨンは約15分で
完結する。これとは対照的に、媒体中に分散する能力を
もたない支持体上にプローブまたは標的が固定化された
ハイブリダイゼーシヨンでは３〜48時間もの長時間を要
する。 無関係のDNA、RNA、細胞破片および不純物は支持体と
特異的に結合しない。しかしながら、実際的方法とし
て、少量の無関係のDNA、RNA、細胞破片および不純物は
回収可能支持体を含む反応容器内に置かれたすべての物
体に非特異的に結合することができ、現に結合する。本
発明の態様は、標的ポリヌクレオチドから無関係のDN
A、RNA、細胞破片および不純物を取り除くべく臨床試料
の更なる精製を容易にするものである。 第１図の工程４は臨床試料からの支持体の分離および
第２媒体中への支持体の懸濁を示す。従つて、第２媒体
は標的ポリヌクレオチド鎖と結合したプローブをもつ回
収可能支持体を含む。また、その支持体と非特異的に結
合した無関係のDNA、RNA、細胞破片および不純物も随伴
されるが、臨床試料中に初めに存在していた濃度よりも
かなり低い濃度である。当分野で習熟した者は、第２媒
体中に懸濁する前に支持体を洗浄することにより若干の
望ましくない物質を減らすことができることを認めるで
あろう。 第２媒体中に懸濁された回収可能支持体（会合プロー
ブおよび標的をもつ）は工程５に示すような変性に付さ
れ、それにより回収可能支持体のプローブ成分から標的
を解離させる。変性操作は回収可能支持体から非特異的
に結合した無関係のDNA、RNA、細胞破片または不純物を
放出させたり、放出させなかつたりする。しかしなが
ら、本方法の工程５は第１臨床試料媒体から初めに運ば
れた非特異的に結合した細胞破片、不純物、無関係のDN
AおよびRNAの多くを支持体と共に保有する第２媒体か
ら、回収可能支持体を分離させる。 工程６に示すように、新しい支持体が結合条件下で第
２媒体中に導入され、その回収可能支持体と会合したプ
ローブ成分上に標的ポリヌクレオチド鎖が再び捕獲され
る。当分野で習熟した者は、新しい支持体が非特異的に
結合したDNA、RNA、細胞破片および不純物をさらに精製
・除去する工程に循環させた後のもとの回収可能支持体
を実際に含みうることを認めるであろう。従つて、第２
媒体中に存在する不純物のみが、以前に支持体へ非特異
的に結合され、その後第１支持体から放出されて第２媒
体中に溶解または懸濁されたDNA、RNA、細胞破片および
不純物を包含する。 しかしながら、この種の不純物は回収可能な第２支持
体を第２媒体から分離し、そして再び回収可能な支持体
を別の媒体に導入し、変性し、古い支持体を分離するこ
とから成るサイクルを繰り返すことにより、標的ポリヌ
クレオチドからさらに除去することができる。当分野で
習熟した者は、溶液が除去されるかまたは収能容器へ添
加されるとき、本発明で説明した磁性ビーズは適所に保
持しやすく、また溶液から取り出しやすいことを認める
であろう。 “溶解状態の反応速度論（insolution kinetics）”
をまねた反応に関与する磁性ビーズの能力は、変性およ
び標的への結合のサイクルの完了を３〜15分で達成させ
る。 十分な精製および濃縮後に、標的は工程８に示すよう
な当分野で知られた発光または放射性検定法により検出
することができる。標的を含む媒体の精製は、細胞破片
および不純物の不在下での非同位標識成分の検出を可能
にする。 さて今や第２図に転ずると、第２図は多重プローブ法
を特徴としており、そこには可溶化剤および試薬の導入
により先の図面の臨床試料と同様に処理されるポリヌク
レオチド標的を含む臨床試料から始まる本検定法の別の
態様が示されている。第２図に示した検定法の試薬には
第１ポリヌクレオチドプローブ鎖（P1）および第２ポリ
ヌクレオチドプローブ鎖（P2）が含まれ、両プローブ
（P1およびP2）は標的と結合して標的との複合体を形成
することができる。第１プローブ（P1）は結合条件下に
回収可能支持体（S1）と会合しうる。第２プローブは検
出可能な少なくとも１つの標識成分を有している。図面
において、標識成分は星印により示される。変性条件下
での可溶化剤および試薬の導入後、臨床試料を含む溶液
は標的ポリヌクレオチド、第１および第２プローブの形
の試薬、細胞破片、可溶化剤、不純物および無関係のDN
AおよびRNAを含有するであろう。 工程２に示すように、第１および第２プローブ（P1お
よびP2）は標的の相互に排他的な部分と結合条件下で結
合する。溶解状態での両プローブ（P1およびP2）と標的
とのハイブリダイゼーシヨンは迅速であり、しかも固体
支持体との会合により妨害されない。第１および第２プ
ローブ鎖（P1およびP2）への標的の結合を確実にするた
めに、過剰のプローブが使用される。しかしながら、た
とえ過剰のプローブ（P1およびP2）が使用されないとし
ても、若干のプローブは標的を発見できずに試料媒体中
にハイブリダイズされないまま残存するであろう。ハイ
ブリダイズされなかつた標識成分含有第２プローブ
（P2）は、もしも検出中に存在するならば、バツクグラ
ウンドノイズの原因になるであろう。 第１プローブ（P1）は支持体上の抗リガンド成分と結
合しうるリガンドにより支持体（S1）と結合できる。リ
ガンド（L1）には例えばホモポリマーから成る尾部が含
まれる。支持体（S1）はリガンド（L1）を受容してそれ
と結合しうる抗リガンド（A1）を包含する。抗リガンド
（A1）には例えばプローブ（P1）のリガンド（L1）に相
補的なホモポリマーが含まれる。 さて工程３に転ずると、結合条件下で支持体（S1）の
抗リガンド成分（A1）は第１プローブ（P1）のリガンド
成分（L1）と会合または結合し、そしてその第１プロー
ブはそれ自体が標的と結合し且つ第２プローブ（P2）に
連結している。支持体はいろいろな形をとることができ
る。ビーズまたは粒状支持体は溶液中に分散され、溶解
状態に近い反応速度論を示す反応により標的−プローブ
との結合に加わることができる。さらに、回収可能なビ
ーズおよび粒状支持体は、より一般的なフイルターや膜
にもともと存在する目詰りの問題なしに、不溶性細胞破
片からプローブ−標的複合体を分離させうる。 しかしながら、一般的な膜、フイルターまたはセルロ
ース支持体も目詰りが問題とならないいくつかの用途に
おいて使用できる。溶液中でのプローブと標的との迅速
なハイブリダイゼーシヨンゆえに、固体の非ビーズ状ま
たは非粒状膜もしくはフイルター支持体を反応容器中に
組み入れることができる。試薬および試料の溶液は支持
体を通過して、標的が捕獲される。支持体（S1）は回収
可能な支持体として第２図に示される。 溶液中には標的−プローブ支持体複合体と共に未結合
の第１および第２プローブ成分、未結合標的、可溶化
剤、不純物および細胞破片が存在する。標識成分をもつ
未結合第２プローブ（P2）はノイズの原因となり、標的
の存在によく似た信号を発する。少量の無関係の細胞破
片、可溶化剤、不純物およびプローブも回収可能支持体
と非特異的に結合しうる。 工程４において、支持体（S1）は臨床試料媒体から分
離される。回収可能支持体を使用する場合、分離は反応
容器内に回収可能支持体を固定化することにより、また
は試料媒体から回収可能支持体を直接取り出すことによ
り達成しうる。当分野で習熟した者は、固定化支持体を
洗浄して望ましくない物質を減らすことができることを
認めるであろう。 さて工程５に転ずると、標的−プローブ支持体複合体
は実質的に無関係のRNA、DNA、可溶化剤、不純物および
細胞物質を含まず、従つて標的分子の存在を示す標識成
分の存在について監視することができる。しかしなが
ら、少量の無関係のDNA、RNA、可溶化剤、不純物および
細胞物質がまだ支持体（S1）と非特異的に結合している
かもしれない。さらに、標的と会合していないという意
味で未結合の第２プローブ（P2）もまた支持体（S1）と
非特異的に結合でき、非同位体標識成分からの信号に影
響を及ぼす。標識成分をもつ未結合第２プローブ（P2）
の存在はバツクグラウンドノイズの主な原因となり、そ
れにより検定法の正確度が減ぜられる。 従つて、別の工程５として、第１支持体（S1）を第２
媒体中に懸濁し、その第２媒体中で変性することにより
支持体（S1）を標的−プローブ複合体から分離すること
ができる。 変性後、工程６において、第１支持体（S1）は第２媒
体から分離され、第２支持体（S2）と置き換えられる。
第２支持体（S2）は第１プローブのリガンド成分（L1）
と結合しうる抗リガンド成分（A1）を含む。 工程７に移ると、標的−プローブ複合体は結合条件下
で第２支持体（S2）と再会合する。第１支持体（S1）の
除去は、その第１支持体（S1）と非特異的に結合した無
関係の物質、破片およびプローブを検定媒体から除去す
る。 工程８に示すように、標的−プローブ複合体を含む媒
体は標識の存在について検定される。しかしながら、検
定媒体をさらに精製することにより、第１支持体（S1）
に非特異的に結合され、その後第１支持体（S1）から第
２媒体中に溶解または解離された試料媒体由来の無関係
の物質およびバツクグラウンドの存在をさらに減ずるこ
とができる。 従つて、回収可能な第２支持体（S2）を第３媒体と接
触させ、その第３媒体を支持体から標的−プローブ複合
体を放出させる条件に至らせ、その後支持体を除去して
更なるサイクルを完結させることができる。サイクルの
回数は試料のタイプ、標識成分の種類、および検出装置
の感度に応じて選択されるだろう。異なるタイプの支持
体を異なる時点で使用してもよい。従つて、回収可能な
支持体を使用することにより初めに試料媒体または溶液
から標的−プローブ複合体を集めまたは濃縮し、こうし
て膜やフイルターに特有の目詰りの問題を避けることが
できる。第２または第３支持体は第１プローブ（P1）の
リガンド成分（L1）と結合する抗リガンド成分（A1）を
もつ膜またはフイルターを含むのが好ましい。膜または
フイルター支持体は標的−プローブ複合体を流動回収さ
せる処理工程を単純化することができる。 本発明の別の態様はバツクグラウンドノイズを減らす
のに特に適している。今や第３図を見ると、そこには第
２図に示した検定法の変法が示されている。第３図にお
いて、標的ポリヌクレオチドは第２図に記載のプローブ
成分と類似した第１および第２プローブ成分（P1および
P2）と複合体を形成している。しかしながら、第２プロ
ーブは第２リガンド（L2）を含む。その第２リガンド
（L2）には例えばホウ酸抗リガンドと複合体を形成する
単一末端リボヌクレオチド、相補的コポリマーと結合す
るコポリマー、アビジン抗リガンドに結合するビオチン
リガンド、または図示したようなホモポリマーリガンド
（L2）および相補的ホモポリマー抗リガンド（A2）が包
含される。 今や工程１に転ずると、第２プローブ（P2）が標的と
結合していない時だけその第２プローブ（P2）と選択的
に結合しうるバツクグラウンド支持体が、標的−プロー
ブ複合体を含む媒体と接触させられる。その媒体は遊離
の、会合していない第１および第２プローブ（P1および
P2）をさらに含む。バツクグラウンドノイズの原因とな
る標識された第２プローブ（P2）は、バツクグラウンド
支持体（B1）と会合した大過剰モルの抗リガンド成分
（A2）により、そのバツクグラウンド支持体（B1）と特
異的に結合する。未結合の標識プローブ（P2）とバツク
グラウンド支持体（B1）との結合後、工程２に示すよう
にバツクグラウンド支持体（B1）を媒体から除去する。
標的−プローブ複合体を含有する媒体は、バツクグラウ
ンドノイズの減少後、第２プローブ（P2）に保有された
標識の存在について検定される。あるいは、標的−プロ
ーブ複合体を含む媒体は更なる処理に付される。 更なる処理は第３図に示した工程１〜３、または第２
図に示した諸工程を繰り返すことによるバツクグラウン
ドの更なる減少を包含する。例えば、バツクグラウンド
減少工程は、第１および第２プローブのリガンドおよび
抗リガンド成分が干渉せず、且つ標的が表１および第２
プローブと複合体を形成するいずれかの時点で、第２図
に示すような臨床試料の処理に組み入れられる。 本方法の態様は第４図に模式図で示した装置を用いて
実施される。この装置は次のような主な要素：すなわち
少なくとも１つの収納容器、プローブと標的分子および
回収可能な支持体との会合を制御する手段、試料溶液か
ら回収可能支持体を分離する手段、および回収可能支持
体から標的分子を放出させる手段を包含する。これらの
主な要素は多種多様な形をとることができ、以下でさら
に詳しく説明する。 この装置はポリヌクレオチドを含む標的分子に関して
第２図および第３図で示した方法を適用して、例示目的
のために以下で説明されるであろう。こうして、ステー
シヨン１では、臨床試料が細胞物質を溶解して核酸を放
出させるために、可溶化剤（例えばカオトロピズム塩、
酵素および界面活性剤）と一緒に収納容器中に入れられ
る。その収容容器は細胞の破壊を容易にするための撹拌
部材を備えている。その収納容器は試料を入れるのに適
したどのような型の容器、管またはキユベツト（浅い水
ばち）であつてもよい。 自動分析用に設計された器械では、第４図に示した装
置は多数の収納容器を受容する手段を含むであろう。例
示目的のために、試料を含む収納容器は逐次分析され
る。こうして、収納容器は第１ステーシヨンへ、続いて
検定法の種々の工程が行われる後続のステーシヨンへ搬
送される。 各ステーシヨンは搬送手段により連結されている。搬
送手段には回転可能なターンテーブル、コンベアーベル
トなどが含まれる。臨床病院に設定する場合、搬送手段
は手動移動を含みうる。従つて、病院スタツフが患者か
ら組織試料を採取し、その試料を収納容器に入れる。組
織試料の破壊および可溶化剤と試薬類の初期混合を含め
た試料処理はベツドのそばで開始され、そしてその後の
処理のために収納容器を後続のステーシヨンへ移動させ
ながら継続されるであろう。ステーシヨンへの言及は例
示目的のためである。当分野で習熟した者は、いくつか
のステーシヨンまたは工程を組み合わせたり逆にしたり
しうることを認めるであろう。 さて第１ステーシヨンに戻ると、試料と可溶化剤を収
納容器に入れ、その中の撹拌部材により試料と可溶化剤
を完全に混合して細胞物質から核酸を放出させる。搬送
手段によりその収納容器をステーシヨン２へ運び、そこ
で収納容器は試薬を受け取る。 試薬は第１ポリヌクレオチドプローブおよび第２ポリ
ヌクレオチドプローブを含む。第１および第２プローブ
は標的ポリヌクレオチドと複合体を形成することがで
き、その際両プローブは標的の相互に排他的な部分と結
合する。第１プローブはまた結合条件下で回収可能な支
持体と結合しうる。第２ポリヌクレオチドプローブは検
出可能な標識成分を含む。試薬と核酸試料は加熱部材に
より変性され、その後ステーシヨン３に運ばれる。 ステーシヨン３において、収納容器は円により示され
る第１支持体を受け取る。第１支持体は適当な手段（撹
拌部材を含む）により試料媒体中に均質分散される。適
当な支持体の例にはポリスチレンビーズ、磁性ビーズお
よび他の粒状またはフイラメント状物質が含まれるが、
これらに限定されない。先に例示したように、第１支持
体はデオキシチミジン（dT）のポリヌクレオチド抗リガ
ンドを有する磁性ビーズでありうる。第１プローブは結
合またはハイブリダイセーシヨン条件下で第１支持体に
結合しうるデオキシアデノシン（dA）の尾部を含む。 ステーシヨン４へ移動すると、そこでは冷却部材で冷
却されることにより試料媒体にハイブリダイゼーシヨン
条件が課せられる。しかしながら、当分野で習熟した者
は塩濃度を変える手段が熱制御手段に容易に取つて代わ
り得ることを認めるであろう。こうして、標的ポリヌク
レオチドは第１および第２プローブと複合体を形成し、
さらに第１プローブのホモポリマーデオキシアデノシン
（dA）尾部が回収可能支持体のデオキシチミジン（dT）
ホモポリマーとハイブリダイズする。 ステーシヨン４からステーシヨン５へ収納容器は移動
し、そこで回収可能な支持体が磁性部材を活性化するこ
とにより収納容器の壁に固定化される。ポリスチレンビ
ーズを磁性ビーズの代わりに使用する場合、ポリスチレ
ンビーズは過または密度差により固定化されるであろ
う。試料媒体は大部分の無関係のDNA、RNA、可溶化剤、
細胞物質および不純物を保有し、廃棄される。固定化さ
れた回収可能支持体は無関係のDNA、RNA、可溶化剤、細
胞物質および不純物をさらに除くために洗浄される。 さらに、回収可能支持体は反応容器の壁に固定化され
るように例示されているが、磁性部材により回収可能支
持体を反応容器から取り出して、反応容器の壁に非特異
的に結合しやすい無関係のDNA、RNA、可溶化剤および細
胞物質を含む第１の反応容器を処分することもできる。 回収可能支持体は同一の収納容器か又は新たな収納容
器中の第２媒体に添加される。第２媒体中に回収可能支
持体を含む収納容器はステーシヨン６に送られる。 ステーシヨン６において、第２媒体は加熱部材を含む
適当な手段で変性条件に至らせる。この変性工程は回収
可能支持体の（dT）ホモポリマーから標的−第１および
第２プローブ複合体を遊離させる。無関係のDNA、RNA、
不純物および細胞物質を含む可能性のある第１支持体は
第２媒体から除去する。その後バツクグラウンド支持体
を第２媒体と接触せしめ、ステーシヨン７へ送る。 ステーシヨン７で第２媒体は冷却部材によりハイブリ
ダイゼーシヨン温度にする。バツクグラウンド支持体は
第２プローブに担持されたリガンドと特異的に結合しう
る第２抗リガンドを含む。例えば、制限するものではな
いが、第２プローブの末端ヌクレオチドは第２支持体に
担持されたホウ酸成分と特異的に結合するリボ誘導体と
して合成される。プローブ−標的複合体の一部として標
的に結合した第２プローブは、立体障害のために第３支
持体に担持されたホウ酸と結合しないだろう。しかしな
がら、未結合の第２プローブはホウ酸支持体と特異的に
結合するだろう。また、第２プローブは第２支持体上の
デオキシグアニン（dG）ホモポリマーリンカーと結合す
るデオキシシトシン（dC）のようなホモポリマーを含み
うる。ホモポリマーの長さは、標的−第１および第２プ
ローブと第２支持体との複合体が不安定であるが、第２
プローブ単独と第２支持体との複合体が反応パラメータ
ー内で安定であるように考案される。実際、未結合第２
プローブに対するバツクグラウンド支持体のバツクグラ
ウンド捕獲結合は不可逆的である。 次に、第２媒体およびバツクグラウンド支持体を含む
収納容器はステーシヨン８に搬送され、ここで標的−プ
ローブ複合体に結合していない第２プローブ鎖を有する
バツクグラウンド支持体が第２媒体から分離される。バ
ツクグラウンド支持体の分離により、媒体から非特異的
なバツクグラウンドノイズが除かれる。 先に述べたように、バツクグラウンド捕獲はビーズ上
で実施される。しかしながら、当分野で習熟した者は、
臨床試料からの標的−第１および第２プローブ複合体の
初期精製により全部または大部分の固体砕片が除かれ、
第２媒体が通過するフイルターまたは膜支持上にバツク
グラウンドが捕獲されることを認めるであろう。 ステーシヨン８から、バツクグラウンドの低減した標
的−プローブ複合体を含む精製媒体はステーシヨン９へ
送られる。ステーシヨン９で、加熱部材によりハイブリ
ダイゼーシヨン温度にした第２媒体を第３支持体（膜ま
たはフイルターとして図示される）と接触させる。第３
支持体は第１プローブの第１リガンド成分と結合する第
１抗リガンド成分を含有する。従つて、第１プローブの
第１リガンド成分がデオキシアデノシン（dA）のホモポ
リマーである場合、第３支持体はデオキシチミジン（d
T）のホモポリマーを含む。先に述べたように、第３支
持体は第２媒体が通過し得るフイルターまたは膜である
が、ビーズや粒子も使用できる。第３支持体は標的−第
１および第２プローブ複合体をさらに濃縮するのに役立
ち、そして第３支持体と特異的に結合しないバツクグラ
ウンドおよび妨害物質をさらに低減せしめる。ステーシ
ヨン10へ移ると、第３支持体は標的−第１および第２プ
ローブ複合体を濃縮し、それにより第２プローブに担持
された標識成分の検出が可能となる。 本発明は以下の一般方法および好適な態様の特徴を例
示する以下の実施例においてさらに詳述される。 I.方法 A.物質 全ての試薬は分析用またはそれ以上のものであつた。
BIO−MAGという商標名で市販されている官能性アミノ基
含有磁性ビーズはアドバンスト・マグネチツクス社（M
A.ケンブリツジ）から入手した。 本実施例において、全ての標識ヌクレオチドはニユー
イングランド・ヌクレアーから入手した。酵素ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（TDT）
はライフ・サイエンス社（フロリダ州セントピータース
バーグ）から入手した。オリゴヌクレオチドpdT10はフ
アーマシアPLバイオケミカルズから入手した。 B.プローブの合成 一般なプロトコールおよび方法を以下に説明する。第
６図を参照されたい。２つのプローブはスパイサー（Sp
icer.E.K.）およびノーブル（J.A.Noble）、J.of Biolo
gical Chem.257,55716〜55751（1982）に記載される構
築マツプ（第６図）に従つて、大腸菌（Escherichia co
li）のエンテロトキシン遺伝子elt A1のセンス鎖（sens
e strand）に構築された。 １組のプローブはその遺伝子配列の483位から始まつ
て30ヌクレオチド長だけ延びるように合成され、以後A4
83プローブと名づけた。第２プローブはその遺伝子配列
の532位から始まつて30ヌクレオチド長だけ延びるよう
に合成され、以後これをA532プローブと名づけた。第３
プローブはその遺伝子配列の726位から始まつて39ヌク
レオチド長だけ延びるように合成され、以後これをA726
プローブと名づけた。特定の塩基配列（５′→３′）を
以下の表Ｉに示す：上記プローブは当分野で利用し得る方法により合成され
た。ナンバリング方式はインテリジエネテイクス・シー
クエンス・バンクECO ELT A1から入手し得る768ヌクレ
オチド配列から適応させた。 プローブA726の３′末端の10個のＧ残基のうち、５′
末端へ向かう３個のグアニン塩基はトキシン遺伝子の３
個の相補的なシトシン塩基と結合することができる。３
個の連続したシトシンはDNA中に普通に見られる。10個
のグアニン塩基はオリゴdC−セルロースのような支持体
に担持されたポリＣ抗リガンドと結合し得るリガンドを
形成する。しかしながら、７個のグアニン塩基は37℃
で、特にプローブが標的と結合している場合は、立体障
害および標的−プローブ複合体の大きさのために、支持
体と安定な会合を形成しないだろう。プローブA726はタ
ーミナルトランスフエラーゼを用いてその３′末端へ約
３個の32P−dCおよび32P−dG残基をランダム付加するこ
とにより修飾した。 当分野で習熟した者は、他のプローブを別の標的分子
に対して容易に合成し得ることを認めるであろう。 C.調製 実施例１、２および３の標的はエンテロトキシン遺伝
子elt A1である。エンテロトキシン遺伝子elt A1はスタ
ンフオード大学から入手したプラスミドEWD−299の一部
として保有される。 実施例１において、エンテロトキシン産生菌をルリア
培地中で対数期まで増殖させた。その細菌を溶解し、プ
ラスミドEWD−299を単離した。プラスミドEWD−299は制
限酵素Xba IおよびHind IIIで消化した。475塩基長のフ
ラグメントを標的として使用し、１％アガロースゲルか
ら電気溶出により精製した。捕獲工程の効率を追跡する
ために、フラグメントは酵素ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて製造者の指示に従つて32P−ATPで５′末端標識
した。 実施例２および３では、エンテロトキシン産生菌およ
び野生型エンテロトキシン非産生大腸菌JM83を別々に対
数期まで増殖させた。野生型大腸菌は対照として役立
つ。エンテロトキシン産生菌と野生菌の抽出物は、カオ
トロピズム溶液中で細胞を実質上可溶化することにより
別々に調製した。こうして、ルリア培地中の細菌培養物
を5M濃度の固体グアニジニウムチオシアネート（GuSC
N）、0.3M濃度のトリス−HCl、および0.1濃度のEDTA（p
A7）に添加した。その後カオトロピズム−細菌溶液は10
0℃で５分間加熱し、冷却した。得られたエンテロトキ
シン産生菌抽出物は野生型エンテロトキシン非産生菌抽
出物で段階的に希釈した。細胞当たりのtoxプラスミド
の濃度および抽出物中の細胞数は慣用技法で測定した。
GuSCN中で可溶化したもとの抽出物は約109個/mlのエン
テロトキシン産生大腸菌および細胞当たり100個のプラ
スミドを含んでいた。 D.ビーズの合成 回収可能な支持体は磁性ビーズから製造した。他の回
収可能支持体には粒子、繊維、ポリスチレンビーズまた
は媒体から物理的に分離し得る他の物品が含まれる。磁
性ビーズは10塩基長のデオキシチミジンの付加物をもつ
ように合成され、その結果ビーズはデオキシアデノシン
を尾部に付加したプローブと容易に可逆的な方法で会合
することができる。 従つて、BIO−MAG（M4100）ビーズのようなアミン官
能基をもつビーズ100mlは４個の275ml Tフラスコ中で20
mMリン酸ナトリウム（pH6.7）により４回洗浄した。そ
の後ビーズは20mMリン酸ナトリウム中の１％グルタルア
ルデヒドで洗浄した。次いで、ビーズは20mMリン酸ナト
リウム（pH6.7）中の10％グルタルアルデヒド100mlと室
温で３時間反応させた。その後ビーズは20mMリン酸ナト
リウム（pH6.7）で十分に洗浄し、次に20mMリン酸塩（p
H7.6）で一回洗浄した。 別個に、精製したpdT10のエチレンジアミン（EDA）付
加物（EDA−dT10）をチュー（Chu,B.C.F.）、ウオール
（G.M.Wahl）、およびオーゲル（L.E.Orgel）、Nucleic
Acid Res.11,6513〜6529（1983）（参照によりここに
引用される）に従つて製造した。EDA−dT10の濃度は20m
Mリン酸塩（pH7.6）中10D/mlに調整した。 EDA−dT10は磁性ビーズの遊離アルデヒド基と反応さ
せるために磁性ビーズと混合した。EDA−dT10とビーズ
の混合物は複数の50mlポリプロピレン製チユーブに分割
して入れた。反応混合物とビーズを含むチユーブは回転
器の中に置き、室温で一晩撹拌した。 次に、ビーズは大型の275ml Tフラスコ中で滅菌20mM
リン酸塩（pH6.7）の洗液により５回洗浄して非共有結
合したEDA−dT10を除き、その洗液で希釈して200mlとし
た。 貯蔵のために、ビーズは20mMリン酸塩緩衝液（0.1％
アジ化ナトリウムおよび0.1％SDSを含む）中で数ケ月間
保存できる。ビーズ調製物は光を遮断して４℃で保存さ
れる。 その後、ビーズは非特異的結合部位を遮断するため
に、0.75Mリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.5％ラウロイ
ルサルコシンナトリウム、10μg/ml大腸菌DNA、0.5mg/m
lウシ血清アルブミン（BSA）（ヌクレアーゼ不含）およ
び5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）から成る緩衝液
（以後“プレハイブリダイゼーシヨン緩衝液”と呼ぶ）
中でプレハイブリダイゼーシヨンを行つた。標的捕獲法
でプローブとビーズを使用する前に、ビーズのプレハイ
ブリダイゼーシヨンを２回実施した。そのプレハイブリ
ダイゼーシヨン法はビーズを10倍容量のプレハイブリダ
イゼーシヨン緩衝液中に入れることを包含していた。 第１のプレハイブリダイゼーシヨン法は撹拌しながら
60℃で行つた。第２のプレハイブリダイゼーシヨン法は
渦巻きを起こさせながら室温で実施した。この溶液には
0.1％のイソアミルアルコールを消泡剤として添加し
た。 dT10−付加ビーズの結合能は次の方法により測定し
た。別々の容器中で、dT50およびdA50はそれぞれ32P−d
Tおよび32P−dAを用いて約106dpm/μｇの比活性（Sa）
になるまで５′末端標識した。次に、既知量の反応した
dT50のSaをトリクロロ酢酸沈降により正確に測定した。 次いで、100,000〜200,000dpm/mgの実質的に同一のSa
をもつ32P−dA50 5μｇおよび32P−dT50 5μｇはプレハ
イブリダイゼーシヨン緩衝液を含むチユーブに別々に加
えて1mlの容量とした。 プレハイブリダイズしたビーズはその既知試料容量を
４個のチユーブに入れた。４個のチユーブのうち２個は
それぞれ0.5mlの32P−dA50混合物を添加し、残りの２個
のチユーブはそれぞれ0.5mlの32P−dT50混合物を添加し
た。４つの溶液すべてはハイブリダイゼーシヨン条件に
５分間おいた。その後ビーズを固定化して洗浄し、次に
溶液の比活性を測定した。マイクログラムで測定した一
定量のビーズ調製物の総結合能Ｃは次式で表される： Ｃ＝Ｖ（Ａ−Ｔ）/X 上記式中Ｘは32P−dT50の比活性（cpm/mg）であり、
Ｖは全容量対試料容量の容量比であり、Ａは32P−dA溶
液中に懸濁したビーズの平均活性（cpm）であり、そし
てＴは32P−dT溶液中に懸濁したビーズの平均活性（cp
m）である。 当分野で習熟した者は他のビーズ、粒子、フイラメン
トなどを他のヌクレオチドコポリマーまたはホモポリマ
ーと共に使用できることを認めるであろう。例えば、ポ
リＡ付加ビーズは（精製したdT10のEDA付加物の代わり
に）20mMリン酸ナトリウム（pH 7.6）50ml中にポリＡ
（MW＞100,000）100mgを含有する溶液を使用することに
より製造された。 E.標的捕獲法 ビーズ調製物は標的ポリヌクレオチドを捕獲するため
に使用した。回収可能な支持体および可逆的捕獲を証明
する一般的な実験標的捕獲法を以下に説明するが、例示
目的のために（制限するものではない）第１プローブA4
83および第２プローブA532を使用してその捕獲法を論じ
るであろう。第１プローブA483は32P−dCTPおよび32P−
dGTPを用いて約1010dpm/mgの比放射能へランダムに３′
末端標識した。第２プローブA532は酵素ターミナルトラ
ンスフエラーゼを用いて約70個の末標識dA残基を尾部に
付加した。 まず初めに、標識プローブA483 200μg/mlと尾部付
加プローブA532 400μg/mlは、いろいろな量のエンテ
ロトキシン遺伝子の熱変性した475mer Xba I−Hind III
制限フラグメントと1.4M塩化ナトリウム中65℃で15分間
混合した。 次に、標的捕獲は標的とプローブ成分を含む媒体を、
dT10−磁性ビーズ（磁性ビーズに対する非特異的結合を
減じるためのプレハイブリダイゼーシヨン後に３μg/ml
のdA50結合能をもつビーズ）のアリコートと接触させる
ことにより開始した。磁性ビーズとプローブ−標的複合
体は5mlポリプロピレンチユーブ中でプレハイブリダイ
ゼーシヨン緩衝液0.1mlと共に室温で２〜５分間インキ
ユベーシヨンした。 チユーブはコーニング（Corning）チユーブ磁気分離
機に配置した。コーニングチユーブ磁気分離機は活性化
されると、ポリプロピレンチユーブを通して磁場を印加
し、その磁場により磁性ビーズがチユーブ内壁に固定化
される。磁性ビーズがポリプロピレンチューブの側壁に
固定化されているうちに、もとの媒体を取り出して捨て
た。 固定化されている間に、ビーズは消泡剤としてイソア
ミルアルコールを含むプレハイブリダイゼーシヨン緩衝
液0.6mlずつで３回洗浄した。プレハイブリダイゼーシ
ヨン緩衝液の添加後、チューブを磁場から移動させ、そ
の媒体を激しく渦巻き混合することによりビーズを再懸
濁させた。 次に、磁場を再度印加してビーズを固定化させ、プレ
ハイブリダイゼーシヨン緩衝液を捨てた。プレハイブリ
ダイゼーシヨン緩衝液の添加、ビーズの再懸濁、ビーズ
の固定化、およびプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液の
除去から成るサイクルは２回繰り返した。ビーズに保持
された標的−プローブ複合体は検出、バツクグラウンド
捕獲または更なる標的捕獲サイクルの追加工程を含めた
その後の処理のために利用可能である。 好適な標的捕獲法は標的−プローブ複合体の放出およ
び第２支持体への再捕獲を包含する。好ましくは、その
支持体は第１支持体と化学的に異なるものである。 標的−プローブ複合体の放出は次の一般方法により行
われる。最後のプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液の除
去後、ビーズを含むチユーブにプレハイブリダイゼーシ
ヨン緩衝液を加えた。ビーズは撹拌下に60℃で１〜２分
間インキユベーシヨンして、ビーズからプローブ−標的
複合体を放出させた。温度を60℃に維持したままで再び
磁性分離機を活性化させ、遊離の標的−プローブ複合体
を含む溶出液をチユーブから分離した。その溶出液は別
の回収可能支持体上に再捕獲されるか、または通常の支
持体上での最終捕獲に付される。当分野で習熟した者
は、標的−プローブ複合体の回収可能支持体（例えば本
実施例の磁性ビーズ）への捕獲およびその支持体からの
放出がハイブリダイゼーシヨンのバツクグラウンドを低
下させるために所望回数反復し得ることを認めるであろ
う。 標的−プローブ複合体の最終捕獲は、一般にdT−3000
を非特異的に結合させた又は共有結合させたニトロセル
ロースフイルターまたはナイロン膜上で実施された。従
つて、磁性ビーズに担持された標的−プローブ複合体
は、そのビーズをプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液中
60℃で２分間加熱することにより、磁性ビーズから放出
させた。ビーズを固定化し、溶出液を分離し、0.2ミク
ロンのアクロデイスク（ゲルマン社製）に通して磁性微
粒子を除去した。dT−3000を保有するニトロセルロース
フイルターは未標識プローブ上のdA尾部を選択し、結合
し、捕獲した。 標的−プローブ複合体の最終捕獲のために化学的に異
なる支持体を使用すると、前に使用した支持体に対して
高い親和力を有するバツクグラウンド分子の結合が回避
される。例えば、特定の支持体に対してもともと高い親
和力を有する低レベルの汚染物質は、支持体と繰り返し
結合してプローブ標的複合体と共に溶出されやすい。こ
のような低レベル汚染物質は非常に異なる組成の支持体
にそれらをさらすのと同程度に完全には同じ組成の回収
可能支持体の反復使用により希釈されない。低レベル汚
染物質はまた化学的に異なる手段を用いて標的−プロー
ブ複合体を支持体から放出させ、再捕獲することにより
減少させることができる。 F.バツクグラウンド捕獲法 バツクグラウンド捕獲法はバツクグラウンドノイズを
選択的に減少させて、標的の存在を示す真の信号の検出
を可能にする。バツクグラウンド捕獲は単一プローブ系
または２以上のプローブを使用する系に適用できる。例
えば、単一プローブを特徴とするバツクグラウンド捕獲
法において、そのプローブは標識成分とリガンドを含
む。プローブは標的と結合することができ、リガンドは
プローブが標的と結合していない時だけ支持体と安定し
た結合を形成することができる。 同様に、例えば、標的捕獲と関連して複数のプローブ
を特徴とするバツクグラウンド捕獲は２つのプローブを
含む。第１の標的捕獲プローブ（第１支持体と結合し得
る未標識リガンドを含む）は標的を捕獲するために使用
され、そして第２のバツクグラウンド捕獲プローブ（検
出可能ナ標識成分を含む）は第２バツクグラウンド支持
体と結合し得る第２リガンドを有する。バツクグラウン
ド捕獲は検定の信号対ノイズのデータを高めるための標
的捕獲に対する価値ある補足的方法である。 第１の標的捕獲プローブA532および第２のバツクグラ
ウンド捕獲プローブA726ならびに標的エンテロトキシン
遺伝子elt A1を使用する代表的なバツクグラウンド捕獲
法について以下に説明する。当分野で習熟した者は、証
明のために使用されるプローブが単に選択の問題である
にすぎないことを認めるであろう。他のプローブも当然
使用できる。 プローブA532は初期標的捕獲のために磁性ビーズに共
有結合されたdT10および最終標的捕獲のためにニトロセ
ルロースに非特異的に結合されたdT3000と可逆的に結合
しうる約100個のdA残基をその尾部に有していた。プロ
ーブA726はターミナルトランスフエラーゼを用いてその
３′末端に約３個の32P−dCおよび32P−dG残基をランダ
ム付加することにより標識した。プローブA726はそのプ
ローブが標的とハイブリダイズしない場合にdC−セルロ
ースと結合できる。 標的−第１および第２プローブ複合体を含有し且つ未
結合第２プローブを含む可能性のある溶液はdC−セルロ
ースと混合し、その混合物の温度を37℃に維持した。こ
の温度（37℃）はオリゴdCとdG7の解離温度よりも高
く、標的−第１および第２プローブ複合体のdC−セルロ
ースへの結合を防止する。この温度はまたオリゴdCとdG
10の解離温度よりも低く、dG尾部をもつ未結合第２プロ
ーブのdC−セルロースへの結合を促進する。さらに、標
的−第１および第２プローブ複合体は未結合第２プロー
ブよりもdC−セルロース支持体へのその接近において著
しく立体的に妨害される。第２プローブA726を含むdC−
セルロースは遠心により除かれるが、当業者は過のよ
うな他の方法も同様に使用できることを認めるであろ
う。残留溶出液は標的−第１および第２プローブ複合体
と濃度の低下した未結合標識第２プローブA726を含有す
る。 G.実施例 当分野で習熟した者は、回収可能支持体の製造、プロ
ーブの製造、標的捕獲およびバツクグラウンド捕獲のた
めの一般方法が特別な要求および目的に合うように変更
しうることを認めるであろう。以下の実施例は特に指定
しない限り上記に概略した一般的方法を包含する。 実施例 1. 磁性ビーズを使用する標的捕獲および検定 標的捕獲検定は２種のプローブと回収可能な磁性ビー
ズ支持体を用いて実施した。標的はエンテロトキシン産
生遺伝子elt A1のXba I−Hind IIIフラグメントを含ん
でいた。第１プローブは磁性ビーズ支持体のdT10残基と
結合しうる130個の非標識dA残基を尾部に付加したA532
30merオリゴヌクレオチドプローブであつた。第２プ
ローブは第１プローブのハイブリダイゼーシヨン位置か
ら20ヌクレオチド下流で同じ標的に結合し得るA483 30
merオリゴヌクレオチドプローブであつた。その第２プ
ローブは30merオリゴヌクレオチドに32P−dCTPおよび32
P−dGTPを末端付加して1010dpm/μｇの比放射能とする
ことにより標識した。 末端付加した第１プローブと標識した第２プローブは
1.4M塩化ナトリウム中でtox遺伝子の熱変性した457mer
制限フラグメントの可変量と65℃にて15分間インキユベ
ーシヨンした。非特異的に結合するバツクグラウンド対
照として、末端付加第１プローブと標識第２プローブは
標的の不在下に同一の溶液中でインキユベーシヨンし
た。特異的に結合する対照として、さらに２つの反応混
合物を調製した。第１の反応混合物は末端付加第１プロ
ーブと非標識第２プローブを含み、４μｇの変性大腸菌
DNAとインキユベーシヨンした。第２の反応混合物は末
端付加第１プローブと標識第２プローブを含み、標的DN
A不含の同一反応混合物中で10μｇの変性ヒトDNAとイン
キユベーシヨンした。 15分のハイブリダイゼーシヨン期間後、試料は0.75M
リン酸塩緩衝液（pH6.8）0.7ml中でdT−付加磁性ビーズ
と５分間インキユベーシヨンした。その後ビーズは磁気
的に固定化して前述の如く十分に洗浄した。標的−プロ
ーブ複合体は0.20Mリン酸塩緩衝液（pH6.8）0.6ml中60
℃でビーズから溶出した。第１群のビーズをその溶出液
および標的−プローブ複合体から分離した。第２群の磁
性ビーズを溶出液に添加し、結合条件に至らしめて標的
−プローブ複合体を再度捕獲させた。第２群のビーズを
洗浄し、標的をビーズから再溶出して、溶出液からビー
ズを分離した。 第３群のビーズは標的−プローブ複合体を含む溶出液
に加え、結合条件下に置いてビーズにもう一度標的−プ
ローブ複合体を捕獲させた。その後ビーズを十分に洗浄
し、前述の如く標的をビーズから溶出した。ビーズをそ
の溶出液から分離し、溶出液は2mm四方のスロツト中のd
T3000−ナイロン膜を通して標的−プローブ複合体を捕
獲させた。 dT3000ナイロン膜はハイブリ−スロツト装置（hybri
−slot apparatus;ベトレスダ・リサーチ・ラボラトリ
ー）を使用して２μｇのdT3000をナイロンに共有結合さ
せることにより作つた。簡単に述べると、dT3000（ライ
フ・サイエンス社製）は無塩トリス緩衝液中でGene−Sc
reenTm（ニユーイングランド・ヌクレアー社製）のよう
なナイロン膜上に直接点在させた。その膜を室温で10分
間乾燥し、次に赤外線ランプの下でさらに10分間乾燥し
た後、さらに10分間室温へ冷却した。ナイロン膜を備え
たフイルター装置はUV−トランスイルミネーター（フオ
トダイン社製）上で上下逆にし、40uW/cm2で２分間UV光
線に露光してdT3000をフイルターに架橋させた。 dT3000膜は次の溶液をこの膜に順次通すことによりプ
レハイブリダイズさせた： （１） １％SDS; （２） 0.5％SDS中の0.5mg/ml BSA;および最後に （３） プレハイブリダイゼーシヨン緩衝液 標的−プローブ複合体を含む可能性のあるdT3000−ナイ
ロン膜は0.2Mリン酸ナトリウムおよび5mM EDTAで洗浄し
た。このナイロン支持体は第２プローブの32P標識成分
の存在についてオーデイオラジオグラフイーで一晩監視
した。オーデイオラジオグラフイー後、バンドをフイル
ターから切り取つてベースシンチレーシヨン液体中で計
数した。tox遺伝子を含む制限フラグメント３フエムト
モル（10-15モル）を含有する溶液では2100および1400c
mpのカウント数であつた。tox遺伝子を含む制限フラグ
メント30アトモル（10-18モル）を含有する試料は62cpm
のカウント数であつた。 DNAを含まない第３試料は7cpmであつた。10μｇの熱
変性したヒトDNAを含有する第４試料は0cpmであつた。
４μｇの熱変性した大腸菌DNAを含有する第５試料は7cp
mであつた。この検定法の絶対感度は10-18モルのtox遺
伝子であると推定された。標識された標的−プローブ複
合体の全回収効率はインプツト（投入量）の１〜２％で
あると推定された。この検定法は良好な特異性を立証し
た。DNAを全く含まない試料中に標識プローブが存在し
ないのと同様に、ヒトDNAまたは大腸菌DNAを含む試料中
にも標識プローブは存在しない。実験プロトコールを繰
り返すことにより、約５％の全標的捕獲効率が得られ
た。この方法はハイブリダイズされない標識プローブの
初期レベル1011モルから約104モルへバツクグラウンド
を減少させた。バツクグラウンドの減少は捕獲効率の減
少を十分以上に補償する７ログ（log）の改善を示す。 実施例 2. 本実施例はバツクグラウンド捕獲と共に標的捕獲を特
徴とする。標的およびバツクグラウンド捕獲は標的捕獲
の処で述べた非標識の第１標的捕獲プローブA532、およ
び標識された第２バツクグラウンド捕獲プローブA726を
使用して行つた。 まず初めに、160ng/mlのdA−末端付加A532と40ng/ml
の32P−標識プローブA726を混合してプローブ混合物を
調製した。このプローブ混合物を可変量のエンテロトキ
シン産生遺伝子を含む細菌抽出物５μに加えた。抽出
物−プローブ混合物は22℃で15分間インキユベーシヨン
した。 15分のハイブリダイゼーシヨン期間後、試料を10倍容
量のプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液で希釈し、0.75
Mリン酸塩緩衝液（pH6.8）0.7ml中でdT−付加磁性ビー
ズと共に５分間インキユベーシヨンして標的捕獲を行つ
た。ビーズを磁気的に固定化して十分に洗浄した。標的
−第1/第２プローブ複合体を前述の如く第１支持体から
溶出し、第１支持体を除去した。 次に、標的−第1/第２プローブ複合体を含みまた未結
合の第２プローブを含む可能性のある溶出液はdC−セル
ロースと混合し、混合物の温度を37℃に維持した。この
温度（37℃）はオリゴdCとdG7の解離温度よりも高く、
そのために標的−第1/第２プローブ複合体がdC−セルロ
ースに結合するのを防止する。この温度はまたオリゴdC
とdG10の解離温度よりも低く保たれ、そのためにdG10尾
部をもつ未結合第２プローブがdC−セルロースに結合す
るのを促進する。標的−第1/第２プローブ複合体はdC−
セルロース支持体への接近において未結合第２プローブ
よりも著しく立体的に障害を受ける。dC−セルロースは
遠心により分離されたが、当業者は過のような他の方
法も同様に使用しうることを認めるであろう。 残存する溶出液は0.2ミクロンのアクロデイスク（ゲ
ルマン社製）を通して磁性微粒子およびセルロース微粒
子を除去した。その後、溶出液は22℃でdT3000を含むニ
トロセルロースフイルターに通した。ニトロセルロース
により最終標的捕獲を実施した。 下記の表２はバツクグラウンド捕獲の適用を示す： 1cpm以下にノイズを減少させることにより、試料中の極
少量の標的を検出することができる。 10-18モル程度に少ない量（これは臨床用途に必要と
される範囲内である）の標的も検出された。 １ラウンドの標的捕獲は約３ログのバツクグラウンド
を除去した。１ラウンドのバツクグラウンド捕獲は、初
回の標的捕獲で除去されなかつたバツクグラウンドを１
ログ減少させた。過による最終標的捕獲（第２ラウン
ドの標的捕獲）は、初めの２工程のどちらによつても除
去されなかつたバツクグラウンドを２ログ減少させた。
標的およびバツクグラウンド捕獲法は独立して作用し、
本実施例ではバツクグラウンドを約６ログまで減少させ
た。バツクグラウンド捕獲は、第１回目の標的捕獲後に
行う場合、よりよく作用すると思われる。明らかに、バ
ツクグラウンド捕獲は標的捕獲よりも試料中の不純物に
対してより一層感受性である。 標的捕獲後にバツクグラウンド捕獲を併用すること
は、いずれか一方の単独使用に比べてより大きな利点を
もたらす。 上記実施例は放射性標識成分について詳述したもので
あるが、本方法は非放射性標識成分を使用する検定法に
対して多大な影響を及ぼしうることが期待される。特
に、本方法は螢光剤や化学ルミネツセンス剤のような発
光標識成分に適用されるだろう。適当な螢光標識には、
例えばフルオロセイン、ピレン、アクリジン、スルホロ
ーダミン、エオシン、エリスロシンおよびそれらの誘導
体が含まれるが、これらに限定されない。適当な化学発
光剤には、例えばミクロペルオキシダーゼ、ルミノー
ル、イソルミノール、グルコースオキシダーゼ、アクリ
ジニウムエステルおよびそれらの誘導体が含まれる。 実施例 3. 以下の実施例は非放射性標識成分およびスパイクした
（spiked）生物学的媒体からの多重ラウンドの標的捕獲
を特徴とする。スパイクした生物学的媒体は医療現場で
臨床的に得られる試料と似ている。 エンテロトキシン産生大腸菌および野生型大腸菌の細
胞抽出物は前述のように調製した。臨床現場に類似した
環境におけるtox遺伝子の検出感度を測定するために、
トキシン産生菌の抽出物は前述の如く野生型大腸菌の抽
出物で希釈した。 次の物質は匿名の提供者から得られた：すなわちヒト
大便試料、牛乳、ヒト唾液、ヒトたん、ヒト全血、ヒト
血清、ヒト尿およびヒト精液。これらの臨床型試料は10
分間にわたり可溶化した。大便試料は固体であるために
5M GuSCN、0.3Mトリス−HCl（pH7.4）、0.1M EDTA（pH
7）、１％β−メルカプトエタノールの溶液中で可溶化
した。可溶化後、試料のアリコートを作り、各アリコー
トは既知量のトキシン産生大腸菌または野生型大腸菌の
いずれかでスパイクした。この混合物はその後粗過
（crude filtration;バイオラツド・エコノカラム）に
通して100℃で５分間加熱した。 残りの試料はその性状がより液状であつたので大便と
は異なる方法で処理した。液状試料を固体のGuSCNに加
えて最終濃度を5Mとした。固体のGuSCNはまた大便の場
合と同じ最終濃度とするために、十分量のトリス−HC
l、EDTAおよびβ−メルカプトエタノールを含んでい
た。次に試料のアリコートを作り、各アリコートは既知
量のトキシン産生大腸菌または野生型大腸菌でスパイク
した。この混合物は粗過に通し、100℃で５分間加熱
した。 実施例３のプローブの作製は前の実施例と相違してい
る。第１捕獲プローブはプラスミドpBR322を用いて作製
された。このプラスミドはHha IおよびHae IIIで制限
し、プラスミドフラグメントの末端にターミナルトラン
スフエラーゼを用いて約100個のdA残基を付加した。標
的プラスミドはpBR322と広範囲にわたつて相同である
（スパイサーおよびノーブル、JBC257、5716〜5721を参
照）。こうして、第１捕獲プローブは比較的大量にプラ
スミドpBR322の両鎖の多数のフラグメントから作製され
た。 第２標識プローブは標的エンテロトキシン遺伝子と特
異的に結合するように作られた。第２標識プローブはバ
クテリオフアージM13mp18にクローニングされたelt A1
遺伝子のEcoR I−Hind III制限フラグメントから作製さ
れた。大腸菌HB101にバクテリオフアージを感染させ、
中間対数期まで増殖させた。大腸菌を収獲し、バクテリ
オフアージを単離した。バクテリオフアージはベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズから入手しうるストツク・
ニツク−トランスレーシヨン・キツトを用いてビオチニ
ル化dCTP（エンゾ・バイオケミカルズ社製）でニツク−
トランスレーシヨンを行つた。約５％のヌクレオチドが
ビオチニルヌクレオチドで置換されて、ビオチン標識第
２プローブを形成した。 プローブ混合物は20mMトリス−HCl（pH7.4）および2m
M EDTA中で８μg/mlの第2M13−toxプローブと４μg/ml
の第1dA付加プローブとを混合することにより調製し
た。このプローブ混合物は100℃で10分間加熱してプロ
ーブを変性させた。 １容量のプローブ混合物は希釈段階の１容量の試料と
混合してハイブリダイゼーシヨン混合物を調製した。ハ
イブリダイゼーシヨン混合物はハイブリダイゼーシヨン
条件下に57℃で15分間維持した。その後、このハイブリ
ダイゼーシヨン混合物は10容量の遮断緩衝液（0.75Mリ
ン酸ナトリウム、pH8、0.5％ウラリルサルコシンナトリ
ウム、10mg/ml大腸菌DNA、0.5mg/mlウシ血清アルブミン
（BSA;ヌクレアーゼ不含）およびmM EDTA）で希釈し
た。このハイブリダイゼーシヨン混合物に前述の如く製
造したdT10付加磁性ビーズを加えた。ハイブリダイゼー
シヨン条件を22℃で約１分間維持した。その後、ビーズ
を磁気的に固定化することにより、ハイブリダイゼーシ
ヨン混合物から分離した。ビーズは15分の間に２回洗浄
して生物学的試料中の不純物とハイブリダイズされなか
つたビオチン標識第２プローブを除去した。 次に、約１分間で、第1/第２プローブ−標的複合体を
遮断緩衝液中65℃で磁性ビーズから溶出した。溶出液と
第１ビーズを分離した。 約７分間で、第1/第２プローブ−標的複合体は第２群
のビーズに可逆的に結合させ、その後再び解離させた。
第２群のdT10付加ビーズを希釈溶出液に加え、ハイブリ
ダイゼーシヨン条件を22℃で約１分維持した。その後ビ
ーズを洗つて遮断緩衝液中に再懸濁した。そのビーズ遮
断緩衝液混合物を65℃に高めて第1/第２プローブ−標的
複合体を放出させた。 ５分間にわたり、ニトロセルロース上で第1/第２プロ
ーブ−標的複合体の最終捕獲を実施した。第２ビーズか
らの溶出液はゲルマン・アクロデイスク（0.2ミクロ
ン）を通過させた。その後、dT3000ニトロセルロースフ
イルター（遮断緩衝液でプレハイブリダイズしたもの）
に22℃で第1/第２プローブ−標的複合体含有溶出液を通
過させた。 約30分間で、フイルターは第２プローブのビオチン標
識を検出すべくさらに処理した。検出に使用した緩衝液
の組成を以下の表３に示す。 まず初めに、第1/第２プローブ−標的複合体を保有す
るフイルターは検出緩衝液No.2中で約５分間インキユベ
ーシヨンした。次に、フイルターは検出緩衝液No.1a中
のストレプトアビジン−アルカリ性ホスフアターゼ（ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）の1:200希釈物中
で５分間インキユベーシヨンした。その後、フイルター
は検出緩衝液No.1で１分間に３回洗浄し、次いで検出緩
衝液No.3で１分間に２回洗浄した。 次に、５−ブロム−４−クロル−３−インドリルホス
フエート（BCIP）およびニトロブルーテトラゾリウム
（NBT）（キールケガード・アンド・ペリー社製）を検
出緩衝液No.3で12倍に希釈し、0.2ミクロンのアクロデ
イスクを通して過した。希釈したBCIP/NBT溶液をフイ
ルターに加え、37℃で15分間発色させた。 次に、フイルターは50mMトリス−HCl（pH7.4）および
10mM EDTA中で１分間インキユベーシヨンして反応を停
止させた。感度はフイルター上で視覚的に、またはCS93
0（島津サイエンテイフイツク社製）でデンシトメータ
ー走査することにより測定した。 本法の工程を以下の表４に示す。 表４は経過時間が１時間を越える例を説明したが、本
法は変更が可能であり、より短い時間で行うことができ
る。匹適する感度の非放射性プローブ検定は12時間〜７
日を要し、大量の試料調製物を必要とする。 本検定法の感度を以下の表５に示す。 本法は感度を改善するためにさらに改変することがで
きる。例えば、多段捕獲放出サイクルにおいて熱溶出お
よび化学的溶出を併用することにより、単一溶出、多段
熱溶出単独または多段化学的溶出単独に比べて信号対ノ
イズの比が５倍以上高まるであろう。 同じ放出法または溶出法を使用すると、支持体から同
じバツクグラウンドを放出させる傾向がある。しかしな
がら、異なる放出条件を使用すると、他の方法では溶出
されやすいバツクグラウンドが支持体に保持される傾向
がある。バツクグラウンドは２つの物理的または化学的
に異なる条件下で標的に対して全く同様にふるまうとは
考えられない。 磁性ビーズ上の標的−プローブ複合体の代表的な化学
溶出法は、ビーズを3M GuSCNと室温で１分間接触させる
ことである。熱溶出の例は先に説明した。 細菌を検出する能力はまたプローブをリボソームRNA
配列に向けることにより改善されるであろう。リボソー
ムRNA配列はゲノムDNAや臨床上重要なプラスミドDNAと
比較したとき細胞当たりの標的の1000倍増加を与える。 こうして、本発明は標的捕獲およびバツクグラウンド
減少ならびにアフイニテイ検定を実施するための装置を
特徴とする。好適な実施態様を例示し説明してきたが、
本発明は変更および修飾が可能であり、従つて説明した
細部に限定されるべきでなく、特許請求の範囲に含まれ
るこのような変更および修飾も本発明に包含されるべき
である。
【図面の簡単な説明】
第1a図および第1b図は本発明の好適な検定法の手順を示
す模式図である。 第2a図および第2b図は本発明の多重プローブ検定法の手
順を示す模式図である。 第３図は第2a図および第2b図に示した本検定法の変法を
示す模式図である。 愛４図は本検定法を実施するための装置を示す模式図で
ある。 第５図はプローブ合成のための構築マツプを示す模式図
である。
す模式図である。 第2a図および第2b図は本発明の多重プローブ検定法の手
順を示す模式図である。 第３図は第2a図および第2b図に示した本検定法の変法を
示す模式図である。 愛４図は本検定法を実施するための装置を示す模式図で
ある。 第５図はプローブ合成のための構築マツプを示す模式図
である。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．試料中の標的核酸を試料中の非標的核酸から分離す
る方法であって、 （ａ） 試料を、標的と結合してプローブ−標的複合体
を形成するが非標的核酸と結合しない第１の核酸プロー
ブを含む試薬と接触させ； （ｂ） 工程（ａ）の試料を、プローブ−標的複合体の
第１の核酸プローブと結合する支持体と接触させ； （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｄ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｅ） 標的を、支持体および結合した第１の核酸プロ
ーブから放出させ；そして （ｆ） 支持体および結合した第１の核酸プローブを、
標的が第２の媒体中に残るように第２の媒体から実質的
に分離する； の各工程を含む方法。 ２．支持体が、試料および第２の媒体のそれぞれに実質
的に分散している、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 ３．支持体がビーズを含む、特許請求の範囲第１項に記
載の方法。 ４．ビーズが磁性である、特許請求の範囲第３項に記載
の方法。 ５．さらに、 （ａ） 前記第２の媒体を、標的と結合してプローブ−
標的複合体を形成する追加の第１の核酸プローブと接触
させ； （ｂ） 第２の媒体を、プローブ−標的複合体の第１の
核酸プローブと結合する追加の支持体と接触させ；そし
て （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
実質的に分離する； の各工程を含む、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ６．さらに、 （ａ） 前記支持体および結合したプローブ−標的複合
体を第３の媒体と接触させ； （ｂ） 標的を、支持体および結合した第１の核酸プロ
ーブから放出させ；そして （ｃ） 支持体および結合した第１の核酸プローブを第
３の媒体から実質的に分離する； の各工程を含む、特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．支持体が、試料ならびに第２および第３の媒体中に
実質的に分散している、特許請求の範囲第６項に記載の
方法。 ８．支持体が磁性ビーズを含む、特許請求の範囲第７項
に記載の方法。 ９．さらに、標的捕獲および放出の少なくとも１つの追
加のサイクルを含む、特許請求の範囲第６項に記載の方
法。 １０．試料中の標的核酸の存在を検出する方法であっ
て、 （ａ） 試料を、標的と結合してプローブ−標的複合体
を形成する第１の核酸プローブを含む試薬と接触させ； （ｂ） 工程（ａ）の試料を、プローブ−標的複合体の
第１の核酸プローブと結合する支持体と接触させ； （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｄ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｅ） 標的を、支持体および結合した第１の核酸プロ
ーブから放出させ； （ｆ） 支持体および結合した第１の核酸プローブを、
標的が第２の媒体中に残るように、第２の媒体から実質
的に分離し；そして （ｇ） 第２の媒体中に存在する標的の存在を検出す
る； の各工程を含む方法。 １１．標的核酸について試料を検定する方法であって、 （ａ） 試料を、標的と結合してプローブ−標的複合体
を形成する第１の核酸プローブおよび少なくとも１つの
第２の核酸プローブを含む試薬と接触させ； （ｂ） 工程（ａ）の試料を、プローブ−標的複合体の
第１の核酸プローブと結合する支持体と接触させ； （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｄ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｅ） プローブ−標的複合体を第２の媒体中に放出さ
せ； （ｆ） 支持体を第２の媒体から実質的に分離し；そし
て （ｇ） プローブ−標的複合体を、標的の存在を示す第
２の核酸プローブの存在について監視する； の各工程を含む方法。 １２．前記第２の核酸プローブが標識を含む、特許請求
の範囲第11項記載の方法。 １３．支持体が前記試料および前記第２の媒体中に実質
的に分散している、特許請求の範囲第11項に記載の方
法。 １４．前記支持体がビーズを含む、特許請求の範囲第11
項に記載の方法。 １５．前記ビーズが磁性である、特許請求の範囲第14項
に記載の方法。 １６．さらに、 （ａ） 第２の媒体を、プローブ−標的複合体の第１の
核酸プローブと結合する追加の支持体と接触させ；そし
て （ｂ）前記支持体および結合したプローブ−標的複合体
を前記第２の媒体から実質的に分離する； の各工程を含む、特許請求の範囲第11項に記載の方法。 １７．さらに、 （ａ） 前記支持体および結合したプローブ−標的複合
体を第３の媒体と接触させ； （ｂ） プローブ−標的複合体を第３の媒体中に放出さ
せ；そして （ｃ） 前記支持体を前記第３の媒体から実質的に分離
する； の各工程を含む、特許請求の範囲第16項に記載の方法。 １８．追加の支持体が、第２の媒体および第３の媒体の
それぞれに実質的に分散している、特許請求の範囲第17
項に記載の方法 １９．さらに、プローブ−標的複合体の捕獲および放出
の追加のサイクルを含む、特許請求の範囲第17項に記載
の方法。 ２０．試料中の標的核酸を試料中の非標的核酸から分離
するためのキットであって、前記分離プロセスは、 （ａ） 試料を、標的と結合してプローブ−標的複合体
を形成するが非標的核酸と結合しない第１の核酸プロー
ブを含む試薬と接触させ； （ｂ） 工程（ａ）の試料を、プローブ−標的複合体の
第１の核酸プローブと結合する支持体と接触させ； （ｃ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｄ） 支持体および結合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｅ） 標的を、支持体および結合した第１の核酸プロ
ーブから放出させ；そして （ｆ） 支持体および結合した第１の核酸プローブを、
標的が第２の媒体中に残るように、第２の媒体から実質
的に分離する； の各工程を含む方法により実施され、前記キットは、 （ｉ） 標的と結合してプローブ−標的複合体を形成す
るが非標的核酸には結合しない第１の核酸プローブを含
む試薬； （ii） プローブ−標的複合体の第１の核酸プローブと
結合する支持体；および （iii） 標的を第１の核酸プローブおよび支持体から
放出させるための試薬； を含むキット。 ２１．第２の媒体中に存在する標的の存在を検出するた
めの試薬をさらに含む、特許請求の範囲第20項記載のキ
ット。 ２２．第２の媒体中に存在する標的の存在を検出するた
めの第２のプローブをさらに含む、特許請求の範囲第20
項記載のキット。 ２３．試料中の標的核酸の存在を検出する方法であっ
て、 （ａ） 試料を、標的と結合して支持体および会合した
プローブ−標的複合体を形成する第１の核酸プローブに
会合した支持体を含む試薬と接触させ； （ｂ） 支持体および会合したプローブ−標的複合体を
試料から実質的に分離し； （ｃ） 支持体および会合したプローブ−標的複合体を
第２の媒体と接触させ； （ｄ） 標的を支持体から、および会合した第１の核酸
プローブを第２の媒体から放出させ； （ｅ） 支持体および会合した第１の核酸プローブを、
標的が第２の媒体中に残るように、第２の媒体から実質
的に分離し；そして （ｆ） 第２の媒体中に存在する標的の存在を検出す
る； の各工程を含む方法。 ２４．支持体がビーズを含む、特許請求の範囲第23項記
載の方法。
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