ES2319380T3 - Determinacion de secuencias de acido nucleico usando la deteccion electronica. - Google Patents

Abstract

Composición que comprende: a) un primer ácido nucleico de cadena sencilla que comprende una primera porción de transferencia de electrones (ETM) con un primer potencial redox; y b) un segundo ácido nucleico de cadena sencilla que comprende un segundo ETM con un segundo potencial redox; en la que el primer y segundo ácidos nucleicos son sustancialmente complementarios al mismo dominio de una secuencia diana y en la que el primer y segundo potenciales redox son diferentes.

Description

Determinación de secuencias de ácido nucleico usando la detección electrónica.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para el uso de monocapas autoensambladas para detectar electrónicamente ácidos nucleicos, particularmente alteraciones, tales como sustituciones de nucleótidos (apareamientos erróneos) y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP).

Antecedentes de la invención

La detección de ácidos nucleicos específicos es una herramienta importante para la medicina de diagnóstico y la investigación en biología molecular. Actualmente, los ensayos de sondas génicas desempeñan papeles en la identificación de organismos infecciosos, tales como bacterias y virus, en el sondaje de la expresión de genes normales y mutantes y en la identificación de genes mutantes tales como oncogenes, en el tipado tisular para determinar la compatibilidad antes de un trasplante de tejido, en el emparejamiento de muestras de tejido o de sangre para la medicina forense y para explorar la homología entre genes de diferentes especies.

Idealmente, un ensayo de sonda génica debería ser sensible, específico y fácil de automatizar (para un revisión, véase Nickerson Current Opinion in Biotechnology 4: 48-51 (1993)). La necesidad de sensibilidad (es decir, bajo límite de detección) se ha mitigado enormemente por el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras tecnologías de amplificación que permiten a los investigadores amplificar exponencialmente una secuencia de ácido nucleico específica antes del análisis (para una revisión, véase Abramson et al., Current Opinion in Biotechnology, 4: 41-47 (1993)).

La especificidad, al contrario, continúa siendo un problema en muchos ensayos de sondas génicas disponibles en la actualidad. El grado de complementariedad molecular entre sonda y diana define la especificidad de la interacción. Las variaciones en la concentración de sondas, de dianas y de sales en el medio de hibridación, en la temperatura de reacción y en la longitud de la sonda pueden alterar o influir en la especificidad de la interacción sonda/diana.

En algunas circunstancias puede ser posible diferenciar dianas con una complementariedad perfecta de dianas con apareamientos erróneos, aunque generalmente esto es muy difícil usando la tecnología tradicional, puesto que pequeñas variaciones en las condiciones de reacción alterarán la hibridación. Las nuevas técnicas experimentales para detección de apareamientos erróneos con sondas convencionales incluyen ensayos de ligación de ADN, en los que apareamientos erróneos puntuales impiden la ligación, y ensayos de digestión de sondas, en los que los apareamientos erróneos generan sitios para la escisión de las sondas.

Recientemente se ha centrado la atención en el análisis de la relación entre las variaciones genéticas y el fenotipo, haciendo uso de marcadores polimórficos de ADN. Los trabajos anteriores utilizaban repeticiones cortas en tándem (STR) como marcadores polimórficos de posición; sin embargo, recientemente se ha centrado la atención en el uso de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), que aparecen a una frecuencia media de más de 1 por kilobase en ADN genómico humano. Algunos SNP, particularmente los que están dentro y alrededor de secuencias codificantes, es probable que sean la causa directa de variantes fenotípicas terapéuticamente relevantes y/o predisposición a enfermedades. Existen varios polimorfismos bien conocidos que causan fenotipos clínicamente importantes; por ejemplo, las variantes apoE2/3/4 se asocian con un riesgo relativo diferente de Alzheimer y otras enfermedades (véase Cordor et al., Science 261 (1993)). Se ha demostrado que la amplificación por PCR múltiple de loci de SNP con la posterior hibridación con matrices de oligonucleótidos es un procedimiento preciso y fiable de genotipado simultáneo de al menos cientos de SNP; véase Wang et al., Science, 280: 1077 (1998); véase también Schafer et al., Nature Biotechnology 16: 33-99 (1998). Las matrices de la técnica anterior pueden sustituirse fácilmente por las composiciones de la presente invención.

Existen una diversidad de técnicas particulares que se usan para detectar secuencias, incluyendo mutaciones y SNP. Éstas incluyen, pero sin limitación, OLA (así como una variación, amplificación de círculo rodante), Invader^{TM}, procedimientos de extensión de una sola base, PCR de alelos y análisis de sondas competitivo (por ejemplo, secuenciación competitiva por hibridación; véase a continuación).

La amplificación de ligación de oligonucleótidos ("OLA", a veces denominada en este documento reacción de ligación en cadena (LCR)) implica la ligación de dos sondas más pequeñas en una sola sonda larga, usando la secuencia diana como molde. Véanse en general las Patentes de Estados Unidos Nº 5.185.243, 5.679.524 y 5.573.907; documentos EP 0 320 308 B1; EP 0 336 731 B1; EP 0 439 182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696; WO 97/31256 y WO 89/09835.

Una variación de la OLA que también puede usarse para el genotipado se denomina "amplificación de círculo rodante". La amplificación de círculo rodante utiliza una sola sonda que hibrida en una diana, de modo que tras la ligación de los dos extremos terminales de la sonda, se forma una sonda circular. Se añade un cebador y una polimerasa, de modo que se extiende la secuencia cebadora. Puesto que la sonda circular no tiene extremos terminales, la polimerasa extiende la sonda circular de forma repetida, dando como resultado concatámeros de la sonda circular. De este modo, la sonda se amplifica. La amplificación de círculo rodante se describe en general en Baner et al., (1998) Nuc. Acids Res. 26: 5073-5078; Barany, F. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193; Lizardi et al. (1998) Nat. Genet. 19: 225-232; Zhang et al., Gene 211: 277 (1998); y Daubendiek et al., Nature Biotech. 15-273 (1997).

La tecnología de Invader^{TM} se basa en nucleasas específicas de estructura que escinden ácidos nucleicos de una forma específica de sitio. Se usan dos sondas: una sonda "invasora" y una sonda "de señalización", que hibridan de forma adyacente con una secuencia diana con un solapamiento no complementario. La enzima escinde en el solapamiento debido a su reconocimiento de la "cola" y libera la "cola" con un marcador. Después, ésta puede detectarse. La tecnología de Invader^{TM} se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.846.717; 5.614.402; 5.719.028; 5.541.311; y 5.843.669.

También pueden usarse para el genotipado procedimientos de extensión de una sola base. La extensión de una sola base utiliza una polimerasa y dNTP marcados de forma diferencial; véanse los documentos WO 92/15712, EP 0 371 437 B1, EP 0317 074 B1; Pastinen et al., Genome Res. 7: 606-614 (1997); Syvänen, Clinica Chimica Acta 226: 225-236 (1994); y WO 91/13075).

Un procedimiento adicional es la PCR de alelos. Como se describe en Newton et al., Nucl. Acid Res. 17: 2503 (1989), que se incorpora expresamente en este documento como referencia, la PCR de alelos permite la discriminación de una sola base en base al hecho de que la reacción de PCR no se desarrolla bien si el nucleótido 3' terminal está apareado erróneamente, asumiendo que la ADN polimerasa que se esté usando carezca de una actividad de corrección de errores exonucleasa 3'.

Las solicitudes PCT WO 95/15971, PCT/US96/09769, PCT/US97/09739, PCT US99/01705, WO96/40712 y WO98/20162 describen nuevas composiciones que comprenden ácidos nucleicos que contienen porciones de transferencia de electrones, incluyendo electrodos, que permiten nuevos procedimientos de detección de la hibridación de ácidos nucleicos.

El documento WO 98/20162 describe ácidos nucleicos acoplados covalentemente a electrodos a través de oligómeros conductores. Se describe la modificación selectiva de ácidos nucleicos con porciones de transferencia de electrones y electrodos para producir biomateriales.

El documento WO 98/31839 describe una técnica para inmovilizar moléculas biológicas, en particular cadenas de ácido nucleico. Las moléculas biológicas inmovilizadas en superficies pueden usarse en técnicas de detección de transferencia de electrones, en las que un compañero de unión de una molécula biológica se aproxima a la molécula biológica inmovilizada en superficie, se genera un potencial eléctrico entre las dos especies que se unen biológicamente y se determina la transferencia de electrones a través de las especies.

El documento WO 98/57159 describe la detección de analitos diana usando técnicas electrónicas, particularmente técnicas de CA.

El documento WO 96/40712 describe la modificación covalente selectiva de ácidos nucleicos con porciones con actividad redox, tales como complejos de metales de transición. Las porciones donadora de electrones y aceptora de electrones se unen covalentemente a la estructura de ribosa-fosfato de un ácido nucleico en posiciones predeterminadas.

Brown et al. (1994) New Journal of Chemistry Vol. 18 (3), págs. 317-326, describe marcadores organometálicos para secuenciación y cartografiado del ADN, en particular el uso de derivados de ferroceno electroquímicamente detectables.

El documento WO 99/67425 describe composiciones y procedimientos útiles en la aceleración de la unión de analitos diana a ligandos de captura en superficies, particularmente el uso de una porción de transferencia de electrones (ETM) que está asociado con el analito diana.

El documento WO 99/57319 describe la detección electrónica de ácidos nucleicos usando monocapas autoensambladas.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos para determinar la secuencia de ácidos nucleicos utilizando la detección electroquímica.

Descripción resumida de la invención

De acuerdo con los objetos anteriores, la presente invención proporciona composiciones como se definen en las reivindicaciones.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona procedimientos como se definen en la reivindicaciones para determinar la identificación de un nucleótido en una posición de detección en una secuencia diana.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1R representan varias composiciones diferentes para el uso en la invención; los resultados se muestran en los Ejemplos 1 y 2 del documento PCT US99/01703. La Figura 1A representa I, también denominada P290. La Figura 1B representa II, también denominada P291. La Figura 1C representa III, también denominada W31. La Figura 1D representa IV, también denominada N6. La Figura 1E representa V, también denominada P292. La Figura 1F representa II, también denominada C23. La Figura 1G representa VII, también denominada C15. La Figura 1H representa VIII, también denominada C95. La Figura 1I representa Y63. La Figura 1J representa otro compuesto para el uso en la invención. La Figura 1K representa N11. La Figura 1L representa C131, con un grupo fosforamidita y un grupo protector DMT. La Figura 1M representa W38, también con un grupo fosforamidita y un grupo protector DMT. La Figura 1N representa la porción disponible en el mercado que permite que se produzca una "ramificación", ya que su incorporación en una cadena oligonucleotídica en crecimiento da como resultado la adición en ambos oxígenos protegidos con DMT. La Figura 1O representa glen, también con un grupo fosforamidita y un grupo protector DMT, que sirve como enlazador que no es de ácido nucleico. Las Figuras 1A a 1G y 1J se muestran sin los grupos fosforamidita y protector (es decir, DMT) que se añaden fácilmente.

Las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D representan varios ejemplos comparativos para detección de apareamientos erróneos usando temperatura. La Figura 2 representa el uso de un electrodo (105) con una monocapa autoensamblada (15), que comprende agentes de pasivación y una sonda de captura (20) unida a través de un enlazador de unión (10). La sonda de captura (20) tiene una posición de interrogación (25), que puede comprender un apareamiento erróneo con la posición de detección en la secuencia diana (120). La Figura 2A representa la secuencia diana (120) que comprende los ETM (135); la Figura 2B representa el uso de una sonda marcadora (40) con los ETM (135). Como apreciarán los especialistas en la técnica, también pueden usarse sondas de amplificación, sondas extensoras marcadoras, etc. La Figura 2C utiliza una sonda marcadora (40) con la posición de detección (25). De nuevo, también pueden usarse sondas de amplificación, sondas extensoras marcadoras, etc. La Figura 2D utiliza una sonda extensora de captura (45) que comprende la posición de interrogación (25).

Las Figuras 3A y 3B representan dos realizaciones de la invención de "competímeros". En la Figura 3A, se muestra el uso de un competímero para determinar apareamientos perfectos. Se muestra un sustrato 1 con dos electrodos (105); al primero está unida una sonda de captura que comprende una posición de interrogación (25) que no se aparea con la posición de detección (121) de la diana (120). La otra sonda de captura tiene una posición de interrogación (25) que se aparea perfectamente con la posición de detección de la diana. En ausencia del competímero, la secuencia diana:sonda de captura imperfecta es lo bastante estable para existir. Sin embargo, en presencia del competímero (50), la diana se libra del apareamiento imperfecto a favor de la unión del competímero. En la Figura 3B, la secuencia diana (120) que comprende la posición de detección (121) hibrida con una sonda extensora de captura (45) con una posición de interrogación (25), que no se aparea perfectamente con la posición de detección. La sonda extensora de captura (45) hibrida con la sonda de captura (20) unida a través de un enlazador de unión (10). La adición de un competímero (50) con la posición de interrogación (25) que ahora se aparea perfectamente con la posición de interrogación (25), expulsa la diana unida de forma imperfecta con su sonda marcadora unida (145). La Figura 3C es similar a la 3B, excepto por que la posición de detección está dentro de la secuencia de reconocimiento de la sonda marcadora.

La Figura 4 representa los resultados de la curva de Tm del Ejemplo 2.

La Figura 5 representa algunos resultados del Ejemplo 4. Después de que el oligonucleótido mixto (de tipo silvestre y mutante) esté en lugar del tampón de oligonucleótido de tipo silvestre, la hibridación con apareamientos erróneos (círculos oscuros) se reemplaza por una hibridación con apareamiento perfecto (círculos blancos).

La Figura 6 representa algunos resultados del Ejemplo 5.

La Figura 7 representa un conjunto de cebadores anidados para una reacción de PCR/APCR.

Las Figuras 8A, 8B y 8C representan algunas composiciones de disulfuro útiles. La Figura 8A representa una clase general, la Figura 8B representa dos realizaciones que se usaron para generar los datos que se muestran en la Figura 8C.

Las Figuras 9A, 9B, 9C, 9D, 9E, 9F y 9G representan la síntesis de algunas composiciones de disulfuro. La Figura 9A representa la síntesis general; siendo R, R' y R'' derivados aromáticos o alquilo C1 a C20 y siendo B cualquier base tal como HaOH, KOH, LiOH o MOR, siendo M un metal. La Figura 9B muestra la síntesis de H-fosfonato, las Figuras 9C y 9D muestran la síntesis del derivado con CPG, y la Figura 9E muestra la síntesis del aislante. Las 9F y 9G representan algunas composiciones de disulfuro cíclicas.

La Figura 10 representa la configuración "en forma de gemelo".

Las Figuras 11A y 11B describen una representación esquemática de la formación de electroconductos usando especies escindibles, incluyendo fotoescindibles y escindibles químicamente. La Figura 11B representa una realización preferida.

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La Figura 12 representa una adición posterior a la síntesis de marcadores detectables, en este caso ETM, a ácidos nucleicos.

Las Figuras 13A y 13B representan el uso de porciones de marcaje que comprenden ETM y un oligómero conductor, para la asociación con o la unión al electrodo. Estas realizaciones utilizan tioles para la unión, aunque como apreciarán los especialistas, la porción dependerá de la superficie. R puede ser hidrógeno o un grupo protector.

La Figura 14 representa un esquema sintético para las porciones de marcaje de la Figura 13.

Las Figuras 15A y 15B representan otra reacción posterior a la síntesis para la unión de marcadores detectables, en esta realización ETM, a ácidos nucleicos.

La Figura 16 representa la reacción de desplazamiento para reemplazar una SAM por otra.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de determinación de la secuencia de un ácido nucleico diana en una posición particular, usando la detección electroquímica en un electrodo. Preferiblemente, la invención incluye la detección (y opcionalmente la cuantificación) de diferencias o variaciones de secuencias (por ejemplo SNP) usando matrices de electrodos para la detección de la variación.

Como se sabe en la técnica, existen varias técnicas que pueden usarse para detectar o determinar la identidad de una base en una localización particular en un ácido nucleico diana, incluyendo, pero sin limitación, el uso de temperatura, hibridación competitiva de sondas perfectas e imperfectas con la secuencia diana, secuenciación mediante síntesis, por ejemplo, usando técnicas de extensión de una sola base (a veces denominada "minisecuenciación"), la reacción de amplificación de oligonucleótidos de la ligasa (OLA), amplificación de círculo rodante (RCA), PCR de alelos, hibridación competitiva y tecnologías Invader^{TM}. Además, la presente invención se refiere a una nueva invención que aprovecha nuevas propiedades de matrices unidas a superficie y usa "competímeros" para reducir la unión inespecífica.

Todas estas técnicas dependen de la formación de complejos de ensayo en una superficie, frecuentemente un electrodo, como resultado de la hibridación de una secuencia diana (la secuencia diana de la muestra o una secuencia generada en el ensayo) con una sonda de captura en la superficie. Como se describe más completamente en este documento, ésta puede ser una hibridación directa o indirecta (por ejemplo, mediante el uso de sistemas de tipo sándwich). El complejo de ensayo comprende además al menos una porción de transferencia de electrones (ETM), que también está unido directa o indirectamente a la diana. Una vez que se forman los complejos de ensayo, se detecta la presencia o ausencia de los ETM como se describe a continuación y en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.591.578; 5.824.473; 5.770.369; 5.705.348 y 5.780.234; documentos U. S. S. N. 08/911.589; 09/135.183; 09/306.653; 09/134.058; 09/295.691; 09/238.351; 09/245.105 y 09/338.726; y solicitudes PCT WO98/20162; WO 00/16089; PCT US99/01705; PCT US99/01703; PCT US00/10903 y PCT US99/10104.

Muchos de estos procedimientos requieren un ácido nucleico cebador (que también puede incluir los marcadores ETM, así como el uso de análogos de ácidos nucleicos) que hibrida con la secuencia diana para formar un complejo de hibridación, y se añade una enzima que modifique de algún modo el cebador para formar un cebador modificado; generalmente, la aparición de la modificación depende de la presencia o ausencia de una secuencia particular, permitiendo de este modo la identificación de secuencia. Por ejemplo, la OLA requiere que hibriden dos cebadores (directamente de forma adyacente o separados por una o más bases) con la secuencia diana y una ligasa; el Invader^{TM} requiere dos cebadores y una enzima de escisión; etc. Por lo tanto, en general, se añade un ácido nucleico diana a una mezcla de reacción que comprende los componentes de amplificación necesarios, y se forma un cebador modificado, que después se detecta como un indicio de que está o no presente la variación, o se consulta para determinar la identidad de la base en la posición de interés.

En general, el cebador modificado se incorpora en un complejo de ensayo que comprende un marcador, tal como una porción de transferencia de electrones (ETM), que se incorpora mediante una enzima, presente en el cebador original, o que se añade mediante una sonda marcadora. Según sea necesario, los cebadores sin reaccionar pueden retirarse de una diversidad de formas, como apreciarán los especialistas en la técnica, aunque en muchas realizaciones esto no es necesario. Después, opcionalmente, el complejo de hibridación se disocia y el cebador modificado se añade a un electrodo como se describe en general en este documento y en las solicitudes mencionadas. Habitualmente, los electrodos comprenden sondas de captura que hibridarán con los cebadores modificados aunque, como se describe en este documento, pueden usarse una diversidad de configuraciones, incluyendo ensayos de tipo sándwich. La detección se desarrolla a través de la detección del marcador ETM como un indicio de la presencia, ausencia o cantidad de la secuencia diana.

Los procedimientos de la invención encuentran una utilidad particular en ensayos de genotipado, es decir, la detección de nucleótidos particulares en posiciones específicas, aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, no es necesario que se produzca la amplificación y/o cuantificación para realizar el genotipado.

Por consiguiente, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para detectar la presencia o ausencia de secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra como se define en las reivindicaciones. Como apreciarán los especialistas en la técnica, la solución de muestra puede comprender gran cantidad de cosas, incluyendo, pero sin limitación, fluidos corporales (incluyendo, pero sin limitación, sangre, orina, suero, linfa, saliva, secreciones anales y vaginales, sudor y semen de prácticamente cualquier organismo, prefiriéndose las muestras de mamíferos y prefiriéndose particularmente las muestras de seres humanos); muestras ambientales (incluyendo, pero sin limitación, muestras de aire, agrícolas, de agua y suelo); muestras de agentes de guerra biológica; muestras de investigación (es decir, en el caso de ácidos nucleicos, la muestra pueden ser los productos de una reacción de amplificación, incluyendo la amplificación tanto de la diana como de la señal, como se describe en general en el documento PCT/US99/01705, tal como una reacción amplificación por PCR); muestras purificadas, tales como ADN genómico, ARN, proteínas, etc. purificadas; muestras sin procesar (bacterias, virus, ADN genómico, etc.; como apreciarán los especialistas en la técnica, puede haberse realizado prácticamente cualquier manipulación experimental sobre la muestra).

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para detectar la presencia o ausencia de secuencias de ácido nucleico diana en una muestra como se define en las reivindicaciones. Por "ácido nucleico" u "oligonucleótido" o equivalentes gramaticales se entienden en este documento al menos dos nucleótidos unidos covalentemente entre sí. Un ácido nucleico de la presente invención contendrá generalmente enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, como se describe a continuación, se incluyen análogos de ácidos nucleicos que pueden tener estructuras alternativas que comprenden, por ejemplo, enlaces fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49 (10): 1925 (1993) y referencias en el mismo; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487(1986); Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); y Pauwels et al., Chemica Scripta 26: 141 91986)), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991); y la Patente de Estados Unidos Nº. 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989), O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) y estructuras y enlaces de ácidos peptidonucleicos (véase Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380: 207 (1996)). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen los que tienen estructuras positivas (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097 (1995); estructuras no iónicas (Patentes de Estados Unidos Nº 5.386.023. 5.637.684. 5.602.240. 5.216.141 y 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); Capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghul y P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996)) y estructuras no ribosa, incluyendo las descritas en las Patentes de Estados Unidos Nº. 5.235.033 y 5.034.506, y los Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghul y P. Dan Cook. También se incluyen dentro de la definición de ácidos nucleicos los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos (véase Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) págs. 169-176). Se describen varios análogos de ácidos nucleicos en Rawls, C & E News 2 de junio de 1997, página 35. Pueden realizarse estas modificaciones de la estructura de ribosa-fosfato para facilitar la adición de ETM o para aumentar la estabilidad y la vida media de dichas moléculas en entornos fisiológicos.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, todos estos análogos de ácido nucleico pueden encontrar utilidad en la presente invención. Además, pueden realizarse mezclas de ácidos nucleicos de origen natural y análogos; por ejemplo, en el sitio de la unión del oligómero conductor o del ETM puede usarse una estructura análoga. Como alternativa, pueden realizarse mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos y mezclas de ácidos nucleicos de origen natural y análogos.

Se prefieren particularmente ácidos peptidonucleicos (PNA) que incluyen análogos de ácidos peptidonucleicos. Estas estructuras son sustancialmente no iónicas en condiciones neutras, al contrario que la estructura fosfodiéster altamente cargada de los ácidos nucleicos de origen natural. Esto da como resultado dos ventajas. En primer lugar, la estructura del PNA presenta una cinética de hibridación mejorada. Los PNA presentan mayores cambios en la temperatura de fusión (Tm) por apareamientos erróneos frente a pares de bases perfectamente apareadas. Típicamente, el ADN y el ARN presentan una disminución de 2-4ºC en la Tm por un apareamiento erróneo interno. Con la estructura no iónica de PNA, la disminución está más próxima a 7-9ºC. Esto permite una detección mejor de los apareamientos erróneos. De forma similar, debido a su naturaleza no iónica, la hibridación de las bases unidas a estas estructuras es relativamente insensible a la concentración de sal. Esto es particularmente ventajoso en los sistemas de la presente invención, puesto que una solución de hibridación de contenido en sal reducido tiene una corriente faradaica inferior que una solución salina fisiológica (en el intervalo de 150 mM).

Los ácidos nucleicos pueden ser de doble cadena o sencilla, según se especifique, o contener porciones de secuencia tanto doble como sencilla. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, en el que el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos y cualquier combinación de bases, incluyendo, uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantanina hipoxantanina, isocitosina, isoguanina, etc. Una realización preferida utiliza isocitosina e isoguanina en ácidos nucleicos diseñados para ser complementarios a otras sondas, en lugar de secuencias diana, ya que esto reduce la hibridación inespecífica, como se describe en general en la Patente de Estados Unidos Nº 5.681.702. Como se usa en este documento, el término "nucleósido" incluye nucleótidos así como nucleósidos y análogos de nucleótidos y nucleósidos modificados tales como nucleósidos modificados con amino. Además, el término "nucleósido" incluye estructuras análogas de origen no natural. Por lo tanto, por ejemplo, las unidades individuales de un ácido peptidonucleico, conteniendo cada una una base, se denominan en este documento nucleósidos.

Las composiciones y procedimientos de la invención se refieren a la detección de secuencias diana. Las expresiones "secuencias diana" o "ácido nucleico diana" o equivalentes gramaticales en este documento significan una secuencia de ácido nucleico en una sola cadena del ácido nucleico. La secuencia diana puede ser una porción de un gen, una secuencia reguladora, ADN genómico, ADNc, ARN incluyendo ARNm y ARNr, u otras. Como se describe en este documento, la secuencia diana puede ser una secuencia diana de una muestra, o una diana secundaria tal como un producto de una reacción tal como una secuencia de detección de una reacción Invader^{TM}, una sonda ligada de una reacción de OLA, una sonda extendida de una reacción de SBE, etc. Puede tener cualquier longitud, a sabiendas de que las secuencias más largas son más específicas. Como apreciarán los especialistas en la técnica, la secuencia diana complementaria puede adoptar muchas formas. Por ejemplo, puede estar contenida dentro de una secuencia de ácido nucleico de mayor tamaño, es decir, todo o parte de un gen o ARNm, un fragmento de restricción de un ADN plasmídico o genómico, entre otras. Como se describe más completamente a continuación, se generan sondas para hibridar con secuencias diana para determinar la presencia o ausencia de la secuencia diana en una muestra. Hablando en términos generales, los especialistas en la técnica comprenderán este término. La secuencia diana también puede estar compuesta por diferentes dominios diana; por ejemplo, un primer dominio diana de la secuencia diana de muestra puede hibridar con una sonda de captura o una porción de la sonda extensora de captura, un segundo dominio diana puede hibridar con una porción de una sonda amplificadora, una sonda marcadora, o una sonda de captura o extensora de captura diferente, etc. Los dominios diana pueden ser adyacentes o estar separados, según se indique. A menos que se especifique, los términos "primer" y "segundo" no pretenden conferir una orientación a las secuencias con respecto a la orientación 5'-3' de la secuencia diana. Por ejemplo, si se asume una orientación 5'-3' de la secuencia diana complementaria, el primer dominio diana puede localizarse 5' al segundo dominio o 3' al segundo dominio.

Como se describe más completamente a continuación, la secuencia diana comprende una posición para la que se desea información de secuencia, generalmente denominada en este documento "posición de detección". En una realización preferida, la posición de detección es un solo nucleótido, aunque en algunas realizaciones puede comprender una pluralidad de nucleótidos, ya sean contiguos entre sí o separados por uno o más nucleótidos. Por "pluralidad", como se usa en este documento, se entienden al menos dos. Como se usa en este documento, la base que se empareja con la base de la posición de detección en un híbrido se denomina "posición de interrogación".

En una realización preferida, se usan los procedimientos de la invención para detectar patógenos tales como bacterias. En esta realización, las secuencias diana preferidas incluyen ARNr, como se describe en general en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.851.330; 5.288.611; 5.723.597; 6.641.632; 5.738.987; 5.830.654; 5.763.163; 5.738.989; 5.738.988; 5.723.597; 5.714.324; 5.582.975; 5.747.252; 5.567.587: 5.558.990; 5.622.827; 5.514.551; 5.501.951;
5.656.427; 5.352.579; 5.683.870; 5.374.718; 5.292.874; 5.780.219; 5.030.557; y 5.541.308.

Si es necesario, la secuencia diana se prepara usando técnicas conocidas. Por ejemplo, la muestra puede tratarse para lisar las células usando tampones de lisis conocidos, electroporación, etc., con purificación y/o amplificación según sea necesario, como apreciarán los especialistas en la técnica. Se describen técnicas de amplificación adecuadas en el documento PCT US99/01705. Además, también pueden usarse técnicas para aumentar la cantidad o velocidad de hibridación; véase por ejemplo el documento WO 99/67425.

En general, los procedimientos de detección de SNP actuales utilizan una primera etapa de amplificación tal como PCR para amplificar los ácidos nucleicos del paciente. En una realización preferida, una etapa en los procedimientos de la invención incluye una etapa para producir un exceso de una cadena sobre la otra. Como apreciarán los especialistas en la técnica, pueden usarse una diversidad de procedimientos incluyendo, pero sin limitación, una reacción en cadena de la polimerasa asimétrica (APCR), un procedimiento de exonucleasa y la captura de la cadena no diana.

En una realización preferida, se usa la reacción en cadena de la polimerasa asimétrica (APCR) para aumentar la producción del fragmento de ácido nucleico de cadena sencilla usado como la secuencia diana para la detección, según se describe en este documento. Las técnicas de APCR tradicionales producen una tendencia a cadena sencilla mediante el uso de los cebadores en una proporción de 5 a 1, aunque también pueden usarse una diversidad de proporciones que varían de 2:1 a 100:1.

En una realización preferida, se usa un nuevo procedimiento de cebadores anidados para amplificar la muestra del paciente. En esta realización, se consigue un aumento de la producción de diana usando un proceso de dos etapas: una primera etapa de PCR simétrica, usando una proporción de cebadores 1:1, seguida de la adición (preferiblemente en la misma reacción) de una segunda etapa de APCR, usando una proporción de 50:1 (de nuevo, siendo útiles proporciones de aproximadamente 2:1 a más de 100:1). Como alternativa, estas reacciones también pueden realizarse en dos etapas. Se ha demostrado que esto da como resultado un aumento de 3-6 veces por encima de una reacción de APCR de una etapa.

En una realización preferida, la etapa de amplificación asimétrica se realiza usando una exonucleasa que puede degradar selectivamente una cadena. Por ejemplo, la exonucleasa Lambda es una exonucleasa 5' a 3' que digiere selectivamente la cadena fosforilada del ADN bicatenario. Esta cadena puede generarse durante la amplificación cuando uno de los cebadores comprende un grupo fosfato terminal 5'. La incorporación de este cebador fosforilado en el amplicón permite que la exonucleasa lambda digiera específicamente una cadena, dejando como producto un ácido nucleico de cadena sencilla. Como apreciarán los especialistas en la técnica, la reacción de amplificación puede ser cualquier reacción que utilice un grupo fosfato terminal 5'; se describen una diversidad de estas técnicas en el documento WO 99/37819. Las realizaciones preferidas utilizan PCR como la reacción.

En una realización preferida, se realiza una PCR usando un cebador con un marcador de captura para permitir la eliminación de una cadena. Por ejemplo, mediante el uso de un cebador marcado con biotina en la reacción de PCR (u otro procedimiento de amplificación), seguido del uso de una etapa de separación, por ejemplo, la adición de perlas de estreptavidina a la mezcla de reacción a una temperatura elevada, se genera un ácido nucleico de cadena sencilla. Como se sabe en la técnica, pueden usarse gran cantidad de parejas de unión, incluyendo antígenos y anticuerpos; véase por ejemplo la lista del documento WO 98/12430.

Por consiguiente, las composiciones y procedimientos de la presente invención se usan para identificar el nucleótido o nucleótidos en una posición de detección dentro de la secuencia diana, como se define en la reivindicaciones.

En una realización preferida, se usan variaciones en la temperatura para determinar la identidad del nucleótido o nucleótidos de la posición de detección o la presencia de un apareamiento erróneo. Como una cuestión preliminar, se conoce bien el uso de la temperatura para determinar la presencia o ausencia de apareamientos erróneos en híbridos de doble cadena que comprenden una secuencia diana de cadena sencilla y una sonda. Como se sabe en la técnica, pueden aprovecharse las diferencias en el número de enlaces de hidrógeno en función del emparejamiento de bases entre apareamientos perfectos y apareamientos erróneos como resultado de sus diferentes Tm (la temperatura a la que se desnaturaliza el 50% del híbrido). Por consiguiente, un híbrido que comprende una complementariedad perfecta se fundirá a una temperatura superior que uno que comprenda al menos un apareamiento erróneo, siendo iguales todos los demás parámetros. (Debe señalarse que para los fines de la discusión en este documento, todos los demás parámetros (es decir, longitud del híbrido, naturaleza de la estructura (es decir, de origen natural o análogo de ácido nucleico), la composición de la solución de ensayo y la composición de las bases, incluyendo el contenido de G-C, se mantienen constantes). Sin embargo, como apreciarán los especialistas en la técnica, estos factores también pueden variarse y después tenerse en cuenta).

Debe señalarse en este contexto que un "apareamiento erróneo" es un término relativo y pretende indicar una diferencia en la identidad de una base en una posición particular, denominada la "posición de detección" en este documento, entre dos secuencias. En general, las secuencias que difieren de las secuencias de tipo silvestre se denominan apareamientos erróneos. Sin embargo, particularmente en el caso de SNP, puede ser difícil de determinar qué constituye el "tipo silvestre" ya que pueden observarse múltiples alelos relativamente frecuentemente en la población y, por lo tanto, un "apareamiento erróneo" en este contexto requiere la adopción artificial de una secuencia como patrón. Por lo tanto, para los fines de esta invención, se hace referencia a las secuencias en este documento como "apareamiento perfecto" y "apareamiento erróneo"

Los procedimientos y composiciones de la invención tienen una utilidad particular por el hecho de que pueden realizarse ensayos repetidos (es decir, inicio y detección electroquímica de los ETM de los complejos de ensayo) en una sola superficie o matriz. Es decir, los sistemas de detección que dependen de fluorescencia están limitados con frecuencia por el número de veces que puede detectarse un complejo de ensayo, a medida que la fotodecoloración de los elementos fluorescentes usados para la detección se convierte en un problema. Generalmente, sólo se desarrolla un solo ensayo sobre un complejo de ensayo. Por lo tanto, cuando se realiza una detección de apareamientos erróneos usando la temperatura, deben desarrollarse varios ensayos diferentes (es decir, diferentes microplacas) para generar una curva de temperatura. Esto tiene la desventaja de la variabilidad de una microplaca a otra o de un ensayo a otro. Además, los marcadores fluorescentes también proporcionan señales cuando no están unidos a la superficie; por lo tanto, se requiere una etapa de lavado. No obstante, las composiciones de la presente invención, como se definen en las reivindicaciones, permiten la detección repetida; de hecho, como se describe a continuación, cuando se usan sistemas de CA, el complejo de ensayo puede ensayarse cientos o miles de veces para tomar un solo punto de datos; por lo tanto, un solo complejo de ensayo puede ensayarse varias veces, incluyendo a una pluralidad de temperaturas. Esto permite la generación de curvas de cinética de la hibridación, por ejemplo, para generar una curva de temperatura en un solo complejo de ensayo, permitiendo de este modo la detección de apareamientos erróneos. Además, la presente invención permite mediciones a múltiples temperaturas y, por lo tanto, todas las Tm en una matriz pueden ser diferentes. Esto contrasta con los marcadores fluorescentes, en los que todas las Tm en una matriz deben coincidir estrechamente.

Por lo tanto, se describen en este documento procedimientos de generación de curvas de cinética de la hibridación en un ensayo para determinar la presencia de una secuencia diana en una muestra. Por "curva de cinética de la hibridación" se entiende en este documento en general una representación del porcentaje de hibridación de dos ácidos nucleicos frente al tiempo o la temperatura, aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, pueden representarse otras propiedades para generar una curva de cinética. Lo que es importante es que la presente descripción permite que se recojan múltiples puntos de datos a partir de una sola matriz, en una amplia diversidad de condiciones, permitiendo de este modo la generación de información adicional sobre una muestra. Estos procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una matriz con sondas de captura como se describen en este documento. Se forma al menos un complejo de hibridación, que comprende al menos la diana y la sonda de captura. El complejo de hibridación comprende además un marcador, tal como un ETM; esto puede conseguirse de una diversidad de formas, como se describe en este documento, incluyendo el uso de una sonda marcadora o la incorporación del marcador en la propia diana. Por lo tanto, se forma un complejo de ensayo. La detección del marcador (es decir, la presencia de la secuencia diana) se realiza varias veces; es decir, se realizan una pluralidad de mediciones. El procedimiento puede no retirar los marcadores que no sean parte del complejo entre cada medición. Esto puede realizarse en una diversidad de condiciones experimentales diferentes; por ejemplo, las mediciones pueden realizarse a diferentes temperaturas, diferentes concentraciones de reactivo o tampón (por ejemplo, condiciones de rigurosidad crecientes), etc.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, la detección de apareamientos erróneos usando la temperatura puede desarrollarse de una diversidad de formas.

Puede desarrollarse un gradiente de temperatura usando un solo tipo de sonda, a contrastar con el uso de una pluralidad de sondas que estén marcadas con diferentes marcadores detectables, como se describe a continuación.

Es decir, como se muestra en la Figura 2, se forma un híbrido entre una secuencia diana y una sonda secundaria que puede contener un apareamiento erróneo en la posición de detección. Como se describe en la Figura, la sonda secundaria puede ser una sonda de captura (Figuras 2A y 2B), una sonda extensora de captura (2D) o una sonda marcadora (2C). En general, se prefieren sistemas que liberen la diana de la superficie como resultado del apareamiento erróneo (2A, 2B y 2D) puesto que el fondo (por ejemplo, la unión inespecífica) puede disminuir.

Generalmente, los complejos de ensayo se forman a una Tm inferior a la Tm de un híbrido apareamiento erróneo:diana. La temperatura se aumenta lentamente y se toman puntos de datos a una pluralidad de temperaturas (o, como se describe en este documento, a una pluralidad de condiciones diferentes). Por "pluralidad", como se usa en este documento, se entienden al menos dos. En este contexto, las pluralidades preferidas incluyen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más temperaturas diferentes. Los incrementos preferidos son de 5ºC, prefiriéndose de 25ºC, 30ºC, 35ºC, 40ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC y 60ºC. También pueden usarse temperaturas menores, tales como de 10ºC, 15ºC y 15ºC. Las temperaturas pueden abarcar la Tm del híbrido en cuestión, aunque esto puede no ser necesario en algunos casos. Por lo tanto, por ejemplo, si un apareamiento erróneo se funde a 45ºC y un apareamiento perfecto se funde a 55ºC, el desarrollo de los ensayos a 40 ó 45ºC y 50ºC puede diferenciar entre el apareamiento erróneo y el apareamiento.

Además, como apreciarán los especialistas en la técnica, también es posible desarrollar un solo experimento por encima de la Tm del apareamiento erróneo. Es decir, la formación de un complejo de ensayo, según se detecta por la presencia o ausencia de los ETM en un complejo de ensayo como se describe más completamente a continuación, por encima de la Tm del apareamiento erróneo indica que la sonda comprende una complementariedad perfecta en la posición de detección. En una realización preferida, se usan una pluralidad de sondas para identificar la base en la posición de detección. En esta realización, cada sonda diferente comprende un marcador de detección diferente y una base diferente en la posición que hibridará con la posición de detección de la secuencia diana (denominada en este documento posición de interrogación), de modo que se producirá una hibridación diferencial. En esta realización, los ensayos pueden desarrollarse isotérmicamente o en función de la temperatura, como se ha descrito en general anteriormente. Es decir, puesto que todos los demás parámetros son iguales, una sonda perfectamente complementaria será más estable y presumiblemente tendrá una constante de disociación menor que una sonda que comprende un apareamiento erróneo a cualquier temperatura particular. Por consiguiente, mediante el uso de sondas diferentes, cada una con una base diferente en la posición de interrogación y cada una con un marcador diferente, se dilucida la identificación de la base en la posición de detección. Estas diferencias pueden amplificarse mediante el uso de temperaturas diferentes.

Como alternativa, como apreciarán los especialistas en la técnica, puede conseguirse el mismo resultado con un solo marcador ETM y 4 adaptadores de electrodo diferentes. Cada adaptador comprende una sonda de captura con una base diferente en la posición de interrogación. Usando alteraciones en la temperatura o competímeros (como se describen a continuación), puede realizarse la identificación de la base en la posición de detección.

Por lo tanto, la invención proporciona una pluralidad de sondas, cada una con al menos un ETM con un potencial redox único. Esto es análogo a la idea de "dos colores" o "cuatro colores" de la hibridación competitiva, y también es análogo a la secuenciación por hibridación. Por ejemplo, se ha descrito la secuenciación por hibridación (Drmanac et al., Genomics 4: 114 (1989); Koster et al., Nature Biotechnology 14: 1123 (1996); Patentes de Estados Unidos Nº 5.525.464; 5.202.231 y 5.695.940, entre otros).

Como se describe más completamente a continuación, una diversidad de ETM encuentran utilidad en la invención. En la invención, se seleccionan los potenciales redox de los diferentes ETM de modo que sean diferenciables en el sistema de ensayo que se use. Por "potencial redox" (a veces denominado E_{o}) se entiende en este documento el voltaje que debe aplicarse a un electrodo (con respecto a un electrodo de referencia patrón, tal como un electrodo de hidrógeno normal), de modo que la proporción de ETM oxidados y reducidos sea de uno en la solución próxima al electrodo. En una realización preferida, los potenciales redox están separados al menos 100 mV, aunque también pueden usarse diferencias menores que ésta o mayores que ésta, dependiendo de la sensibilidad del sistema, la técnica de medición electroquímica usada y del número de marcadores diferentes usados. En una realización particularmente preferida, se usan derivados de ferroceno; por ejemplo, pueden usarse ETM que comprenden ferroceno sin sustituyentes de anillo o con la adición de amina o una amida, un carboxilato, etc.

En una realización preferida, cada sonda del conjunto de sondas tiene una base diferente en la posición de interrogación y un ETM diferente unido covalentemente. Por lo tanto, pueden usarse conjuntos de dos sondas (por ejemplo, cuando un SNP puede existir como una de dos bases diferentes), tres sondas (cuando un alelo comprende 3 bases diferentes) o cuatro sondas (para determinar la identidad de la base en la posición de detección). Por adición del conjunto de sondas a la secuencia diana y detección de qué ETM está presente, se determina la identidad de la base en la posición de detección.

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En una realización preferida, todas las demás posiciones de las sondas usadas en esta realización son iguales; es decir, en algunas realizaciones, es preferible usar sondas que tengan todos los demás componentes iguales (por ejemplo, tanto la longitud de las sondas como también las bases que no son de interrogación) para permitir una buena discriminación. Esto se prefiere particularmente para el descubrimiento de SNP. En otras realizaciones, puede ser deseable alterar otros componentes para maximizar la discriminación en la posición de detección. En técnicas que dependen de la hibridación competitiva de sondas con apareamiento perfecto y sondas con apareamientos erróneos, pueden usarse una diversidad de técnicas únicas para maximizar la discriminación de las sondas por incorporación de ciertas características en las sondas.

Como una cuestión preliminar, debe seleccionarse la cadena que proporcione la diferencia más favorable para diferencias de Tm; por ejemplo, se seleccionan apareamientos erróneos G/T sobre C/A y G/A sobre C/T. De forma similar, generalmente las realizaciones preferidas utilizan sondas que tienen la base de interrogación en la mitad de la sonda, en lugar de hacia uno de los extremos. Sin embargo, como se describe en este documento, el desplazamiento de la posición de interrogación dentro de la sonda puede usarse para maximizar la discriminación en algunas realizaciones.

Por ejemplo, en una realización preferida, la discriminación de apareamiento perfecto/apareamiento erróneo de las sondas puede mejorarse por modificación de las afinidades de unión de bases en y próximas a la posición con apareamiento erróneo. Por ejemplo, las secuencias que tienen parejas G-C adyacentes a la posición de detección (o a menos de 3 bases) pueden dificultar una buena discriminación de apareamiento/apareamiento erróneo. Mediante la selección de sustituciones en estas áreas se consigue una discriminación mejor. Por ejemplo, esto puede realizarse para desestabilizar el emparejamiento de bases en la posición de detección o, preferiblemente, para estabilizar el emparejamiento de bases en la posición de detección al tiempo que se desestabilizan las pares de bases en las posiciones adyacentes a la posición de detección. Las sustituciones de bases reducen el número de enlaces de hidrógeno a sólo dos enlaces de hidrógeno o menos por par de bases sin alterar la estructura de apilamiento de la doble cadena en la zona. La cantidad de desestabilización dependerá de la naturaleza química de la sustitución, del número de sustituciones y de la posición de las sustituciones con respecto a la posición de detección. La desestabilización local de la cadena tiene que equilibrarse frente a la pérdida de especificidad de la sonda. Estas sustituciones pueden ser de origen natural o análogos de bases sintéticos.

Por ejemplo, los análogos de bases que aumentan la resistencia del emparejamiento de bases incluyen la isodesoxiguanosina (isodG), que se empareja con C, y 5-metil isodesoxicitidina (5-Me-isodC), que se empareja con G.

De forma similar, se conocen análogos de bases que puedan desestabilizar frecuentemente el emparejamiento de bases. Generalmente estos pertenecen a tres categorías. Las bases degeneradas, tales como 2'-desoxiinosina y 2'-desoxinebularina presentan una formación de enlaces de hidrógeno desigual y reducida con todas las bases. Otras bases degeneradas se emparejan solamente con subconjuntos de bases: 6H, 8H-3, 4-dihidropirimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-ona (dP), pares de bases con purinas solamente y pares de bases de 2-amino-6-metoxiamino purina (dK) con pirimidinas solamente. Como alternativa, existen algunas bases universales tales como 3-nitropirrol y 5-nitroindol y presentan una formación de enlaces de hidrógeno desigual y reducida con todas las bases. Además, también pueden usarse bases apareadas erróneamente (de origen natural o análogas) siempre que no sea demasiado desestabilizante.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, estos análogos de bases pueden incorporarse en las sondas o, cuando se utiliza una etapa de amplificación de la secuencia diana, en la diana y/o las sondas.

En una realización preferida, la base de interrogación se cambia por un análogo de base. En algunas realizaciones, el apareamiento erróneo más difícil de discriminar es un apareamiento erróneo G:T o G:U, puesto que la disminución de la Tm es la más pequeña; las parejas G:T y G:U todavía tienen dos enlaces de hidrógeno potenciales. Por lo tanto, cuando el SNP de interés implica por ejemplo una diferencia de G/A, puede ser difícil diferenciar entre éstos. Para aumentar la desestabilización del apareamiento G:T o G:U, pueden usarse bases alternativas. Por ejemplo, se ha descrito que la 2-tiotimida o 2-tiouridina hibridan con A mejor que con T o U, supuestamente porque los los grupos 2-tio no participan en los enlaces de hidrógeno. Véase, por ejemplo, Connolly et al., Nucleic Acid Res. 17: 4957 (1989); Ishikawa et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1: 523 (1991); Kuimelis et al., Nuoleic Acid Res. 22: 1429 (1991). Por lo tanto, la introducción de estas bases tioladas puede estabilizar las parejas A:T o A:dU y desestabilizar los apareamientos erróneos G:T o G:U.

Además, en una realización preferida, la discriminación de las sondas de interrogación puede alterarse por alteración de la longitud de las sondas. Por ejemplo, como se ha indicado anteriormente, ciertos apareamientos erróneos, tales como diferencias de G/A, pueden ser difíciles debido a la estabilidad de los emparejamientos erróneos G/T. Mediante la disminución de la longitud de la sonda patrón de 15-25 pares de bases a 10-15 pares de bases, puede realizarse una discriminación mejorada.

Además, un buen diseño de sondas también puede permitir una discriminación aumentada en la posición de detección. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, los apareamientos erróneos G-T pueden ser los más difíciles de evaluar; por lo tanto, en situaciones en las que debe evaluarse un apareamiento erróneo G-T, pueden usarse sondas más cortas.

De forma similar, la detección de apareamientos erróneos puede maximizarse en formatos de ensayo de tipo sándwich que dependen de complejos de ensayo que comprenden una diana, una sonda de captura y una sonda marcadora. Se observa una discriminación mejor cuando la sonda de captura y la sonda marcadora hibridan en la diana en dominios separados por al menos 2 o más bases. La discriminación puede maximizarse adicionalmente mediante el diseño del sistema de modo que la Tm de la sonda marcadora sea sólo ligeramente superior a la de la sonda de captura.

Además, puede conseguirse una discriminación adicional del sistema a través de la selección del ETM asociado con cada sonda. Es decir, en cualquier sistema de SAM dado, algunos de los ETM se asocian con la SAM mejor que otros. Por lo tanto, cuando es necesaria una discriminación adicional, la selección del ETM en cada sonda puede ayudar. Por ejemplo en algunas monocapas que comprenden aislantes (M44) y oligómeros conductores (H6), la molécula W97 representada en este documento es algo menos estable que N6 sobre la monocapa y este hecho puede aprovecharse.

De forma similar, la longitud de las sondas puede ayudar a la discriminación; generalmente se usan sondas de 15-20, prefiriéndose particularmente de 17 nucleótidos para el genotipado a temperatura ambiente.

Además, el uso de múltiples ETM potenciales permite el control de la expresión génica en sistemas que comparan dos o más muestras. En esta realización, se detecta una selección específica de ácidos nucleicos procedentes de dos o más fuentes diferentes (preferiblemente cuantitativamente) y se compara entre las fuentes con respecto a la abundancia de ácidos nucleicos individuales. En una realización preferida, pueden examinarse ácidos nucleicos (particularmente ARNm) de gran cantidad de organismos o líneas celulares; por ejemplo, pueden compararse células de patologías (por ejemplo, células cancerosas) con células normales. De forma similar, pueden evaluarse los efectos de fármacos, candidatos a fármacos, otros compuestos o condiciones experimentales diferentes: pueden compararse células en presencia y ausencia del compuesto o en condiciones diferentes (cambios en temperatura, pH, etc.). Como alternativa, pueden compararse diferentes muestras biológicas de diferentes localizaciones o momentos: por ejemplo, pueden compararse muestras de agua, suelo, aire, clínicas, tisulares o forenses.

En esta realización, una primera muestra se marca con ETM con un primer potencial redox y una segunda muestra se marca con ETM con un segundo potencial redox. Como se describe en este documento, este marcaje puede realizarse de varias formas. Por ejemplo, los cebadores usados en una etapa de amplificación pueden comprender los ETM. Como alternativa, se usan nucleótidos marcados durante la amplificación. Como alternativa, el uso de cebadores que comprenden "marcadores" que hibridarán con sondas marcadoras; diferentes muestras utilizan diferentes marcadores y, por lo tanto, diferentes sondas de señalización. Las muestras pueden mezclarse y añadirse a una matriz, analizarse en paralelo o en gran cantidad de formatos de ensayo que se conocen en la técnica.

Como se describe en este documento, la identificación del nucleótido en la posición de detección puede realizarse usando procesos enzimáticos que dependen de la complementariedad para desarrollarse. Es decir, varios procesos que se usan en reacciones de amplificación (véase, por ejemplo el documento PCT US99/01705) tales como la tecnología Invader^{TM} u OLA, dependen de una complementariedad perfecta para que se desarrolle la reacción. Mediante el uso de sondas que en la posición de interrogación sean perfectamente complementarias o no a la posición de detección, puede determinarse la identidad de la base en la posición de detección.

Como se describe en este documento, puede usarse la amplificación de ligación de oligonucleótidos (OLA) para determinar la identidad de la base en la posición de detección. Véanse en general las Patentes de Estados Unidos 5.165.243 y 5.573.907; documentos EP 0 320 308 B1; EP 0 336 731 B1; EP 0 439182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696: y WO 89/09835 y U. S. S. N. 60/078.102 y 60/073.011.

Este procedimiento se basa en el hecho de que ciertas enzimas de ligación ligarán dos sondas entre sí si están hibridadas con una cadena diana y si existe una complementariedad perfecta entre las dos bases que se ligan entre sí. Por lo tanto, la secuencia diana comprende un primer dominio diana contiguo que comprende la posición de detección y un segundo dominio diana adyacente a la posición de detección. Es decir, la posición de detección está "entre" la porción del primer dominio diana y el segundo dominio diana. Una primera sonda de ligación hibrida con el primer dominio diana y una segunda sonda de ligación hibrida con el segundo dominio diana. Si la primera sonda de ligación tiene una base perfectamente complementaria a la base de la posición de detección, y la base adyacente en la segunda sonda tiene una complementariedad perfecta con su posición, se forma una estructura de ligación tal que una enzima ligasa ligará las dos sondas entre sí para formar una sonda ligada. Si esta complementariedad no existe, no se forma ninguna estructura de ligación y la enzima ligasa no liga las sondas entre sí en un grado apreciable. Esto puede realizarse usando termociclado, para permitir que la sonda ligada se desnaturalice de la secuencia diana de modo que sirva como molde para reacciones adicionales.

Después, la sonda ligada se detecta como se describe en general a continuación. Como apreciarán los especialistas en la técnica, esto puede producirse de una diversidad de formas. Una de las sondas puede comprender al menos un ETM unido covalentemente y la otra sonda puede comprender una secuencia que se use para hibridar directa o indirectamente (es decir, a través del uso de una sonda extensora de captura) con una sonda de captura en un electrodo. Por lo tanto, sólo si están presentes ambos componentes se generará una señal; esto puede eliminar la necesidad de retirar las sondas no ligadas del sistema. Como alternativa, las sondas no ligadas pueden retirarse o eliminarse por lavado, por ejemplo usando una etapa de unión, etc. Por ejemplo, la sonda de captura puede hibridar con la segunda sonda de ligación o con una primera porción de una sonda extensora de captura. Esta sonda extensora de captura comprende una primera porción que hibrida con la sonda de captura y una segunda porción que hibrida con la segunda sonda de ligación. Se apreciarán otras variaciones por los especialistas en la técnica.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, la reacción de ligación puede realizarse en solución, generando una pluralidad de sondas ligadas. Después, éstas pueden añadirse a un electrodo de detección como se describe en este documento; de nuevo, estos procedimientos utilizan la separación del marcador ETM y las secuencias de captura en sondas diferentes. Por lo tanto, las sondas no ligadas que comprenden el ETM no serán capturadas en la superficie. Como alternativa, la reacción puede realizarse en una superficie, con la captura de la secuencia diana y, después, el reclutamiento de la sonda que comprende el marcador (o una sonda a la que se unirá una sonda marcadora) en la secuencia diana. Generalmente, este procedimiento utiliza una etapa térmica para expulsar las sondas no ligadas, de modo que sólo las sondas ligadas más largas permanecerán en la superficie. De forma similar, la propia sonda de captura puede usarse como una sonda de ligación, comprendiendo su extremo terminal la posición de detección. Tras la adición de la secuencia diana y una segunda sonda de ligación, se forma una estructura de ligación. También puede añadirse una sonda marcadora (u otras sondas). De nuevo, este procedimiento puede requerir el uso de una etapa térmica para asegurar que la secuencia diana no permanece en la superficie a menos que se haya producido la ligación.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, estas técnicas pueden realizarse para las dos cadenas de una secuencia diana de doble cadena. La secuencia diana se desnaturaliza y se añaden dos conjuntos de sondas: un conjunto como se ha descrito anteriormente para una cadena de la diana y un conjunto separado (es decir, tercer y cuarto ácidos nucleicos sonda cebadores) para la otra cadena de la diana. Como se describe en este documento, la primera y tercera sondas pueden hibridar y la segunda y cuarta sondas pueden hibridar, de modo que puede producirse la amplificación. Es decir, cuando la primera y segunda sondas se han unido, la sonda ligada puede usarse ahora como molde, además de la segunda secuencia diana, para la unión de la tercera y cuarta sondas. De forma similar, la tercera y cuarta sondas ligadas servirán como molde para la unión de la primera y segunda sondas, además de la primera cadena diana. De esta forma, puede producirse una amplificación exponencial más que simplemente lineal.

De nuevo, como se ha descrito anteriormente, la detección de la reacción de OLA puede producirse directamente, en el caso en el que uno o ambos cebadores comprendan al menos un ETM, o indirectamente, usando ensayos de tipo sándwich, mediante el uso de sondas adicionales; es decir, las sondas ligadas pueden servir como secuencias diana y la detección puede utilizar sondas de amplificación, sondas de captura, sondas extensoras de captura, sondas marcadoras y sondas extensoras marcadoras, etc.

En una realización preferida, la técnica de amplificación de señales es RCA. La amplificación de círculo rodante se describe en general en Baner et al. (1998) Nuc. Acids Res. 26: 5073-5078; Barany, F. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193; Lizardi et al. (1998) Nat. Genet. 19: 225-232; Zhang et al., Gene 211: 277 (1998); y Daubendiek et al., Nature Biotech. 15: 273 (1997).

En general, la RCA puede describirse de la forma siguiente. En primer lugar, como se describe en más detalle a continuación, una sola sonda de RCA hibrida con un ácido nucleico diana. Cada extremo terminal de la sonda hibrida adyacentemente en el ácido nucleico diana (o, como alternativa, existen nucleótidos intermedios que pueden "rellenarse" usando una polimerasa y dNTP, como se describe en este documento) y se produce el ensayo de OLA como se ha descrito anteriormente. Es decir, sólo si existe una complementariedad perfecta se producirá la ligación. Cuando se liga, la sonda por lo tanto se circulariza, al tiempo que hibrida con el ácido nucleico diana. La adición de un cebador, una polimerasa y dNTP da como resultado la extensión de la sonda circular. Sin embargo, puesto que la sonda no tiene extremos terminales, la polimerasa continúa extendiendo la sonda de forma repetida. Por lo tanto, da como resultado la amplificación de la sonda circular. Este concatámero de gran tamaño puede detectarse intacto, como se describe a continuación, o puede escindirse de una diversidad de formas para formar amplicones de menor tamaño para la detección como se describe en este documento.

Por consiguiente, puede usarse un solo oligonucleótido tanto para la OLA como molde circular para la RCA (denominado en este documento "sonda candado" o una "sonda de RCA" (RCP)). Es decir, cada extremo terminal del oligonucleótido contiene una secuencia complementaria al ácido nucleico diana y funciona como un cebador de OLA como se ha descrito anteriormente. Es decir, el primer extremo de la sonda de RCA es sustancialmente complementario a un primer dominio diana y el segundo extremo de la sonda de RCA es sustancialmente complementario a un segundo dominio diana, adyacente (directa o indirectamente, como se describe en este documento) al primer dominio. La hibridación de la sonda con el ácido nucleico diana da como resultado la formación de un complejo de hibridación. La ligación de los "cebadores" (que son los extremos separados de un solo oligonucleótido, la sonda de RCA) da como resultado la formación de un complejo de hibridación modificado que contiene una sonda circular, es decir, un complejo de molde de RCA. Es decir, el oligonucleótido se circulariza mientras continúa hibridado con el ácido nucleico diana. Esto sirve como molde circular para la RCA. Además de un cebador, una polimerasa y los dNTP necesarios para el complejo de molde de RCA dan como resultado la formación de un ácido nucleico producto amplificado. Después de la RCA, el ácido nucleico producto amplificado se detecta como se describe en este documento. Esto puede realizarse de una diversidad de formas. Por ejemplo, la polimerasa puede incorporar nucleótidos marcados; puede usarse un cebador marcado o, como alternativa, se usa una sonda marcadora que es sustancialmente complementaria a una porción de la sonda de RCA y que comprende al menos un marcador.

Por consiguiente, se describen en este documento sondas de RCA (a veces denominadas en este documento "sondas de círculo rodante" (RCP) o "sondas candado" (PP)). Las RCP pueden comprender gran cantidad de elementos, incluyendo una primera y una segunda secuencia de ligación, un sitio de escisión, un sitio de cebamiento, una secuencia de captura, análogos de nucleótidos y una secuencia marcadora.

La RCP puede comprender una primera y una segunda secuencia de ligación. Como se ha descrito anteriormente para la OLA, las secuencias de ligación son sustancialmente complementarias a dominios adyacentes de la secuencia diana. Los dominios pueden ser directamente adyacentes (es decir, sin bases intermedias entre el extremo 3' del primero y el 5' del segundo) o indirectamente adyacentes, con de 1 a 100 o más bases entre medias.

Las RCP pueden comprender un sitio de escisión, de modo que después de o durante la amplificación de círculo rodante, el concatámero de RCP puede escindirse en amplicones. Esto facilita la detección, puesto que generalmente los amplicones son de menor tamaño y presentan una cinética de hibridación favorable en la superficie; como apreciarán los especialistas en la técnica, el sitio de escisión puede asumir varias formas, incluyendo, pero sin limitación, el uso de sitios de restricción en la sonda, el uso de secuencias de ribozimas, o mediante el uso o la incorporación de porciones de escisión de ácido nucleico.

La sonda candado puede contener un sitio de restricción. El sitio para endonucleasa de restricción permite la escisión de concatámeros largos que típicamente son el resultado de RCA en unidades individuales de menor tamaño que hibridan más eficazmente o más rápido con sondas de captura unidas a una superficie. Por lo tanto, después de la RCA (o en algunos casos, durante la reacción), el ácido nucleico producto se pone en contacto con la endonucleasa de restricción apropiada. Esto da como resultado la escisión del ácido nucleico producto en fragmentos de menor tamaño. Después, los fragmentos hibridan con la sonda de captura que está inmovilizada, dando como resultado una concentración de fragmentos de producto sobre el electrodo de detección. De nuevo, como se describe en este documento, estos fragmentos pueden detectarse de una de dos formas: se incorporan nucleótidos marcados durante la etapa de replicación, por ejemplo, como dNTP individuales marcados o mediante el uso de un cebador marcado, o se añade una sonda marcadora adicional.

El sitio de restricción puede ser un sitio de restricción de cadena sencilla seleccionado de modo que su complementaria aparezca solamente una vez en la RCP.

El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión para ribozima como se describen en general en Daubendiek et al., Nature Biotech, 15: 273 (1997). En esta realización, mediante el uso de RCP que codifican ARN catalíticos, NTP y una ARN polimerasa, el concatámero resultante puede autoescindirse, formando en última instancia amplicones monoméricos.

La escisión puede conseguirse usando reactivos de escisión de ADN. Por ejemplo, como se sabe en la técnica, existen varias porciones intercalantes que pueden efectuar la escisión, por ejemplo, usando la luz.

Las RCP pueden no comprender un sitio de escisión. En su lugar, el tamaño de la RCP se diseña de modo que pueda hibridar "suavemente" con muchas sondas de captura en una superficie. Como alternativa, la reacción puede ciclarse de modo que no se formen concatámeros muy largos.

Las RCP pueden comprender un sitio de cebamiento, para permitir la unión de un cebador de ADN polimerasa. Como se sabe en la técnica, muchas ADN polimerasas requieren un ácido nucleico de doble cadena y un extremo terminal libre para permitir la síntesis de ácidos nucleicos. Sin embargo, en algunos casos, por ejemplo cuando se usa ARN polimerasas, puede no ser necesario un cebador (véase Daubendiek, anteriormente). De forma similar, dependiendo del tamaño y la orientación de la cadena diana, es posible que un extremo libre de la secuencia diana pueda servir como cebador; véase Baner et al., anteriormente.

Por lo tanto, la sonda candado también puede contener un sitio de cebamiento para cebar la reacción de RCA. Es decir, cada sonda candado comprende una secuencia con la que hibrida un ácido nucleico cebador formando un molde para la polimerasa. El cebador puede encontrarse en cualquier porción de la sonda circular. El cebador puede localizarse en un sitio separado en la sonda. El sitio cebador en cada sonda candado diferente es idéntico, aunque esto no es necesario. Las ventajas del uso de sitios cebadores con secuencias idénticas incluye la capacidad de usar solamente un solo oligonucleótido cebador para cebar el ensayo de RCA con una pluralidad de complejos de hibridación diferentes. Es decir, la sonda candado hibrida únicamente con el ácido nucleico diana para el que se diseña. Un solo cebador hibrida con todos los complejos de hibridación únicos que forman un sitio de cebamiento para la polimerasa. Después, la RCA se desarrolla a partir de un locus idéntico dentro de cada sonda candado única de los complejos de hibridación.

El sitio cebador puede solapar, incluir o residir dentro de cualquiera de los elementos descritos anteriormente de la sonda candado. Es decir, el cebador puede encontrarse, por ejemplo, solapante o dentro del sitio de restricción o de la secuencia de identificación. Es necesario que el ácido nucleico cebador esté diseñado para emparejarse con el sitio cebador seleccionado.

El cebador puede comprender los ETM unidos covalentemente.

Las RCP pueden comprender una secuencia de captura. Una secuencia de captura, como se describe en este documento, es sustancialmente complementaria a una sonda captura, como se describe en este documento.

Las RCP pueden comprender una secuencia marcadora; es decir, una secuencia que puede usarse para unirse a sondas marcadoras y es sustancialmente complementaria a una sonda marcadora. Es posible usar la misma secuencia marcadora y sonda marcadora para todas las sondas candado en una matriz; como alternativa, cada sonda candado puede tener una secuencia marcadora diferente.

Las RPC pueden comprender análogos de nucleótidos. Por ejemplo, puesto que puede ser deseable incorporar ETM en localizaciones específicas dentro del amplicón (por ejemplo, como un agrupamiento de 8-10 ETM en una extensión de 20-30 pares de bases, para permitir una señalización y una configuración óptimas del complejo de hibridación de detección), pueden incorporarse bases únicas en la RCP. Como se sabe en la técnica, la isocitosina es un análogo de nucleósido que sólo se emparejará con isoguanina, como se describe en general en la Patente de Estados Unidos Nº 5.681.702. Mediante la utilización de isoC o isoG en la RCP, puede añadirse desoxi-isoC o desoxi-isoG marcada con un ETM a la combinación de nucleótidos, dando como resultado la incorporación de ETM en localizaciones específicas predeterminadas.

Los conjuntos de RCP/cebador se diseñan para permitir un nivel adicional de amplificación, a veces denominado "hiperramificación" o "amplificación en cascada". Como se describe en Zhang et al, anteriormente, mediante el uso de varias secuencias de cebamiento y cebadores, un primer concatámero puede servir como molde para concatámeros adicionales. Se usa preferiblemente una polimerasa que tiene una actividad de desplazamiento elevada. Se usa un primer cebador antisentido, seguido del uso de cebadores con sentido, para generar grandes cantidades de concatámeros y amplicones, cuando se usa la escisión.

Por lo tanto, se describen en este documento procedimientos de detección usando RCP. Una vez que las secuencias de ligación de la RCP han hibridado con la diana, formando un primer complejo de hibridación, los extremos de la RCP se ligan entre sí como se ha descrito anteriormente para la OLA. El cebador de RCP se añade, si es necesario, junto con una polimerasa y dNTP (o NTP, si es necesario).

La polimerasa puede ser cualquier polimerasa que se describe en este documento, pero preferiblemente es una que carece de actividad exonucleasa 3' (3' exo^{-}). Los ejemplos de polimerasas adecuadas incluyen, pero sin limitación, exonucleasas menos el fragmento grande de la ADN Polimerasa I (Klenow), ADN polimerasa Phi29, ADN polimerasa Taq y similares. Además, puede usarse una polimerasa que replique ADN monocatenario (es decir, sin un cebador que forme una sección de doble cadena).

Por lo tanto, la OLA/RCA puede realizarse en solución seguida de escisión por endonucleasa de restricción del producto de RCA. Después, el producto escindido se aplica a una matriz como se describe en este documento. La incorporación de un sitio para endonucleasa permite la generación de secuencias cortas fácilmente hibridables. Además, la secuencia de captura única en cada secuencia de sonda candado de círculo rodante permite que se analicen diversos conjuntos de secuencias de ácidos nucleicos en paralelo en una matriz, ya que cada secuencia se resuelve en base a la especificidad de la hibridación.

De nuevo, estas copias se detectan posteriormente mediante uno de dos procedimientos; hibridando una sonda marcadora que comprende ETM que es complementaria a la diana circular o mediante la incorporación de nucleótidos marcados con ETM en la reacción de amplificación. El marcador se detecta como se describe en este documento.

La polimerasa puede generar más de 100 copias del ADN circular. La polimerasa puede generar más de 1.000 copias del ADN circular. La polimerasa puede generar más de 10.000 copias o más de 50.000 copias del molde.

Después, la secuencia de ADN circular amplificada se detecta por procedimientos conocidos en la técnica y que se describen en este documento. La detección se consigue mediante la hibridación con una sonda marcada. La sonda se marca directa o indirectamente. Como alternativa, se incorporan nucleótidos marcados en el producto de ADN circular amplificado. Los nucleótidos pueden marcarse directamente o indirectamente, como se describe adicionalmente en este documento.

La RCA, como se describe en este documento, encuentra utilidad al permitir una detección altamente específica y altamente sensible de secuencias diana de ácidos nucleicos. En particular, el procedimiento encuentra utilidad en mejorar la capacidad de realizar análisis múltiples de matrices de ADN y suprimir una preparación costosa de muestras o diana. Como ejemplo, pueden realizarse ahorros sustanciales en el coste analizando directamente el ADN genómico en una matriz, en lugar de emplear una etapa de amplificación por PCR intermedia. El procedimiento encuentra utilidad en el examen del ADN genómico y otras muestras, incluyendo el ARNm.

Además, la RCA encuentra utilidad al permitir que se detecten fácilmente productos de amplificación de círculo rodante mediante hibridación con sondas en un formato en fase sólida. Una ventaja adicional de la RCA es que proporciona la capacidad de análisis múltiples, de modo que pueden analizarse en paralelo grandes cantidades de secuencias. Mediante la combinación de la sensibilidad de la RCA y la detección en paralelo en matrices, muchas secuencias pueden analizarse directamente a partir del ADN genómico.

Pueden diseñarse sistemas de OLA o RCP para que asuman una configuración particular, como se representa en la Figura 10, a veces denominada configuración "en forma de gemelo". La primera sonda de ligación tiene una secuencia que hibridará con una primera porción de la sonda de captura y una secuencia específica de diana; la segunda sonda de ligación tiene una secuencia específica de diana, una secuencia "en forma de gemelo" y un enlazador de reclutamiento que comprende ETM. Una vez que se produce la ligación y la secuencia ligada se añade a la matriz, se añade una sonda en forma de gemelo que comprende una primera porción que hibrida con una segunda porción de la sonda de captura, y una porción que hibrida con la secuencia en forma de gemelo. Después, la sonda en forma de gemelo aproxima el enlazador de reclutamiento y, por lo tanto, los ETM más cerca del electrodo, proporcionando una buena señalización.

Puede usarse la tecnología Invader^{TM} para la identidad de la base en la posición de detección. En general, las técnicas Invader^{TM} dependen del uso de nucleasas específicas de estructura, en las que la estructura puede formarse como resultado de la presencia o ausencia de un apareamiento erróneo. Estas estructuras se forman a partir de dos sondas (la "sonda invasora" y la "sonda de señalización") que hibridan de forma adyacente con dos dominios diana de una secuencia diana en una posición de detección: la sonda invasora con el primer dominio y la sonda de señalización con el segundo dominio. La sonda de señalización comprende una porción de al menos un nucleótido que también es complementario al primer dominio, en la posición de detección y, por lo tanto, solapa con la sonda invasora, y una porción que no es complementaria al primer dominio. La presencia de este solapamiento forma una estructura que una nucleasa reconocerá y escindirá, liberando la porción de señalización no complementaria. Sin embargo, si no existe solapamiento, debido a que la sonda de señalización no contiene un apareamiento perfecto en la posición de detección, la estructura no se forma y no se produce la escisión, Por lo tanto, la escisión también es específica de secuencia.

Por consiguiente, se describen en este documento procedimientos de determinación de la identidad de una base en la posición de detección de una secuencia diana. La secuencia diana comprende, de 5' a 3', un primer 6dominio diana que comprende un dominio de solapamiento que comprende al menos un nucleótido en la posición de detección, y un segundo dominio diana contiguo a la posición de detección. Una primera sonda hibrida con el primer dominio diana de la secuencia diana. Una segunda sonda, que comprende una primera porción que hibrida con el segundo dominio diana de la secuencia diana y una segunda porción que no hibrida con la secuencia diana, hibrida con el segundo dominio diana. Si la segunda sonda comprende una base que es perfectamente complementaria a la posición de detección se forma una estructura de escisión. La adición de una enzima de escisión, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.846.717; 5.614.402; 5.719.029; 5.541.311 y 5.843.669 dan como resultado la escisión de la secuencia de detección de la sonda de señalización. Después, ésta puede usarse como una secuencia diana en un complejo de ensayo.

Como anteriormente, como apreciarán los especialistas en la técnica, la reacción Invader^{TM} puede realizarse en solución, generando una pluralidad de secuencias de detección. Después, éstas pueden añadirse a un electrodo de detección como se describe en este documento.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, estas técnicas pueden realizarse para las dos cadenas de una secuencia diana de doble cadena. La secuencia diana se desnaturaliza y se añaden dos conjuntos de sondas: un conjunto como se ha descrito anteriormente para una cadena de la diana, y un conjunto separado (es decir, tercer y cuarto ácidos nucleicos sonda cebadores) para la otra cadena de la diana. La primera y tercera sondas pueden hibridar, y la segunda y cuarta sondas pueden hibridar, de modo que puede producirse la amplificación.

De nuevo, como se ha descrito anteriormente, la detección de la reacción Invader^{TM} puede producirse directamente, en el caso en el que la secuencia de detección comprenda al menos un ETM, o indirectamente, usando ensayos de tipo sándwich, mediante el uso de sondas adicionales; es decir, las secuencias de detección pueden servir como secuencias diana y la detección puede utilizar sondas de amplificación, sondas de captura, sondas extensoras de captura, sondas marcadoras y sondas extensoras marcadoras, etc.

Puede usarse la extensión de una sola base (SBE; a veces denominada "minisecuenciación") para determinar la identidad de la base en la posición de detección. En resumen, la SBE es una técnica que utiliza un cebador de extensión que hibrida con el ácido nucleico diana inmediatamente adyacente a la posición de detección. Se usa una polimerasa (generalmente una ADN polimerasa) para extender el extremo 3' del cebador con un análogo de nucleótido marcado con un ETM como se describe en este documento. Un nucleótido se incorpora en la cadena de ácido nucleico en crecimiento solamente si es complementario a la base en la cadena diana en la posición de detención. El nucleótido se derivatiza de modo que no puedan producirse extensiones adicionales, así que solamente se añade un solo nucleótido. Una vez que se añade el nucleótido marcado, la detección del ETM se desarrolla como se describe en este documento.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, la determinación de la base en la posición de detección puede desarrollarse de varias formas. En una realización preferida, la reacción se desarrolla con los cuatro nucleótidos, cada uno con un marcador diferente, por ejemplo, ETM con diferentes potenciales redox, como se describe en general en este documento.

La reacción se inicia por introducción del complejo de ensayo que comprende la secuencia diana (es decir, la matriz) en una solución que comprende un primer análogo de nucleótido. Por "análogo de nucleótido" en este contexto se entiende en este documento un desoxinucleósido-trifosfato (también denominados desoxinucleótidos o dNTP, es decir, dATP, dTTP, dCTP y dGTP), que se derivativa adicionalmente para ser terminador de la cadena. Los nucleótidos pueden ser de origen natural, tales como desoxinucleótidos, o de origen no natural. Las realizaciones preferidas utilizan nucleótidos didesoxi-trifosfato (ddNTP). En general, se usa un conjunto de nucleótidos que comprende ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP.

Además, como apreciarán los especialistas en la técnica, las reacciones de extensión de una sola base descritas en este documento permiten la incorporación precisa de bases modificadas en una cadena de ácido nucleico en crecimiento. Por lo tanto, pueden incorporarse gran cantidad de nucleótidos modificados por gran cantidad de razones, incluyendo sondaje de relaciones estructura-función (por ejemplo, interacciones de ADN:ADN o ADN:proteína), escisión del ácido nucleico, entrecruzamiento del ácido nucleico, incorporación de apareamientos erróneos, etc.

Además de un primer nucleótido, la solución también comprende una enzima de extensión, generalmente una ADN polimerasa. Las ADN polimerasas adecuadas incluyen, pero sin limitación, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, SEQUENASE 1.0 y SEQUENASE 2.0 (U. S. Biochemical), ADN polimerasa T5 y ADN polimerasa Phi29. Si el NTP es complementario a la base de la posición de detección de la secuencia diana, que es adyacente al cebador de extensión, la enzima de extensión lo añadirá al cebador de extensión en la posición de interrogación. Por lo tanto, se modifica el cebador de extensión, es decir, se extiende para formar un cebador modificado, a veces denominado en este documento "cadena recién sintetizada". Si se desea, la temperatura de la reacción puede ajustarse (o ciclarse) de modo que se produzca la amplificación, generando una pluralidad de cebadores modificados.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, la configuración del sistema de SBE puede asumir varias formas. Como para la reacción de LCR, la reacción puede realizarse en solución y, después, las cadenas recién sintetizadas con los marcadores de ETM específicos de base pueden detectarse. Por ejemplo, pueden hibridar directamente con sondas de captura que sean complementarias a los cebadores de extensión y, después, puede detectarse la presencia del ETM usando los sistemas de "mecanismo-1" o de "mecanismo-2" que se describen en este documento.

Como alternativa, la reacción puede realizarse en una superficie por captura de la secuencia diana y, después, desarrollo de la reacción de SBE. De forma similar, la propia sonda de captura puede usarse como la sonda de extensión, estando su extremo terminal directamente adyacente a la posición de detección. Tras la adición de la secuencia diana y los reactivos de SBE, se forma el cebador modificado que comprende un ETM y después se detecta.

Como se describe en este documento, el procedimiento usado para detectar la base en la posición de detección puede ser una PCR de alelos, denominada en este documento "aPCR". Como se describe en Newton et al., Nucl. Acid Res. 17: 2503 (1989), la PCR de alelos permite la discriminación de una sola base en base al hecho de que la reacción de PCR no se desarrolla bien si el nucleótido 3' terminal está apareado erróneamente, asumiendo que la ADN polimerasa que se esté usando carezca de una actividad de corrección de errores exonucleasa 3'. Por consiguiente, la identificación de la base se desarrolla mediante el uso de cebadores de PCR de alelos (a veces denominados en este documento cebadores de aPCR) que tienen posiciones de lectura en sus extremos 3'. Por lo tanto, la secuencia diana comprende un primer dominio que comprende en su extremo 5' una posición de detección.

En general, la aPCR puede describirse brevemente de la forma siguiente. Un ácido nucleico diana de doble cadena se desnaturaliza, generalmente por aumento de la temperatura, y después se enfría en presencia de un exceso de un cebador de aPCR, que entonces hibrida con la primera cadena diana. Si la posición de lectura del cebador de aPCR se empareja correctamente con la posición de detección de la secuencia diana, entonces una ADN polimerasa (de nuevo, que carece de actividad exonucleasa 3') actúa para extender el cebador con dNTP, dando como resultado la síntesis de una nueva cadena que forma un complejo de hibridación. Después, la muestra se calienta de nuevo para disociar el complejo de hibridación y se repite el proceso. Mediante el uso de un segundo cebador de PCR para la cadena diana complementaria, se produce una amplificación rápida y exponencial. Por lo tanto, las etapas de la aPCR son desnaturalización, hibridación y extensión. Las particularidades de la aPCR son bien conocidas, e incluyen el uso de una polimerasa termoestable tal como la polimerasa Taq I y termociclado.

Por consiguiente, la reacción de aPCR requiere al menos un cebador de aPCR, una polimerasa y un conjunto de dNTP. Como se describe en este documento, los cebadores pueden comprender el marcador, o uno o más de los de dNTP pueden comprender un marcador.

En una realización preferida, la invención proporciona nuevos procedimientos y composiciones para ensayos de ácidos nucleicos en soportes sólidos. Sin estar ligado a teoría alguna, parece que cuando los ácidos nucleicos hibridan con sondas superficiales, la concentración relativamente elevada de carga negativa en la superficie proporciona un "entorno desestabilizante" similar a la introducción de calor, que permite la discriminación de complementariedad perfecta e imperfecta en presencia de un exceso de sondas complementarias perfectas. Es decir, cuando una primera sonda de captura es un apareamiento perfecto con una secuencia diana y una segunda sonda de captura comprende un cambio de un solo par de bases en la posición de interrogación, a temperaturas por debajo de la Tm del apareamiento erróneo se formarán ambos híbridos. Sin embargo, la adición de un exceso de una sonda (denominada en este documento "competímero") que se aparea con la segunda sonda de captura en la posición de interrogación, expulsa la secuencia diana unida con apareamiento erróneo en favor de la unión del competímero. Esencialmente, ésta es una reducción de la unión de secuencias que tiene una complementariedad imperfecta; puede considerarse que esto es una reducción de la unión inespecífica. Éste no parece ser el caso en los sistemas basados en solución; de nuevo, sin estar ligado a teoría alguna, esto parece ser el resultado de una diferencia en la "constante de disociación" en función del entorno desestabilizante. Como se muestra en los Ejemplos, esto permite una reducción significativa en la unión de ácidos nucleicos apareados erróneamente a superficies.

La idea general se muestra en la Figura 3. La Figura 3A representa una superficie con dos sondas de captura, diferenciándose cada una por una sola base en la posición de interrogación, una de las cuales es "perfecta" en comparación con la secuencia diana y una que contiene un apareamiento erróneo. En ausencia del competímero, la diana se une a ambas sondas de captura. Tras la adición del competímero, el competímero expulsa la diana que contiene el apareamiento erróneo, dejando intacto el híbrido perfecto. Como apreciarán los especialistas en la técnica, esto puede configurarse de una diversidad de formas. Como se muestra en la Figura 3B, puede usarse un extensor de captura. Como alternativa, como se muestra en la Figura 3C, la posición de detección puede consultarse usando diferentes sondas marcadoras. Como apreciarán los especialistas en la técnica, también son posibles otras configuraciones (por ejemplo, usando sondas amplificadoras, sondas extensoras marcadoras, etc.). Lo que es importante es que el competímero se dirija a la región de la secuencia diana que comprende la posición de detección.

Por consiguiente, se describen en este documento composiciones que comprenden sustratos con una pluralidad de localizaciones de matrices. Por "sustrato" o "soporte sólido" u otros equivalente gramaticales se entiende en este documento cualquier material que puede modificarse para contener sitios individuales separados apropiados para la unión o asociación de ácidos nucleicos. Los sustratos adecuados incluyen superficies metálicas tales como oro, electrodos como se definen a continuación, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluyendo acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflón, etc.), polisacáridos, nylon o nitrocelulosa, resinas, sílice y materiales basados en sílice, incluyendo silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos y una diversidad de otros polímeros.

El sustrato incluye localizaciones de matrices. Por "localizaciones de matrices" o "adaptadores" o "sitios" se entiende en este documento una localización en el sustrato que comprende una sonda de ácido nucleico unida covalentemente.

Las composiciones comprenden además una pluralidad de competímeros. Por "competímero" se entiende en este documento un ácido nucleico que es sustancialmente complementario a un ácido nucleico para el que se desea especificidad, para que sea más estable que un apareamiento erróneo. Como se describe en este documento, éste puede asumir varias formas. El competímero debe ser sustancialmente complementario a su diana. Por "sustancialmente complementario" se entiende en este documento que los competímeros son suficientemente complementarios para hibridar en condiciones de reacción normales. En una realización preferida, los competímeros son perfectamente complementarios a su diana. Sin embargo, dependiendo de cómo de próximas estén las diferentes secuencia diana, pueden usarse diferentes niveles de complementariedad. Por ejemplo, para el análisis de SNP, las secuencias diana generalmente son idénticas salvo por la posición de detección y, por lo tanto, para utilizar competímeros deben ser perfectamente complementarios. Sin embargo, para dianas no relacionadas, sólo es importante que el competímero tenga una estabilidad mayor en un dúplex que el ácido nucleico que se reemplaza. Por lo tanto, en esta realización, puede ser posible utilizar competímeros que no presenten una complementariedad perfecta con sus dianas.

En una realización preferida, como se representa en la Figura 3A y 3B, el competímero es complementario a una sonda de captura o a una porción de una sonda extensora de captura. Es decir, en una realización preferida, cuando la secuencia diana hibrida directamente con una sonda de captura, los competímeros son complementarios a la sonda de captura. Sin embargo, si se usa una sonda extensora de captura como se describe en este documento, la sonda extensora de captura tiene una primera porción que hibrida con la secuencia diana y una segunda porción que hibrida con la sonda de captura. En este caso, el competímero hibridará con la primera porción de la sonda de captura.

En una realización preferida, como se representa en la Figura 3C, el competímero es complementario a la región de unión de la sonda marcadora (a veces denominada en este documento como la secuencia de reconocimiento de la sonda marcadora) de la secuencia diana.

Los competímeros de la invención pueden añadirse en cualquier momento durante el ensayo. En una realización preferida, los competímeros se añaden después de la formación del complejo de ensayo y, por lo tanto, sirven para "expulsar" la unión imperfecta. Esto puede realizarse con o sin una etapa de lavado. Como alternativa, los competímeros pueden añadirse antes de o durante la formación del complejo de ensayo. En esta realización, dependiendo del uso de la matriz y la sensibilidad de detección, es importante señalar que el competímero también está compitiendo con la diana por la unión y, por lo tanto, la cantidad de diana unida a la superficie puede disminuir.

Todas las composiciones y procedimientos anteriores se refieren a la determinación de la identificación de la base en una o más posiciones de detección dentro un ácido nucleico diana. Los sistemas de detección de la presente invención se basan en la incorporación de una porción de transferencia de electrones (ETM) en un complejo de ensayo como resultado de la unión de un analito diana.

En general, existen dos mecanismos de detección básicos. En una realización preferida, la detección de un ETM se basa en la transferencia de electrones a través de los orbitales \pi apilados de un ácido nucleico de doble cadena. Este mecanismo básico se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.591.578, 5.770.369, 5.705.348 y el documento PCT US97/20014 y se denomina "mecanismo-1" en este documento. En resumen, trabajos anteriores han demostrado que la transferencia de electrones puede desarrollarse rápidamente a través de los orbitales \pi apilados del ácido nucleico de doble cadena y significativamente más lentamente a través de un ácido nucleico de cadena sencilla. Por consiguiente, esto puede servir como base de un ensayo. Por lo tanto, por adición de ETM (covalentemente a una de las cadenas o no covalentemente al complejo de hibridación mediante el uso de indicadores de hibridación, que se describen a continuación) a un ácido nucleico que está unido a un electrodo de detección a través de un oligómero conductor, puede detectarse la transferencia de electrones entre el ETM y el electrodo a través del ácido nucleico y del oligómero conductor.

Como alternativa, el ETM puede detectarse, no necesariamente mediante la transferencia de electrones a través del ácido nucleico, sino más bien puede detectarse directamente en un electrodo que comprende una SAM; es decir, los electrones de los ETM no necesitan viajar a través de los orbitales n apilados para generar una señal. Como anteriormente, en esta realización, el electrodo de detección comprende preferiblemente una monocapa autoensamblada (SAM) que sirve para proteger al electrodo de especies con actividad redox en la muestra. En esta realización, la presencia de ETM en la superficie de una SAM, que se ha formulado para que comprenda ligeras "imperfecciones" (a veces denominadas en este documento "microconductos", "nanoconductos" o "electroconductos"), puede detectarse directamente. Esta idea básica se denomina "mecanismo-2" en este documento. Esencialmente, los electroconductos permiten un acceso de ETM particulares a la superficie. Sin estar ligado a teoría alguna, debe señalarse que la configuración del electroconducto depende en parte del ETM seleccionado. Por ejemplo, el uso de ETM relativamente hidrófobos permite el uso de especies formadoras de electroconductos hidrófobas que excluyen eficazmente ETM hidrófilos o cargados. De forma similar, el uso de especies más hidrófilas o cargadas en la SAM puede servir para excluir ETM hidrófobos.

Debe señalarse que estas imperfecciones deben diferenciarse de "orificios" que permiten el contacto directo de componentes de muestra con el electrodo de detección. Como se describe más completamente a continuación, los electroconductos pueden generarse de varias formas generales, incluyendo, pero sin limitación, el uso de superficies de electrodos irregulares, tales como electrodos de oro formulados sobre placas de circuito de PC; o la inclusión de al menos dos especies diferentes en la monocapa, es decir, usando una "monocapa mixta", siendo al menos una de ellas una especie formadora de electroconductos (EFS). Por lo tanto, tras la unión de un analito diana, un ligando de unión soluble que comprende un ETM se lleva a la superficie y puede desarrollarse la detección del ETM, supuestamente a través de los "electroconductos" del electrodo. Esencialmente, el papel de la SAM que comprende las imperfecciones es permitir el contacto del ETM con la superficie electrónica del electrodo, al tiempo que proporciona todavía los beneficios de protección del electrodo de los componentes de la solución y reducción de la cantidad de unión inespecífica a los electrodos. Desde un punto de vista de frente, el papel del ligando de unión es proporcionar especificidad para un reclutamiento de ETM en la superficie, donde pueden detectarse directamente.

Por lo tanto, en cualquier realización, como se describe más completamente a continuación, se forma un complejo de ensayo que contiene un ETM que después se detecta usando el electrodo de detección.

Por consiguiente, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones, como se definen en las reivindicaciones, útiles en la detección de ácidos nucleicos. Como apreciarán los especialistas en la técnica, las composiciones de la invención pueden asumir una amplia diversidad de configuraciones. Como se describen más completamente a continuación, los sistemas preferidos de la invención funcionan de la forma siguiente. Una secuencia de ácido diana se une (por hibridación) a un electrodo que comprende una monocapa, que incluye generalmente oligómeros conductores. Esta unión puede ser directamente a una sonda de captura en la superficie o indirectamente usando sondas extensoras de captura. En algunas realizaciones, la propia secuencia diana comprende los ETM. Después, se añade una sonda marcadora, formando un complejo de ensayo. La unión de la sonda marcadora puede ser directa (es decir, hibridación con una porción de la secuencia diana) o indirecta (es decir, hibridación con una sonda amplificadora que hibrida con la secuencia diana), formando todos los ácidos nucleicos necesarios un complejo de ensayo. Como resultado de la hibridación de la primera porción de la sonda marcadora, la segunda porción de la sonda marcadora, el "enlazador de reclutamiento", que contiene los ETM, se aproxima espacialmente a la superficie de la SAM en el electrodo y entonces puede detectarse electrónicamente la presencia del ETM.

El presente sistema encuentra una utilidad particular en formatos de matrices, es decir, en los que existe una matriz de electrodos de detección direccionables (denominados generalmente en este documento "adaptadores", "direcciones" o "microlocalizaciones"). Por "matriz" se entiende en este documento una pluralidad de ligandos de captura en un formato de matriz; el tamaño de la matriz dependerá de la composición y del uso final de la matriz. Pueden generarse matrices que contengan desde aproximadamente 2 hasta muchos miles de ligandos de captura diferentes. Generalmente, la matriz comprenderá de dos a tantos como 100.000 o más, dependiendo del tamaño de los electrodos, así como del uso final de la matriz. Son intervalos preferidos de aproximadamente 2 a aproximadamente 10.000, prefiriéndose de aproximadamente 5 a aproximadamente 1.000 y prefiriéndose particularmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención pueden no estar en un formato de matriz; es decir, para algunas realizaciones, también pueden generarse composiciones que comprenden un solo ligando de captura. Además, en algunas matrices, pueden usarse múltiples sustratos de composiciones idénticas o diferentes. Por lo tanto, por ejemplo, las matrices grandes pueden comprender una pluralidad de sustratos de menor tamaño.

Por lo tanto, en una realización preferida, las composiciones comprenden un electrodo. Por "electrodo" se entiende en este documento una composición que, cuando se conecta a un dispositivo electrónico, es capaz de detectar una corriente o carga y convertirla en una señal. Como alternativa, un electrodo puede definirse como una composición que puede aplicar un potencial a y/o pasar electrones a o desde especies en la solución. Por lo tanto, un electrodo es un ETM como se describe en este documento. Se conocen en la técnica electrodos preferidos que incluyen, pero sin limitación, ciertos metales y sus óxidos, incluyendo oro; platino; paladio; silicio; aluminio; electrodos de óxidos metálicos incluyendo óxido de platino, óxido de titanio, óxido de estaño, óxido de indio y estaño, óxido de paladio, óxido de silicio, óxido de aluminio, óxido de molibdeno (Mo_{2}O_{6}), óxido de tungsteno (WO_{3}) y óxidos de rutenio; y carbono (incluyendo electrodos de carbono vítreo, grafito y pasta de carbono). Los electrodos preferidos incluyen oro, silicio, carbono y electrodos de óxidos metálicos, prefiriéndose particularmente oro.

Los electrodos descritos en este documento se representan como una superficie plana, que sólo es una de las posibles conformaciones del electrodo y es con fines esquemáticos solamente. La conformación del electrodo variará con el procedimiento de detección que se use. Por ejemplo, pueden preferirse electrodos planos lisos para procedimientos de detección óptica, o cuando se generan matrices de ácidos nucleicos, requiriendo por lo tanto localizaciones direccionables tanto para la síntesis como para la detección. Como alternativa, para el análisis de una sola sonda, el electrodo puede ser en forma de un tubo, estando las SAM que comprenden oligómeros conductores y ácidos nucleicos unidas a la superficie interna. Esto permite que se exponga un máximo de área superficial que contiene los ácidos nucleicos a un volumen pequeño de muestra.

En una realización preferida, los electrodos de detección se forman en un sustrato. Además, la discusión en este documento se refiere en general a la formación de electrodos de oro, pero como apreciarán los especialistas en la técnica, también pueden usarse otros electrodos. El sustrato puede comprender una amplia diversidad de materiales, como apreciarán los especialistas en la técnica, prefiriéndose particularmente materiales de placa de circuito impreso (PCB). Por lo tanto, en general, los sustratos adecuados incluyen, pero sin limitación, fibra de vidrio, teflón, cerámicos, vidrio, silicio, mica, plásticos (incluyendo acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, policarbonato, poliuretanos, Teflon^{TM} y derivados de los mismos, etc.), GETEK (una mezcla de óxido de polipropileno y fibra de vidrio), etc.

En general, los materiales preferidos incluyen materiales de placa de circuito impreso. Los materiales de placa de circuito son los que comprenden un sustrato aislante que está recubierto con una capa conductora y procesado usando técnicas de litografía, particularmente técnicas de fotolitografía, para formar los patrones de electrones e interconexiones (a veces denominadas en la técnica interconexiones o conductores). El sustrato aislante es, generalmente, pero no siempre, un polímero. Como se sabe en la técnica, pueden usarse una pluralidad de capas, para hacer placas "bidimensionales" (por ejemplo, todos los electrodos e interconexiones están en un plano) o "tridimensionales" (en las que los electrodos están en una superficie y las interconexiones pueden atravesar la placa hacia el otro lado). Con frecuencia, los sistemas tridimensionales dependen del uso de taladrado o grabado, seguido de electrometalización con un metal tal como cobre, de modo que se generan las interconexiones "a través de la placa". Con frecuencia los materiales de placa de circuito se proporcionan ya con un papel metalizado unido al sustrato, tal como un papel metalizado de cobre, añadiéndose cobre adicional según sea necesario (por ejemplo, para las interconexiones), por ejemplo, por electrometalización. Después, puede ser necesario que la superficie de cobre se haga irregular, por ejemplo, mediante grabado, para permitir la unión de la capa de adhesión.

En algunas realizaciones, puede no preferirse vidrio como sustrato.

Por consiguiente, se describen en este documento biomicroplacas (a veces denominadas en este documento "microplacas") que comprenden sustratos que comprenden una pluralidad de electrodos, preferiblemente electrodos de oro. El número de electrodos es como se ha descrito para matrices. Cada electrodo comprende preferiblemente una monocapa autoensamblada como se describe en este documento. Una de las especies formadoras de monocapa puede comprender un ligando de captura como se describe en este documento. Además, cada electrodo tiene una interconexión que está unida al electrodo en un extremo y, en última instancia, está unida a un dispositivo que puede controlar el electrodo. Es decir, cada electrodo es direccionable de forma independiente.

Los sustratos pueden ser parte de un dispositivo de mayor tamaño que comprende una cámara de detección que expone un volumen dado de muestra al electrodo de detección. Generalmente, la cámara de detección varía de aproximadamente 1 nl a 1 ml, prefiriéndose de aproximadamente 10 \mul a 500 \mul. Como apreciarán los especialistas en la técnica, dependiendo de las condiciones experimentales y de ensayo, pueden usarse volúmenes más pequeños o más grandes.

La cámara de detección y el electrodo pueden ser parte de un cartucho que puede colocarse en un dispositivo que comprende componentes electrónicos (una fuente de voltaje CA/CC, un amperímetro, un procesador, una pantalla de lectura, controlador temperatura, fuente de luz, etc.). Las interconexiones de cada electrodo se disponen de tal modo que tras la inserción del cartucho en el dispositivo, se establecen conexiones entre los electrodos y los componentes eléctricos.

Los electrodos de detección en un material de placa de circuito (u otros sustratos) se preparan generalmente de una amplia diversidad de formas. En general, se usa oro de alta pureza y puede depositarse en una superficie mediante procesos de deposición al vacío (pulverización por bombardeo y evaporación) o deposición de solución (electrometalización o procesos no electrolíticos). Cuando se realiza la electrometalización, el sustrato debe comprender inicialmente un material conductor; las placas de circuito de fibra de vidrio se suministran frecuentemente con un papel metalizado de cobre. Frecuentemente, dependiendo del sustrato, se usa una capa de adhesión entre el sustrato y el oro para asegurar una buena estabilidad mecánica. Por lo tanto, los sustratos pueden utilizar una capa de deposición de un metal de adhesión tal como cromo, titanio, titanio/tungsteno, tántalo, níquel o paladio, que puede depositarse como anteriormente para el oro. Cuando se usa un metal electrometalizado (ya sea el metal de adhesión o el metal del electrodo), pueden añadirse opcionalmente aditivos para refinamiento de grano, denominados frecuentemente en la industria abrillantadores, para alterar las propiedades de deposición superficial. Los abrillantadores preferidos son mezclas de especies orgánicas e inorgánicas, prefiriéndose cobalto y níquel.

En general, la capa de adhesión es de aproximadamente 100 \ring{A} de grosor a aproximadamente 25 micrómetros (1.000 micropulgadas). Si el metal de adhesión es electroquímicamente activo, el metal del electrodo debe recubrirse a un grosor que evite el "flujo a través"; si el metal de adhesión no es electroquímicamente activo, el metal del electrodo puede ser más delgado. Generalmente, el metal del electrodo (preferiblemente oro) se deposita a un grosor que varía de aproximadamente 500 \ring{A} a aproximadamente 5 micrómetros (200 micropulgadas), prefiriéndose de aproximadamente 30 micropulgadas a aproximadamente 50 micropulgadas. En general, el oro se deposita para hacer que el tamaño de los electrodos varíe de aproximadamente 5 micrómetros a aproximadamente 5 mm de diámetro, prefiriéndose de aproximadamente 100 a 250 micrómetros. Después, los electrodos de detección formados de este modo preferiblemente se limpian y se añaden SAM, como se analiza a continuación.

Por lo tanto, se describen en este documento procedimientos de preparación de un sustrato que comprende una pluralidad de electrodos de oro. Los procedimientos comprenden primero recubrir un metal de adhesión, tal como níquel o paladio (opcionalmente con abrillantador), sobre el sustrato. Se prefiere la electrometalización. Después, el metal del electrodo, preferiblemente oro, se recubre (de nuevo, prefiriéndose la electrometalización) sobre el metal de adhesión. Después, los patrones del dispositivo, que comprende los electrodos y sus interconexiones asociadas, se generan usando técnicas litográficas, particularmente técnicas fotolitográficas como se conocen en la técnica, y grabado químico húmedo. Frecuentemente, se deposita un material aislante químicamente resistente y no conductor, tal como una máscara soldada o plástico, usando estas técnicas fotolitográficas, dejando solamente los electrodos y un punto de conexión expuestos a los conductores; los propios conductores se recubren generalmente.

Los procedimientos continúan con la adición de SAM. Pueden usarse técnicas de deposición por goteo para añadir la química necesaria, es decir, las especies formadoras de monocapa, siendo preferiblemente una de ellas una especie que comprende un ligando de captura. Se conocen bien técnicas de deposición por goteo para generar matrices de "aplicación puntual". Esto se realiza para añadir una composición diferente a cada electrodo, es decir, para generar una matriz que comprenda diferentes ligandos de captura. Como alternativa, las especies de SAM pueden ser idénticas para cada electrodo, y esto puede conseguirse usando una técnica de deposición por goteo o la inmersión del sustrato completo o una superficie del sustrato en la solución.

Por lo tanto, el electrodo puede comprender una monocapa, que comprende una especie formadora de electroconductos (EFS). Como se describe en este documento, la eficacia de la unión de analito diana (por ejemplo, hibridación de oligonucleótido) puede aumentar cuando el analito está a una distancia del electrodo. De forma similar, la unión inespecífica de biomoléculas, incluyendo los analitos diana, a un electrodo se reduce generalmente cuando está presente una monocapa. Por lo tanto, una monocapa facilita el mantenimiento del analito lejos de la superficie del electrodo. Además, una monocapa sirve para mantener especies cargadas lejos de la superficie del electrodo. Por lo tanto, esta capa ayuda a evitar el contacto eléctrico entre los electrodos y los ETM, o entre el electrodo y especies cargadas dentro del disolvente. Dicho contacto puede dar como resultado un "cortocircuito" directo o un cortocircuito indirecto por medio de especies cargadas que pueden estar presentes en la muestra. Por consiguiente, la monocapa está preferiblemente firmemente compactada en una capa uniforme sobre la superficie del electrodo, de modo que existan un mínimo de "orificios". Por lo tanto, la monocapa sirve como una barrera física para bloquear la accesibilidad del disolvente al electrodo.

Por "monocapa" o "monocapa autoensamblada" o "SAM" se entiende en este documento un ensamblaje relativamente ordenado de moléculas espontáneamente quimisorbidas en una superficie, en la que las moléculas se orientan aproximadamente paralelas entre sí y más o menos perpendiculares a la superficie. La mayoría de las moléculas incluyen un grupo funcional que se adhiere a la superficie y una porción que interacciona con moléculas vecinas en la monocapa para formar la matriz relativamente ordenada. Una monocapa "mixta" comprende una monocapa heterogénea, es decir, en la que al menos dos moléculas diferentes componen la monocapa.

En general, las SAM pueden generarse de varias formas y comprenden varios componentes diferentes, dependiendo de la superficie del electrodo y del sistema que se use. Para realizaciones del "mecanismo-1", las realizaciones preferidas utilizan dos especies formadoras de monocapa: una especie formadora de monocapa (incluyendo aislantes u oligómeros conductores) y una especie oligomérica conductora, que comprende el ligando de unión de captura, aunque, como apreciarán los especialistas en la técnica, también pueden incluirse especies formadoras de monocapa adicionales. Para los sistemas del "mecanismo-2", la composición de la SAM depende de la superficie del electrodo de detección. En general, se describen dos sistemas básicos del "mecanismo-2"; electrodos de detección que comprenden superficies "regulares", tales como electrodos de bola de oro, y los que comprende superficies "irregulares", tales como los que están hechos usando procesos comerciales sobre placas de circuito de PC. En general, sin estar ligado a teoría alguna, parece que las monocapas generadas sobre superficies imperfectas, es decir, superficies "irregulares", forman espontáneamente monocapas que contienen suficientes electroconductos incluso en ausencia de EFS, probablemente debido al hecho de que es difícil la formación de una monocapa uniforme sobre una superficie irregular. Las superficies "más regulares", sin embargo, pueden requerir la inclusión de números suficientes de EFS para generar los electroconductos, puesto que las superficies uniformes permiten que se forme una monocapa más uniforme. De nuevo, sin estar ligado a teoría alguna, la inclusión de especies que alteran la uniformidad de la monocapa, por ejemplo, por inclusión de una molécula rígida en un fondo de otras más flexibles, causa electroconductos. Por lo tanto, las superficies "regulares" comprenden monocapas que comprenden tres componentes: una especie aislante, una EFS y una especie que comprende el ligando de captura, aunque en algunas circunstancias, por ejemplo cuando la especie del ligando de captura se incluye a alta densidad, la especie del ligando de captura puede servir como la EFS. La "regularidad" en este contexto no se mide físicamente sino más bien en función de un aumento en la señal medida cuando se incluyen EFS. Es decir, la señal de un electrodo de detección recubierto con una especie formadora de monocapa se compara con una señal de un electrodo de detección recubierto con una especie formadora de monocapa que incluye una EFS. Un aumento indica que la superficie es relativamente regular, puesto que la inclusión de una EFS servía para facilitar el acceso del ETM al electrodo. También debe señalarse que aunque la discusión en este documento se refiere principalmente a electrodos de oro y especies formadoras de monocapa que contienen tiol, pueden usarse otros tipos de electrodos y especies formadoras de monocapa.

Debe señalarse que los "electroconductos" de los sistemas del mecanismo-2 no dan como resultado el contacto directo de componentes de muestra con la superficie del electrodo; es decir, los electroconductos no son grandes poros u orificios que permiten el acceso físico al electrodo. En su lugar, sin estar ligado a teoría alguna, parece que los electroconductos permiten que ciertos tipos de ETM, particularmente ETM hidrófobos, penetren lo suficiente en la monocapa para permitir la detección. Sin embargo, otros tipos de especies con actividad redox, incluyendo algunas especies hidrófilas, no penetran en la monocapa, ni siquiera con electroconductos presentes. Por lo tanto, en general, las especies con actividad redox que pueden estar presentes en la muestra no proporcionan señales sustanciales como resultado de los electroconductos. Aunque el sistema exacto variará con la composición de la SAM y la selección del ETM, en general, el ensayo para determinar una SAM adecuada que reduzca la unión inespecífica y tenga además suficientes electroconductos para la detección de ETM consiste en añadir ferroceno o ferrocianuro a la SAM; el primero debería dar una señal y el último no.

Por consiguiente, en los sistemas del mecanismo-1, la monocapa comprende una primera especie que comprende un oligómero conductor que comprende el ligando de unión de captura, como se describe más completamente a continuación, y una segunda especie que comprende una especie formadora de monocapa, incluyendo aislantes u oligómeros conductores o ambos.

En una realización preferida, la monocapa comprende una especie formadora de electroconductos. Por "especie formadora de electroconductos" o "EFS" se entiende en este documento una molécula que es capaz de generar suficientes electroconductos en una monocapa, generalmente de aislantes tales como grupos alquilo, para permitir la detección de ETM en la superficie. En general, la EFS tiene una o más de las siguientes cualidades: pueden ser moléculas relativamente rígidas, por ejemplo en comparación con una cadena de alquilo; pueden unirse a la superficie del electrodo con una geometría diferente de la otra especie formadora de monocapa (por ejemplo, se piensa que las cadenas de alquilo unidas a una superficie de oro con grupos tiol se unen más o menos en ángulos de 45º, y se piensa que las cadenas de fenil-acetileno unidas a oro mediante tioles descienden en ángulos de 90º); pueden tener una estructura que interfiera estéricamente o interrumpa la formación de una monocapa firmemente compactada, por ejemplo mediante la inclusión de grupos de ramificación, tales como grupos alquilo, o la inclusión de especies altamente flexibles, tales como unidades de polietilenglicol; o pueden ser capaces de activarse para formar electroconductos; por ejemplo, especies fotoactivables que pueden eliminarse selectivamente de la superficie tras la fotoactivación, dejando los electroconductos.

Las EFS preferidas incluyen oligómeros conductores, como se definen a continuación, y especies de fenil-acetilen-polietilenglicol, así como especies disulfuro formadoras de SAM asimétricas, tales como las representadas en la Figura 9 y en las figuras del documento U. S. S. N. 60/145.912, presentado el 27 de julio de 1999. Sin embargo, en algunas realizaciones, la EFS no es un oligómero conductor.

La monocapa puede comprender oligómeros conductores. Por "oligómero conductor" se entiende en este documento un oligómero sustancialmente conductor, preferiblemente lineal, denominándose algunas realizaciones del mismo en la bibliografía como "hilos moleculares". Por "sustancialmente conductor" se entiende en este documento que el oligómero es capaz de transferir electrones a 100 Hz. Generalmente, el oligómero conductor tiene orbitales \pi sustancialmente superpuestos, es decir, orbitales \pi conjugados, como entre las unidades monoméricas del oligómero conductor, aunque el oligómero conductor también puede contener uno o más enlaces sigma (\sigma). Además, un oligómero conductor puede definirse funcionalmente por su capacidad para inyectar o recibir electrones hacia o desde un ETM asociado. Además, el oligómero conductor es más conductor que los aislantes, como se definen en este documento. Además, los oligómeros conductores de la invención deben diferenciarse de polímeros electroactivos, que por sí mismos pueden donar o aceptar electrones.

Los oligómeros conductores pueden tener una conductividad, S, de entre aproximadamente 10^{-8} y aproximadamente 10^{4} \Omega^{-1} cm^{-1}, prefiriéndose de aproximadamente 10^{-5} a aproximadamente 10^{3} \Omega^{-1} cm^{-1}, calculándose estos valores de S para moléculas que varían de aproximadamente 20 \ring{A} a aproximadamente 200 \ring{A}. Como se describe a continuación, los aislantes tienen una conductividad S de aproximadamente 10^{-7} \Omega^{-1} cm^{-1} o inferior, prefiriéndose de menos de aproximadamente 10^{-8} \Omega^{-1} cm^{-1}. Véase, en general, Gardner et al., Sensors and Actuators A 51 (1995) 57-66.

Las características deseadas de un oligómero conductor incluyen una alta conductividad, una solubilidad suficiente en disolventes orgánicos y/o agua para la síntesis y el uso de las composiciones de la invención y, preferiblemente, una resistencia química a las reacciones que se producen i) durante la síntesis de ácidos nucleicos (de modo que pueden añadirse nucleósidos que contienen los oligómeros conductores a un sintetizador de ácidos nucleicos durante la síntesis de las composiciones de la invención), ii) durante la unión del oligómero conductor a un electrodo o iii) durante ensayos de hibridación. Además, se prefieren los oligómeros conductores que promoverán la formación de monocapas autoensambladas.

Los oligómeros descritos en este documento comprenden al menos dos subunidades monoméricas. Como se describe más completamente a continuación, los oligómeros incluyen homooligómeros y heterooligómeros, e incluyen polímeros.

El oligómero conductor puede tener la estructura representada en la Estructura 1:

1

Como entenderán los especialistas en la técnica, todas las estructuras representadas en este documento pueden tener átomos o estructuras adicionales; es decir, el oligómero conductor de la Estructura 1 puede unirse a ETM, tales como electrodos, complejos de metales de transición, ETM orgánicos y metalocenos, y a ácidos nucleicos o a varios de éstos. A menos que se indique otra cosa, los oligómeros conductores representados en este documento estarán unidos en el lado izquierdo a un electrodo; es decir, como se representa en la Estructura 1, la "Y" izquierda está conectada al electrodo como se describe en este documento. Si el oligómero conductor se va a unir a un ácido nucleico, la "Y" derecha, si está presente, se une al ácido nucleico, directamente o mediante el uso de un enlazador, como se describe en este documento.

En esta realización, Y es un grupo aromático, n es un número entero de 1 a 50, g es 1 o cero, e es un número entero de cero a 10 y m es cero o 1. Cuando g es 1, B-D es un enlace capaz de conjugarse con enlaces vecinos (denominado en este documento "enlace conjugado"), preferiblemente seleccionado de acetileno, B-D es un enlace conjugado, preferiblemente seleccionado de acetileno, alqueno, alqueno sustituido, amida, azo, -C=N- (incluyendo -N=C-, -CR=N- y -N=CR-), -Si=Si- y -Si=C- (incluyendo -C=Si-, -Si=CR- y -CR=Si-). Cuando g es cero, e es preferiblemente 1, D es preferiblemente carbonilo o una porción heteroatómica en la que el heteroátomo se selecciona de oxígeno, azufre, nitrógeno, silicio o fósforo. Por lo tanto, las porciones heteroatómicas adecuados incluyen, pero sin limitación, -NH y -NR, donde R es como se define en este documento; azufre sustituido; sulfonilo (-SO_{2}-), sulfóxido (-SO-); óxido de fosfina (-PO- y RPO-); y tiofosfina (-PS- y -RPS-). Sin embargo, cuando el oligómero conductor se va a unir a un electrodo de oro, como se describe a continuación, no se prefieren los derivados de azufre.

Por "grupo aromático" o equivalentes gramaticales se entiende en este documento una porción hidrocarburo aromático monocíclico o policíclico que contiene generalmente de 5 a 14 átomos de carbono (aunque pueden prepararse estructuras de anillos policíclicos de mayor tamaño) y cualquier derivado carbocíclico de cetona o tiocetona del mismo, en el que el átomo de carbono con la valencia libre es un miembro de un anillo aromático. Los grupos aromáticos incluyen grupos arileno y grupos aromáticos con más de dos átomos eliminados. Para los fines de esta solicitud, el término aromático incluye heterociclos. Los términos "heterociclo" o "heteroarilo" significan un grupo aromático en el que de 1 a 5 de los átomos de carbono indicado se reemplazan por un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo, boro y silicio, donde el átomo con la valencia libre es un miembro de un anillo aromático, y cualquier derivado heterocíclico de cetona y tiocetona del mismo. Por lo tanto, el heterociclo incluye tienilo, furilo, pirrolilo, pirimidinilo, oxalilo, indolilo, purinilo, quinolilo, isoquinolilo, tiazolilo, imidozilo, etc.

Es importante que los grupos aromáticos Y del oligómero conductor pueden ser diferentes, es decir, el oligómero conductor puede ser un heterooligómero. Es decir, un oligómero conductor puede comprender un oligómero de un solo tipo de grupos Y o de múltiples tipos de grupos Y.

El grupo aromático puede sustituirse con un grupo de sustitución, generalmente representado en este documento como R. Pueden añadirse grupos R según sea necesario para afectar a la condensación de los oligómeros conductores, es decir, pueden usarse grupos R para alterar la asociación de los oligómeros en la monocapa. También pueden añadirse grupos R para 1) alterar la solubilidad del oligómero o de composiciones que contienen los oligómeros; 2) alterar la conjugación o el potencial electroquímico del sistema; y 3) alterar la carga o las características en la superficie de la monocapa.

En una realización preferida, cuando el oligómero conductor es de más de tres subunidades, se prefieren grupos R para aumentar la solubilidad cuando se realiza una síntesis en solución. Sin embargo, los grupos R y sus posiciones se seleccionan para que afecten mínimamente a la condensación de los oligómeros conductores en una superficie, particularmente dentro de una monocapa, como se describe a continuación. En general, sólo se usan grupos R pequeños dentro de la monocapa, con grupos R de mayor tamaño generalmente por encima de la superficie de la monocapa. Por lo tanto, por ejemplo, se prefiere la unión de grupos metilo a la porción del oligómero conductor dentro de la monocapa para aumentar la solubilidad, realizándose preferiblemente la unión de grupos alcoxi más largos, por ejemplo de C3 a C10, por encima de la superficie de la monocapa. En general, para los sistemas descritos en este documento, esto significa generalmente que la unión de grupos R estéricamente significativos no se realiza en ninguna de las dos o tres primeras subunidades del oligómero, dependiendo de la longitud media de las moléculas que componen la
monocapa.

Los grupos R adecuados incluyen, pero sin limitación, hidrógeno, alquilo, alcohol, aromático, amido, amino, nitro, éteres, ésteres, aldehídos, sulfonilo, porciones de silicio, halógenos, porciones que contienen azufre, porciones que contienen fósforo y etilenglicoles. En las estructuras representadas en este documento, R es hidrógeno cuando la posición no está sustituida. Debe señalarse que algunas posiciones pueden permitir dos grupos de sustitución, R y R', en cuyo caso los grupos R y R' pueden ser iguales o diferentes.

Por "grupo alquilo" o equivalentes gramaticales se entiende en este documento un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada, prefiriéndose grupos alquilo de cadena lineal. Si están ramificados, pueden estar ramificados en una o más posiciones y, a menos que se especifique, en cualquier posición. El grupo alquilo puede variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 átomos de carbono (C1-C30), utilizando una realización preferida de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono (C1-C20), prefiriéndose de aproximadamente C1 a de aproximadamente C12 a aproximadamente C15, prefiriéndose particularmente de C1 a C5, aunque en algunas realizaciones el grupo alquilo puede ser mucho más largo. También se incluyen dentro de la definición de un grupo alquilo grupos cicloalquilo tales como anillos de C5 y C6, y anillos heterocíclicos con nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo. El alquilo también incluye heteroalquilo, prefiriéndose heteroátomos de azufre, oxígeno, nitrógeno y silicona. El alquilo incluye grupos alquilo sustituidos. Por "grupo alquilo sustituido" se entiende en este documento un grupo alquilo que comprende además una o más porciones de sustitución "R", como se han definido anteriormente.

Por "grupos amino" o equivalentes gramaticales se entienden en este documento grupos -NH_{2}, -NHR y -NR_{2}, siendo R como se ha definido en este documento.

Por "grupo nitro" se entiende en este documento un grupo -NO_{2}.

Por "porciones que contienen azufre" se entienden en este documento compuestos que contienen átomos de azufre, incluyendo, pero sin limitación, tia-, tio- y sulfocompuestos, tioles (-SH y -SR) y sulfuros (-RSR-). Por "porciones que contienen fósforo" se entienden en este documento compuestos que contienen fósforo, incluyendo, pero sin limitación, fosfinas y fosfatos. Por "porciones que contienen silicio" se entienden en este documento compuestos que contienen silicio.

Por "éter" se entiende en este documento un grupo -O-R. Los éteres preferidos incluyen grupos alcoxi, prefiriéndose -O-(CH_{2})_{2}CH_{3} y -O-(CH_{2})_{4}CH_{3}.

Por "éster" se entiende en este documento un grupo -COOR.

Por "halógeno" se entiende en este documento bromo, yodo, cloro o flúor. Son alquilos sustituidos preferidos alquilos parcialmente o totalmente halogenados tales como CF_{3}, etc.

Por "aldehído" se entienden en este documento grupos -RCHO.

Por "alcohol" se entienden en este documento grupos -OH y alcoholes alquílicos -ROH.

Por "amido" se entienden en este documento grupos -RCONH- o RCONR-.

Por "etilenglicol" o "(poli)etilenglicol" se entiende en este documento un grupo -(O-CH_{2}-CH_{2})_{n}-, aunque cada átomo de carbono del grupo etileno también puede estar individualmente o doblemente sustituido, es decir, -(O-CR_{2}-CR_{2})_{n}- con R como se ha descrito anteriormente. También se prefieren derivados de etilenglicol con otros heteroátomos en lugar de oxígeno (es decir, -(N-CH_{2}-CH_{2})_{n}- o -(S-CH_{2}-CH_{2})_{n}-, o con grupos de sustitución).

Los grupos de sustitución preferidos incluyen, pero sin limitación, metilo, etilo, propilo, grupos alcoxi, tales como O-(CH_{2})_{2}CH_{3} y -O-(CH_{2})_{4}CH_{3} y etilenglicol y derivados del mismo.

Los grupos aromáticos preferidos incluyen, pero sin limitación, fenilo, naftilo, naftaleno, antraceno, fenantrolina, pirol, piridina, tiofeno, porfirinas y derivados sustituidos de cada de uno de éstos, incluidos derivados de anillo condensado.

En los oligómeros conductores representados en este documento, cuando g es 1, B-D es un enlace que une dos átomos o porciones químicas. En una realización preferida, B-D es un enlace conjugado que contienen orbitales \pi superpuestos o conjugados.

Se seleccionan enlaces B-D preferidos de acetileno (-C\equivC, también denominado alquino o etino), alqueno
(-CH=CH-. también denominado etileno), alqueno sustituido (-CR=CR-, -CH=CR- y -CR=CH-), amida (-NH-CO- y -NR-CO- o -CO-NH- y -CO-NR-), azo (-N=N-), ésteres y tioésteres (-CO-O-, -O-CO-, -CS-O- y -O-CS-) y otros enlaces conjugados tales como (-CH=N-, -CR=N-, -N=CH- y -N=CR-), (-SiH=SiH-, -SiR=SiH-, -SiR=SiH- y -SiR=SiR-),
(-SiH=CH-, -SiR=CH-, -SiH=CR-, -SiR=CR-, -CH=SiH-, -CR=SiH-, -CH=SiR- y -CR=SiR-). Son enlaces B-D particularmente preferidos acetileno, alqueno, amida y derivados sustituidos de estos tres, y azo. Son enlaces B-D especialmente preferidos, acetileno, alqueno y amida. Los componentes oligoméricos unidos a dobles enlaces pueden estar en la conformación trans o cis o ser mezclas. Por lo tanto, B o D pueden incluir carbono, nitrógeno o silicio. Los grupos de sustitución son como se han definido anteriormente para R.

Cuando g = 0 en el oligómero conductor de Estructura 1, e es preferiblemente 1 y la porción D puede ser carbonilo o una porción heteroatómica como se ha definido anteriormente.

Como anteriormente para los anillos Y, dentro de cualquier oligómero conductor individual, los enlaces B-D (o porciones D, cuando g = 0) pueden ser todos iguales, o al meno uno puede ser diferente. Por ejemplo, cuando m es cero, el enlace B-D terminal puede ser un enlace amida y la porción de los enlaces B-D pueden ser enlaces acetileno. Generalmente, cuando están presentes enlaces amida, son preferibles tan pocos enlaces amida como sea posible, pero en algunas realizaciones todos los enlaces B-D son enlaces amida. Por lo tanto, como se ha descrito anteriormente para los anillos Y, puede estar presente un tipo de enlace B-D en el oligómero conductor dentro una monocapa como se describe a continuación, y otro tipo por encima del nivel de la monocapa, por ejemplo, para dar una mayor flexibilidad para la hibridación de ácidos nucleicos cuando el ácido nucleico se une a través de un oligómero conductor.

En las estructuras representadas en este documento, n es un número entero de 1 a 50, aunque también pueden usarse oligómeros más largos (véase, por ejemplo, Schumm et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994 33 (13): 1360). Sin estar ligado a teoría alguna, parece que para una hibridación eficaz de ácidos nucleicos en una superficie, la hibridación debería producirse a una distancia de la superficie, es decir, la cinética de hibridación aumenta en función de la distancia de la superficie, particularmente para oligonucleótidos largos de 200 a 300 pares de bases. Por consiguiente, cuando un ácido nucleico se une a través de un oligómero conductor, como se describe más completamente a continuación, la longitud del oligómero conductor es tal que el nucleótido más próximo del ácido nucleico se sitúa a de aproximadamente 6 \ring{A} a aproximadamente 100 \ring{A} (aunque pueden usarse distancias de hasta 500 \ring{A}) de la superficie del electrodo, prefiriéndose de aproximadamente 15 \ring{A} a aproximadamente 60 \ring{A} y prefiriéndose también de aproximadamente 25 \ring{A} a aproximadamente 60 \ring{A}. Por consiguiente, n dependerá del tamaño del grupo aromático, pero generalmente será de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, prefiriéndose de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 y prefiriéndose especialmente de aproximadamente 3 a aproximadamente 10.

En las estructuras representadas en este documento, m es 0 ó 1. Es decir, cuando m es 0, el oligómero conductor puede terminar en el enlace B-D o en la porción D, es decir, el átomo D está unido al ácido nucleico directamente o a través de un enlazador. En algunas realizaciones, por ejemplo, cuando el oligómero conductor está unido a un fosfato de la estructura de ribosa-fosfato de un ácido nucleico, puede haber átomos adicionales, tales como un enlazador, unidos entre el oligómero conductor y el ácido nucleico. Además, como se describe a continuación, el átomo D puede ser el átomo de nitrógeno de la ribosa modificada con amino. Como alternativa, cuando m es 1, el oligómero conductor puede terminar en Y, un grupo aromático, es decir, el grupo aromático está unido al ácido nucleico o enlazador.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, pueden utilizarse un gran número de oligómeros conductores posibles. Estos incluyen oligómeros conductores que se incluyen en las fórmulas de Estructura 1 y Estructura 8, así como otros oligómeros conductores, como se conocen en general en la técnica, incluyendo, por ejemplo, compuestos que comprenden anillos aromáticos condensados u oligómeros similares a Teflon® tales como -(CF_{2})_{n}-, -(CHF)_{n}- y -(CFR)_{n}-. Véase por ejemplo, Schumm et al., Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 1361 (1994); Grosshenny et al., Platinum Metals Rev. 40 (1): 26-35 (1996); Tour, Chem. Rev. 96: 537-553 (1996); Hsung et al., Organometallics 14: 4808-4815 (1995; y referencias citadas en los mismos.

Se representan a continuación oligómeros conductores particularmente preferidos de esta realización:

2

La Estructura 2 es la Estructura 1 cuando g es 1. Las realizaciones preferidas de la Estructura 2 incluyen: e es cero, Y es pirol o pirol sustituido; e es cero, Y es tiofeno o tiofeno sustituido; e es cero, Y es furano o furano sustituido; e es cero, Y es fenilo o fenilo sustituido; e es cero, Y es piridina o piridina sustituida; e es 1, B-D es acetileno e Y es fenilo o fenilo sustituido (véase la Estructura 4 a continuación). Una realización preferida de la Estructura 2 es también cuando e es uno, representada como Estructura 3 a continuación:

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3

Las realizaciones preferidas de la Estructura 3 son: Y es fenilo o fenilo sustituido y B-D es azo; Y es fenilo o fenilo sustituido y B-D es acetileno; Y es fenilo o fenilo sustituido y B-D es alqueno; Y es piridina o piridina sustituida y B-D es acetileno; Y es tiofeno o tiofeno sustituido y B-D es acetileno; Y es furano o furano sustituido y B-D es acetileno; Y es tiofeno o furano (o tiofeno o furano sustituido) y B-D son enlaces alqueno y acetileno alternos.

La mayoría de las estructuras representadas en este documento utiliza un oligómero conductor de Estructura 3. Sin embargo, cualquier oligómero de Estructura 3 puede sustituirse con cualquiera de las otras estructuras representadas en este documento, es decir, oligómero de Estructura 1 u 8, u otro oligómero conductor y el uso de dicha representación de Estructura 3 no pretende limitar el alcance de la invención.

Las realizaciones particularmente preferidas de la Estructura 3 incluyen las Estructuras 4, 5, 6, y 7, representadas a continuación:

4

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Las realizaciones particularmente preferidas de la Estructura 4 incluyen: n es dos, m es uno y R es hidrógeno; n es tres, m es cero y R es hidrógeno; y el uso de grupos R para aumentar la solubilidad.

5

6

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Cuando el enlace B-D es un enlace amida, como en la Estructura 5, los oligómeros conductores son oligómeros pseudopeptídicos. Aunque el enlace amida en la Estructura 5 se representa con el carbonilo a la izquierda, es decir, -CONH-, también puede usarse a la inversa, es decir, -NHCO-. Las realizaciones particularmente preferidas de la Estructura 5 incluyen: n es dos, m es uno y R es hidrógeno; n es tres, m es cero y R es hidrógeno (en esta realización, el nitrógeno terminal (el átomo D) puede ser el nitrógeno de la ribosa modificada con amino); y el uso de grupos R para aumentar la solubilidad.

7

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Las realizaciones preferidas de la Estructura 6 incluyen que la primera n sea dos, la segunda n sea uno, m sea cero y todos los grupos R sean hidrógeno, o el uso de grupos R para aumentar la solubilidad.

8

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Las realizaciones preferidas de la Estructura 7 incluyen: la primera n es tres, la segunda n es de 1-3, siendo m 0 ó 1, y el uso de grupos R para aumentar la solubilidad.

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En una realización preferida, el oligómero conductor tiene la estructura representada en la Estructura 8:

9

En esta realización, C son átomos de carbono, n es un número entero de 1 a 50, m es 0 ó 1, J es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, silicio, fósforo, azufre, carbonilo o sulfóxido, y G es un enlace seleccionado de alcano, alqueno o acetileno, de modo que junto con los dos átomos de carbono el grupo C-G-C- es un alqueno (-CH=CH-), alqueno sustituido (-CR=CR-) o mezclas de los mismos (-CH=CR- o -CR=CH-), acetileno (-C\equivC-) o alcano (-CR_{2}-CR_{2}-, siendo R un hidrógeno o un grupo de sustitución como se describe en este documento). El enlace G de cada subunidad puede ser igual o diferente de los enlaces G de otras subunidades; es decir, pueden usarse oligómeros alternos de enlaces alqueno y acetileno, etc. Sin embargo, cuando G es un enlace alcano, el número de enlaces alcano en el oligómero debería mantenerse al mínimo, prefiriéndose aproximadamente seis o menos enlaces sigma por oligómero conductor. Se prefieren enlaces alqueno y se representan en general en este documento, aunque los enlaces alcano y acetileno pueden sustituirse en cualquier estructura o realización descrita en este documento, como apreciarán los especialistas en la técnica.

En algunas realizaciones, por ejemplo cuando no están presentes ETM, si m = 0 entonces al menos uno de los enlaces G no es un enlace alcano.

En una realización preferida, la m de la Estructura 8 es cero. En una realización particularmente preferida, m es cero y G es un enlace alqueno, como se representa en la Estructura 9:

10

El oligómero alqueno de estructura 9 y otros representados en este documento, se representan generalmente en la configuración trans preferida, aunque también pueden usarse oligómeros de cis o mezclas de trans y cis. Como anteriormente, pueden añadirse grupos R para alterar la condensación de las composiciones en un electrodo, la hidrofilicidad o hidrofobicidad del oligómero y la flexibilidad, es decir, la flexibilidad rotacional, torsional o longitudinal del oligómero. n es como se ha definido anteriormente.

En una realización preferida, R es hidrógeno, aunque R también pueden ser grupos alquilo y grupos polietileno o derivados.

En una realización alternativa, el oligómero conductor puede ser una mezcla de tipos diferentes de oligómeros, por ejemplo de estructuras 1 y 8.

Además, el extremo terminal de al menos algunos de los oligómeros conductores en la monocapa está expuesto electrónicamente. Por "expuestos electrónicamente" se entiende en este documento que tras la colocación de un ETM en estrecha proximidad al extremo terminal, y después del inicio con la señal apropiada, puede detectarse una señal dependiente de la presencia del ETM. Los oligómeros conductores pueden tener o no grupos terminales. Por lo tanto, en una realización preferida, no existe ningún grupo terminal adicional y el oligómero conductor termina con uno de los grupos representados en las Estructuras 1 a 9; por ejemplo, un enlace B-D tal como un enlace acetileno. Como alternativa, en una realización preferida, se añade un grupo terminal, a veces representado en este documento como "Q". Puede usarse un grupo terminal por varias razones; por ejemplo, para contribuir a la disponibilidad electrónica del oligómero conductor para la detección de ETM o para alterar la superficie de la SAM por otras razones, por ejemplo, para evitar la unión inespecífica. Por ejemplo, puede haber grupos cargados negativamente en el extremo terminal para formar una superficie cargada negativamente, de modo que cuando el ácido nucleico es ADN o ARN el ácido nucleico se repele o se impide que se deposite en la superficie, para facilitar la hibridación. Los grupos terminales preferidos incluyen -NH_{2}, -OH, - COOH y grupos alquilo tales como -CH_{3} y (poli)alquilóxidos tales como (poli)etilenglicol, prefiriéndose -OCH_{2}CH_{2}OH, -(OCH_{2}CH_{2}O)_{2}H, -(OCH_{2}CH_{2}O)_{3}H y -(OCH_{2}CH_{2}O)_{4}H.

En una realización es posible usar mezclas de oligómeros conductores con diferentes tipos de grupos terminales. Por lo tanto, por ejemplo, algunos de los grupos terminales pueden facilitar la detección y algunos pueden evitar la unión inespecífica.

Se apreciará que la monocapa puede comprender diferentes especies oligoméricas conductoras, aunque preferiblemente las diferentes especies se seleccionan de modo que pueda formarse una SAM razonablemente uniforme. Por lo tanto, por ejemplo, cuando los ácidos nucleicos se unen covalentemente al electrodo usando oligómeros conductores, es posible tener un tipo de oligómero conductor usado para unir el ácido nucleico y otro tipo que funcione para detectar el ETM. De forma similar, puede ser deseable tener mezclas de diferentes longitudes de oligómeros conductores en la monocapa para ayudar a reducir las señales inespecíficas. Por lo tanto, por ejemplo, las realizaciones preferidas utilizan oligómeros conductores que terminan por debajo de la superficie de la porción de la monocapa, es decir, por debajo de la capa aislante, si se usa, o por debajo de alguna fracción de los otros oligómeros conductores. De forma similar, puede hacerse uso de diferentes oligómeros conductores para facilitar la formación de la monocapa o para preparar monocapas con propiedades modificadas.

En una realización preferida, las especies formados de monocapa son oligómeros conductores "interrumpidos", que contienen una porción alquilo en la mitad del oligómero conductor.

En una realización preferida, la monocapa comprende especies fotoactivables como EFS. Este esquema general se representa en la Figura 11. Se conocen en la técnica especies fotoactivables e incluyen éster 4,5-dimetoxi-2-nitrobencílico, que puede fotolizarse a 365 nm durante 2 horas.

En una realización preferida, la monocapa puede comprender además porciones aislantes. Por "aislante" se entiende en este documento un oligómero sustancialmente no conductor, preferiblemente lineal. Por "sustancialmente no conductor" se entiende en este documento que el aislante no transferirá electrones a 100 Hz. La velocidad de transferencia de electrones a través del aislante es preferiblemente más lenta que la velocidad a través de los oligómeros conductores que se describen en este documento.

En una realización preferida, los aislantes tienen una conductividad, S, de aproximadamente 10^{-7} \Omega^{-1} cm^{-1} o inferior, prefiriéndose de menos de aproximadamente 10^{-8} \Omega^{-1} cm^{-1}. Véase en general, Gardner et al., anteriormente.

Generalmente, los aislantes son oligómeros o porciones alquilo o heteroalquilo con enlaces sigma, aunque cualquier molécula aislante particular puede contener grupos aromáticos o uno o más enlaces conjugados. Por "heteroalquilo" se entiende en este documento un grupo alquilo que tiene al menos un heteroátomo, es decir, nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo, silicio o boro incluido en la cadena. Como alternativa, el aislante puede ser muy similar a un oligómero conductor con la adición de uno o más heteroátomos o enlaces que sirven para inhibir o ralentizar, preferiblemente sustancialmente, la transferencia de electrones.

Se conocen en la técnica aislantes adecuados e incluyen, pero sin limitación, -(CH_{2})_{n}-, -(CRH)_{n}- y -(CR_{2})_{n}-, etilenglicol o derivados usando otros heteroátomos en lugar de oxígeno, es decir, nitrógeno o azufre (no se prefieren los derivados de azufre cuando el electrodo es oro).

En cuanto a los oligómeros conductores, los aislantes pueden sustituirse con grupos R como se definen en este documento para alterar la condensación de la porciones u oligómeros conductores en un electrodo, la hidrofilicidad o hidrofobicidad del aislante y la flexibilidad, es decir, la flexibilidad rotacional, torsional o longitudinal del aislante. Por ejemplo, pueden usarse grupos alquilo ramificados. De forma similar, los aislantes pueden contener grupos terminales, como se han descrito anteriormente, particularmente para influir en la superficie de la monocapa.

En una realización preferida, la especie aislante incluida en la SAM utiliza nuevos procedimientos y composiciones que comprenden disulfuros asimétricos. Como se describe en este documento, las señales generadas a partir de sondas marcadoras pueden depender del comportamiento o de las propiedades de la SAM. Las SAM que comprenden "nanoconductos" o "electroconductos" proporcionan buenas señales. Por lo tanto, la presente invención proporciona aislantes asimétricos basados en disulfuros, siendo uno de los brazos una cadena alquilo más larga (u otra especie formadora de SAM) y comprendiendo el otro brazo un grupo voluminoso, tal como un grupo alquilo ramificado (que puede ser polar o apolar) para generar los nanoconductos. Se muestran dos especies ejemplares en las Figuras 31A y 31B, mostrándose los datos en la Figura 31C. Se muestran una diversidad de esquemas sintéticos en la Figura 32. Véase también Mukaiyama Tetrahedron Lett. 1968, 5907; Boustany Tetrahedron Lett. 1970 3547; Harpp Tetrahedron Lett. 1970 3551; y Oae, J. Chem. Soc. Chem. Commun, 1977, 407.

La longitud de la especie que compone la monocapa variará según sea necesario. Como se ha descrito anteriormente, parece que la hibridación es más eficaz a una distancia de la superficie. Las especies con las que se unen los ácidos nucleicos (como se describe a continuación, éstas pueden ser aislantes u oligómeros conductores) pueden tener básicamente la misma longitud que las especies formadoras de monocapa o ser de mayor longitud que las mismas, dando como resultado que los ácidos nucleicos sean más accesibles para el disolvente para la hibridación. En algunas realizaciones, los oligómeros conductores a los que se unen los ácidos nucleicos pueden ser más cortos que la monocapa.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, las combinaciones y proporciones reales de las diferentes especies que componen la monocapa pueden variar ampliamente, y dependerán de si se usa el mecanismo 1 ó 2. Generalmente, se prefieren sistemas de tres componentes para los sistemas de mecanismo-2, comprendiendo la primera especie una especie que contiene una sonda de captura unida al electrodo a través de un aislante o de un oligómero conductor. La segunda especie son oligómeros conductores y la tercera especie son aislantes. En esta realización, la primera especie puede comprender de aproximadamente el 90% a aproximadamente el 1%, prefiriéndose de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40%. Para ácidos nucleicos, se prefiere especialmente de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 40% para dianas oligonucleotídicas cortas, y se prefiere de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 20% para dianas más largas. La segunda especie puede comprender de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 90%, prefiriéndose de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 90% y prefiriéndose especialmente de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60%. La tercera especie puede comprender de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 90%, prefiriéndose de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40% y prefiriéndose especialmente de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 30%. Para conseguir estas proporciones aproximadas, son proporciones preferidas de primera:segunda:tercera especie en disolventes de formación de SAM de 2:2:1 para dianas cortas, 1:3:1 para dianas más largas, con una concentración total de tiol (cuando se usa para unir estas especies, como se describe más completamente a continuación) en el intervalo de 500 \muM a 1 mM, prefiriéndose
de 833 \muM.

Como alternativa, pueden usarse sistemas de dos componentes. En una realización, para el uso en sistemas de mecanismo-1 o de mecanismo-2, los dos componentes son la primera y segunda especie. En esta realización, la primera especie puede comprender de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 90%, prefiriéndose de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 40% y prefiriéndose especialmente de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 40%. La segunda especie puede comprender de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 90%, prefiriéndose de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 60% y prefiriéndose especialmente de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40%. Como alternativa, para sistemas de mecanismo-1, los dos componentes son la primera y la tercera especie. En esta realización, la primera especie puede comprender de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 90%, prefiriéndose de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 40% y prefiriéndose especialmente de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 40%. La segunda especie puede comprender de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 90%, prefiriéndose de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 60% y prefiriéndose especialmente de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40%.

En una realización preferida, la deposición de la SAM se realiza usando disolventes acuosos. Como se describe en general en Steel et al., Anal. Chem. 70: 4670 (1998), Heme et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 8916 (1997) y Finklea, Electrochemistry of Organized Monolayers of Thiols and Related Molecules on Electrodes, de A. J. Bard, Electroanalytical Chemistry: A Series of Advances, Vol. 20, Dekker N. Y. 1966-, la deposición de la especie formadora de SAM puede realizarse fuera de soluciones acuosas, que comprenden frecuentemente sal.

La unión covalente de los oligómeros conductores y aislantes puede realizarse de una diversidad de formas, dependiendo del electrodo y de la composición de los aislantes y oligómeros conductores usados. En una realización preferida, los enlazadores de unión con nucleósidos o ácidos nucleicos unidos covalentemente, como se representan en este documento, están unidos covalentemente a un electrodo. Por lo tanto, un extremo o extremo terminal del enlazador de unión se une al nucleósido o ácido nucleico y el otro se une a un electrodo. En algunas realizaciones puede ser deseable tener el enlazador de unión unido en una posición distinta de un extremo terminal, o incluso tener un enlazador de unión ramificado que esté unido a un electrodo en un extremo terminal y a dos o más nucleósidos en otro extremo terminal, aunque esto no se prefiere. De forma similar, el enlazador de unión puede estar unido en dos sitios al electrodo, como se representa en general en las Estructuras 11-13. En general, se usa algún tipo de enlazador, como se representa a continuación como "A" en la Estructura 10, donde "X" es el oligómero conductor, "I" es un aislante y la superficie sombreada es el electrodo:

11

12

En esta realización, "A" es un enlazador o átomo. La selección de "A" dependerá en parte de las características del electrodo. Por lo tanto, por ejemplo, A puede ser una porción de azufre cuando se usa un electrodo de oro. Como alternativa, cuando se usan electrodos de óxidos metálicos, A puede ser una porción de silicio (silano) unido al oxígeno del óxido (véase, por ejemplo, Chen et al., Langmuir 10: 3332-3337 (1994); Lenhard et al., J. Electroanal. Chem. 78: 195-201 (1977)). Cuando se usan electrodos basados en carbono, A puede ser una porción amino (preferiblemente una amina primaria; véase, por ejemplo, Deinhammer et al., Langmuir 10: 1306-1313 (1994)). Por lo tanto, las porciones A preferidas incluyen, pero sin limitación, porciones silano, porciones azufre (incluyendo porciones alquil sulfuro) y porciones amino. En una realización preferida, no se usan enlaces tipo epóxido con polímeros redox como se conocen en la técnica.

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Aunque se representan en este documento como una porción sencilla, los aislantes y oligómeros conductores pueden estar unidos al electrodo con más de una porción "A"; las porciones "A" pueden ser iguales o diferentes. Por lo tanto, por ejemplo, cuando el electrodo es un electrodo de oro y "A" es un átomo o porción de azufre, pueden usarse múltiples átomos de azufre para unir el oligómero conductor al electrodo, tal como se representa en general a continuación en las Estructuras 11, 12 y 13. Como apreciarán los especialistas en la técnica, puede generarse otras estructuras de este tipo. En las Estructuras 11, 12 y 13, la porción A es sólo un átomo de azufre, pero también pueden usarse porciones de azufre sustituidos.

13

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15

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También debe señalarse que de forma similar a la Estructura 13, puede ser posible tener un oligómero conductor que termine en un solo átomo de carbono con tres porciones de azufre unidos al electrodo. Además, aunque no siempre se represente en este documento, los oligómeros conductores y aislantes también pueden comprender un grupo terminal "Q".

En una realización preferida, el electrodo es un electrodo de oro y la unión es a través de un enlace de azufre, como se conoce bien en la técnica, es decir, la porción A es un átomo o porción de azufre. Aunque las características exactas de la unión oro-azufre no se conocen, este enlace se considera covalente para los fines de esta invención. Se representa una estructura representativa en la Estructura 14, usando el oligómero conductor de Estructura 3, aunque como para todas las estructuras representadas en este documento, puede usarse cualquiera de los oligómeros conductores, o combinaciones de oligómeros conductores. De forma similar, cualquiera de los oligómeros conductores o aislantes también puede comprender grupos terminales como se describen en este documento. La Estructura 14 representa el enlazador "A" como que comprende sólo un átomo de azufre, aunque pueden estar presentes átomos adicionales (es decir, enlazadores del azufre al oligómero conductor o grupos de sustitución). Además, la Estructura 14 muestra el átomo de azufre unido al grupo aromático Y, pero como apreciarán los especialistas en la técnica, también puede estar unido al grupo B-D (es decir, un acetileno).

17

En una realización preferida, el electrodo es un electrodo de carbono, es decir, un electrodo de carbono vítreo, y la unión es a través de un nitrógeno de un grupo amina. Se representa una estructura representativa en la Estructura 15. De nuevo, pueden estar presentes átomos adicionales, es decir, enlazadores de tipo Z y/o grupos terminales.

18

En la Estructura 16, el átomo de oxígeno es del óxido del electrodo de óxido metálico. El átomo de Si también puede contener otros átomos, es decir, puede ser una porción de silicio que contenga grupos de sustitución. Se conocen en la técnica otras uniones para SAM a otros electrodos; véase, por ejemplo, Napier et al., Langmuir, 1997, para la unión a electrodos de óxido de indio y estaño, y también la quimisorción de fosfatos a un electrodo de óxido de indio y estaño (conferencia por H. Holden Thorpe, CHI conference, 4-5 de mayo de 1998).

Las SAM de la invención puede prepararse de una diversidad de formas, incluyendo la deposición fuera de soluciones orgánicas y la deposición fuera de soluciones acuosas. Los procedimientos descritos en este documento usan un electrodo de oro como ejemplo, aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, también pueden usarse otros metales y procedimientos. En una realización preferida, se usa óxido de indio y estaño (ITO) como el electrodo.

En una realización preferida, una superficie de oro se limpia primero. Pueden emplearse una diversidad de procedimientos de limpieza, incluyendo, pero sin limitación, limpieza química o soluciones de ataque (incluyendo solución Piranha (peróxido de hidrógeno/ácido sulfúrico) o agua regia (acido clorhídrico/ácido nítrico), procedimientos electroquímicos, tratamiento a la llama, tratamiento con plasma o combinaciones de los mismos.

Después de la limpieza, el sustrato de oro se expone a la especie de SAM. Cuando el electrodo es de ITO, la especie de SAM es una especie que contiene fosfonato. Esto también puede realizarse de una diversidad de formas, incluyendo, pero sin limitación, deposición de solución, deposición de fase gaseosa, impresión por microcontacto, deposición por pulverización, deposición usando componentes puros, etc. Una realización preferida utiliza una solución de deposición que comprende una mezcla de diversas especies de SAM en solución, generalmente especies que contienen tiol. Habitualmente se preparan monocapas mixtas que contienen ácidos nucleicos usando un procedimiento de dos etapas. El ácido nucleico tiolado se deposita durante la primera etapa de deposición (generalmente en presencia de al menos otra especie formadora de monocapa) y la formación de la monocapa mixta se completa durante la segunda etapa, en la que se añade una segunda solución de tiol sin ácido nucleico. La segunda etapa implica con frecuencia un calentamiento suave para promover la reorganización de la monocapa.

En una realización preferida, la solución de deposición es una solución de deposición orgánica. En esta realización, se coloca una superficie de oro limpia en un vial limpio. Se prepara una solución de deposición de ligando de unión en un disolvente orgánico en la que la concentración total de tiol está entre micromolar y la saturación; los intervalos preferidos incluyente de aproximadamente 1 \muM a 10 mM, prefiriéndose especialmente de aproximadamente 400 \muM a aproximadamente 1,0 mM. En una realización preferida, la solución de deposición contiene ADN modificado con tiol (es decir, ácido nucleico unido a un enlazador de unión) y moléculas de diluyente de tiol (oligómeros conductores o aislantes, prefiriéndose estos últimos). La proporción de ácido nucleico con respecto a diluyente (si está presente) es habitualmente de entre 1000:1 1 y 1:1000, prefiriéndose de entre aproximadamente 10:1 1 y aproximadamente 1:10 y prefiriéndose especialmente de 1:1. Los disolventes preferidos son tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo, dimetilformamida (DMF), etanol o mezclas de los mismos; generalmente, puede usarse cualquier disolvente de polaridad suficiente para disolver el ligando de captura, siempre que el disolvente esté desprovisto de grupos funcionales que reaccionen con la superficie. Se añade una solución de deposición de ácido nucleico suficiente al vial de modo que cubra completamente la superficie del electrodo. El sustrato de oro se deja incubar a temperatura ambiente o ligeramente por encima de la temperatura ambiente durante un periodo de tiempo que varía de segundos a horas, prefiriéndose de 5-30 minutos. Después de la incubación inicial, la solución de deposición se retira y se añade una solución de moléculas de diluyente solamente (de aproximadamente 1 \muM a 10 mM, prefiriéndose de aproximadamente 100 \muM a aproximadamente 1,0 mM) en disolvente orgánico. El sustrato de oro se deja incubar a temperatura ambiente o por encima de la temperatura ambiente durante un periodo de tiempo (de segundos a días, prefiriéndose de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas). La muestra de oro se retira de la solución, se aclara en disolvente
limpio y se usa.

En una realización preferida, se usa una solución de deposición acuosa. Como anteriormente, se coloca una superficie de oro limpia en un vial limpio. Se prepara una solución de deposición de ácido nucleico en agua en la que la concentración total de tiol es de entre aproximadamente 1 \muM y 10 mM, prefiriéndose de aproximadamente 1 \muM a aproximadamente 200 \muM. Frecuentemente, la solución acuosa tiene sal presente (hasta la saturación, prefiriéndose de aproximadamente 1 M), aunque puede usarse agua pura. La solución de deposición contiene ácido nucleico modificado con tiol y con frecuencia una molécula de diluyente de tiol. La proporción de ácido nucleico con respecto a diluyente es habitualmente de entre entre 1000:1 y 1:1000, prefiriéndose de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10 y prefiriéndose especialmente de 1:1. La solución de deposición de ácido nucleico se añade al vial en un volumen tal que cubra completamente la superficie del electrodo. El sustrato de oro se deja incubar a temperatura ambiente o ligeramente por encima de la temperatura ambiente durante 1-30 minutos, siendo habitualmente suficientes 5 minutos. Después de la incubación inicial, se retira la solución de deposición y se añade una solución de moléculas de diluyente solamente (10 \muM-1,0 mM) en agua o disolvente orgánico. El sustrato de oro se deja incubar a temperatura ambiente o por encima de la temperatura ambiente hasta que se forma una monocapa completa (10 minutos-24 horas). La muestra de oro se retira de la solución, se aclara en disolvente limpio y se usa.

En una realización preferida, la solución de deposición comprende un compuesto zwitteriónico, preferiblemente betaína. Las realizaciones preferidas utilizan betaína y tampones Tris-HCl.

En una realización preferida, como se describe en este documento, se usa una placa de circuito como el sustrato para los electrodos de oro. La formación de las SAM en la superficie de oro se realiza generalmente limpiando primero las placas, por ejemplo, en una solución de ácido sulfúrico al 10% durante 30 segundos, soluciones detergentes, agua regia, plasma, etc., como se describen en este documento. Después del tratamiento con ácido sulfúrico, las placas se lavan, por ejemplo, por inmersión en dos baños de agua Milli-Q durante 1 minuto cada uno. Después se secan las placas, por ejemplo en una corriente de nitrógeno. La aplicación puntual de la solución de deposición sobre las placas se realiza usando gran cantidad de sistemas de aplicación puntual conocidos, generalmente por colocación de las placas en una mesa X-Y, preferiblemente en una cámara de humedad. El tamaño de la gota para aplicación puntual variará con el tamaño de los electrodos en las placas y el equipamiento usado para la administración de la solución; por ejemplo, para electrodos de 250 \muM de tamaño, se usa una gota de 30 nanolitros. El volumen debería ser suficiente para cubrir la superficie del electrodo completamente. La gota se incuba a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo (de segundos a una noche, prefiriéndose de 5 minutos) y después la gota se retira por aclarado en un baño de agua Milli-Q. Después, las placas se tratan preferiblemente con una segunda solución de deposición, que comprende generalmente un aislante en un disolvente orgánico, preferiblemente acetonitrilo, por inmersión en un baño a 45ºC. Después de 30 minutos, las placas se retiran y se sumergen en un baño de acetonitrilo durante 30 segundos, seguido de un baño con agua milli-Q durante 30 segundos. Las placas se secan en una corriente de
nitrógeno.

En una realización preferida, el electrodo que comprende la monocapa que incluye oligómeros conductores comprende además una sonda de captura de ácido nucleico. El ácido nucleico sonda de captura se une covalentemente al electrodo. Esta unión puede ser a través de un oligómero conductor o a través de un aislante. Por "sonda de captura" o "sonda de anclaje" se entiende en este documento un componente de un complejo de ensayo como se define en este documento, que permite la unión de una secuencia diana al electrodo con el fin de la detección. Como se describe más completamente a continuación, la unión de la secuencia diana a la sonda de captura puede ser directa (es decir, la secuencia diana hibrida con la sonda de captura) o indirecta (se usan una o más sondas extensoras de captura). Por "unidos covalentemente" se entiende en este documento que dos porciones están unidos por al menos un enlace, incluyendo enlaces sigma, enlaces pi y enlaces de coordinación. Además, como se describe más completamente a continuación, las sondas de captura pueden tener porciones tanto de ácido nucleico como que no sean de ácido nucleico. Por lo tanto, por ejemplo, pueden usarse enlazadores flexibles tales como grupos alquilo, incluyendo enlazadores de polietilenglicol, para quitar la porción de ácido nucleico de la sonda de captura de la superficie del electrodo. Esto puede ser particularmente útil cuando las secuencias diana sean grandes, por ejemplo, cuando la diana sea ADN genómico o ARNr.

El ácido nucleico sonda de captura se une covalentemente al electrodo a través de un "enlazador de unión", que puede ser un oligómero conductor, o a través de un aislante. Por lo tanto, un extremo del enlazador de unión se une a un ácido nucleico y el otro extremo (aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, no es necesario que sea exactamente el extremo terminal en ningún caso) se une al electrodo. Por lo tanto, cualquiera de las estructuras representadas en este documento puede comprender además un ácido nucleico eficazmente como grupo terminal. Por lo tanto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden ácidos nucleicos unidos covalentemente a electrodos, como se representa en general a continuación en la Estructura 17:

19

En la Estructura 17, las marcas sombreadas a la izquierda representan un electrodo. X es un oligómero conductor e I es un aislante, como se definen en este documento. F_{1} es un enlace que permite la unión covalente del electrodo y el oligómero conductor o aislante, incluyendo enlaces, átomos o enlazadores como se describen en este documento, por ejemplo, como "A", que se define a continuación. F_{2} es un enlace que permite la unión covalente del oligómero conductor o aislante al ácido nucleico y puede ser un enlace, un átomo o un enlazador, como se describen en este documento. F_{2} puede ser parte del oligómero conductor, parte del aislante, parte del ácido nucleico o exógeno a ambos, por ejemplo, como se define en este documento para "Z".

En una realización preferida, el ácido nucleico sonda de captura se une covalentemente al electrodo a través de un oligómero conductor. La unión covalente del ácido nucleico y el oligómero conductor pueden conseguirse de varias formas. En una realización preferida, la unión es mediante la unión a la base del nucleósido, mediante la unión a la estructura del ácido nucleico (a la ribosa, al fosfato o a un grupo análogo de una estructura análoga de ácido nucleico) o mediante un ligando de metal de transición, como se describe a continuación. Las técnicas que se describen a continuación se describen en general para ácidos nucleicos de origen natural aunque, como apreciarán los especialistas en la técnica, pueden usarse técnicas similares con análogos de ácidos nucleicos.

En una realización preferida, el oligómero conductor se une a la base de un nucleósido del ácido nucleico. Esto puede realizarse de varias formas, dependiendo del oligómero, como se describe a continuación. En una realización, el oligómero está unido a un nucleósido terminal, es decir, al nucleósido 3' ó 5' del ácido nucleico. Como alternativa, el oligómero conductor está unido a un nucleósido interno.

El punto de unión a la base variará con la base. Generalmente es posible la unión en cualquier posición. En algunas realizaciones, por ejemplo cuando la sonda que contiene los ETM puede usarse para hibridación, se prefiere unir en posiciones que no estén implicadas en la formación de enlaces de hidrógeno con la base complementaria. Por lo tanto, por ejemplo, generalmente la unión es en la posición 5 ó 6 de pirimidinas tales como uridina, citosina y timina. Para purinas tales como adenina y guanina, el enlace es preferiblemente por la posición 8. La unión a bases no convencionales se realiza preferiblemente en posiciones comparables.

En una realización, la unión es directa; es decir, no existen átomos intermedios entre el oligómero conductor y la base. En esta realización, por ejemplo, los oligómeros conductores con enlaces acetileno terminales se unen directamente a la base. La Estructura 18 es un ejemplo de este enlace, usando un oligómero conductor de Estructura 3 y uridina como base, aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, pueden usarse otras bases y oligómeros conductores:

20

Debe señalarse que las estructuras de pentosa representadas en este documento pueden tener unidos grupos hidrógeno, hidroxi, fosfatos u otros grupos tales como grupos aminos. Además, las estructuras de pentosa y nucleósido representadas en este documento se representan de forma no convencional, como imágenes especulares de la versión convencional. Además, las estructuras de pentosa y nucleósido también pueden contener grupos adicionales, tales como grupos protectores, en cualquier posición, por ejemplo, según sean necesarios durante la síntesis.

Además, la base puede contener modificaciones adicionales según sea necesario, es decir, los grupos carbonilo o amina pueden modificarse o protegerse, por ejemplo, como se representa en la Figura 18A del documento WO 98/20162. Esto puede ser necesario para evitar una dimerización significativa de oligómeros conductores en lugar de acoplamiento con la base de yodación. Además, también puede ser deseable cambiar los componentes de la reacción de paladio. Pueden preferirse grupos R en oligómeros conductores más largos para aumentar la solubilidad.

En una realización alternativa, la unión es por gran cantidad de enlazadores Z diferentes, incluyendo enlaces amida y amina, como se representa en general en la Estructura 19 usando uridina como base y un oligómero de Estructura 3:

21

En esta realización, Z es un enlazador. Preferiblemente, Z es un enlazador corto de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 átomos, prefiriéndose de 1 a 5 átomos, que no puede o no contener enlaces alqueno, alquinilo, amina, amida, azo, imina, etc. Se conocen la técnica enlazadores; por ejemplo, enlazadores homo o heterobifuncionales como son bien conocidos (véase, catálogo 1994 Pierce Chemical Company, sección técnica sobre reticulantes, páginas 155-200). Los enlazadores Z preferidos incluyen, pero sin limitación, grupos alquilo (incluyendo grupos alquilo sustituidos y grupos alquilo que contienen porciones heteroatómicos), prefiriéndose grupos alquilo cortos, ésteres, grupos amida, amina, epoxi y etilenglicol y derivados, prefiriéndose especialmente propilo, acetileno y alqueno C_{2}. Z también puede ser un grupo sulfona que forme enlaces sulfonamida como se analiza a continuación.

En una realización preferida, la unión del ácido nucleico y el oligómero conductor se realiza mediante la unión a la estructura del ácido nucleico. Esto puede realizarse de varias formas, incluyendo la unión a una ribosa de la estructura de ribosa-fosfato, o al fosfato de la estructura o a otros grupos de estructuras análogas.

Como una cuestión preliminar, debe entenderse que el sitio de unión en esta realización puede ser en un nucleótido terminal 3' ó 5', o en un nucleótido interno, como se describe más completamente a continuación.

En una realización preferida, el oligómero conductor está unido a la ribosa de la estructura de ribosa-fosfato. Esto puede realizarse de varias formas. Como se sabe en la técnica, pueden generarse nucleósidos que estén modificados en la posición 2' ó 3' de la ribosa con grupos amino, grupos azufre, grupos silicona, grupos fósforo o grupos oxo (Imazawa et al., J. Org. Chem., 44: 2039 (1979); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42 (4): 714 (1977); Verheyden et al., J. Orrg. Chem. 36 (2): 250 (1971); McGee et al., J. Org. Chem. 61: 781-785 (1996); Mikhailopulo et al., Liebigs. Ann. Chem. 513-519 (1993); McGee et al., Nucleosides & Nucleotides 14 (6): 1329 (1995). Después, estos nucleósidos modificados se usan para añadir los oligómeros conductores.

Una realización preferida utiliza nucleósidos modificados con amino. Después, estas ribosas modificadas con amino pueden usarse para formar enlaces amida o amina con los oligómeros conductores. En una realización preferida, el grupo amino está unido directamente a la ribosa, aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, pueden estar presentes enlazadores cortos tales como los descritos en este documentos para "Z" entre el grupo amino y la ribosa.

En una realización preferida, se usa un enlace amida para la unión a la ribosa. Preferiblemente, si se usa el oligómero conductor de las Estructuras 1-3, m es cero y, por lo tanto, el oligómero conductor termina en el enlace amida. En esta realización, el nitrógeno del grupo amino de la ribosa modificada con amino es el átomo "D" del oligómero conductor. Por lo tanto, se representa una unión preferida de esta realización en la Estructura 20 (usando el oligómero conductor de Estructura 3):

22

Como apreciarán los especialistas en la técnica, la Estructura 20 tiene el enlace terminal fijo como un enlace amida.

En una realización preferida, se usa un enlace heteroatómico, es decir, oxo, amina, azufre, etc. Una realización preferida utiliza un enlace amina. De nuevo, como se ha descrito anteriormente para los enlaces amida, para enlaces amina, el nitrógeno de la ribosa modificada con amino puede ser el átomo "D" del oligómero conductor cuando se usa el oligómero conductor de Estructura 3. Por lo tanto, por ejemplo, las Estructuras 21 y 22 representan nucleósidos con los oligómeros conductores de las Estructuras 3 y 9 respectivamente, usando el nitrógeno como heteroátomo, aunque pueden usarse otros heteroátomos:

23

En la Estructura 21, preferiblemente ni m ni t son cero. Un Z preferido aquí es un grupo metileno u otro enlazador alquilo alifático. Uno, dos o tres carbonos en esta posición son particularmente útiles por razones sintéticas; véase el documento WO 98/20162.

24

En la estructura 22, Z es como se ha definido anteriormente. Los enlazadores adecuados incluyen metileno y etileno.

En una realización alternativa, el oligómero conductor está unido covalentemente al ácido nucleico a través del fosfato de la estructura de ribosa-fosfato (o análogos) de un ácido nucleico. En esta realización, la unión es directa, utiliza un enlazador o es mediante un enlace amida. La Estructura 23 representa un enlace directo y la Estructura 24 representa un enlace mediante un enlace amida (ambos utilizan el oligómero conductor de Estructura 3, aunque también son posibles oligómeros conductores de Estructura 8). Las Estructuras 23 y 24 representan el oligómero conductor en la posición 3', aunque también es posible la posición 5'. Además, tanto las Estructuras 23 como 24 representan enlaces fosfodiéster de origen natural, aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, también pueden usarse análogos no convencionales de enlaces fosfodiéster.

25

En la Estructura 23, si la Y terminal está presente (es decir, m = 1), entonces preferiblemente Z no está presente (es decir, t = 0). Si la Y terminal no está presente, entonces Z está preferiblemente presente.

La Estructura 24 representa una realización preferida, en la que el enlace B-D terminal es un enlace amida, la Y terminal no está presente y Z es un enlazador, como se define en este documento.

26

En una realización preferida, el oligómero conductor está unido covalentemente al ácido nucleico a través de un ligando de metal de transición. En esta realización, el oligómero conductor está unido covalentemente a un ligando que suministra uno o más de los átomos de coordinación para un metal de transición. En una realización, el ligando al que está unido el oligómero conductor también tiene unido el ácido nucleico, como se representa en general a continuación en la Estructura 25. Como alternativa, el oligómero conductor está unido a un ligando y el ácido nucleico está unido a otro ligando, como se representa en general a continuación en la Estructura 26. Por lo tanto, en presencia del metal de transición, el oligómero conductor se une covalentemente al ácido nucleico. Ambas estructuras representan oligómeros conductores de Estructura 3, aunque pueden utilizarse otros oligómeros. Las Estructuras 25 y 26 representan dos estructuras representativas:

27

En las estructuras representadas en este documento, M es un átomo metálico, prefiriéndose metales de transición. Los metales de transición adecuados para el uso en la invención incluyen, pero sin limitación, cadmio (Cd), cobre (Cu), cobalto (Co), paladio (Pd), cinc (Zn), hierro (Fe), rutenio (Ru), rodio (Rh), osmio (Os), renio (Re), platino (Pt), escandio (Sc), titanio (Ti), vanadio (V), cromo (Cr), manganeso (Mn), níquel (Ni), molibdeno (Mo), tecnecio (Tc), tungsteno (W) e iridio (Ir). Es decir, se prefiere la primera serie de metales de transición, los metales de platino (Ru, Rh, Pd, Os, Ir y Pt), junto con Fe, Re, W, Mo y Tc. Se prefieren particularmente rutenio, renio, osmio, platino, cobalto y hierro.

L son los coligandos que suministran los átomos de coordinación para la unión del ión metálico. Como apreciarán los especialistas en la técnica, el número y la naturaleza de los coligandos dependerán del número de coordinación del ión metálico. Pueden usarse coligandos mono-, di- o polidentados en cualquier posición. Por lo tanto, por ejemplo, cuando el metal tiene un número de coordinación de seis, el L del extremo terminal del oligómero conductor, el L aportado por el ácido nucleico y r suman seis. Por lo tanto, cuando el metal tiene un número de coordinación de seis, r puede variar de cero (cuando todos los átomos de coordinación se suministran por los otros dos ligandos) a cuatro, cuando todos los coligandos son monodentados. Por lo tanto, generalmente, r será de 0 a 8 dependiendo del número de coordinación del ión metálico y de la selección de los otros ligandos.

En una realización, el ión metálico tiene un número de coordinación de seis y tanto el ligando unido al oligómero conductor como el ligando unido al ácido nucleico son al menos bidentados; es decir, r es preferiblemente cero, uno (es decir, el coligando restante es bidentado) o dos (se usan dos coligandos monodentados).

Como se apreciará en la técnica, los coligandos pueden ser iguales o diferentes. Los ligandos adecuados se incluyen en dos categorías: ligandos que usan átomos de nitrógeno, oxígeno, azufre, carbono o fósforo (dependiendo del ión metálico) como los átomos de coordinación (generalmente denominados en la bibliografía como donadores sigma (\sigma)) y ligandos organometálicos tales como ligandos de metaloceno (generalmente denominados en la bibliografía como donadores pi (\pi) y representados en este documento como L_{m}). Se conocen bien en la técnica ligandos donadores de nitrógeno adecuados e incluyen, pero sin limitación, NH_{2}; NHR; NRR'; piridina; pirazina; isonicotinamida; imidazol; bipiridina y derivados sustituidos de bipiridina; terpiridina y derivados sustituidos; fenantrolinas, particularmente 1,10-fenantrolina (abreviada phen) y derivados sustituidos de fenantrolinas, tales como 4,7-dimetilfenantrolina y dipiridol[3,2-a:2',3'-c]fenazina (abreviada dppz); dipiridofenazina; 1,4,5,8,9,12-hexaazatrifenileno (abreviado hat); diimina de 9,10-fenantrenoquinona (abreviada phi); 1,4,5,8-tetraazafenantreno (abreviado tap); 1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano (abreviado cyclam), EDTA, EGTA e isocianuro. También pueden usarse derivados sustituidos, incluyendo derivados condensados. En algunas realizaciones, pueden usarse porfirinas y derivados sustituidos de la familia de porfirinas. Véase, por ejemplo, Comprehensive Coordination Chemistry, Ed. Wilkinson et al., Pergammon Press, 1987, Capítulos 13.2 (págs. 73-98), 21.1 (págs. 813-898) y 21.3 (págs. 915-957).

Se conocen en la técnica ligandos donadores sigma adecuados usando carbono, oxígeno, azufre y fósforo. Por ejemplo, se encuentran donadores de carbono sigma adecuados en Cotton y Wilkenson, Advanced Organic Chemistry, 5ª Edición, John Wiley & Sons, 1988, véase la página 38, por ejemplo. De forma similar, los ligandos de oxígeno adecuados incluyen éteres corona, agua y otros conocidos en la técnica. También son adecuadas fosfinas y fosfinas sustituidas; véase la página 38 de Cotton y Wilkenson.

Los ligandos donadores de oxígeno, azufre, fósforo y nitrógeno se unen de tal forma que permiten que los heteroátomos sirvan como átomos de coordinación.

En una realización preferida, se usan ligandos organometálicos. Además de compuestos puramente orgánicos para el uso como porciones redox y diversos complejos de coordinación de metales de transición con ligandos orgánicos unidos mediante enlace \delta con átomos donadores como sustituyentes heterocíclicos o exocíclicos, están disponibles una amplia diversidad de compuestos organometálicos de metales de transición con ligandos orgánicos unidos mediante enlace \pi (véase Advanced Inorganic Chemistry, 5ª Ed., Cotton & Wilkinson, John Wiley & Sons, 1988, capítulo 26; Organometallics, A Concise Introduction, Elschenbroich et al., 2ª Ed., 1992, VCH; y Comprehensive Organometallic Chemistry II, A Review of the Literature 1982-1994, Abel et al. Ed., Vol. 7, capítulos 7, 8, 10 y 11, Pergamon Press). Dichos ligandos organometálicos incluyen compuestos aromáticos cíclicos tales como el ión ciclopentadienuro [C_{5}H_{5}(-1)] y diversos derivados sustituidos con anillo y condensados con anillo tales como el ión indeniluro (-1), que produce una clase de compuestos metálicos de bis(ciclopentadieilo) (es decir, los metalocenos); véase, por ejemplo, Robins et al., J. Am. Chem. Soc. 104: 1882-1893 (1982); y Gassman et al., J. Am. Chem. Soc. 108: 4228-4229 (1986). De éstos, el ferroceno [(C_{5}H_{5})_{2}Fe] y sus derivados son ejemplos prototípicos que se han usado en una amplia diversidad de reacciones de transferencia de electrones químicas (Connelly et al., Chem. Rev. 96: 877-910 (1996)) y electroquímicas (Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 23: 1-93; y Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 24: 87) o "redox". Los derivados de metaloceno de una diversidad de los metales de transición de la primera, segunda y tercera filas son candidatos potenciales como porciones redox que se unen covalentemente al anillo de ribosa o a la base de nucleósido del ácido nucleico. Otros ligandos organometálicos potencialmente adecuados incluyen arenos cíclicos tales como benceno, para dar compuestos bis(areno)metálicos y sus derivados sustituidos con anillo y condensados con anillo, siendo un ejemplo prototípico el bis(benceno)cromo. Otros ligandos acíclicos unidos mediante enlace \pi tales como el ión alilo (-1) o butadieno producen compuestos organometálicos potencialmente adecuados y todos estos ligandos, junto con otros ligandos unidos mediante enlaces n y enlaces \delta constituyen la clase general de compuestos organometálicos en los que existe un enlace de metal con carbono. Los estudios electroquímicos de diversos dímeros y oligómeros de dichos compuestos con ligandos orgánicos que forman enlaces y ligandos adicionales que no forman enlaces, así como con y sin enlaces metal-metal son porciones redox candidatos potenciales en el análisis de ácidos nucleicos.

Cuando uno o más de los coligandos es un ligando organometálico, el ligando se une generalmente mediante uno de los átomos de carbono del ligando organometálico, aunque la unión puede ser mediante otros átomos para ligandos heterocíclicos. Los ligandos organometálicos preferidos incluyen ligandos de metaloceno, incluyendo derivados sustituidos, y los metalocenofanos (véase la página 1174 de Cotton y Wilkenson, anteriormente). Por ejemplo, pueden usarse derivados de ligandos de metaloceno tales como metilciclopentadienilo, prefiriéndose múltiples grupos metilo, tales como pentametilciclopentadienilo, para aumentar la estabilidad del metaloceno. En una realización preferida, sólo se derivatiza uno de los dos ligandos de metaloceno de un metaloceno.

Como se describe en este documento, puede usarse cualquier combinación de ligandos. Las combinaciones preferidas incluyen: a) todos los ligandos son ligandos donadores de nitrógeno; b) todos los ligandos son ligandos organometálicos; y c) el ligando en el extremo terminal del oligómero conductor es un ligando de metaloceno y el ligando proporcionado por el ácido nucleico es un ligando donador de nitrógeno, siendo los otros ligandos, si es necesario, ligandos donadores de nitrógeno o ligandos de metaloceno o una mezcla. Estas combinaciones se representan en estructuras representativas usando el oligómero conductor de Estructura 3, se representan en las Estructuras 27 (usando fenantrolina y amino como ligandos representativos), 28 (usando ferroceno como la combinación de metal-ligando) y 29 (usando ciclopentadienilo y amino como ligandos representativos).

28

Además de servir como uniones para oligómeros conductores y electrodos, las composiciones anteriores también pueden usarse como marcadores ETM. Es decir, como se describe en las Figuras 19 y 20, pueden añadirse metales de transición (u otros ETM) unidos a oligómeros conductores a los ácidos nucleicos para su detección. En esta realización, sin estar ligado a teoría alguna, el oligómero conductor, que termina preferiblemente en un enlace F1 (un enlace que permite la unión del oligómero conductor a la superficie) penetrará en la SAM y facilitará la transferencia de electrones entre el ETM y el electrodo. Sin estar ligado a teoría alguna, esto parece permitir una transferencia de electrones rápida, similar a un sistema de "mecanismo-1", proporcionando una ruta directa para electrones; esto se denomina a veces en este documento "conexión por cable".

Sorprendentemente, como se describe en el Ejemplo 3, el sistema parece funcionar independientemente de que la porción F1 esté o no protegido; es decir, puede no ser necesaria una unión directa para aumentar la respuesta de frecuencia del ETM. Por lo tanto, el oligómero conductor puede terminar en una porción F1, una porción F1 protegido con un grupo protector (véase Greene, anteriormente) o no es necesario que termine en una porción F1 en absoluto; también pueden usarse grupos terminales como los que sean en las superficies de las SAM. Como alternativa, puede ser suficiente el extremo terminal sin protección del oligómero conductor.

En esta realización pueden usarse una pluralidad de ETM por "rama". Pueden estar unidos como un grupo, por ejemplo, como un polímero de metaloceno, terminales en el oligómero conductor o pueden ser grupos de sustitución fuera del oligómero conductor. En general, las realizaciones preferidas utilizan la conjugación de electrones entre los ETM y el oligómero conductor para facilitar la transferencia de electrones.

En general, la longitud del oligómero conductor en esta realización variará con la longitud de la SAM en el electrodo, y las realizaciones preferidas utilizan oligómeros de dos unidades y de tres unidades. Los oligómeros conductores preferidos en esta realización son los mismos que los descritos anteriormente para la unión de ácidos nucleicos a electrodos, siendo los más preferidos los oligómeros de fenilacetileno.

En esta realización, generalmente se sintetiza el ETM con el oligómero conductor y después se genera una porción fosforamidita.

En una realización preferida, los ligandos usados en la invención muestran propiedades fluorescentes alteradas dependiendo del estado redox del ión metálico quelado. Como se describe a continuación, esto sirve por lo tanto como un modo adicional de detección de la transferencia de electrones entre el ETM y el electrodo.

En una realización preferida, como se describe más completamente a continuación, el ligando unido al ácido nucleico es un grupo amino unido en la posición 2' ó 3' de una ribosa de la estructura de ribosa-fosfato. Este ligando puede contener una multiplicidad de grupos amino para formar un ligando polidentado que se una al ión metálico. Otros ligandos preferidos incluyen ciclopentadieno y fenantrolina.

El uso de iones metálicos para conectar los ácidos nucleicos puede servir como control interno o calibración del sistema para evaluar el número de ácidos nucleicos disponibles en la superficie. Sin embargo, como apreciarán los especialistas en la técnica, si se usan iones metálicos para conectar los ácidos nucleicos con los oligómeros conductores, generalmente es deseable que este complejo de ión metálico tenga un potencial redox diferente del de los ETM usados en la porción del sistema, como se describe a continuación. Generalmente esto se cumple de modo que se pueda distinguir la presencia de la sonda de captura de la presencia de la secuencia diana. Esto puede ser útil para la identificación, calibración y/o cuantificación. Por lo tanto, la cantidad de sonda de captura en un electrodo puede compararse con la cantidad de ácido nucleico bicatenario hibridado para cuantificar la cantidad de secuencia diana en una muestra. Esto es muy significativo para servir como control interno del detector o sistema. Esto permite una medición anterior a la adición de diana o posterior, sobre las mismas moléculas que se usarán para la detección, en lugar de depender de un sistema de control similar pero diferente. Por lo tanto, las moléculas reales que se usarán para la detección pueden cuantificarse antes de cualquier experimento. Esta es una ventaja significativa sobre procedimientos anteriores.

En una realización preferida, los ácidos nucleicos de sonda de captura se unen covalentemente al electrodo mediante un aislante. Se conoce bien la unión de ácidos nucleicos a aislantes tales como grupos alquilo y puede realizarse en la base o la estructura, incluyendo la ribosa o el fosfato para estructuras que contienen estas porciones, o a estructuras alternativas para análogos de ácidos nucleicos.

En una realización preferida, puede haber una o más especies de sondas de captura diferentes en la superficie, como se representa en general en las Figuras. En algunas realizaciones, puede haber un tipo de sonda de captura, o un tipo de extensor de sonda de captura, como se describe más completamente a continuación. Como alternativa, pueden usarse sondas de captura diferentes, o una sonda de captura con una multiplicidad de sondas extensoras de captura diferentes. De forma similar, puede ser deseable usar sondas de captura auxiliares, que comprenden secuencias de sonda relativamente cortas, que pueden usarse para "sujetar" los componentes del sistema, por ejemplo, los enlazadores de reclutamiento, para aumentar la concentración de ETM en la superficie.

Por lo tanto, la presente invención proporciona electrodos que comprenden monocapas que comprenden oligómeros conductores y sondas de captura, útiles en sistemas de detección de ácidos nucleicos. En una realización preferida, las composiciones comprenden además una sonda marcadora. La sonda marcadora es un ácido nucleico, generalmente de cadena sencilla, aunque como se describe más completamente a continuación, puede contener porciones de doble cadena. La sonda marcadora comprende una primera porción que es capaz de hibridar con un componente del complejo de ensayo, definido a continuación, y una segunda porción que no hibrida con un componente de un complejo de ensayo y que comprende al menos un ETM unido covalentemente.

Por lo tanto, se proporcionan sondas marcadoras con ETM unidos covalentemente. Las expresiones "porción donadora de electrones", "porción aceptora de electrones" y "ETM" (ETM) o equivalentes gramaticales se refieren en este documento a moléculas capaces de la transferencia de electrones en condiciones determinadas. Debe entenderse que las capacidades donadora y aceptora de electrones son relativas; es decir, una molécula que puede perder un electrón en ciertas condiciones experimentales será capaz de aceptar un electrón en condiciones experimentales diferentes. Debe entenderse que el número de porciones donadores de electrones y porciones aceptores de electrones posibles es muy grande, y que un especialista en la técnica de compuestos de transferencia de electrones será capaz de utilizar varios compuestos en la presente invención. Los ETM preferidos incluyen, pero sin limitación, complejos de metales de transición, ETM orgánicos y electrodos.

En una realización preferida, los ETM son complejos de metales de transición. Los metales de transición son aquellos cuyos átomos tienen una corteza d de electrones parcial o completa. Se han enumerado anteriormente los metales de transición adecuados para el uso en la invención.

Los metales de transición forman complejos con una diversidad de ligandos, L, definidos anteriormente, para formar complejos de metales de transición adecuados, como se conocen bien en la técnica.

Además de complejos de metales de transición, otros donadores y aceptores de electrones orgánicos pueden unirse covalentemente al ácido nucleico para el uso en la invención. Estas moléculas orgánicas incluyen, pero sin limitación, riboflavina, colorantes de xantano, colorantes de azina, naranja de acridina, dicloruro de N,N'-dimetil-2,7-diazapirenio (DAP^{2+}), metilviológeno, bromuro de etidio, quinonas tales como dicloruro de N,N'-dimetilantra(2,1,9-def:6,5,10-d'e'f')diisoquinolina (ADIQ^{2+}); porfirinas ([tetracloruro de meso-tetrakis(N-metil-x-piridinio)porfirina], clorhidrato de varlamina azul B, verde de Binschedler; 2,6-dicloroindofenol, 2,6-dibromofenolindofenol; azul marino Brillante (cloruro de 3-amino-9-dimetil-amino-10-metilfenoxiazina), azul de metileno; azul Nilo A (sulfato de aminoaftodietilaminofenoxazina), ácido indigo-5,5',7,7'-tetrasulfónico, ácido indigo-5,5',7-trisulfónico; fenosafranina, ácido indigo-5-monosulfónico; safranina T; cloruro de bis(dimetil-glioximato)-hierro(II); escarlata de indulina, rojo neutro, antraceno, coroneno, pireno, 9-fenilantraceno, rubreno, binaftilo, DPA, fenotiazeno, fluoranteno, fenantreno, criseno, 1,8-difenil-1,3,5,7-octatetraceno, naftaleno, acenaftaleno, perileno, TMPD y análogos y derivados sustituidos de estos compuestos.

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En una realización, los donadores y aceptores de electrones son proteínas redox como se conocen en la técnica. Sin embargo, no se prefieren proteínas redox en muchas realizaciones.

La selección de los ETM específicos estará influenciada por el tipo de detección de transferencia de electrones que se use, como se describe en general a continuación. Los ETM preferidos son metalocenos, prefiriéndose particularmente el ferroceno.

Sin estar ligado a teoría alguna, parece que en los sistemas de "mecanismo-2", la transferencia de electrones se facilita cuando el ETM es capaz de penetrar ("arrimarse") hacia la monocapa en cierto grado. Es decir, en general, parece que los ETM hidrófobos usados con SAM hidrófobos dan origen a mejores señales (mayores) que los ETM que están cargados o que son más hidrófilos. Por lo tanto, por ejemplo, el ferroceno en solución puede penetrar en las monocapas de los ejemplos y dar una señal cuando existen electroconductos, mientras que el ferrocianuro en solución proporciona una escasa o ninguna señal. Por lo tanto, en general, se prefieren ETM hidrófobos en los sistemas de mecanismo-2; sin embargo, los complejos de metales de transición, aunque cargados, con uno o más ligandos hidrófobos tales como complejos de Ru y Os, también dan origen a buenas señales. De forma similar, la transferencia de electrones entre el ETM y electrodo se facilita mediante el uso de enlazadores o espaciadores que permitan al ETM cierta flexibilidad para penetrar en la monocapa; por lo tanto, las composiciones N6 de la invención tienen un enlazador de cuatro carbonos uniendo el ETM al ácido nucleico. Además, como se describe en este documento, la selección de la pareja ETM/monocapa puede aprovecharse durante el genotipado.

Se usan una pluralidad de ETM de acuerdo con la invención, como se definen en las reivindicaciones. Como se muestra en los ejemplos, el uso de múltiples ETM proporciona una amplificación de la señal y, por lo tanto, permite unos límites de detección más sensibles. Como se analiza a continuación, aunque el uso de múltiples ETM en ácidos nucleicos que hibridan con cadenas complementarias puede causar disminuciones en las T_{m} de los complejos de hibridación dependiendo del número, sitio de unión y distancia entre los múltiples ETM, éste no es un factor cuando los ETM están en el enlazador de reclutamiento, puesto que éste no hibrida con una secuencia complementaria. Por consiguiente, se prefieren pluralidades de ETM, prefiriéndose al menos aproximadamente 2 ETM por enlazador de reclutamiento, y prefiriéndose particularmente al menos aproximadamente 10 y prefiriéndose especialmente al menos aproximadamente 20 a 50. En algunos casos, pueden usarse cantidades muy grandes de ETM (de 100 a 1000).

Como apreciarán los especialistas en la técnica, la porción de la sonda marcadora (o diana, en algunas realizaciones) que comprende los ETM (denominada en este documento "enlazador de reclutamiento" o "portador de señal") puede ser un ácido nucleico, o puede ser un enlazador que no sea un ácido nucleico, que enlaza la primera porción hibridable de la sonda marcadora con los ETM. Es decir, puesto que esta porción de la sonda marcadora no es necesaria para la hibridación, no necesita ser un ácido nucleico, aunque esto puede realizarse para facilitar la síntesis. En algunas realizaciones, como se describe más completamente a continuación, el enlazador de reclutamiento puede comprender porciones de doble cadena. Por lo tanto, como apreciarán los especialistas en la técnica, existen una diversidad de configuraciones que pueden usarse. En una realización preferida, el enlazador de reclutamiento es un ácido nucleico (incluyendo análogos), y la unión de los ETM puede ser mediante (1) una base; (2) la estructura, incluyendo la ribosa, el fosfato, o estructuras comparables en análogos de ácidos nucleicos; (3) reemplazo de nucleósidos, que se describe a continuación; o (4) polímeros de metaloceno, como se describen a continuación. En una realización preferida, el enlazador de reclutamiento no es un ácido nucleico y puede ser un polímero de metaloceno o un polímero de tipo alquilo (incluyendo heteroalquilo, como se describe más completamente a continuación) que contengan grupos de sustitución de ETM. Estas opciones se representan en general en las Figuras.

En una realización preferida, el enlazador de reclutamiento es un ácido nucleico y comprende ETM unidos covalentemente. Los ETM pueden estar unidos a nucleósidos dentro del ácido nucleico en una diversidad de posiciones. Las realizaciones preferidas incluyen, pero sin limitación, (1) unión a la base del nucleósido, (2) unión al ETM como reemplazo de una base, (3) unión a la estructura del ácido nucleico, incluyendo a una ribosa de la estructura de ribosa-fosfato o a una porción fosfato o a estructuras análogas en análogos de ácidos nucleicos y (4) unión mediante polímeros de metaloceno, prefiriéndose esta última.

Además, como se describe a continuación, cuando el enlazador de reclutamiento es un ácido nucleico, puede ser deseable usar sondas marcadoras secundarias, que tienen una primera porción que hibridará con una porción de las sondas marcadoras primarias y una segunda porción que comprende un enlazador de reclutamiento como se define en este documento. Esto se representa en general en la Figura 16H; esto es similar al uso de una sonda amplificadora, excepto porque tanto la sonda marcadora primaria como la secundaria comprenden ETM.

En una realización preferida, el ETM está unido a la base de un nucleósido, como se ha descrito en general anteriormente para la unión del oligómero conductor. La unión puede ser a un nucleósido interno o a un nucleósido terminal.

La unión covalente a la base dependerá en parte del ETM seleccionado, pero en general es similar a la unión de oligómeros conductores a bases, como se ha descrito anteriormente. La unión puede realizarse en general en cualquier posición de la base. En una realización preferida, el ETM es un complejo de metal de transición y, por lo tanto, la unión de un ligando metálico adecuado a la base conduce a la unión covalente del ETM. Como alternativa, pueden usarse tipos de enlaces similares para la unión de ETM orgánicos, como apreciarán los especialistas en la técnica.

En una realización, el grupo amino de citosina unido a C4, el grupo amino de adenina unido a C6, o el grupo amino de guanina unido a C2 pueden usarse como ligando de metal de transición.

Los ligandos que contienen grupos aromáticos pueden unirse mediante enlaces acetileno como se sabe en la técnica (véase Comprehensive Organic Synthesis, Trost et al., Ed., Pergamon Press, Capítulo 2.4: Coupling Reactions Between sp2 and sp Carbon Centers, Sonogashira, págs. 521-549 y págs. 950-953). La Estructura 30 representa una estructura representativa en presencia del ión metálico y cualquier otro ligando necesario; la Estructura 30 representa uridina, aunque como para todas las estructuras de este documento, también puede usarse cualquier otra base.

29

L_{a} es un ligando que puede incluir ligandos donadores de nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo o ligandos organometálicos tales como ligandos de metaloceno. Los ligandos L_{a} adecuados incluyen, pero sin limitación, fenantrolina, imidazol, bpy y terpy. L y M son como se han definido anteriormente. De nuevo, los especialistas en la técnica apreciarán que puede incluirse un enlazador ("Z") entre el nucleósido y el ETM.

De forma similar, como para los oligómeros conductores, el enlace puede realizarse usando un enlazador, que puede utilizar un enlace amida (véase, en general, Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 7221-7226 (1989): Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 7226-7232 (1989)). Estas estructuras se representan en general a continuación en la Estructura 31, que de nuevo usa uridina como base, aunque como anteriormente, también pueden usarse las otras bases:

30

En esta realización, L es un ligando como se ha definido anteriormente, siendo L y M también como se han definido anteriormente. Preferiblemente, L es amino, phen, byp y terpy.

En una realización preferida, el ETM unido a un nucleósido es un metaloceno; es decir, el L y L, de la Estructura 31, son ambos ligandos de metaloceno, L_{m}, como se han descrito anteriormente. La Estructura 32 representa una realización preferida en la que el metaloceno es ferroceno y la base es uridina, aunque pueden usarse otras bases:

31

Los datos preliminares sugieren que la Estructura 32 puede ciclarse, atacando el segundo átomo de carbono del acetileno el oxígeno del carbonilo, formando una estructura similar a furano. Los metalocenos preferidos incluyen ferroceno, cobaltoceno y osmioceno.

En una realización preferida, el ETM está unido a una ribosa en cualquier posición de la estructura de ribosa-fosfato del ácido nucleico, es decir, en el extremo terminal 5' ó 3' o en cualquier nucleósido interno. En este caso, la ribosa puede incluir análogos de ribosa. Como se sabe en la técnica, pueden generarse nucleósidos que estén modificados en la posición 2' ó 3' de la ribosa, siendo posibles modificaciones que contengan nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Se prefiere ribosa modificada con amino y modificada con oxígeno. Véase, en general, la publicación PCT WO 95/15971. Estos grupos de modificación pueden usarse como ligando de metal de transición o como porción químicamente funcional para la unión de otros ligandos de metales de transición y ligandos organometálicos, o porciones donadoras de electrones orgánicos, como apreciarán los especialistas en la técnica. En esta realización, también puede usarse un enlazador como se representa en este documento para "Z", o un oligómero conductor entre la ribosa y el ETM. Las realizaciones preferidas utilizan la unión en la posición 2' ó 3' de la ribosa, prefiriéndose la posición 2'. Por lo tanto, por ejemplo, los oligómeros conductores representados en la Estructura 13, 14 y 15 pueden reemplazarse por ETM; como alternativa, los ETM pueden añadirse en el extremo terminal libre del oligómero conductor.

En una realización preferida, un metaloceno sirve como el ETM y está unido mediante un enlace amida, como se representa a continuación en la Estructura 33. Los ejemplos describen la síntesis de un compuesto preferido cuando el metaloceno es ferroceno.

32

En una realización preferida, se usan enlaces amina, como se representa en general en la Estructura 34.

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33

Z es un enlazador, como se define en este documento, prefiriéndose de 1-16 átomos y prefiriéndose particularmente de 2-4 átomos, y t es uno o cero.

En una realización preferida se usan enlaces oxo, como se representa en general en la Estructura 35.

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34

En la Estructura 35, Z es un enlazador, como se define en este documento, y t es uno o cero. Los enlazadores Z preferidos incluyen grupos alquilo, incluyendo grupos heteroalquilos tales como (CH_{2})n y (CH_{2}CH_{2}O)n, prefiriéndose n de 1 a 10, y prefiriéndose especialmente n = 1 a 4, y prefiriéndose particularmente n=4.

También son posibles enlaces que utilizan otros heteroátomos.

En una realización preferida, un ETM se une a un fosfato en cualquier posición de la estructura de ribosa-fosfato del ácido nucleico. Esto puede realizarse de una diversidad de formas. En una realización, pueden incorporarse análogos de enlaces fosfodiéster, tales como enlaces fosforamida o fosforamidita, en un ácido nucleico, donde el heteroátomo (es decir, nitrógeno) sirve como un ligando de metal de transición (véase la publicación PCT WO 95/15971). Como alternativa, los oligómeros conductores representados en las Estructuras 23 y 24 pueden reemplazarse por ETM. En una realización preferida, la composición tiene la estructura que se muestra en la Estructura 36.

35

En la Estructura 361, el ETM se une a través de un enlace fosfato, generalmente mediante el uso de un enlazador, Z. Los enlazadores Z preferidos incluyen grupos alquilo, incluyendo grupos heteroalquilo tales como (CH_{2})_{n}, (CH_{2}
CH_{2}O)_{n}, prefiriéndose n de 1 a 10, y prefiriéndose especialmente n = 1 a 4, y prefiriéndose particularmente n = 4.

Cuando el ETM está unido a la base o a la estructura del nucleósido, es posible unir los ETM mediante estructuras "dendriméricas", como se describe más completamente a continuación. Como se representa en general en las Figuras, pueden usarse enlazadores basados en alquilo para generar múltiples estructuras de ramificación que comprendan uno o más ETM en el extremo terminal de cada rama (aunque también pueden usarse ETM internos). Generalmente, esto se realiza por generación de puntos de ramificación que contienen múltiples grupos hidroxi, que después pueden usarse opcionalmente para añadir puntos de ramificación adicionales. Después, los grupos hidroxi terminales pueden usarse en reacciones de fosforamidita para añadir ETM, como se realiza en general a continuación para el reemplazo de nucleósidos y reacciones de polímero de metaloceno. El punto de ramificación puede ser uno interno o uno terminal y puede ser un punto de ramificación químico o un punto de ramificación de nucleósido.

En una realización preferida, se usa un ETM tal como metaloceno como un "reemplazo de nucleósido", sirviendo como un ETM. Por ejemplo, la distancia entre los dos anillos ciclopentadieno de ferroceno es similar a la distancia ortogonal entre dos bases en un ácido nucleico de doble cadena. Pueden usarse otros metalocenos además de ferroceno, por ejemplo, metalocenos estables al aire tal como los que contienen cobalto o rutenio. Por lo tanto, pueden incorporarse porciones de metaloceno en la estructura de un ácido nucleico, como se representa en general en la Estructura 37 (ácido nucleico con una estructura de ribosa-fosfato) y la Estructura 38 (estructura de ácido peptidonucleico). Las Estructuras 37 y 38 representan ferroceno, aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, también pueden usarse otros metalocenos. En general, se prefieren metalocenos estables al aire, incluyendo metalocenos que utilizan rutenio y cobalto como metal.

36

En la Estructura 37, Z es un enlazador como se ha definido anteriormente, prefiriéndose generalmente grupos alquilo cortos, incluyendo heteroátomos tales como oxígeno. Generalmente, lo que es importante es la longitud del enlazador, de tal modo que se efectúen perturbaciones mínimas de un ácido nucleico de doble cadena, como se describe más completamente a continuación. Por lo tanto, se prefieren metileno, etileno, etilenglicoles, propileno y butileno, prefiriéndose particularmente etileno y etilenglicol. Además, cada enlazador Z puede ser igual o diferente. La Estructura 37 representa una estructura de ribosa-fosfato, aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, también pueden usarse análogos de ácidos nucleicos, incluyendo análogos de ribosa y análogos unidos a fosfato.

37

En la Estructura 38, los grupos Z preferidos son como se han enumerado anteriormente y, de nuevo, cada enlazador Z puede ser igual o diferente. Como anteriormente, también pueden usarse otros análogos de ácidos nucleicos.

Además, aunque las estructuras y la discusión anterior representan metalocenos y, particularmente, ferroceno, esta misma idea general puede usarse para añadir ETM además de metalocenos, como reemplazos de nucleósidos o en realizaciones de polímeros, que se describen a continuación. Por lo tanto, por ejemplo, cuando el ETM es un complejo de metal de transición distinto de metaloceno, que comprende uno, dos o tres (o más) ligandos, los ligandos pueden funcionalizarse como se ha representado para el ferroceno para permitir la adición de grupos fosforamidita. Se prefieren particularmente en esta realización complejos que comprenden ligandos de al menos dos anillos (por ejemplo, arilo y arilo sustituido), en los que cada uno de los ligandos comprende grupos funcionales para la unión mediante química de fosforamidita. Como apreciarán los especialistas en la técnica, este tipo de reacción, que genera polímeros de ETM como una porción de la estructura del ácido nucleico o como "grupos laterales" de los ácidos nucleicos para permitir la amplificación de las señales generadas en este documento, puede realizarse con prácticamente cualquier ETM que pueda funcionalizarse para contener los grupos químicos correctos.

Por lo tanto, mediante la inserción de un metaloceno tal como ferroceno (u otro ETM) en la estructura de un ácido nucleico, se generan análogos de ácidos nucleicos; es decir, la invención proporciona ácidos nucleicos que tienen una estructura que comprende al menos un metaloceno. Esto se diferencia de los ácidos nucleicos que tienen metalocenos unidos a la estructura, es decir, mediante una ribosa, un fosfato, etc. Es decir, cada uno de dos ácidos nucleicos compuestos por un ácido nucleico tradicional o análogo (incluyendo los ácidos nucleicos en este caso un solo nucleósido), pueden unirse covalentemente entre sí mediante un metaloceno. Desde un punto de vista diferente, se proporciona un derivado de metaloceno o metaloceno sustituido, en el que cada uno de los dos anillos aromáticos del metaloceno tiene un grupo sustituyente de ácido nucleico.

Además, como se describe más completamente a continuación, es posible incorporar más de un metaloceno en la estructura, con nucleótidos entre medias y/o con metalocenos adyacentes. Cuando se añaden metalocenos adyacentes a la estructura, esto es similar al proceso que se describe a continuación como "polímeros de metaloceno"; es decir, existen áreas de polímeros de metaloceno dentro de la estructura.

Además de los grupos sustituyentes de ácido nucleico, también es deseable añadir en algunos casos grupos sustituyentes adicionales en uno o ambos anillos aromáticos del metaloceno (o ETM). Por ejemplo, puesto que generalmente estos reemplazos de nucleósidos son parte de secuencias de sondas que van a hibridar con un ácido nucleico sustancialmente complementario, por ejemplo una secuencia diana u otra secuencia de sonda, es posible añadir grupos sustituyentes a los anillos de metaloceno para facilitar la formación de enlaces de hidrógeno con la base o bases en la cadena opuesta. Estos pueden añadirse en cualquier posición en los anillos de metaloceno. Los grupos sustituyentes adecuados incluyen, pero sin limitación, grupos amida, grupos amina, ácidos carboxílicos y alcoholes, incluyendo alcoholes sustituidos. Además, estos grupos sustituyentes también pueden unirse mediante enlazadores, aunque en general esto no se prefiere.

Además, pueden añadirse grupos sustituyentes en un ETM, particularmente metalocenos tales como ferroceno, para alterar las propiedades redox del ETM. Por lo tanto, por ejemplo, en algunas realizaciones, como se describe más completamente a continuación, puede ser deseable tener ETM diferentes unidos de formas diferentes (es decir, unión a base o a ribosa), en sondas diferentes, o con fines diferentes (por ejemplo, calibración o como patrón interno). Por lo tanto, la adición de grupos sustituyentes en el metaloceno puede permitir que se distingan dos ETM
diferentes.

Para generar estos análogos de ácidos nucleicos de estructura de metaloceno, también se proporcionan los componentes intermedios. Por lo tanto, en una realización preferida, la invención proporciona metalocenos de fosforamidita, como se representa en general en la Estructura 39:

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38

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En la Estructura 39, PG es un grupo protector, generalmente adecuado para el uso en la síntesis de ácidos nucleicos, prefiriéndose DMT, MMT y TMT. Los anillos aromáticos pueden ser los anillos del metaloceno o anillos aromáticos de ligandos para complejos de metales de transición u otros ETM orgánicos. Los anillos aromáticos pueden ser iguales o diferentes y pueden estar sustituidos, como se analiza en este documento. La Estructura 40 representa el derivado de ferroceno:

39

Estos análogos de fosforamidita pueden añadirse a la síntesis de oligonucleótidos convencionales, como se conoce en la técnica.

La Estructura 41 representa el monómero de ácido peptidonucleico (PNA) de ferroceno, que puede añadirse a la síntesis de PNA, como se conoce en la técnica y se representa en de las Figuras y Ejemplos:

40

En la Estructura 41, el grupo protector PG es adecuado para el uso en la síntesis de ácidos peptidonucleicos, prefiriéndose MMT, boc y Fmoc.

Estos mismos compuestos intermedios pueden usarse para formar ETM o polímeros de metaloceno que se añaden a los ácidos nucleicos, en lugar de como reemplazos de la estructura, como se describe más completamente a continuación.

En una realización preferida, los ETM se unen como polímeros, por ejemplo como polímeros de metaloceno, en una configuración "ramificada" similar a las realizaciones de "ADN ramificado" de este documento y que se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.124.246, usando nucleótidos funcionalizados modificados. La idea general es la siguiente. Se genera un nucleótido de fosforamidita modificado que en última instancia puede contener un grupo hidroxi libre que puede usarse en la unión de ETM de fosforamidita, tales como metalocenos. Este grupo hidroxi libre puede estar en la base o la estructura, tal como la ribosa o el fosfato (aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, también pueden usarse análogos de ácidos nucleicos que contienen otras estructuras). El nucleótido modificado se incorpora en un ácido nucleico y se elimina cualquier grupo protector hidroxi, dejando de este modo el hidroxilo libre. Tras la adición de un ETM de fosforamidita, tal como un metaloceno, como se ha descrito anteriormente en las estructuras 39 y 40, se añaden ETM, tales como ETM de metaloceno. Pueden añadirse ETM de fosforamidita adicionales tales como metalocenos para formar "polímeros de ETM", incluyendo "polímeros de metaloceno", como se representa en este documento, particularmente para ferroceno. Además, en algunas realizaciones, es deseable aumentar la solubilidad de los polímeros por adición de un grupo "de terminación" al ETM terminal en el polímero, por ejemplo, un grupo fosfato final en el metaloceno, como se representa en general en la Figura 12. Otros grupos "de terminación" adecuados que aumentan la solubilidad serán evidentes para los especialistas en la técnica. Debe señalarse que estos grupos potenciadores de la solubilidad pueden añadirse a los polímeros en otros lugares, incluyendo en los anillos de ligandos, por ejemplo, en los metalocenos, como se analiza en este documento.

Se describe en las Figuras una realización preferida de esta idea general. En esta realización, la posición 2' de una ribosa de un nucleótido de fosforamidita se funcionaliza primero para contener primero un grupo hidroxi protegido, en este caso mediante un enlace oxo, aunque pueden usarse gran cantidad de enlazadores, como se describe en general en este documento para enlazadores Z. Después, el nucleótido modificado protegido se incorpora mediante química de fosforamidita convencional en un ácido nucleico en crecimiento. Se elimina el grupo protector y se usa el grupo hidroxi libre, usando de nuevo química de fosforamidita convencional para añadir un metaloceno de fosforamidita tal como ferroceno. Es posible una reacción similar para análogos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, usando ácidos peptidonucleicos y el monómero de metaloceno que se muestra la Estructura 41, pueden generarse estructuras de ácidos peptidonucleicos que contengan polímeros de metaloceno.

Por lo tanto, la presente invención proporciona enlazadores de reclutamiento de ácidos nucleicos que comprenden "ramas" de polímeros de metaloceno, como se representan en general en las Figuras 12 y 13. Las realizaciones preferidas también utilizan polímeros de metaloceno de uno a aproximadamente 50 metalocenos de longitud, prefiriéndose de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 y prefiriéndose especialmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.

Además, cuando el enlazador de reclutamiento es un ácido nucleico, puede realizarse cualquier combinación de uniones de ETM.

En una realización preferida, el enlazador de reclutamiento no es un ácido nucleico y en su lugar puede ser cualquier clase de enlazador o polímero. Como apreciarán los especialistas en la técnica, en general puede usarse cualquier enlazador o polímero que pueda modificarse para contener ETM. En general, los polímeros o enlazadores deben ser razonablemente solubles y contener grupos funcionales adecuados para la adición de ETM.

Como se usa en este documento, un "polímero de reclutamiento" comprende al menos dos o tres subunidades que están unidas covalentemente. Al menos alguna porción de las subunidades monoméricas contiene grupos funcionales para la unión covalente de ETM. En algunas realizaciones, se usan porciones de acoplamiento para unir covalentemente las subunidades con los ETM. Son grupos funcionales preferidos para la unión grupos amino, grupos carboxi, grupos oxo y grupos tiol, prefiriéndose particularmente grupos amino. Como apreciarán los especialistas en la técnica, son posibles una amplia diversidad de polímeros de reclutamiento.

Los enlazadores adecuados incluyen, pero sin limitación, enlazadores alquilo (incluyendo heteroalquilo (incluyendo estructuras tipo (poli)etilenglicol) alquilo sustituido, enlazadores arilaquilo, etc. Como anteriormente para los polímeros, los enlazadores comprenderán uno o más grupos funcionales para la unión de ETM, que se realizará como apreciarán los especialistas en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de enlazadores homo o heterobifuncionales, como son bien conocidos (véase el catálogo 1994 Pierce Chemical Company, sección técnica sobre reticulantes, páginas 155-200).

Los polímeros de reclutamiento adecuados incluyen, pero sin limitación, estirenos funcionalizados, tales como aminoestireno, dextranos funcionalizados y poliaminoácidos. Son polímeros preferidos poliaminoácidos (tales como poli-D-aminoácidos y poli-L-aminoácidos) tales como polilisina, y prefiriéndose particularmente polímeros que contienen lisina y otros aminoácidos. Otros poliaminoácidos adecuados son ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, copolímeros de lisina y ácido glutámico o aspártico, copolímeros de lisina con alanina, tirosina, fenilalanina, serina, triptófano y/o prolina.

En una realización preferida, el enlazador de reclutamiento comprende un polímero de metaloceno, como se ha descrito anteriormente.

La unión de los enlazadores de reclutamiento a la primera porción de la sonda marcadora dependerá de la composición del enlazador de reclutamiento, como apreciarán los especialistas en la técnica. Cuando el enlazador de reclutamiento es un ácido nucleico, generalmente se forma durante la síntesis de la primera porción de la sonda marcadora, con incorporación de nucleósidos que contienen ETM según sea necesario. Como alternativa, la primera porción de la sonda marcadora y el enlazador de reclutamiento pueden generarse por separado y unirse después. Por ejemplo, puede haber una sección solapante de complementariedad, formando una sección de ácido nucleico de doble cadena que después puede entrecruzarse químicamente, por ejemplo, mediante el uso de psoraleno como se conoce en la técnica.

Cuando se usan enlazadores de reclutamiento que no son ácidos nucleicos, la unión del enlazador/polímero del enlazador de reclutamiento se realizará generalmente usando técnicas químicas convencionales, como apreciarán los especialistas en la técnica. Por ejemplo, cuando se usan enlazadores basados en alquilo, la unión puede ser similar a la unión de aislantes a ácidos nucleicos.

Además, es posible tener enlazadores de reclutamiento que sean mezclas de ácidos nucleicos y no de ácidos nucleicos, en una forma lineal (es decir, segmentos de ácidos nucleicos unidos entre sí con enlazadores alquilo) o en formas ramificadas (ácidos nucleicos con "ramas" alquilo que pueden contener ETM y pueden estar ramificados adicionalmente).

En una realización preferida, es la propia secuencia diana la que lleva los ETM, en lugar de ser el enlazador de reclutamiento de una sonda marcadora. Por ejemplo, como se describe más completamente a continuación, es posible añadir enzimáticamente nucleótidos trifosfato que comprenden los ETM de la invención a un ácido nucleico en crecimiento, por ejemplo, durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como reconocerán los especialistas en la técnica, aunque se ha demostrado que varias enzimas toleran en general nucleótidos modificados, algunos de los nucleótidos modificados de la invención, por ejemplo, las realizaciones de "reemplazo de nucleósidos", y supuestamente algunas de las uniones fosfato, pueden o no ser reconocidas por las enzimas para permitir la incorporación en un ácido nucleico en crecimiento. Por lo tanto, son uniones preferidas en esta realización a la base o a la ribosa del nucleótido.

Por lo tanto, por ejemplo, la amplificación por PCR de una secuencia diana, como se conoce bien en la técnica, dará como resultado secuencias diana que comprenden ETM, generalmente incorporados aleatoriamente en la secuencia. Después, el sistema de la invención puede configurarse para permitir la detección usando estos ETM, como se representa en general en las Figuras 16A, 16B y 16D.

Como alternativa, como se describe más completamente a continuación, es posible añadir enzimáticamente nucleótidos que comprenden ETM al extremo terminal de un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico diana. En esta realización, se añade un "enlazador de reclutamiento" eficaz en el extremo terminal de la secuencia diana que después puede usarse para la detección. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que utilizan electrodos que comprenden monocapas de oligómeros conductores y sondas de captura, y secuencias diana que comprenden una primera porción que es capaz de hibridar con un componente de un complejo de ensayo, y una segunda porción que no hibrida con un componente de un complejo de ensayo y que comprende al menos una porción de transferencia de electrones unido covalentemente. De forma similar, también se proporcionan procedimientos que utilizan estas composiciones.

También es posible tener ETM conectados con secuencias de sondas, es decir, secuencias diseñadas para hibridar con secuencias complementarias. Por lo tanto, también pueden añadirse ETM a enlazadores que no sean de reclutamiento. Por ejemplo, puede haber ETM añadidos a secciones de sondas marcadoras que hibriden con componentes del complejo de ensayo, por ejemplo, la primera porción, o con la secuencia diana como se ha descrito anteriormente. Estos ETM pueden usarse para la detección de la transferencia de electrones en algunas realizaciones, o pueden no usarse, dependiendo de la localización y del sistema. Por ejemplo, en alguna realizaciones, cuando por ejemplo la secuencia diana que contiene ETM incorporados aleatoriamente hibrida directamente con la sonda de captura, como se representa en la Figura 16A, puede haber ETM en la porción que hibrida con la sonda de captura. Si la sonda de captura se une al electrodo usando un oligómero conductor, estos ETM pueden usarse para detectar la transferencia de electrones como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, estos ETM pueden no detectarse específicamente.

De forma similar, en algunas realizaciones, cuando el enlazador de reclutamiento es un ácido nucleico, puede ser deseable en algunos casos que parte o todo el enlazador de reclutamiento sea de doble cadena. En una realización, puede haber un segundo enlazador de reclutamiento, sustancialmente complementario al primer enlazador de reclutamiento, que puede hibridar con el primer enlazador de reclutamiento. En una realización preferida, el primer enlazador de reclutamiento comprende los ETM unidos covalentemente. En una realización alternativa, el segundo enlazador de reclutamiento contiene los ETM y el primer enlazador de reclutamiento no, y los ETM se reclutan hacia la superficie por hibridación del segundo enlazador de reclutamiento con el primero. En otra realización más, tanto el primer como el segundo enlazador de reclutamiento comprenden ETM. Debe señalarse, como se ha analizado anteriormente, que los ácidos nucleicos que comprenden una gran cantidad de ETM pueden no hibridar tan bien, es decir, la T_{m} puede disminuirse, dependiendo del sitio de unión y de las características del ETM. Por lo tanto, en general, cuando se usan múltiples ETM en cadenas de hibridación, generalmente hay menos de aproximadamente 5, prefiriéndose menos de aproximadamente 3, o como alternativa los ETM deben estar suficientemente separados para que los nucleótidos intermedios puedan hibridar lo suficiente para permitir una buena cinética.

En una realización, pueden usarse ETM unidos no covalentemente. En una realización, el ETM es un Indicador de hibridación. Los Indicadores de hibridación sirven como ETM que se asociarán preferentemente con ácido nucleico de doble cadena, se añaden, habitualmente de forma reversible, de forma similar al procedimiento de Millan et al., Anal. Chem. 65: 2317-2323 (1993); Millan et al., Anal. Chem. 662943-2948 (1994). En esta realización, los aumentos en la concentración local de ETM debido a la asociación del Indicador de hibridación de ETM con ácido nucleico de doble cadena en la superficie, pueden controlarse usando las monocapas que comprenden los oligómeros conductores.

Los indicadores de hibridación incluyen intercalantes y porciones de unión a la hendidura menor y/o mayor. En una realización preferida, pueden usarse intercalantes; puesto que la intercalación se produce solamente generalmente en presencia de ácido nucleico de doble cadena, sólo en presencia de ácido nucleico de doble cadena se concentrarán los ETM. Se conocen en la técnica ETM de complejos de metales de transición intercalantes. De forma similar, también pueden usarse en esta realización porciones de unión a la hendidura mayor o menor, tales como azul de metileno.

De forma similar, los sistemas de la invención pueden utilizar ETM unidos no covalentemente, como se describen en general en Napier et al., Bioconj. Chem. 8: 906 (1997). En esta realización, pueden detectarse cambios en el estado redox de ciertas moléculas como resultado de la presencia de ADN (es decir, oxidación de guanina por complejos de rutenio) usando también las SAM que comprenden oligómeros conductores.

Por lo tanto, la presente invención proporciona electrodos que comprenden monocapas que comprenden oligómeros conductores, que incluyen generalmente sondas de captura, y secuencias diana o sondas marcadoras que comprenden enlazadores de reclutamiento que contienen ETM. Las sondas de la presente invención se diseñan para ser complementarias a una secuencia diana (a la secuencia diana de la muestra o a otras secuencia de sondas, como se describe a continuación), de modo que se produzca la hibridación de la secuencia diana y las sondas de la presente invención. Como se describe a continuación, no es necesario que esta complementariedad sea perfecta; pueden existir gran cantidad de apareamientos erróneos de pares de bases que interferirán con la hibridación entre la secuencia diana y los ácidos nucleicos de cadena sencilla de la presente invención. Sin embargo, si el número de mutaciones es tan grande que ni siquiera puede producirse la hibridación en las condiciones de hibridación menos rigurosa, la secuencia no es una secuencia diana complementaria. Por lo tanto, por "sustancialmente complementaria" se entiende en este documento que las sondas son suficientemente complementarias a las secuencias diana para hibridar en condiciones de reacción normales.

Generalmente, las composiciones de ácido nucleico de la invención son útiles como sondas oligonucleotídicas. Como apreciarán los especialistas en la técnica, la longitud de la sonda variará con la longitud de la secuencia diana y las condiciones de hibridación y de lavado. Generalmente, las sondas oligonucleotídicas varían de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleótidos, prefiriéndose de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 y prefiriéndose especialmente de aproximadamente 12 a aproximadamente 25. En algunos casos pueden usarse sondas muy largas, por ejemplo de 50 a 200-300 nucleótidos de longitud. Por lo tanto, en las estructuras que se representan en este documento, los nucleósidos pueden reemplazarse con ácidos nucleicos.

Pueden usarse una diversidad de condiciones de hibridación en la presente invención, incluyendo condiciones de rigurosidad alta, moderada y baja; véase, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª Edición, 1989 y Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et. al. Las condiciones de hibridación también pueden variar cuando se usa una estructura no iónica, es decir, PNA, como se sabe en la técnica. Además, puede añadirse agentes entrecruzantes después de la unión de la diana para entrecruzar, es decir, unir covalentemente, las dos cadenas del complejo de hibridación.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, los sistemas de la invención pueden asumir una gran cantidad de configuraciones diferentes, como se representan en general en las Figuras. En general, existen tres tipos de sistemas que pueden usarse: (1) sistemas en los que la propia secuencia diana está marcada con ETM (véanse las Figuras 16A, 16B y 16D); (2) sistemas en los que las sondas marcadoras hibridan directamente con las secuencias diana (véanse las Figuras 16C y 16H); y (3) sistemas en los que las sondas marcadoras hibridan indirectamente con las secuencias diana, por ejemplo, mediante el uso de sondas amplificadoras (véanse las figuras 16E, 16F y 16G).

En los tres sistemas se prefiere, aunque no es necesario, que la secuencia diana esté inmovilizada en la superficie del electrodo. Esto se realiza preferiblemente usando sondas de captura y, opcionalmente, una o más sondas extensoras de captura. Cuando se utilizan solamente sondas de captura, es necesario tener sondas de captura únicas para cada secuencia diana; es decir, la superficie debe adaptarse para contener sondas de captura únicas. Como alternativa, pueden usarse sondas extensoras de captura, que permitan una superficie "universal", es decir, una superficie que contenga un solo tipo de sonda de captura que pueda usarse para detectar cualquier secuencia diana. Las sondas "extensoras de captura" se representan en general en la Figura 14 y tienen una primera porción que hibridará con toda o parte de la sonda de captura y una segunda porción que hibridará con una porción de la secuencia diana. Después, esto permite la generación de sondas solubles a medida que, como apreciarán los especialistas en la técnica, generalmente son más simples y menos costosas. Como se muestra en este documento (por ejemplo, en la Figura 14C), pueden usarse dos sondas extensoras de captura. Esto se ha realizado generalmente para estabilizar complejos de ensayo, por ejemplo, cuando la secuencia diana es grande, o cuando se usan sondas amplificadoras de gran tamaño (particularmente sondas amplificadoras ramificadas o dendriméricas).

En una realización preferida, los ácidos nucleicos se añaden después de la formación de la SAM ((4) anteriormente). Esto puede realizarse de una diversidad de formas, como apreciarán los especialistas en la técnica. En una realización, se preparan oligómeros conductores con grupos funcionales terminales, utilizando las realizaciones preferidas carboxilatos e isotiocianatos activados que reaccionarán con aminas primarias que se sitúan sobre el ácido nucleico, como se representa en general en la Figura 6 usando un carboxilato activado. Estos dos reactivos tienen la ventaja de ser estables en solución acuosa y aun así reaccionar con alquilaminas primarias. Sin embargo, las aminas aromáticas primarias y aminas secundarias y terciarias de las bases no deberían reaccionar, permitiendo de este modo la adición específica de sitio de ácidos nucleicos en la superficie. Esto permite la aplicación puntual de sondas (sondas de captura o de detección, o ambas) usando procedimientos conocidos (chorro de tinta, aplicación puntual, etc.) sobre la superficie.

Además, existen varios procedimientos no de ácidos nucleicos que pueden usarse para inmovilizar un ácido nucleico sobre una superficie. Por ejemplo, pueden utilizarse parejas de compañeros de unión; es decir, un compañero de unión se une al extremo terminal del oligómero conductor, y el otro al extremo del ácido nucleico. Esto también puede realizarse sin usar una sonda de captura de ácido nucleico; es decir, un compañero de unión sirve como sonda de captura y el otro se une a la secuencia diana o a una sonda extensora de captura. Es decir, la secuencia diana comprende el compañero de unión o una sonda extensora de captura que hibridará con la secuencia diana comprende el compañero de unión. Las parejas de compañeros de unión adecuadas incluyen, pero sin limitación, parejas de haptenos tales como biotina/estreptavidina; antígenos/anticuerpos; marcadores de NTA/histidina; etc. En general, se prefieren compañeros de unión de menor tamaño, de modo que los electrones puedan pasar desde el ácido nucleico hacia el oligómero conductor para permitir la detección.

En una realización preferida, cuando la propia secuencia diana se modifica para contener un compañero de unión, el compañero de unión se une mediante un nucleótido modificado que puede unirse enzimáticamente a la secuencia diana, por ejemplo, durante una etapa de amplificación de diana por PCR. Como alternativa, el compañero de unión debe unirse fácilmente a la secuencia diana.

Como alternativa, puede utilizarse una sonda extensora de captura que tiene una porción de ácido nucleico para la hibridación con la diana, así como un compañero de unión (por ejemplo, la sonda extensora de captura puede comprender una porción que no sea de ácido nucleico tal como un enlazador alquilo que se use para unirse a un compañero de unión). En esta realización, puede ser deseable entrecruzar el ácido nucleico de doble cadena de la diana y la sonda extensora de captura para la estabilidad, por ejemplo, usando psoraleno como se conoce en la técnica.

En una realización, la diana no está unida a la superficie del electrodo usando sondas de captura. En esta realización, lo que es importante, como para todos los ensayos en este documento, es que el exceso de sondas marcadoras se elimine antes de la detección y que el complejo de ensayo (el enlazador de reclutamiento) esté próximo a la superficie. Como apreciarán los especialistas en la técnica, esto puede conseguirse de otras formas. Por ejemplo, el complejo de ensayo puede estar presente en perlas que se añaden al electrodo que comprende la monocapa. Los enlazadores de reclutamiento que comprenden los ETM pueden colocarse en proximidad a la superficie del oligómero conductor usando procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo sedimentación por gravedad de las perlas en la superficie, interacciones electrostáticas o magnéticas entre componentes de perlas y la superficie, usando la unión de compañeros de unión como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, después de la eliminación de los reactivos en exceso tales como las sondas marcadoras en exceso, el complejo de ensayo puede dirigirse hacia la superficie, por ejemplo, estimulando el sistema con un voltaje suficiente para dirigir el complejo de ensayo hacia la superficie.

Sin embargo, las realizaciones preferidas utilizan complejos de ensayo unidos a través de sondas de captura de ácidos nucleicos.

En una realización preferida, la propia secuencia diana contiene los ETM. Como se ha analizado anteriormente, esto puede realizarse usando secuencias diana que tienen ETM incorporados en gran cantidad de posiciones, como se ha descrito anteriormente. Se representan ejemplos representativos en las Figuras 16A, 16B y 16D. En esta realización, como para las otras del sistema, la orientación 3'-5' de las sondas y dianas se selecciona para aproximar las estructuras que contienen ETM (es decir, enlazadores de reclutamiento o secuencias diana) tanto como sea posible a la superficie de la monocapa, y en la orientación correcta. Esto puede realizarse usando la unión mediante aislantes u oligómeros conductores, como se muestra en general en las Figuras. Además, como apreciarán los especialistas en la técnica, pueden utilizarse múltiples sondas de captura en una configuración tal como se representa en la Figura 16D, en la que la orientación 5'-3' de las sondas de captura es diferente, o en la que se forman "bucles" de diana cuando se usan múltiples sondas de captura.

En una realización preferida, las sondas de captura hibridan directamente con las secuencias diana, como se representa en general en la Figura 16C. En estas condiciones, la secuencia diana está, preferiblemente pero no necesariamente, inmovilizada sobre la superficie usando sondas de captura, incluyendo sondas extensoras de captura. Después, se usan sondas marcadoras para aproximar los ETM a la superficie de la monocapa que comprende oligómeros conductores. En una realización preferida, se usan múltiples sondas marcadoras; es decir, se diseñan sondas marcadoras de modo que la porción que hibrida con la secuencia diana (marcada 141 en las Figuras) puede ser diferente para varias sondas marcadoras diferentes, de modo que se produzca la amplificación de la señal, ya que pueden unirse múltiples sondas marcadoras para cada secuencia diana. Por lo tanto, como se representa en las figuras, n es un número entero de al menos uno. Dependiendo de la sensibilidad deseada, la longitud de la secuencia diana, el número de ETM por sonda marcadora, etc., los intervalos preferidos de n son de 1 a 50, prefiriéndose particularmente de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 y prefiriéndose especialmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. Además, si se desean sondas marcadoras "genéricas", pueden usarse sondas extensoras marcadoras como se describen en general a continuación para el uso con sondas amplificadoras.

Como anteriormente, generalmente en esta realización la configuración del sistema y las sondas marcadoras se diseñan para reclutar los ETM tan próximos como sea posible a la superficie de la monocapa.

En una realización preferida, las sondas marcadoras hibridan con la secuencia diana indirectamente. Es decir, la presente invención encuentra utilidad en nuevas combinaciones de tecnologías de amplificación de señales y detección de transferencia de electrones en electrodos, que pueden ser particularmente útiles en ensayos de hibridación de tipo sándwich, como se representa en general en la Figura 16. En estas realizaciones, las sondas amplificadoras de la invención se unen a la secuencia diana en una muestra directamente o indirectamente. Puesto que las sondas amplificadoras contienen preferiblemente un número relativamente grande de secuencias de amplificación que están disponibles para la unión de sondas marcadoras, la señal detectable se aumenta significativamente y permite que se mejoren significativamente los límites de detección de la diana. Estas sondas marcadora y amplificadora, y los procedimientos de detección que se describen en este documento, pueden usarse en esencialmente cualquier formato hibridación de ácidos nucleicos conocido, tal como aquéllos en los que la diana se une directamente a una fase sólida o en ensayos de hibridación de tipo sándwich en los que la diana se une a uno o más ácidos nucleicos que a su vez están unidos a la fase sólida.

En general, estas realizaciones pueden describirse de la forma siguiente. Una sonda amplificadora hibrida con la secuencia diana, directamente (por ejemplo Figura 16E), o mediante el uso de una sonda extensora marcadora (por ejemplo, Figura 16F y 16G) que sirve para permitir que se generen sondas amplificadoras "genéricas". La secuencia diana está preferiblemente, pero no necesariamente, inmovilizada sobre el electrodo usando sondas de captura. Preferiblemente, la sonda amplificadora contiene una multiplicidad de secuencias de amplificación, aunque en algunas realizaciones, como se describe a continuación, la sonda amplificadora puede contener solamente una sola secuencia de amplificación. La sonda amplificadora puede asumir varias formas diferentes; una conformación ramificada, una conformación dendrimérica o una "hebra" lineal de secuencias de amplificación. Estas secuencias de amplificación se usan para formar complejos de hibridación con sondas marcadoras, y los ETM pueden detectarse usando el electrodo.

Por consiguiente, la presente invención proporciona complejos de ensayo que comprenden al menos una sonda amplificadora. Por "sonda amplificadora" o "multímero de ácido nucleico" o "multímero de amplificación" o equivalentes gramaticales se entiende en este documento una sonda de ácido nucleico que se usa para facilitar la amplificación de la señal. Las sondas amplificadoras comprenden al menos una primera secuencia de sonda de ácido nucleico de cadena sencilla, como se define a continuación, y al menos una secuencia de amplificación de ácido nucleico de cadena sencilla, prefiriéndose una multiplicidad de secuencias de amplificación.

Las sondas amplificadoras comprenden una primera secuencia de sonda que se usa, directa o indirectamente, para hibridar con la secuencia diana. Es decir, la propia sonda amplificadora puede tener una primera secuencia de sonda que sea sustancialmente complementaria a la secuencia diana (por ejemplo, Figura 16E), o tiene una primera secuencia de sonda que es sustancialmente complementaria a una porción de una sonda adicional, en este caso denominada sonda extensora marcadora, que tiene una primera porción que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana (por ejemplo, Figura 16F). En una realización preferida, la primera secuencia de sonda de la sonda amplificadora es sustancialmente complementaria a la secuencia diana, como se representa en general en la Figura 16E.

En general, como para todas las sondas en este documento, la primera secuencia de sonda es de una longitud suficiente para proporcionar especificidad y estabilidad. Por lo tanto, generalmente, las secuencias de sondas de la invención que están diseñadas para hibridar con otro ácido nucleico (es decir, secuencias de sondas, secuencias de amplificación, porciones o dominios de sondas de mayor tamaño) son de al menos aproximadamente 5 nucleósidos de longitud, prefiriéndose de al menos aproximadamente 10 y prefiriéndose especialmente de al menos aproximadamente 15.

En una realización preferida, como se representa en la Figura 14, las sondas amplificadoras, o cualquiera de las otras sondas de la invención, pueden formar estructuras de tallo y bucle en forma de horquilla en ausencia de su diana. La longitud de la secuencia de doble cadena del tallo se seleccionará de modo que la estructura de horquilla no se favorezca en presencia de la diana. El uso de este tipo de sondas, en los sistemas de la invención o en cualquier sistema de detección de ácidos nucleicos, puede dar como resultado una disminución significativa en la unión inespecífica y, por lo tanto, un aumento en la proporción de señal con respecto a interferencia.

Generalmente, estas estructuras de horquilla comprenden cuatro componentes. El primer componente es una secuencia de unión a diana, es decir, una región complementaria a la diana (que puede ser la secuencia diana de muestra u otra secuencia de sonda con la que se desee la unión), que es de aproximadamente 10 nucleósidos de longitud, prefiriéndose de aproximadamente 15. El segundo componente es una secuencia de bucle que puede facilitar la formación de bucles ácido nucleico. Se prefieren particularmente a este respecto repeticiones de GTC, que se ha identificado en el Síndrome de la X Frágil que forman giros. (Cuando se usan análogos de PNA, pueden preferirse giros que comprendan porciones de prolina). Generalmente, se usan de tres a cinco repeticiones, prefiriéndose de cuatro a cinco. El tercer componente es una región autocomplementaria que tiene una primera porción que es complementaria a una porción de la región de la secuencia diana y una segunda porción que comprende una primera porción de la secuencia de unión a la sonda marcadora. El cuarto componente es sustancialmente complementario a una sonda marcadora (o a otra sonda, según el caso). El cuarto componente comprende además una "extremo cohesivo", es decir, una porción que no hibrida con ninguna otra porción de la sonda y que, preferiblemente, contiene la mayoría, si no todos, los ETM. La estructura general se representa en la Figura 14. Como apreciarán los especialistas en la técnica, cualquiera o todas las sondas que se describen en este documento pueden configurarse para formar horquillas en ausencia de sus dianas, incluyendo las sondas amplificadora, de captura, extensora de captura, marcadora y extensora marcadora.

En una realización preferida, se usan varias sondas amplificadoras diferentes, cada una con una primera secuencia de sonda que hibridará con una porción diferente de la secuencia diana. Es decir, existe más de un nivel de amplificación; la sonda amplificadora proporciona una amplificación de señal debido a una multiplicidad de acontecimientos de marcaje, y se usan varias sondas amplificadoras diferentes, cada una con esta multiplicidad de marcadores, para cada secuencia diana. Por lo tanto, las realizaciones preferidas utilizan al menos dos combinaciones diferentes de sondas amplificadoras, teniendo cada combinación una secuencia de sonda diferente para la hibridación con porciones diferentes de la secuencia diana; la única limitación real sobre el número de sondas amplificadoras diferentes será la longitud de la secuencia diana original. Además, también es posible que las diferentes sondas amplificadoras contengan secuencias de amplificación diferentes, aunque generalmente esto no se prefiere.

En una realización preferida, la sonda amplificadora no hibrida con la secuencia diana de muestra directamente, pero en su lugar hibrida con una primera porción de una sonda extensora marcadora, como se representa en general en la Figura 16F. Esto es particularmente útil para permitir el uso de sondas amplificadoras "genéricas", es decir, sondas amplificadoras que pueden usarse con una diversidad de dianas diferentes. Esto puede ser deseable puesto que varias de las sondas amplificadoras requieren técnicas de síntesis especiales. Por lo tanto, se prefiere la adición de una sonda relativamente corta como sonda extensora marcadora. Por lo tanto, la primera secuencia de sonda de la sonda amplificadora es sustancialmente complementaria a una primera porción o dominio de una primera sonda extensora marcadora de ácido nucleico de cadena sencilla. La sonda extensora marcadora también contiene una segunda porción o dominio que es sustancialmente complementario a una porción de la secuencia diana. Estas dos porciones son preferiblemente de al menos aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, prefiriéndose un intervalo de aproximadamente 15 a aproximadamente 30. Los términos "primera" y "segunda" no pretenden conferir una orientación de las secuencias con respecto a la orientación 5'-3' de las secuencias de diana o sonda. Por ejemplo, asumiendo una orientación 5'-3' de la secuencia diana complementaria, la primera porción puede localizarse 5' a la segunda porción o 3' a la segunda porción. Por comodidad en este documento, el orden de las secuencias de sonda se muestra generalmente de izquierda a derecha.

En una realización preferida puede usarse más de una pareja de sonda extensora marcadora-sonda amplificadora, es decir, n es mayor de 1. Es decir, pueden usarse una pluralidad de sondas extensoras marcadoras, cada una con una porción que es sustancialmente complementaria a una porción diferente de la secuencia diana; esto puede servir como otro nivel de amplificación. Por lo tanto, una realización preferida utiliza combinaciones de al menos dos sondas extensoras marcadoras, ajustándose el límite superior por la longitud de la secuencia diana.

En una realización preferida, se usa más de una sonda extensora marcadora con una sola sonda amplificadora para reducir la unión inespecífica, como se representa en la Figura 16G y se describe en general en la Patente de Estados Unidos Nº 5.681.697. En esta realización, una primera porción de la primera sonda extensora marcadora hibrida con una primera porción de la secuencia diana y la segunda porción de la primera sonda extensora marcadora hibrida con una primera secuencia de sonda de la sonda amplificadora. Una primera porción de la segunda sonda extensora marcadora hibrida con una segunda porción de la secuencia diana y la segunda porción de la segunda sonda extensora marcadora hibrida con una segunda secuencia de sonda de la sonda amplificadora. Esto forma estructuras denominadas a veces estructuras o configuraciones "cruciformes", y generalmente se realizan para conferir estabilidad cuando se usan sondas amplificadoras ramificadas o dendriméricas de gran tamaño.

Además, como apreciarán los especialistas en la técnica, las sondas extensoras marcadoras pueden interaccionar con una sonda preamplificadora que se describe a continuación, en lugar de directamente con la sonda amplificadora.

De forma similar, como se ha descrito anteriormente, una realización preferida utiliza varias sondas amplificadoras diferentes, cada una con una primera secuencia de sonda que hibridará con una porción diferente de la sonda extensora marcadora. Además, como se ha descrito anteriormente, también es posible que las sondas amplificadoras diferentes contengan secuencias de amplificación diferentes, aunque generalmente esto no se prefiere.

Además de la primera secuencia de sonda, la sonda amplificadora también comprende al menos una secuencia de amplificación. Una "secuencia de amplificación" o "segmento de amplificación" o equivalentes gramaticales en este documento se refieren a una secuencia que se usa, directa o indirectamente, para unirse a una primera porción de una sonda marcadora, como se describe más completamente a continuación. Preferiblemente, la sonda amplificadora comprende una multiplicidad de secuencias de amplificación, prefiriéndose de aproximadamente 3 a aproximadamente 1000, prefiriéndose particularmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 y prefiriéndose especialmente de aproximadamente 50. En algunos casos, por ejemplo, cuando se usan sondas amplificadoras lineales, se prefieren de 1 a aproximadamente 20, prefiriéndose particularmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.

Las secuencias de amplificación pueden estar unidas entre sí de una diversidad de formas, como apreciarán los especialistas en la técnica. Pueden estar unidas covalentemente directamente entre sí, o con secuencias o porciones químicos intermedios, mediante enlaces de ácidos nucleicos tales como enlaces fosfodiéster, enlaces de PNA, etc., o mediante agentes de enlace interpuestos como puentes de aminoácidos, hidratos de carbono o polioles, o mediante otros agentes entrecruzantes o compañeros de unión. El sitio o sitios de enlace pueden estar en los extremos de un segmento y/o en uno o más nucleótidos internos en la cadena. En una realización preferida, las secuencias de amplificación se unen mediante enlaces de ácidos nucleicos.

En una realización preferida, se usan sondas amplificadoras ramificadas, como se describe en general en la Patente de Estados Unidos Nº 5.124.246. Las sondas amplificadoras ramificadas pueden asumir conformaciones "de tipo tenedor" o "de tipo peine". Las sondas amplificadoras ramificadas "de tipo tenedor" tienen generalmente tres o más segmentos oligonucleotídicos que proceden de un punto de origen para formar una estructura ramificada. El punto de origen puede ser otro segmento nucleotídico o una molécula multifuncional a la que pueden unirse covalentemente o estrechamente al menos tres segmentos. Las sondas amplificadoras ramificadas "de tipo peine" tienen una estructura lineal con una multiplicidad de oligonucleótidos de cadena lateral que se prolongan desde la estructura. En cualquier conformación, los segmentos colgantes dependerán normalmente de un nucleótido modificado u otra porción orgánica que tenga los grupos funcionales apropiados para la unión de oligonucleótidos. Además, en cualquier conformación, están disponibles gran cantidad de secuencias de amplificación para la unión, directa o indirectamente, a sondas de detección. En general, estas estructuras se preparan como se conoce en la técnica, usando nucleótidos multifuncionales modificados, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.635.352 y 5.214.246, entre otras.

En una realización preferida se usan sondas amplificadoras dendriméricas, como se describen en general en la Patente Estados Unidos Nº 5.175.270. Las sondas amplificadoras dendriméricas tienen secuencias de amplificación que se unen mediante hibridación y, por lo tanto, tienen porciones de ácido nucleico de doble cadena como componentes de su estructura. La superficie externa de la sonda amplificadora dendrimérica tiene una multiplicidad de secuencias de amplificación.

En una realización preferida, se usan sondas amplificadoras lineales que tienen secuencias de amplificación individuales unidas extremo con extremo directamente o con secuencias intermedias cortas para formar un polímero. Como con las otras configuraciones amplificadoras, puede haber secuencias o porciones adicionales entre las secuencias de amplificación. Además, como se describe en este documento, las sondas de amplificación lineales pueden formar estructuras de tallo y bucle en forma de horquilla, como se representa en la Figura 14.

En una realización, la sonda amplificadora lineal tiene una sola secuencia de amplificación. Esto puede ser útil cuando se producen ciclos de hibridación/disociación, formando una combinación de sondas amplificadoras que hibridaron con la diana y después se retiraron para permitir que se unieran más sondas, o cuando se usan grandes cantidades de ETM para cada sonda marcadora. Sin embargo, en una realización preferida, las sondas amplificadoras lineales comprenden una multiplicidad de secuencias de amplificación.

Además, la sonda amplificadora puede ser totalmente lineal, totalmente ramificada, totalmente dendrimérica o cualquier combinación de las mismas.

Se usan las secuencias de amplificación de la sonda amplificadora, directa o indirectamente, para unirse a una sonda marcadora para permitir la detección. En una realización preferida, las secuencias de amplificación de la sonda amplificadora son sustancialmente complementarias a una primera porción de una sonda marcadora. Como alternativa, se usan sondas extensoras amplificadoras que tienen una primera porción que se une a la secuencia de amplificación y una segunda porción que se une a la primera porción de la sonda marcadora.

Además, las composiciones de la invención pueden incluir moléculas "preamplificadoras", que sirven de porción de enlace entre las moléculas extensoras marcadoras y las sondas amplificadoras. De esta forma, más amplificadoras y, por lo tanto, más ETM, se unen en última instancia a las sondas de detección. Las moléculas preamplificadoras pueden ser lineales o ramificadas, y típicamente contienen en el intervalo de aproximadamente 30-3000 nucleótidos.

Las reacciones que se describen a continuación pueden realizarse de una diversidad de formas, como apreciarán los especialistas en la técnica. Los componentes de la reacción pueden añadirse simultáneamente o de forma secuencial, en cualquier orden, describiéndose a continuación las realizaciones preferidas. Además, la reacción puede incluir una diversidad de otros reactivos que pueden incluirse en los ensayos. Éstos incluyen reactivos como sales, tampones, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc. que pueden usarse para facilitar una hibridación y una detección óptimas y/o reducir las interacciones inespecíficas o de fondo. También pueden usarse reactivos que mejoren de otro modo la eficacia del ensayo, tales como inhibidores de proteasas, inhibidores de nucleasas, agentes antimicrobianos, etc., dependiendo de los procedimientos de preparación de muestra y de la pureza de la diana.

Generalmente, los procedimientos son los siguientes. En una realización preferida, la diana se inmoviliza o se une inicialmente al electrodo. En una realización, esto se realiza por formación de un complejo de hibridación entre una sonda de captura y una porción de la secuencia diana. Una realización preferida utiliza sondas extensoras de captura; en esta realización, se forma un complejo de hibridación entre una porción de la secuencia diana y una primera porción de una sonda extensora de captura, y un complejo de hibridación adicional entre una segunda porción de la sonda extensora de captura y una porción de la sonda de captura. Las realizaciones preferidas adicionales utilizan sondas de captura adicionales, formando de este modo un complejo de hibridación entre una porción de la secuencia diana y una primera porción de una segunda sonda extensora de captura, y un complejo de hibridación adicional entre una segunda porción de la segunda sonda extensora de captura y una segunda porción de la sonda de captura.

Como alternativa, la unión de la secuencia diana al electrodo se realiza simultáneamente a las otras reacciones.

El procedimiento se desarrolla con la introducción de sondas amplificadoras, si se utilizan. En una realización preferida, la sonda amplificadora comprende una primera secuencia de sonda que es sustancialmente complementaria a una porción de la secuencia diana, y al menos una secuencia de amplificación.

En una realización, la primera secuencia de sonda de la sonda amplificadora hibrida con la secuencia diana, y se retira cualquier sonda amplificadora no hibridada. Esto se realiza generalmente como se sabe en la técnica, y depende del tipo de ensayo. Cuando la secuencia diana se inmoviliza en una superficie tal como un electrodo, la eliminación del exceso de reactivos se realiza generalmente mediante una o más etapas de lavado, como apreciarán los especialistas en la técnica. En esta realización, la diana puede inmovilizarse en cualquier soporte sólido. Cuando la secuencia diana no se inmoviliza en una superficie, la eliminación de los reactivos en exceso tales como las sondas de la invención puede realizarse por adición de perlas (es decir, partículas de soporte sólidas) que contienen secuencias complementarias a las sondas, de modo que las sondas en exceso se unan a las perlas. Después, las perlas pueden retirarse, por ejemplo por centrifugación, filtración, la aplicación de campos magnéticos o electrostáticos, etc.

Después, la mezcla de reacción se somete a condiciones (temperatura, alto contenido en sal, cambios en el pH, etc.) en las que la sonda amplificadora se disocia de la secuencia diana y se recoge la sonda amplificadora. Después, la sonda amplificadora puede añadirse a un electrodo que comprende sondas de captura para las sondas amplificadoras, se añaden sondas marcadoras y se consigue la detección.

En una realización preferida, se genera una combinación más grande de sondas por adición de más sondas amplificadoras a la secuencia diana y las reacciones de hibridación/disociación se repiten, para generar una combinación más grande de sonda amplificadora. Después, esta combinación de sonda amplificadora se añade a un electrodo que comprende sondas de captura amplificadoras, se añaden sondas marcadoras y se desarrolla la detección.

En esta realización, se prefiere que la secuencia diana se inmovilice en un soporte sólido, incluyendo un electrodo, usando los procedimientos descritos en este documento; aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, pueden usarse tecnologías de unión a soportes sólidos alternativas, tales como unión a vidrio, polímeros, etc.. Es posible realizar la reacción en un soporte sólido y después añadir la sonda amplificadora combinada a un electrodo para la detección.

En una realización preferida, la sonda amplificadora comprende una multiplicidad de secuencias de amplificación.

En una realización, la primera secuencia de sonda de la sonda amplificadora hibrida con la secuencia diana, y se retira cualquier sonda amplificadora no hibridada. De nuevo, la realizaciones preferidas utilizan secuencias diana inmovilizadas en las que las secuencias diana se inmovilizan por hibridación con sondas de captura que están unidas al electrodo, o hibridación con sondas extensoras de captura que a su vez hibridan con sondas de captura inmovilizadas, como se describe en este documento. Generalmente en estas realizaciones, las sondas de captura y las sondas de detección están inmovilizadas sobre el electrodo, generalmente en la misma "dirección".

En una realización preferida, la primera secuencia de sonda de la sonda amplificadora hibrida con una primera porción de al menos una sonda extensora marcadora y una segunda porción de la sonda extensora marcadora hibrida con una porción de la secuencia diana. Otras realizaciones preferidas utilizan más de una sonda extensora marcadora.

En una realización preferida, las secuencias de amplificación de la sonda amplificadora se usan directamente para la detección, por hibridación de al menos una secuencia de sonda marcadora.

Por lo tanto, la invención proporciona complejos de ensayo que comprenden como mínimo una secuencia diana y una sonda marcadora. La expresión "complejo de ensayo" se refiere en este documento a la colección de complejos de hibridación que comprenden ácidos nucleicos, incluyendo sondas y dianas, que contienen al menos un ETM y, por lo tanto, permiten la detección. La composición del complejo de ensayo depende del uso de los diferentes componentes de sondas descritos en este documento. Por lo tanto, en las Figuras 16A, 16B y 16C, el complejo de ensayo comprende la sonda de captura y la secuencia diana. Los complejos de ensayo también pueden incluir sondas marcadoras, sondas extensoras de captura, sondas extensoras marcadoras y sondas amplificadoras, como se describe en este documento, dependiendo de la configuración que se use.

Los ensayos se desarrollan generalmente en condiciones de rigurosidad que permiten la formación del complejo de hibridación de sonda marcadora solamente en presencia de diana. La rigurosidad puede controlarse alterando un parámetro de etapa que sea una variable termodinámica, incluyendo, pero sin limitación, temperatura, concentración de formamida, concentración de sal, concentración de sal caotrópica, pH, concentración de disolvente orgánico, etc.

Estos parámetros también pueden usarse para controlar la unión inespecífica, como se describe en general en la Patente de Estados Unidos Nº 5.681.697. Por lo tanto, puede ser deseable realizar ciertas etapas en condiciones de mayor rigurosidad; por ejemplo, cuando se realiza una etapa de hibridación inicial entre la secuencia diana y las sondas extensora marcadora y extensora de captura. El desarrollo de esta etapa en condiciones que favorezcan la unión específica puede permitir la reducción de la unión inespecífica.

En una realización preferida, cuando se usan todos los componentes descritos en este documento, un procedimiento preferido es el siguiente. Se incuba una secuencia diana de cadena sencilla en condiciones de hibridación con las sondas extensoras de captura y las sondas extensoras marcadoras. Una realización preferida realiza esta reacción en presencia del electrodo con sondas de captura inmovilizadas, aunque esto también puede realizarse en dos etapas, con la incubación inicial y la posterior adición al electrodo. Se retiran por lavado los reactivos en exceso y después se añaden sondas amplificadoras. Si se usan sondas preamplificadoras, pueden añadirse antes de las sondas amplificadoras o simultáneamente a las sondas amplificadoras. Los reactivos en exceso se retiran por lavado y después se añaden sondas marcadoras. Los reactivos en exceso se retiran por lavado y la detección se desarrolla como se describe a continuación.

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En una realización, se usan varias sondas de captura (o sondas de captura y sondas extensoras de captura) que son cada una sustancialmente complementarias a una porción diferente de la secuencia diana.

De nuevo, como se describe en este documento, cuando se usan sondas amplificadoras, el sistema se configura generalmente de modo que tras la unión de la sonda marcadora, los enlanzadores de reclutamiento que comprenden los ETM se sitúan en proximidad a la superficie de la monacapa. Por lo tanto, por ejemplo, cuando los EMT se unen mediante estructuras de tipo "dendrimérico", como se describen en este documento, la longitud de los enlanzadores desde el punto de unión del ácido nucleico a los ETM puede variar, particularmente con la longitud de la sonda de captura cuando se usan sondas extensoras de captura. Es decir, sondas de captura más largas, con extensores de captura, pueden dar como resultado que las secuencias diana se "mantengan" más lejos de la superficie que para sondas de captura más cortas. La adición de secuencias de enlace extra entre el ácido nucleico sonda y los ETM puede dar como resultado que los ETM estén espacialmente más próximos a la superficie, proporcionando mejores resultados.

Además, si es deseable, los ácidos nucleicos utilizados en la invención también pueden ligarse entre sí antes de la detección, si es aplicable, mediante el uso de técnicas de biología molecular convencionales tales como el uso de una ligasa. De forma similar, si es deseable para la estabilidad, pueden añadirse agentes entrecruzantes para mantener las estructuras estables.

Las composiciones de la invención se sintetizan generalmente como se describe a continuación, utilizando generalmente procedimientos bien conocidos en la técnica. Como apreciarán los especialistas en la técnica, muchas de las técnicas descritas a continuación se refieren a ácidos nucleicos que contienen una estructura de ribosa-fosfato. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, pueden utilizarse muchos análogos de ácidos nucleicos alternativos, algunos de los cuales pueden no contener ribosa ni fosfato en la estructura. En estas realizaciones, para la unión en posiciones distintas de la base, la unión se realiza como apreciarán los especialistas en la técnica, dependiendo de la estructura. Por lo tanto, por ejemplo, la unión puede realizarse en los átomos de carbono de la estructura de PNA, como se describe a continuación, o en el extremo terminal del PNA.

Las composiciones pueden prepararse de varias formas. Un procedimiento preferido sintetiza primero un oligómero conductor unido a un nucleósido, con adición de nucleósidos adicionales para formar la sonda de captura seguida de la unión al electrodo. Como alternativa, puede generarse la sonda de captura completa y después añadirse el oligómero conductor terminado, seguido de la unión al electrodo. Como alternativa, una monocapa de oligómero conductor (teniendo alguno de los mismos grupos funcionales para la unión de sondas de captura) se une primero al electrodo, seguido de la unión de la sonda de captura. Los últimos dos procedimientos pueden preferirse cuando se usan oligómeros conductores que no son estables en los disolventes y en las condiciones usadas en la síntesis de ácidos nucleicos tradicional.

En una realización preferida, las composiciones de la invención se preparan formando primero el oligómero conductor unido covalentemente al nucleósido, seguido de la adición de nucleósidos adicionales para formar un ácido nucleico sonda de captura, comprendiendo la última etapa la adición del oligómero conductor al electrodo.

La unión del oligómero conductor al nucleósido puede realizarse de varias formas. En una realización preferida, todo o parte del oligómero conductor se sintetiza primero (generalmente con un grupo funcional en el extremo para la unión al electrodo), que después se une al nucleósido. Después, se añaden nucleósidos adicionales según sea necesario, siendo generalmente la última etapa la unión al electrodo. Como alternativa, las unidades de oligómero se añaden de una en una al nucleósido, con adición de nucleósidos adicionales y unión al electrodo. Se muestran varias síntesis representativas en las Figuras del documento WO 98/20162.

Después, el oligómero conductor se une a un nucleósido que puede contener una (o más) de las unidades de oligómero, unidas como se representa en este documento.

En una realización preferida, la unión es a una ribosa de la estructura de ribosa-fosfato. Por lo tanto, es posible la unión mediante enlaces amida y amina (véanse las Figuras 1 y 2 del documento WO 98/20162). En una realización preferida, existe al menos un grupo metileno u otros grupos alquilo alifáticos cortos (como un grupo Z) entre el nitrógeno unido a la ribosa y el anillo aromático del oligómero conductor. Se muestra una síntesis representativa en la Figura 16 del documento WO 98/20162.

Como alternativa, la unión es mediante un fosfato de la estructura de ribosa-fosfato. Se muestran ejemplos de dos esquemas sintéticos en la Figura 4 y la Figura 5 del documento WO 98/20162. Aunque ambas Figuras muestran la unión en la posición 3' de la ribosa, la unión también puede realizarse mediante la posición 2'. En la Figura 5, Z es un enlazador de etileno, aunque pueden usarse otros enlazadores, como apreciarán los especialistas en la técnica.

En una realización preferida, la unión es mediante la base. Se representa un esquema general en la Figura 3 del documento WO 98/20162, usando uridina como el nucleósido y un oligómero conductor de fenileno-acetileno. Como apreciarán en la técnica, también son posibles enlaces amida usando procedimientos bien conocidos en la técnica. En una realización preferida, pueden añadirse grupos protectores a la base antes de la adición de los oligómeros conductores, como se describe en general en las Figuras 10 y 11 del documento WO 98/20162. Además, las reacciones de acoplamiento cruzado con paladio pueden alterarse para evitar problemas de dimerización; es decir, que dos oligómeros conductores se dimericen en lugar de acoplarse con la base.

Como alternativa, la unión a la base puede realizarse preparando el nucleósido con una unidad del oligómero, seguido de la adición de otras.

Una vez que los nucleósidos modificados se preparan, se protegen y se activan, antes de la unión al electrodo, pueden incorporarse en un oligonucleótido en crecimiento por técnicas sintéticas convencionales (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, UK 1984; Eckstein) de varias formas.

En realizaciones preferidas, por ejemplo para los procedimientos de SBE descritos en este documento, uno o más nucleósidos modificados se convierten en la forma trifosfato y se incorporan en una cadena oligonucleotídica en crecimiento mediante el uso de técnicas de biología molecular convencionales, tales como con el uso de la enzima ADN polimerasa I, ADN polimerasa T4, ADN polimerasa T7, ADN polimerasa Taq, transcriptasa inversa y ARN polimerasas. Para la incorporación de un nucleósido 3'-modificado en un ácido nucleico puede usarse una deoxinucleotidiltransferasa terminal. (Ratliff, Terminal deoxynucleotidyltransferase. En The Enzymes, Vol 14A. P. D. Boyer ed págs. 105-118. Academic Press, San Diego, CA. 1981). Por lo tanto, la presente invención proporciona desoxirribonucleósidos trifosfato que comprenden un ETM unido covalentemente. Las realizaciones preferidas utilizan la unión de ETM a la base o a la estructura, tal como a la ribosa (preferiblemente en la posición 2'), como se representa en general a continuación en las Estructuras 42 y 43:

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Por lo tanto, en algunas realizaciones, puede ser posible generar los ácidos nucleicos que comprenden ETM in situ. Por ejemplo, una secuencia diana puede hibridar con una sonda de captura (por ejemplo en la superficie) de tal forma que el extremo terminal de la secuencia diana esté expuesto, es decir, no esté hibridado. La adición de enzima y nucleótidos trifosfato marcados con ETM permite la generación in situ del marcador. De forma similar, el uso de nucleótidos marcados reconocidos por polimerasas puede permitir la PCR y la detección simultáneas; es decir, las secuencias diana se generan in situ.

En una realización preferida, el nucleósido modificado se convierte en la forma de fosforamidita o H-fosfonato, que después se usa en la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida o en solución. De esta forma, el nucleósido modificado, para la unión a la ribosa (es decir, nucleósidos modificados con amino o con tiol) o a la base, se incorpora en el oligonucleótido en una posición interna o en el extremo terminal 5'. Esto se realiza generalmente de una de dos formas. En primer lugar, la posición 5' de la ribosa se protege con 4',4-dimetoxitritilo (DMT), seguido de la reacción con 2-cianoetoxi-bis-diisopropilaminofosfina en presencia de tetrazolida de diisopropilamonio, o de la reacción con clorodiisopropilamino 2'-cianoetioxifosfina, para dar la fosforamidita como se conoce en la técnica; aunque pueden usarse otras técnicas como apreciarán los especialistas en la técnica. Véase Gait, anteriormente; Caruthers, Science 230: 281 (1985).

Para la unión de un grupo en el extremo terminal 3', un procedimiento preferido utiliza la unión del nucleósido modificado (o el reemplazo de nucleósido) a vidrio de tamaño de poro controlado (CPG) u otros soportes oligoméricos. En esta realización, el nucleósido modificado se protege en el extremo 5' con DMT y después reacciona con anhídrido succínico con activación. El compuesto succinilo resultante se une a CPG u otros soportes oligoméricos, como se conocen en la técnica. Se añaden nucleósidos de fosforamidita adicionales, modificados o no, en el extremo 5' después de la desprotección. Por lo tanto, la presente invención proporciona oligómeros conductores o aislantes unidos covalentemente a nucleósidos unidos a soportes oligoméricos sólidos tales como CPG, y a derivados de fosforamidita de los nucleósidos de la invención.

La invención proporciona además procedimientos de preparación de sondas marcadoras con enlazadores de reclutamiento que comprenden ETM. Estas reacciones sintéticas dependerán del carácter del enlazador de reclutamiento y del procedimiento de unión del ETM, como apreciarán los especialistas en la técnica. Para enlazadores de reclutamiento de ácidos nucleicos, las sondas marcadoras se preparan generalmente como se describe en este documento, con la incorporación de ETM en una o más posiciones. Cuando se usa un complejo de metal de transición como ETM, la síntesis puede producirse de varias formas. En una realización preferida, el ligando o ligandos se añaden a un nucleósido, seguido del ión metálico de transición, y después el nucleósido con el complejo de metal de transición unido se añade a un oligonucleótido, es decir, por adición al sintetizador de ácidos nucleicos. Como alternativa, puede unirse el ligando o ligandos, seguido de la incorporación en una cadena oligonucleotídica en crecimiento, seguido de la adición del ión metálico.

En una realización preferida, se unen ETM a una ribosa de la estructura de ribosa-fosfato. Esto se realiza generalmente como se describe en este documento para oligómeros conductores, como se describe en este documento y en la publicación PCT WO 95/15971, usando nucleósidos modificados con amino o modificados con oxo en la posición 2' ó 3' de la ribosa. Después, el grupo amino puede usarse como ligando, por ejemplo, como un ligando de metal de transición para la unión del ión metálico, o como un grupo químicamente funcional que puede usarse para la unión de otros ligandos o ETM orgánicos, por ejemplo, mediante enlaces amida, como apreciarán los especialistas en la técnica. Por ejemplo, los ejemplos describen la síntesis de nucleósidos con una diversidad de ETM unidos a través de la
ribosa.

En una realización preferida, se unen ETM a un fosfato de la estructura de ribosa-fosfato. Como se describe en este documento, esto puede realizarse usando análogos fosfodiéster tales como enlaces fosforamidita, véase en general la publicación PCT WO 95/15971, o puede realizarse de una forma similar a la representada en las Figuras 4 y 5 del documento WO 98/20162, en las que el oligómero conductor se reemplaza por un ligando o complejo de metal de transición o un ETM orgánico, así como se describe en los Ejemplos.

La unión a estructuras alternativas, por ejemplo ácidos peptidonucleicos, o enlaces fosfato alternativos se realizará como apreciarán los especialistas en la técnica.

En una realización preferida, se unen ETM a una base del nucleósido. Esto puede realizarse de una diversidad de formas. En una realización, se usan grupos amino de la base, de origen natural o añadidos como se describe en este documento (véanse las figuras, por ejemplo), como ligandos para complejos de metales de transición o como un grupo químicamente funcional que puede usarse para añadir otros ligandos, por ejemplo mediante un enlace amida o ETM orgánicos. Esto se realiza como apreciarán los especialistas en la técnica. Como alternativa, están disponibles en el mercado nucleósidos que contienen átomos de halógeno unidos al anillo heterocíclico. Pueden añadirse ligandos unidos a acetileno usando las bases halogenadas, como se conoce en general; véase por ejemplo, Tzalis et al., Tetrahedron Lett. 36 (34): 6017-6020 (1995); Tzalis et al., Tetrahedron Lett. 36 (2): 3489-3490 (1995); y Tzalis et al., Chem. Communications (en prensa) 1996. Véanse también las figuras y los ejemplos, que describen la síntesis de metalocenos (en este caso, ferroceno) unidos mediante enlaces acetileno a las bases.

En una realización, los nucleósidos se preparan con ligandos de metales de transición, se incorporan en un ácido nucleico, y después el ión metálico de transición y cualquier ligando necesario restante se añaden como se conoce en la técnica. En una realización alternativa, el ión metálico de transición y los ligandos adicionales se añaden antes de la incorporación en el ácido nucleico.

Una vez que se preparan los ácidos nucleicos de la invención, con un enlazador de unión unido covalentemente (es decir, un aislante o un oligómero conductor), el enlazador de unión se une al electrodo. El procedimiento variará dependiendo del tipo de electrodo que se use. Como se describe en este documento, los enlazadores de unión se preparan generalmente con un enlazador "A" terminal para facilitar la unión al electrodo. Para los fines de esta solicitud, una unión de azufre-oro se considera una unión covalente.

En una realización preferida, los oligómeros conductores, aislantes y enlazadores de unión se unen covalentemente mediante enlaces de azufre al electrodo. Sin embargo, sorprendentemente, los grupos protectores tradicionales para usar en la unión de moléculas a electrodos de oro generalmente no son ideales para el uso tanto en la síntesis de las composiciones descritas en este documento como en la inclusión en reacciones sintéticas de oligonucleótidos. Por consiguiente, la presente invención proporciona nuevos procedimientos para la unión de oligómeros conductores a electrodos de oro, utilizando grupos protectores poco habituales, incluyendo etilpiridina y trimetilsililetilo, como se representan en las Figuras. Sin embargo, como apreciarán los especialistas, cuando los oligómeros conductores no contienen ácidos nucleicos pueden usarse grupos protectores tradicionales tales como grupos acetilo y otros. Véase Greene et al., anteriormente.

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Esto puede realizarse de varias formas. En una realización preferida, la subunidad del oligómero conductor que contiene el átomo de azufre para la unión al electrodo se protege con un grupo etil-piridina o trimetilsililetilo. Para el primero, esto se realiza generalmente por contacto de la subunidad que contiene el átomo de azufre (preferiblemente en forma de un sulfhidrilo) con un grupo vinil piridina o un grupo vinil trimetilsililetilo en condiciones por las que se añade un grupo etilpiridina o trimetilsililetilo al átomo de azufre.

Esta subunidad también contiene generalmente una porción funcional para la unión de subunidades adicionales y, por lo tanto, se unen subunidades adicionales para formar el oligómero conductor. Después, el oligómero conductor se une a un nucleósido y se unen nucleósidos adicionales. Después, el grupo protector se elimina y se realiza la unión covalente azufre-oro. Como alternativa, se prepara todo o parte del oligómero conductor y después se añade una subunidad que contiene un átomo de azufre protegido o se añade un átomo de azufre y después se protege. Después, el oligómero conductor se une a un nucleósido y se unen nucleósidos adicionales. Como alternativa, se prepara el oligómero conductor unido a un ácido nucleico y después se añade una subunidad que contiene un átomo de azufre protegido, o se añade un átomo de azufre y después se protege. Como alternativa, puede usarse el grupo protector etil piridina como anteriormente, pero eliminarse después de una o más etapas y reemplazase con un grupo protector convencional como disulfuro. Por lo tanto, el grupo etil piridina o trimetilsililetilo puede servir como el grupo protector para algunas de las reacciones sintéticas y después eliminarse y reemplazase con un grupo protector tradicional.

Por "subunidad" de un polímero conductor se entiende en este documento al menos la porción del oligómero conductor al que se une el átomo de azufre, aunque pueden estar presentes átomos adicionales, incluyendo grupos funcionales que permiten la adición de componentes adicionales del oligómero conductor o componentes adicionales del oligómero conductor. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se usan oligómeros de Estructura 1, una subunidad comprende al menos el primer grupo Y.

Un procedimiento preferido comprende 1) añadir un grupo protector etil piridina o trimetilsililetilo a un átomo de azufre unido a una primera subunidad de un oligómero conductor, generalmente realizado por adición de un grupo vinil piridina o trimetilsililetilo a un sulfhidrilo; 2) añadir subunidades adicionales para formar el oligómero conductor; 3) añadir al menos un primer nucleósido al oligómero conductor; 4) añadir nucleósidos adicionales al primer nucleósido para formar un ácido nucleico; 5) unir el oligómero conductor al electrodo de oro. Esto también puede realizarse en ausencia de nucleósidos como se describe en los Ejemplos.

El procedimiento anterior también puede usarse para unir moléculas aislantes a un electrodo de oro.

En una realización preferida, se añade una monocapa que comprende oligómeros conductores (y opcionalmente aislantes) al electrodo. Generalmente, la química de adición es similar a igual que la adición de oligómeros conductores al electrodo, es decir, usando un átomo de azufre para la unión a un electrodo de oro, etc. Las composiciones que comprenden monocapas además de los oligómeros conductores unidos covalentemente a ácidos nucleicos pueden prepararse de al menos una de cinco formas: (1) adición de la monocapa, seguida de la adición posterior del complejo de enlazador de unión-ácido nucleico; (2) adición del complejo de enlazador de unión-ácido nucleico, seguido de la adición de la monocapa; (3) adición simultánea de la monocapa y del complejo de enlazador de unión-ácido nucleico; (4) formación de una monocapa (usando cualquiera de 1, 2 ó 3) que incluye enlazadores de unión que terminan en una porción funcional adecuado para la unión de un ácido nucleico terminado; o (5) formación de una monocapa que incluye enlazadores de unión que terminan en una porción funcional adecuado para la síntesis de ácidos nucleicos, es decir, el ácido nucleico se sintetiza en la superficie de la monocapa como se conoce en la técnica. Dichas porciones funcionales adecuados incluyen, pero sin limitación, nucleósidos, grupos amino, grupos carboxilo, porciones de azufre protegido o grupos hidroxilo para adiciones de fosforamidita. Los ejemplos describen la formación de una monocapa en un electrodo de oro usando el procedimiento preferido (1).

En una realización preferida, el ácido nucleico es un ácido peptidonucleico o análogo. En esta realización, la invención proporciona ácidos peptidonucleicos con al menos un ETM o enlazador de unión unido covalentemente. En una realización preferida, estas porciones se unen covalentemente a una subunidad monomérica del PNA. Por "subunidad monomérica de PNA" se entiende en este documento el -NH-CH_{2}CH_{2}-N(COCH_{2}-Base)-CH_{2}-Comonómero, o derivados (incluidos en este documento dentro de la definición de "nucleósido") de PNA. Por ejemplo, puede modificarse el número de átomos de carbono en la estructura del PNA; véase en general Nielsen et al., Chem. Soc. Rev. 1997, página 73, que describe varios derivados de PNA. De forma similar, puede modificarse el enlace amida que une la base a la estructura; pueden usarse enlaces fosforamida y sulfuramida. Como alternativa, las porciones se unen a una subunidad monomérica interna. Por "interna" se entiende en este documento que la subunidad monomérica no es la subunidad monomérica N-terminal ni la subunidad monomérica C-terminal. En esta realización, las porciones pueden unirse a una base o a la estructura de la subunidad monomérica. La unión a la base se realiza como se describe en este documento o se conoce en la bibliografía. En general, las porciones se añaden a una base que después se incorpora en un PNA, como se describe en este documento. La base puede protegerse, según sea necesario para la incorporación en la reacción sintética de PNA, o derivatizarse, para permitir la incorporación, antes o después de la adición de sustituyente químico. La protección y derivatización de las bases se muestra en las Figuras 24-27 del documento WO 98/20162. Después, las bases pueden incorporarse en subunidades monoméricas como se muestra en la Figura 28 del documento WO 98/20162. Las Figuras 29 y 30 del documento WO 98/20162 representan dos sustituyentes químicos diferentes, un ETM y un oligómero conductor unidos en la base. La Figura 29 representa una síntesis representativa de una subunidad monomérica de PNA con un ferroceno unido a una base uracilo. La Figura 30 representa la síntesis de un oligómero conductor de tres unidades unido a una base uracilo.

En una realización preferida, las porciones se unen covalentemente a la estructura del monómero de PNA. Generalmente, la unión es en uno de los átomos de carbono no sustituidos de la subunidad monomérica, preferiblemente el carbono \alpha de la estructura, como se representa en las Figuras 31 y 32, aunque puede realizarse la unión en cualquiera de las posiciones de carbono 1 ó 2, o en el carbono \alpha del enlace amida que une la base a la estructura. En el caso de análogos de PNA, también pueden sustituirse otros carbonos o átomos. En una realización preferida, se añaden porciones en los átomos de carbono \alpha, en una subunidad monomérica terminal o en una interna.

En esta realización, se sintetiza una subunidad monomérica modificada con un ETM o un enlazador de unión o un grupo funcional para su unión, y después se añade la base y el monómero modificado puede incorporarse en una cadena de PNA en crecimiento. La Figura 31 del documento WO 98/20162 representa la síntesis de un oligómero conductor unido covalentemente a la estructura de una subunidad monomérica de PNA, y la Figura 32 del documento WO 98/20162 representa la síntesis de un ferroceno unido a la estructura de una subunidad monomérica.

Una vez generadas, las subunidades monoméricas con porciones unidos covalentemente se incorporan en un PNA usando las técnicas descritas en Will et al., Tetrahedron 51 (44): 12069-12082 (1995) y Vanderlaan et al., Tett. Let. 38: 2249-2252 (1997). Estos procedimientos permiten la adición de sustituyentes químicos a ácidos peptidonucleicos sin destruir los sustituyentes químicos.

Como apreciarán los especialistas en la técnica, pueden generarse electrodos que tengan cualquier combinación de ácidos nucleicos, oligómeros conductores y aislantes.

Las composiciones de la invención pueden contener además uno o más marcadores en cualquier posición. Por "marcador" se entiende en este documento un elemento (por ejemplo, un isótopo) o compuesto químico que está unido para permitir la detección del compuesto. Son marcadores preferidos marcadores isotópicos radioactivos y colorantes coloreados o fluorescentes. Los marcadores pueden incorporarse en el compuesto en cualquier posición. Además, las composiciones de la invención también pueden contener otras porciones tales como agentes entrecruzantes para facilitar el entrecruzamiento del complejo diana-sonda. Véase, por ejemplo, Lukhtanov et al., Nucl. Acids. Res. 24 (4): 683 (1996) y Tabone et al., Biochem. 33: 375 (1994).

Una vez preparadas, las composiciones encuentran utilidad en varias aplicaciones, como se describe en este documento. En particular, las composiciones de la invención encuentran utilidad en ensayos de hibridación. Como apreciarán los especialistas en la técnica, pueden generarse electrodos que tengan una sola especie de ácido nucleico, es decir, una sola secuencia de ácido nucleico, o múltiples especies de ácidos nucleicos.

Además, como se describe en este documento, el uso de un soporte sólido tal como un electrodo permite el uso de estas sondas génicas en forma de matriz. El uso de matrices de oligonucleótidos se conoce bien en la técnica. Además, se conocen técnicas para el "direccionamiento" de localizaciones dentro de un electrodo y para la modificación de la superficie de los electrodos. Por lo tanto, en una realización preferida, se depositan matrices de ácidos nucleicos diferentes sobre el electrodo, estando cada una covalentemente unida al electrodo mediante un enlazador conductor. En esta realización, el número de especies de oligonucleótidos sonda diferentes puede variar ampliamente, de una a miles, prefiriéndose de aproximadamente 4 a aproximadamente 100.000, prefiriéndose particularmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000.

Una vez que se generan los complejos de ensayo de la invención, que comprenden como mínimo una secuencia diana y una sonda marcadora, la detección se desarrolla con inicio electrónico. Sin estar limitada por el mecanismo o por la teoría, la detección se basa en la transferencia de electrones del ETM al electrodo.

La detección de la transferencia de electrones, es decir, la presencia de los ETM, se inicia generalmente electrónicamente, prefiriéndose el voltaje. Se aplica un potencial al complejo de ensayo. Puede realizarse un control preciso y variaciones en el potencial aplicado mediante un potenciostato y un sistema de tres electrodos (un electrodo de referencia, uno de muestra (o de trabajo) y uno contador) o un sistema de dos electrodos (un electrodo de muestra y uno contador). Esto permite ajustar el potencial aplicado al potencial máximo del sistema que depende en parte de la selección de los ETM y en parte del oligómero conductor que se use, la composición y la integridad de la monocapa, y de qué tipo de electrodo de referencia se use. Como se describe en este documento, el ferroceno es un ETM preferido.

En una realización preferida, se usa un co-reductor o co-oxidante (en conjunto, co-redoxante), como una fuente o colector de electrones adicional. Véase, en general Sato et al., Bull. Chem. Soc. Jpn 66: 1032 (1993); Uosaki et al., Electrochimica Acta 36: 1799 (1991); y Alleman et al., J. Phys. Chem 100: 17050 (1996).

En una realización preferida, se usan una fuente de aportación de electrones en solución en el inicio de la transferencia de electrones, preferiblemente cuando el inicio y la detección se están realizando usando una corriente CC o frecuencias de CA a las que la difusión no es limitante. En general, como apreciarán los especialistas en la técnica, las realizaciones preferidas utilizan monocapas que contienen un mínimo de "orificios", de modo que se evita que se produzca un cortocircuito en el sistema. Esto puede realizarse de varias formas generales. En una realización preferida, se usa una fuente de aportación de electrones que tiene un potencial redox inferior o similar al del ETM de la sonda marcadora. Por lo tanto, a voltajes por encima del potencial redox de la fuente de aportación de electrones, tanto el ETM como la fuente de aportación de electrones se oxidan y, por lo tanto, pueden donar electrones; el ETM dona un electrón al electrodo y la fuente de aportación dona al ETM. Por ejemplo, el ferroceno, como un ETM unido a las composiciones de la invención como se describe en los ejemplos, tiene un potencial redox de aproximadamente 200 mV en solución acuosa (que puede cambiar significativamente dependiendo de a qué esté unido el ferroceno, la forma de enlace y la presencia de cualquier grupo de sustitución). El ferrocianuro, una fuente de electrones, también tiene un potencial redox de aproximadamente 200 mV (en solución acuosa). Por consiguiente, a o por encima de voltajes de aproximadamente 200 mV, el ferroceno se convierte en ferricenio, que después transfiere un electrón al electrodo. Ahora, el ferricianuro puede oxidarse para transferir un electrón al ETM. De esta forma, la fuente de electrones (o co-reductor) sirve para amplificar la señal generada en el sistema, puesto que las moléculas fuente de electrones donan rápidamente y de forma repetida electrones al ETM unido al ácido nucleico. La velocidad de donación o aceptación de electrones estará limitada por la velocidad de difusión del co-reductor, la transferencia de electrones entre el co-reductor y el ETM, que a su vez se ve afectada por la concentración y el tamaño, etc.

Como alternativa, las fuentes de aportación de electrones pueden tener potenciales redox inferiores que el ETM que se use. A voltajes inferiores al potencial redox del ETM, pero superiores al potencial redox de la fuente de electrones, la fuente de aportación tal como ferrocianuro es incapaz de oxidarse, y por lo tanto, incapaz de donar un electrodo al ETM; es decir, no se produce transferencia de electrones. Una vez que se oxida el ferroceno, entonces existe una ruta para la transferencia de electrones.

En una realización preferida alternativa, se usa una fuente de aportación de electrones que tiene un potencial redox superior al del ETM de la sonda marcadora. Por ejemplo, el luminol, una fuente de electrones, tiene un potencial redox de aproximadamente 720 mV. A voltajes superiores al potencial redox del ETM, pero inferiores al potencial redox de la fuente de electrones, es decir, 200-720 mV, el ferroceno se oxida y transfiere un solo electrón al electrodo a través del oligómero conductor. Sin embargo, el ETM es incapaz de aceptar cualquier electrón de la fuente de electrones de luminol, puesto que los voltajes son inferiores al potencial redox del luminol. Sin embargo, a o por encima del potencia redox del luminol, el luminol transfiere entonces un electrón al ETM, permitiendo una transferencia de electrones rápida y repetida. De esta forma, la fuente de electrones (o co-reductor) sirve para amplificar la señal generada en el sistema, puesto que las moléculas fuente de electrones donan rápidamente y de forma repetida electrones al ETM de la sonda marcadora.

El luminol tiene el beneficio añadido de convertirse en una especie quimioluminiscente tras la oxidación (véase Jirka et al., Analytica Chimica Acta 284: 345 (1993)), permitiendo de este modo la fotodetección de la transferencia de electrones desde el ETM al electrodo. Por lo tanto, siempre que el luminol sea incapaz de contactar con el electrodo directamente, es decir, en presencia de la SAM de forma que no exista una ruta de transferencia de electrones eficaz hacia el electrodo, el luminol sólo puede oxidarse por transferencia de un electrón al ETM en la sonda marcadora. Cuando el ETM no está presente, es decir, cuando la secuencia diana no está hibridada con la composición de la invención, el luminol no se oxida significativamente, dando como resultado una baja emisión de fotones y, por lo tanto, una señal reducida (si existe) del luminol. En presencia de la diana, se genera una señal mucho mayor. Por lo tanto, la medida de la oxidación de luminol por emisión de fotones es una medición indirecta de la capacidad del ETM para donar electrones al electrodo. Además, puesto que generalmente la detección de fotones es más sensible que la detección de electrones, la sensibilidad del sistema puede aumentarse. Los resultados iniciales sugieren que la luminiscencia puede depender de la concentración de peróxido de hidrógeno, pH y concentración de luminol, pareciendo esta última no ser lineal.

Se conocen bien en la técnica moléculas fuente de electrones adecuadas e incluyen, pero sin limitación, ferricianuro y luminol.

Como alternativa, pueden usarse aceptores o colectores de electrones producidos, es decir, las reacciones anteriores pueden desarrollarse a la inversa, recibiendo el ETM tal como un metaloceno un electrón del electrodo, convirtiéndolo en el metalicenio, aceptando después el aceptor de electrones producidos el electrón rápidamente y de forma repetida. En esta realización, el cobalticenio es el ETM preferido.

La presencia de los ETM en la superficie de la monocapa puede detectarse de una diversidad de formas. Pueden usarse una diversidad de procedimientos de detección incluyendo, pero sin limitación, detección óptica (como resultado de cambios espectrales tras cambios en los estados redox), que incluye fluorescencia, fosforescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, e índice de refracción; y detección electrónica, incluyendo, pero sin limitación, amperimetría, voltimetría, capacitancia e impedancia. Estos procedimientos incluyen procedimientos dependientes del tiempo o de la frecuencia basados en corrientes CA o CC, procedimientos por pulsos, técnicas de sincronización, filtrado (paso alto, paso bajo, paso de banda) y técnicas de resolución temporal incluyendo fluorescencia de resolución temporal.

En una realización, la transferencia eficaz de electrones desde el ETM al electrodo da como resultado cambios estereotipados en el estado redox del ETM. Con muchos ETM incluyendo los complejos de rutenio que contienen bipiridina, piridina y anillos imidazol, estos cambios en el estado redox se asocian con cambios en las propiedades espectrales. Se observan diferencias significativas en la absorbancia entre estados reducidos y oxidados para estas moléculas. Véase, por ejemplo, Fabbrizzi et al., Chem. Soc. Rev. 1995 págs. 197-202). Estas diferencias pueden controlarse usando un espectrofotómetro o un dispositivo de tubo fotomultiplicador simple.

En esta realización, los donadores y aceptores de electrones posibles incluyen todos los derivados enumerados anteriormente para la fotoactivación o inicio. Los donadores y aceptores de electrones preferidos tienen característicamente grandes cambios espectrales tras la oxidación y reducción que dan como resultado un control altamente sensible de la transferencia de electrones. Dichos ejemplos incluyen Ru(NH_{3})_{4}py y Ru(bpy)_{2}im como ejemplos preferidos. Debe entenderse que sólo el donador o aceptor que se está controlando por absorbancia debe tener características espectrales ideales.

En una realización preferida, la transferencia de electrones se detecta fluorométricamente. Numerosos complejos de metales de transición, incluyendo los de rutenio, tienen diferentes propiedades de fluorescencia. Por lo tanto, el cambio en el estado redox de los donadores de electrones y aceptores de electrones unidos al ácido nucleico puede controlarse con una gran sensibilidad usando fluorescencia, por ejemplo con Ru(4,7-bifenil_{2}-fenantrolina)_{3}^{2+}. La producción de este compuesto puede medirse fácilmente usando técnicas de ensayo de fluorescencia convencionales. Por ejemplo, puede registrarse la fluorescencia inducida por láser en un fluorímetro de una sola celda convencional, un fluorímetro "en línea" de flujo continuo (tales como los unidos a un sistema de cromatografía) o un "lector de placas" multimuestra similar a los comercializados para inmunoensayos de 96 pocillos.

Como alternativa, puede medirse la fluorescencia usando detectores de fibra óptica con sondas de ácidos nucleicos en solución o unidas a la fibra óptica. La fluorescencia se controla usando un tubo fotomultiplicador u otro instrumento de detección de luz unido a la fibra óptica. La ventaja de este sistema son los volúmenes extremadamente pequeños de muestra que pueden ensayarse.

Además, detectores de barrido de fluorescencia tales como el FluorImager comercializado por Molecular Dynamics se adaptan idealmente al control de la fluorescencia de moléculas de ácido nucleico modificadas organizadas en matrices sobre superficies sólidas. La ventaja de este sistema es la gran cantidad de sondas de transferencia de electrones que pueden explorarse a la vez, usando microplacas cubiertas con miles de sondas de ácido nucleico diferentes.

Muchos complejos de metales de transición presentan fluorescencia con grandes desplazamientos de Stokes. Los ejemplos adecuados incluyen complejos de bis y trisfenantrolina y complejos de bis y trisbipiridilo de metales de transición, tales como rutenio (véase Juris A., Balzani, V., et. al. Coord. Chem. Rev. V. 84, págs. 85-277, 1988). Los ejemplos preferidos presentan una fluorescencia eficaz (rendimientos cuánticos razonablemente altos) así como bajas energías de reorganización. Éstos incluyen Ru(4,7-bifenil_{2}-fenantrolina)_{3}^{2+}, Ru(4,4'-difenil-2,2'-bipiridina)_{3}^{2+} y complejos de platino (véase Cummings et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 1949-1960 (1996)). Como alternativa, puede medirse una reducción en la fluorescencia asociada con la hibridación usando estos sistemas.

En una realización adicional, se usa la electroquimioluminiscencia como base de la detección de la transferencia de electrones. Con algunos ETM tales como Ru^{2+}(bpy)_{3}, la desintegración del estado excitado va acompañada de una luminiscencia directa. Los cambios en esta propiedad se asocian con hibridación del ácido nucleico y pueden controlarse con un dispositivo de tubo fotomultiplicador simple (véase Blackburn, G. F. Clin. Chem. 37: 1534-1539 (1991); y Juris et al., anteriormente.

En una realización preferida, se usa detección electrónica, incluyendo amperimetría, voltimetría, capacitancia e impedancia. Las técnicas adecuadas incluyen, pero sin limitación, electrogravimetría; culombimetría (incluyendo culombimetría potencial controlada y culombimetría de corriente constante); voltimetría (voltimetría cíclica, voltimetría de pulso (voltimetría de pulso normal, voltimetría de onda cuadrada, voltimetría de pulso diferencial, voltimetría de onda cuadrada de Osteryoung y técnicas de pulso coulostático); análisis de separación (análisis de separación anódica, análisis de separación catódica, voltimetría de separación de onda cuadrada); mediciones de conductancia (conductancia electrolítica, análisis directo); análisis electroquímicos dependientes del tiempo (cronoamperimetría, cronopotenciometría, cronopotenciometría cíclica y amperimetría, polografía de CA, cronogalvanometría y cronoculombimetría); medición de la impedancia de CA; medición de capacitancia; voltimetría de CA; y fotoelectroquímica.

En una realización preferida, el control de la transferencia de electrones es mediante detección amperimétrica. Este procedimiento de detección implica la aplicación de un potencial (en comparación con un electrodo de referencia separado) entre el electrodo conjugado con ácido nucleico y un electrodo de referencia (contador) en la muestra que contiene genes diana de interés. La transferencia de electrones de eficacias diferentes se induce en muestras en presencia o ausencia de ácido nucleico diana; es decir, la presencia o ausencia del ácido nucleico y, por lo tanto, la sonda marcadora, pueden dar como resultado corrientes diferentes.

El dispositivo para medir amperimétricamente la transferencia de electrones implica una detección de corriente sensible e incluye un medio de control del potencial de voltaje, habitualmente un potenciostato. Este voltaje se optimiza con respecto al potencial del complejo donador de electrones en la sonda marcadora. Los complejos donadores de electrones posibles se incluyen los mencionados anteriormente, prefiriéndose complejos de hierro, osmio, platino, cobalto, renio y rutenio y siendo más preferidos complejos de hierro.

En una realización preferida, se utilizan modos de detección de electrones alternativos. Por ejemplo, las mediciones potenciométricas (o voltimétricas) implican procesos no faradaicos (sin flujo de corriente neto) y se utilizan tradicionalmente en detectores de pH y otros iones. Se usan detectores similares para controlar la transferencia de electrones entre el ETM y el electrodo. Además, podrían usarse otras propiedades de aislantes (tales como resistencia) y de conductores (tales como conductividad, impedancia, capacitancia) para controlar la transferencia de electrones entre el ETM y el electrodo. Por último, cualquier sistema que genere una corriente (tal como una transferencia de electrones) también genera un pequeño campo magnético que puede controlarse en algunas realizaciones.

Se entenderá que un beneficio de las rápidas velocidades de transferencia de electrones observados en las composiciones de la invención es que la resolución temporal puede aumentar enormemente los resultados de señal con respecto a interferencia de controles basados en absorbancia, fluorescencia y corriente electrónica. Las rápidas velocidades de transferencia de electrones de la presente invención dan como resultado tanto señales intensas como retrasos estereotipados entre el inicio y la terminación de la transferencia de electrones. Mediante la amplificación de señales de retrasos particulares, tal como mediante el uso del inicio por pulsos de la transferencia de electrones y amplificadores "síncronos" de detección y transformaciones de Fourier.

En una realización preferida, la transferencia de electrones se inicia usando procedimientos de corriente alterna (CA). Sin estar ligado a teoría alguna, parece que los ETM unidos a un electrodo responden de forma similar a un voltaje de CA a través de un circuito que contiene resistores y capacitores. Básicamente, cualquier procedimiento que permita la determinación de la naturaleza de estos complejos, que actúe como resistor y capacitor, puede usarse como base de la detección. Sorprendentemente, la teoría electroquímica tradicional, como se ejemplifica en Laviron et al., J. Electroanal. Che. 97: 135 (1979) y Laviron et al., J. Electroanal. Chem. 105: 35 (1979), no modela con precisión los sistemas que se describen en este documento, excepto para E_{CA} muy pequeñas (menores de 10 mV) y un número de moléculas relativamente grande. Es decir, la corriente CA (I) no se describe con precisión mediante la ecuación de Laviron. Esto puede deberse en parte al hecho de que esta teoría asume una fuente y un colector de electrones ilimitados, que no se cumple en los presentes sistemas.

La teoría de voltimetría de CA que modela bien estos sistemas se describe en O'Connor et al., J. Electroanal. Chem. 466 (2): 197-202 (1999). La ecuación que predice estos sistemas se muestra a continuación como Ecuación 1:

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En la Ecuación 1, n es el número de electrones oxidados o reducidos por molécula redox, f es la frecuencia aplicada, F es la constante de Faraday, N_{total} es el número total de moléculas redox, E_{o} es el potencial correcto de la molécula redox, R es la constante de gases, T es la temperatura en grados Kelvin y E_{CC} es el potencial del electrodo. El modelo se ajusta muy bien a los datos experimentales. En algunos casos, la corriente es menor que la predicha, sin embargo se ha demostrado que esto está causado por la degradación del ferroceno, que puede remediarse de varias formas.

Además, la corriente faradaica también puede expresarse en función del tiempo, como se muestra en la Ecuación 2:

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I_{F} es la corriente Faradaica y q_{e} es la carga elemental.

Sin embargo, la Ecuación 1 no incorpora el efecto de la velocidad de transferencia de electrones ni los factores del instrumento. La velocidad de transferencia de electrones es importante cuando la velocidad está próxima a o es inferior a la frecuencia aplicada. Por lo tanto, la i_{CA} verdadera debe estar en función de las tres, como se representa en la Ecuación 3.

Ecuación 3

i_{CA} = f(factores de Nernst)f(k_{ET})f(factores del instrumento)

Estas ecuaciones pueden usarse para modelar y predecir las corrientes CA esperadas en sistemas que usan señales de entrada que comprenden componentes tanto de CA como de CC. Como se describe a continuación, sorprendentemente la teoría tradicional no modela estos sistemas en absoluto, excepto para voltajes muy bajos.

En general, las sondas marcadoras unidas inespecíficamente/ETM muestran diferencias en la impedancia (es decir, impedancias superiores) que cuando las sondas marcadoras que contienen los ETM se unen específicamente en la orientación correcta. En una realización preferida, el material unido inespecíficamente se retira por lavado, dando como resultado una impedancia efectiva de infinito. Por lo tanto, la detección de CA proporciona varias ventajas como se analizan en general a continuación, incluyendo un aumento en la sensibilidad y la capacidad de "filtrar" interferencias de fondo. En particular, pueden controlarse los cambios en la impedancia (incluyendo, por ejemplo, la impedancia volumétrica) como entre la unión inespecífica de sondas que contienen ETM y la formación de complejos de ensayo específicos de diana.

Por consiguiente, cuando se usan procedimientos de inicio y de detección de CA, la respuesta de frecuencia del sistema cambia como resultado de la presencia del ETM. Por "respuesta de frecuencia" se entiende en este documento una modificación de las señales como resultado de la transferencia de electrones entre el electrodo y el ETM. Esta modificación es diferente dependiendo de la frecuencia de la señal. Una respuesta de frecuencia incluye corrientes CA a una o más frecuencias, desplazamientos de fase, voltajes de compensación de CC, impedancia faradaica, etc.

Una vez que el complejo de ensayo que incluye la secuencia diana y la sonda marcadora se preparan, entonces se aplica una primera señal eléctrica de entrada al sistema, preferiblemente a través de al menos el electrodo de muestra (que contiene los complejos de la invención) y el electrodo contador, para iniciar la transferencia de electrones entre el electrodo y el ETM. También pueden usarse sistemas de tres electrodos, aplicando el voltaje a los electrodos de referencia y de trabajo. La primera señal de entrada comprende al menos un componente de CA. El componente de CA puede ser de amplitud y frecuencia variables. Generalmente, para el uso en los presentes procedimientos, los intervalos de amplitud de CA de aproximadamente 1 mV a aproximadamente 1,1 V, prefiriéndose de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 800 mV, y prefriéndose especialmente de aproximadamente 10 mV a aproximadamente 500 mV. Los intervalos de frecuencia de CA de aproximadamente 0,01 Hz a aproximadamente 100 MHz, prefiriéndose de aproximadamente 10 Hz a aproximadamente 10 MHz y prefiriéndose especialmente de aproximadamente 100 Hz a aproximadamente 20 MHz.

El uso de combinaciones de señales de CA y CC proporciona una diversidad de ventajas, incluyendo una sensibilidad y una maximización de la señal sorprendentes.

En una realización preferida, la primera señal de entrada comprende un componente de CC y un componente de CA. Es decir, se realiza un barrido de voltaje de compensación de CC entre los electrodos de muestra y contador a lo largo del potencial electroquímico del ETM (por ejemplo, cuando se usa ferroceno, el barrido es generalmente de 0 a 500 mV) (o como alternativa, el electrodo de trabajo se conecta a tierra y el electrodo de referencia se barre de 0 a -500 mV). El barrido se usa para identificar el voltaje de CC al que se observa la respuesta máxima del sistema. Generalmente, esto es a o por encima del potencial electroquímico del ETM. Una vez que se determina este voltaje, puede usarse un barrido o uno o más voltajes de compensación de CC uniformes. Se prefieren voltajes de compensación de CC de aproximadamente -1 V a aproximadamente a +1,1 V, prefiriéndose especialmente de aproximadamente -500 mV a aproximadamente a +800 mV y prefiriéndose particularmente de aproximadamente -300 mV a aproximadamente 500 mV. En una realización preferida, el voltaje de compensación de CC no es cero. En la parte superior del voltaje de compensación de CC, se aplica un componente de señal de CA de amplitud y frecuencia variables. Si el ETM está presente y puede responder a la perturbación de CA, se producirá una corriente CA debido a la transferencia de electrones entre el electrodo y el ETM.

Para sistemas definidos, puede ser suficiente aplicar una sola señal de entrada para diferenciar entre la presencia y ausencia del ácido nucleico ETM (es decir, la presencia de la secuencia diana). Como alternativa, se aplican una pluralidad de señales de entrada. Como se describe en este documento esto puede adoptar una diversidad de formas, incluyendo el uso de frecuencias múltiples, voltajes de compensación de CC múltiples o amplitudes de CA múltiples o combinaciones de cualquiera o de todos éstos.

Por lo tanto, en una realización preferida, se usan voltajes de compensación de CC múltiples, aunque como se ha descrito anteriormente, se prefieren barridos de voltaje de CC. Esto puede realizarse a una sola frecuencia o a dos o más frecuencias.

En una realización preferida, se varía la amplitud de CA. Sin estar ligado a teoría alguna, parece que aumentar la amplitud aumenta la fuera directriz. Por lo tanto, amplitudes mayores que dan como resultado sobrepotenciales mayores proporcionan velocidades más rápidas de transferencia de electrones. Por lo tanto, en general, el mismo sistema proporciona una respuesta mejorada (es decir, señales de salida superiores) a cualquier frecuencia individual mediante el uso de mayores sobrepotenciales a esa frecuencia. Por lo tanto, la amplitud puede aumentarse a altas frecuencias para aumentar la velocidad de transferencia de electrones a través del sistema, dando como resultado una mayor sensibilidad. Además, esto puede usarse, por ejemplo, para inducir respuestas en sistemas más lentos tales como los que no poseen configuraciones de separación óptimas.

En una realización preferida, se toman mediciones del sistema a al menos dos amplitudes o sobrepotenciales separados, prefiriéndose mediciones a una pluralidad de amplitudes. Como se ha señalado anteriormente, cambios en la respuesta como resultado de cambios en la amplitud pueden constituir la base de la identificación, calibración y cuantificación del sistema. Además, también pueden usarse una o más frecuencias de CA.

En una realización preferida, se varía la frecuencia de CA. A diferentes frecuencias, diferentes moléculas responden de formas diferentes. Como apreciarán los especialistas en la técnica, el aumento de la frecuencia generalmente aumenta la corriente de salida. Sin embargo, cuando la frecuencia es superior a la velocidad a la que los electrones pueden viajar entre el electrodo y el ETM, frecuencias mayores dan como resultado una pérdida o disminución de la señal de salida. En algún punto, la frecuencia será mayor que la velocidad de transferencia de electrones entre el ETM y el electrodo y entonces la señal de salida también disminuirá.

En una realización, la detección utiliza una sola medición de la señal de salida a una sola frecuencia. Es decir, puede determinarse previamente que la respuesta de frecuencia del sistema en ausencia de secuencia diana y, por lo tanto, ausencia de sonda marcadora que contiene ETM, es muy baja a una alta frecuencia particular. Usando esta información, cualquier respuesta a una frecuencia particular demostrará la presencia del complejo de ensayo. Es decir, cualquier respuesta a una frecuencia particular es característica del complejo de ensayo. Por lo tanto, puede ser sólo necesario usar una sola alta frecuencia de entrada y cualquier cambio en la respuesta de frecuencia es un indicio de que el ETM está presente y, por lo tanto, de que la secuencia diana está presente.

Además, el uso de técnicas de CA permite la reducción significativa de las señales de fondo a cualquier frecuencia individual debidas a entidades distintas de los ETM, es decir, "bloqueando" o "filtrando" las señales no deseadas. Es decir, la respuesta de frecuencia de una molécula activa transportadora de carga o redox en solución estará limitada por su coeficiente de difusión y su coeficiente de transferencia de carga. Por consiguiente, a altas frecuencias, un transportador de carga puede no difundir lo bastante rápido para transferir su carga al electrodo y/o la cinética de transferencia de carga puede no ser lo bastante rápida. Esto es particularmente significativo en realizaciones que no tienen buenas monocapas, es decir, que tienen monocapas parciales o insuficientes, es decir, en las que el disolvente es accesible para el electrodo. Como se ha descrito anteriormente, en técnicas de CC, la presencia de "orificios" en los que el electrodo es accesible para el disolvente puede dar como resultado que los transportadores de carga del disolvente "cortocircuiten" el sistema, es decir, alcancen el electrodo y generen una señal de fondo. Sin embargo, usando las presentes técnicas de CA, pueden seleccionarse una o más frecuencias que eviten una respuesta de frecuencia de uno o más transportadores de carga en solución, esté o no presente una monocapa. Esto es particularmente significativo puesto que muchos fluidos biológicos tales como sangre contienen cantidades significativas de moléculas con actividad redox que pueden interferir como procedimientos de detección amperimétricos.

En una realización preferida, se toman mediciones del sistema a al menos dos frecuencias separadas, prefiriéndose mediciones a una pluralidad de frecuencias. Una pluralidad de frecuencias incluye una exploración. Por ejemplo, la medición de la señal de salida, por ejemplo, la corriente CA, a una baja frecuencia de entrada tal como 1-20 Hz, y la comparación de la respuesta a la señal de salida a alta frecuencia tal como 10-100 kHz demostrará una diferencia de respuesta de frecuencia entre la presencia y ausencia del ETM. En una realización preferida, la respuesta de frecuencia se determinará a al menos dos, preferiblemente a al menos aproximadamente cinco, y más preferiblemente a al menos aproximadamente 10 frecuencias.

Después de transmitir la señal de entrada para iniciar la transferencia de electrones, se recibe o detecta una señal de salida. La presencia y la magnitud de la señal de salida dependerán de varios factores, incluyendo el sobrepotencial/amplitud de la señal de entrada; la frecuencia de la señal de CA de entrada; la composición del medio intermedio; la compensación de CC; el entorno del sistema; la naturaleza del ETM; el disolvente; y el tipo y la concentración de sal. A una señal de entrada dada, la presencia y la magnitud de la señal de salida dependerán en general de la presencia o ausencia del ETM, la colocación y la distancia del ETM de la superficie de la monocapa y el carácter de la señal de entrada. En algunas realizaciones, puede ser posible diferenciar entre la unión inespecífica de sondas marcadoras y la formación de complejos de ensayo específicos de diana que contienen sondas marcadoras, en base a la impedancia.

En una realización preferida, la señal de salida comprende una corriente CA. Como se ha descrito anteriormente, la magnitud de la corriente de salida dependerá de varios parámetros. Mediante la variación de estos parámetros el sistema puede optimizarse de varias formas.

En general, las corrientes CA generadas en la presente invención varían de aproximadamente 1 femtoamperio a aproximadamente 1 miliamperio, prefiriéndose corrientes de aproximadamente 50 femtoamperios a aproximadamente 100 microamperios, y prefiriéndose especialmente de aproximadamente 1 picoamperio a aproximadamente 1 microamperio.

En una realización preferida, la señal de salida se desplaza de fase en el componente de CA con respecto a la señal de entrada. Sin estar ligado a teoría alguna, parece que los sistemas de la presente invención pueden ser suficientemente uniformes para permitir una detección basada en el desplazamiento de fase. Es decir, las biomoléculas del complejo de la invención a través de las que se produce la transferencia de electrones reaccionan con la entrada de CA de una forma homogénea, similar a componentes electrónicos convencionales, de modo que puede determinarse un desplazamiento de fase. Esto puede servir como base de la detección entre la presencia y la ausencia del ETM, y/o diferencias entre la presencia de complejos de ensayo específicos de diana que comprenden sondas marcadoras y la unión específica de las sondas marcadoras a los componentes del sistema.

La señal de salida es característica de la presencia del ETM; es decir, la señal de salida es característica de la presencia del complejo de ensayo específico de diana que comprende sondas marcadoras y ETM. En una realización preferida, la base de la detección es una diferencia en la impedancia faradaica del sistema como resultado de la formación del complejo de ensayo. La impedancia faradaica es la impedancia del sistema entre el electrodo y el ETM. La impedancia faradaica es muy diferente de la impedancia volumétrica o dieléctrica, que es la impedancia de la solución volumétrica entre los electrodos. Muchos factores pueden modificar la impedancia faradaica que pueden no afectar a la impedancia volumétrica y viceversa. Por lo tanto, los complejos de ensayo que comprenden los ácidos nucleicos en este sistema tienen una cierta impedancia faradaica que dependerá de la distancia entre el ETM y el electrodo, sus propiedades electrónicas, y la composición del medio intermedio entre otras cosas. Es de importancia en los procedimientos de la invención, que la impedancia faradaica entre el ETM y el electrodo sea significativamente diferente dependiendo de si las sondas marcadoras que contienen los ETM se unen específicamente o inespecíficamente al electrodo.

Por consiguiente, la presente invención proporciona además un aparato para la detección de ácidos nucleicos usando procedimientos de detección de CA. El aparato incluye una cámara de ensayo que tiene al menos un primer electrodo de medición o de muestra y un segundo electrodo de medición o contador. También son útiles sistemas de tres electrodos. El primer y segundo electrodos de medición están en contacto con una región receptora de muestra de ensayo, de modo que en presencia de una muestra de ensayo líquida, los dos electrodos pueden estar en contacto eléctrico.

En una realización preferida, el primer electrodo de medición comprende una sonda de captura de ácido nucleico de cadena sencilla unida covalentemente mediante un enlazador de unión y una monocapa que comprende oligómeros conductores, como se describen en este documento.

El aparato comprende además una fuente de voltaje de CA conectada eléctricamente a la cámara de ensayo; es decir, a los electrodos de medición. Preferiblemente, la fuente de voltaje de CA también es capaz de suministrar un voltaje de compensación de CC.

En una realización preferida, el aparato comprende además un procesador capaz de comparar la señal de entrada y la señal de salida. El procesador está acoplado a los electrodos y configurado para recibir una señal de salida y, por lo tanto, detectar la presencia del ácido nucleico diana.

Por lo tanto, las composiciones de la presente invención pueden usarse en una diversidad de entornos de investigación, clínicos, de control de calidad o ensayos de campo.

En una realización preferida, las sondas se usan en el diagnóstico genético. Por ejemplo, pueden generarse sondas usando las técnicas descritas en este documento para detectar secuencias diana, tales como el gen para el cáncer de colon no poliposo, el gen del cáncer de mama BRCA1, P53, que es un gen asociado con una diversidad de cánceres, el gen Apo E4 que indica un mayor riesgo de enfermedad de Alzheimer, permitiendo una exploración presintomática sencilla de pacientes, mutaciones en el gen de la fibrosis quística o cualquiera de los otros bien conocidos en la técnica.

En una realización adicional, se realiza la detección viral y bacteriana usando los complejos de la invención. En esta realización, se diseñan sondas para detectar secuencias diana de una diversidad de bacterias y virus. Por ejemplo, las técnicas actuales de análisis sanguíneo dependen de la detección de anticuerpos anti-VIH. Los procedimientos descritos en este documento permiten la exploración directa de muestras clínicas para detectar secuencias del ácido nucleico del VIH, particularmente secuencias del VIH altamente conservadas. Además, esto permite el control directo de virus circulante dentro un paciente como un procedimiento mejorado de evaluación de la eficacia de terapias antivirales. De forma similar, pueden detectarse virus asociados con leucemia, HTLV-I y HTLV-II de esta forma. También pueden detectarse infecciones bacterianas tales como tuberculosis, clamidiasis y otras enfermedades de transmisión sexual, por ejemplo, usando ARN ribosómico (ARNr) como las secuencias dianas.

En una realización preferida, los ácidos nucleicos de la invención encuentran utilidad como sondas para bacterias tóxicas en la exploración de muestras de agua y alimento. Por ejemplo, las muestras pueden tratarse para lisar las bacterias para liberar su ácido nucleico (particularmente ARNr) y después diseñarse sondas para reconocer cepas bacterianas, incluyendo, pero sin limitación, cepas patogénicas, tales como Salmonella, Campylobacter, Vibrio cholerae, Leishmania, cepas enterotóxicas de E. coli y bacterias de la enfermedad del legionario. De forma similar, pueden evaluarse estrategias biorreparadoras usando las composiciones de la invención.

En una realización adicional, las sondas se usan para "identificación de ADN" forense para enfrentar el ADN de la escena de un crimen con muestras obtenidas de víctimas y sospechosos.

En una realización adicional, las sondas en una matriz se usan para secuenciación por hibridación.

Por lo tanto, la presente invención proporciona sondas extremadamente específicas y sensibles que, en algunas realizaciones, pueden detectar secuencias diana sin la retirada de la sonda no hibridada. Esto será útil en la generación de ensayos de sondas génicas automáticos.

Como alternativa, las composiciones de la invención son útiles para detectar una amplificación génica con éxito en la PCR, permitiendo de este modo que reacciones de PCR exitosas sean un indicio de la presencia o ausencia de una secuencia diana. Puede usarse PCR de esta forma de varios modos. Por ejemplo, en una realización, se realiza la reacción de PCR como se conoce en la técnica y después se añade a una composición de la invención que comprende el ácido nucleico diana con un ETM, unido covalentemente a un electrodo mediante un oligómero conductor, con la detección posterior de la secuencia diana. Como alternativa, se realiza una PCR usando nucleótidos marcados con un ETM, en presencia de o con adición posterior a un electrodo con un oligómero conductor y un ácido nucleico diana. La unión del producto de PCR que contiene ETM a la composición del electrodo permitirá la detección mediante transferencia de electrones. Por último, el ácido nucleico unido al electrodo mediante un polímero conductor puede ser un cebador de PCR, con adición de un segundo cebador marcado con un ETM. La elongación da como resultado un ácido nucleico de doble cadena con un ETM y un electrodo unidos covalentemente. De esta forma, la presente invención se usa para detección por PCR de secuencias diana.

En una realización preferida, las matrices se usan para la detección de ARNm. Una realización preferida utiliza sondas de captura o sondas extensoras de captura que hibridan próximas a la cola de poliadenilación 3' de los ARNm. Esto permite el uso de una especie de sonda de unión a diana para la detección, es decir, la sonda contiene una porción poli-T que se unirá a la cola poli-A de la diana de ARNm. Generalmente, la sonda contendrá una segunda porción, preferiblemente no poli-T, que se unirá a la sonda de detección (u otra sonda). Esto permite que se genere una sonda de unión a diana y, por lo tanto, disminuya la cantidad de síntesis de sondas diferentes que se realiza.

En una realización preferida, el uso de enzimas de restricción y procedimientos de ligación permite la generación de matrices "universales". En esta realización, las monocapas que comprenden sondas de captura que comprenden extremos para endonucleasas de restricción, como se representa en general en la Figura 7 del documento PCT US97/20014. Mediante la utilización de porciones complementarias de ácido nucleico, aunque dejando "extremos cohesivos", se genera una matriz que comprende gran cantidad de sitios para endonucleasas de restricción. El tratamiento de una muestra diana con una o más de estas endonucleasas de restricción permite que las dianas se unan a la matriz. Esto puede realizarse sin conocer la secuencia de la diana. Las secuencias dianas pueden ligarse, según se desee, usando procedimientos convencionales tales como ligasas, y la secuencia diana detectarse usando marcadores convencionales o los procedimientos de la invención.

La presente invención proporciona procedimientos que pueden dar como resultado una detección sensible de ácidos nucleicos. En una realización preferida, se detectan menos de aproximadamente 10 x 10^{6} moléculas, prefiriéndose menos de aproximadamente 10 x 10^{5}, prefiriéndose particularmente menos de 10 x 10^{4}, prefiriéndose especialmente menos de aproximadamente 10 x 10^{3} y prefiriéndose más menos de aproximadamente 10 x 10^{2}. Como apreciarán los especialistas en la técnica, esto asume una correlación 1:1 entre secuencias diana y moléculas indicadoras; si se usa más de una molécula indicadora (es decir, porción de transferencia de electrones) por cada secuencia diana, la sensibilidad aumentará.

Aunque los límites de detección se están evaluando actualmente, basándose en la velocidad de transferencia de electrones publicada a través del ADN, que es de aproximadamente 1 x 10^{6} electrones/s/dúplex para una separación de 8 pares de bases (véase Meade et al., Angw. Chem. Eng. Ed., 34: 352 (1995)) y altas fuerzas directrices, serían posibles frecuencias de CA de aproximadamente 100 kHz. Como muestran los resultados preliminares, la transferencia de electrones a través de estos sistemas es muy eficaz, dando como resultado casi 100 x 10^{3} electrones/s, dando como resultado una sensibilidad potencial de femtoamperios para muy pocas moléculas.

Los siguientes ejemplos sirven para describir más completamente la forma de usar la invención descrita anteriormente, así como para exponer los mejores modos contemplados para llevar a cabo diversos aspectos de la invención. Se entiende que estos ejemplos de ningún modo sirven para limitar el verdadero alcance de esta invención, sino que más bien se presentan con fines ilustrativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Procedimientos Generales de Preparación de Sustratos y Monocapas Procedimiento General de Formación de SAM en Sustratos

Las monocapas autoensambladas se forman sobre una superficie de oro limpia. La superficie de oro puede prepararse mediante una diversidad de procedimientos diferentes: hilo de oro fundido o pulido, oro pulverizado por bombardeo o evaporado sobre obleas de vidrio, o mica o silicio o algún otro sustrato, oro electrometalizado o no electrolítico sobre material de placa de circuito o vidrio o silicio o algún otro sustrato. Tanto las muestras de oro depositadas al vacío (evaporadas y pulverizadas por bombardeo) como las muestras de oro depositadas en solución (no electrolítica y electrometalización) requieren con frecuencia el uso de una capa de adhesión entre el sustrato y el oro para asegurar una buena estabilidad mecánica. Se emplean frecuentemente Cromo, Titanio, Titanio/Tungsteno o Tántalo con oro pulverizado por bombardeo y evaporado. Habitualmente se emplea níquel electrometalizado con oro electrometalizado y no electrolítico, no obstante, pueden usarse otros materiales de adhesión.

El sustrato de oro se limpia antes de la formación de la monocapa. Se han empleado una diversidad de procedimientos diferentes. La limpieza con una solución química es la más extendida. Está más extendida la limpieza con solución Piranha (peróxido de hidrógeno/ácido sulfúrico) o agua regia (ácido clorhídrico/ácido nítrico), sin embargo, también se han empleado procedimientos electroquímicos, tratamiento a la llama y procedimientos con plasma.

Después de la limpieza, el sustrato de oro se incuba en una solución de deposición. La solución de deposición consiste en una mezcla de diversos tioles en un disolvente. El procedimiento más extendido es una mezcla de alcanotioles en un disolvente orgánico como etanol, sin embargo se han desarrollado numerosas variaciones. Los procedimientos alternativos implican deposición de fase gaseosa del alcanotiol, impresión por microcontacto, deposición usando tiol puro, deposición a partir de disolvente acuoso, y se han desarrollado procedimiento de dos etapas. La concentración del alcanotiol en la solución de deposición varía de un intervalo molar a submicrolar, siendo el más extendido de 0,5-2,0 milimolar. El sustrato de oro se incuba o se pone en contacto con la solución de deposición durante de menos de un segundo a días dependiendo del procedimiento. El tiempo más común es una incubación de 1 h a de una noche. La incubación se realiza habitualmente a temperatura ambiente, sin embargo, son comunes temperaturas de hasta 50ºC.

Habitualmente se preparan monocapas mixtas que contienen ADN usando un procedimiento de dos etapas. El ADN tiolado se deposita durante la primera etapa de deposición y la formación de la monocapa mixta se completa durante la segunda etapa, en la que se añade una segunda solución de tiol sin ADN. La segunda etapa implica frecuentemente un calentamiento suave para promover la reorganización de la monocapa.

Procedimiento General para la formación de SAM por Deposición a partir de Solución Orgánica

Se colocó una superficie de oro limpia en un vial limpio. Se preparó una solución de deposición de ADN en disolvente orgánico en la que la concentración total de tiol era de entre 400 \muM y 0,1 mM. La solución de deposición contenía ADN modificado con tiol y moléculas de diluyente de tiol. Habitualmente, la proporción de ADN con respecto a diluyente era de entre 10:1 y 1:10, prefiriéndose de 1:1. Los disolventes preferidos son tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo, dimetilformamida (DMF) o mezclas de los mismos. Se añade solución de deposición de ADN suficiente al vial para cubrir completamente la superficie del electrodo. El sustrato de oro se deja incubar a temperatura ambiente o ligeramente por encima de la temperatura ambiente durante 5-30 minutos. Después de la incubación inicial, la solución de deposición se retira y se añade una solución de moléculas de diluyente solamente (100 \muM-1,0 mM) en disolvente orgánico. El sustrato de oro se deja incubar a temperatura ambiente o por encima de la temperatura ambiente hasta que se forma una monocapa completa (10 minutos-24 horas). La muestra de oro se retira de la solución, se aclara en disolvente limpio y se usa.

Procedimiento General para la formación de SAM por deposición a partir de Solución Acuosa

Se coloca una superficie de oro limpia en un vial limpio. Se prepara una solución de deposición de ADN en agua en la que la concentración total de tiol está entre 1 \muM y 200 \muM. Frecuentemente, la solución acuosa tiene sal presente (aproximadamente 1 M) aunque puede usarse agua pura. La solución de deposición contiene ADN modificado con tiol y con frecuencia una molécula de diluyente de tiol. Habitualmente, la proporción de ADN con respecto a diluyente es de entre 10:1 y 1:10, prefiriéndose de 1:1. La solución de deposición de ADN se añade al vial en un volumen tal que cubra completamente la superficie del electrodo. El sustrato de oro se deja incubar a temperatura ambiente o ligeramente por encima de la temperatura ambiente durante 1-30 minutos, siendo habitualmente suficientes 5 minutos. Después de la incubación inicial, la solución de deposición se retira y se añade una solución de moléculas de diluyente solamente (10 \muM-1,0 mM) en agua o disolvente orgánico. El sustrato de oro se deja incubar a temperatura ambiente o por encima de la temperatura ambiente hasta que se forma una monocapa completa (10 minutos-24 horas). La muestra de oro se retira de la solución, se aclara en disolvente limpio y se usa.

Monocapas sobre Electrodos de Bola de Au

Generación de Electrodos de Bola de Au: Usando una cuchilla para cortar longitudes de 10 cm de hilo de oro (diámetro de 127 pm, pureza del 99,99%; por ejemplo, de Aldrich). Usar un aguja de calibre 16 (1,626 mm) para pasar el hilo a través de un tabique de goma natural de nº 4 (del tamaño para ajustarse alrededor de un tubo eppendorf de PCR de ½ ml). (Esto sirve para sostener el hilo y sellar los tubos durante la deposición. Véase a continuación). Usar una llama de combustión limpia (metano o propano) para fundir un centímetro del hilo y formar una esfera unida al extremo terminal del hilo. Ajustar la longitud del hilo de modo que cuando se selle en un tubo de PCR la bola de oro se sitúe próxima al fondo, capaz de sumergirse en 20 \mul de líquido. El día del uso, sumergir los electrodos en agua regia (4:3:1 H_{2}O:HCl:HNO_{3}) durante 20 segundos y después aclararlos minuciosamente con agua.

Derivatización: Durante 5 minutos, calentar alícuotas de 20 \mul de soluciones de deposición (2:2:1 ADN/H6/M44 a 833 \muM total en DMF) en tubos de PCR en un bloque de PCR a 50ºC. Después colocar cada electrodo en un tubo de solución de deposición (sumergiendo solamente la bola de oro - tan poco del "tallo" del hilo como sea posible) y retirar a temperatura ambiente. Incubar durante quince minutos antes de transferir los electrodos a tubos de PCR con 200 \mul de M44 400 \muM en DMF (sumergiendo también gran parte del tallo del hilo). Dejar que se asienten en M44 a temperatura ambiente durante 5 minutos, después colocarlos en el bloque de PCR y ejecutar el programa HCLONG. Sacar los electrodos de la solución de M44, sumergirlos en SSC 6x y colocarlos en tubos de PCR con 20 \mul de solución de hibridación. Sumergir los electrodos en SSC 6x antes de la medición de ACV.

HCLONG: 65ºC 2', -0,3ºC/s hasta 40ºC, 40ºC 2', +0,3ºC/s hasta 55ºC, 55ºC 2', -0,3ºC/s hasta 30ºC, 30ºC 2', +0,3ºC/s hasta 35ºC, 35ºC 2', -0,3ºC/s hasta 22ºC.

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Fabricación de Placas de Circuito

Un panel de 45,72 cm x 60,96 cm x 1,2 cm (18'' x 24'' x 0,047'') de FR-4 (General Electric) con un papel metalizado de cobre de 14,17 g (media onza) en ambos lados se perforó de acuerdo con las especificaciones (archivos de Gerber). El panel de FR-4 se metaliza con cobre no electrolítico (500 micropulgadas -12,70 \mum) para hacer a los orificios de taladro especificados conductores, y después el panel se metaliza con 12,70 \mum (500 micropulgadas) adicionales de cobre electrometalizado. Después de la metalización con cobre, el panel se graba de acuerdo con las especificaciones mediante grabado con cloruro cúprico (grabado ácido). Después, el panel grabado se metaliza con 10,16 \mum (400 micropulgadas) de níquel electrometalizado con abrillantador, seguido de 1,27 \mum (50 micropulgadas) de oro blando (pureza del 99,99%). El panel de oro se recubre con máscara soldada de líquido fotográfico para formación de imágenes (Probimer 52, Ciba-Geigy Co.) en ambos lados del panel. La formación de imágenes se realiza de acuerdo con las especificaciones. Se crean 14 electrodos detectores que tienen 250 micrómetros de diámetro y 2 electrodos de mayor tamaño (500 micrómetros de diámetro) con conductores aislados que llevan a contactos metalizados con oro en el borde de la placa. Después, el panel recubierto con máscara soldada se ranura de acuerdo con las especificaciones para crear obleas individuales que son de 2,54 cm x 2,54 cm (1'' x 1''). Se aplica una pasta de plata/cloruro de plata a uno de los dos electrodos de mayor tamaño (ERCON R-414). Después, el panel se limpia con plasma con una mezcla de plasma de Argón/
Oxígeno. Después de la limpieza, el panel se almacena en una bolsa revestida de papel de aluminio hasta el uso.

Deposición de Monocapa sobre Placas de Circuito

Las placas de circuito se sacan de las bolsas revestidas de papel de aluminio y se sumergen en una solución de ácido sulfúrico al 10% durante 30 segundos. Después del tratamiento con ácido sulfúrico, las placas se sumergen en dos baños de agua Milli-Q durante 1 minuto cada uno. Después, las placas se secan en una corriente de nitrógeno. Las placas se colocan en una mesa X-Y en una cámara de humedad y se deposita una gota de 30 nanolitros de solución de deposición de ADN en cada uno de los 14 electrodos. La solución de deposición de ADN consiste en ADN tiolado 33 \muM, hilo de fenilacetileno de 2 unidades (H6) 33 \muM y M44 16 \muM en SSC 6x (cloruro de sodio 900 mM, citrato de sodio 90 mM, pH 7) p/Trietilamina al 1%. La gota se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos y después la gota se retira por aclarado en un baño de agua Milli-Q. Las placas se sumergen en un baño a 45ºC de M44 en acetonitrilo. Después de 30 minutos, las placas se retiran y se sumergen en un baño de acetonitrilo durante 30 segundos, seguido de un baño de agua Milli-Q durante 30 segundos. Las placas se secan en una corriente de nitrógeno.

Ejemplo 2 Detección de Secuencias Diana Deposición de Monocapa sobre Placas de Circuito

Como anteriormente, las placas de circuito se sacaron de las bolsas revestidas de papel de aluminio y se sumergieron en una solución de ácido sulfúrico al 10% durante 30 segundos. Después del tratamiento con ácido sulfúrico, las placas se sumergieron en dos baños de agua Milli-Q durante 1 minuto cada uno. Después, las placas se secaron en una corriente de nitrógeno. Las placas se colocaron en una mesa X-Y en una cámara de humedad y se depositó una gota de 30 nanolitros de solución de deposición de ADN sobre cada uno de los 14 electrodos. La solución de deposición de ADN consistía en ADN tiolado 33 \muM, hilo de fenilacetileno de 2 unidades (H6) 33 \muM y undec-1-en-11iltri(etilenglicol)(HS-CH_{2})_{11}-(OCH_{2}CH_{2})_{3}-OH) en SSC 6x (cloruro de sodio 900 mM, citrato de sodio 90 mM, pH 7) p/Trietilamina al 1%. Se aplicó puntualmente en 3 electrodos una solución que contenía ADN 1 (5'-ACCATGGACACAGAT(CH_{2})_{16}SH-3'). Se aplicó puntualmente en 4 electrodos una solución que contenía ADN 2 (5'TCATTGATGGTCTCTTTTAACA((CH_{2})_{16}SH-3'). Se aplicó puntualmente en 4 electrodos ADN 3 (5'CA
CAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA(CH_{2})_{16}SH-3'). Se aplicó puntualmente en 3 electrodos ADN 4 (5'-TGTGCAGTTGACGTGGAT(CH_{2})_{16}SH-3'). La solución de deposición se dejó incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos y después se retiró la gota por aclarado en un baño de agua Milli-Q. Las placas se sumergieron en un baño a 45ºC de M44 en acetonitrilo. Después de 30 minutos, las placas se retiraron y se sumergieron en un baño de acetonitrilo durante 30 segundos, seguido de un baño de agua milli-Q durante 30 segundos. Las placas se secaron en una corriente de nitrógeno y se almacenaron en bolsas revestidas de papel de aluminio lavadas abundantemente con nitrógeno hasta el uso.

Hibridación y Medición

Las placas modificadas se sacaron de las bolsas revestidas de papel de aluminio y se encajaron con una cámara de muestra moldeada por inyección (cartucho). La cámara se adhirió a la tarjeta usando una cinta adhesiva de dos caras y tenía un volumen total de 250 microlitros. Se preparó una solución de hibridación. La solución contiene diana de ADN 10 nM (5'-TGTGCAGTTGACGTGGATTGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCA GAATGGGATAGAGTCATCCAGT-3' (D-998), sonda de señalización 30 nM (D-1055) y 5'-TCTACAG(N6)C(N6)ATCTGTGTCCATGGT-3' 10 nm (N6 se muestra en la Figura 1D del documento PCTUS99/01705; comprende un ferroceno conectado por una cadena de 4 carbonos al oxígeno 2' de la ribosa de un nucleósido). La sonda de señalización es la siguiente:

5'-(C23)_{4}-N87-N87-N87-N87-ATC CAC GTC AAC TGC ACA-3' (D-1055)

44

N87 es un punto de ramificación que comprende una estructura de anillo. C23 se muestra en la Figura 1F del documento PCTUS99/01705. En una solución que contiene tampón de lisis AL de Qiagen al 25%, NaClO_{4} 455 mM, NaCl 195 mM, mercaptohexanol 1,0 mM y suero fetal de ternero al 10%. Se inyectaron 250 microlitros de solución de hibridación en el cartucho y se dejó hibridar durante 12 horas. Después de 12 horas, la microplaca hibridada se conectó a un amplificador de transconductancia casero con un circuito de conmutación. El amplificador de transconductancia se equipó con un circuito adicionador que combina una rampa de CC de la tarjeta DAQ del ordenador y una onda sinusal de CA del amplificador síncrono (SR830 Stanford Instruments). Cada electrodo se exploró de forma secuencial y los datos se guardaron y se manipularon usando un programa casero diseñado usando Labview (National Instruments). La microplaca se exploró a una CC de entre -100 mV y 500 mV (electrodo de referencia de pseudo Ag/Ag/Cl) con una onda sinusal superpuesta de 1.000 Hz y 25 mV (50 mV de pico a pico). Se suministró la corriente de salida al amplificador síncrono y se registró la señal de 1.000 Hz (técnica de ACV). Los datos para cada conjunto de adaptadores se recopilaron y se calculó el promedio.

45

Los resultados se muestran en la Figura 14 del documento U. S. S. N. 09/338.726 (US 6. 264.825).

Ejemplo Comparativo 2

El uso de la temperatura y de competímeros para determinar la secuencia

La capacidad para discriminar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) es un objetivo importante. Se ensayó la capacidad para discriminar mutaciones de un solo nucleótido en el gen de la Hemocromatosis Hereditaria (HFE), en la que un producto proteico anormal da como resultado una sobrecarga de hierro. Se estableció en primer lugar un ensayo de tipo sándwich para la detección de apareamientos erróneos en el dominio de unión a sonda superficial de la diana. La secuencia modelo oligonucleotídica de 76 nucleótidos para el VIH sirvió como la diana inicial y, posteriormente, se usaron oligonucleótidos modelo que mimetizaban los amplicones de HFE. Por último, se ensayaron productos de PCR asimétrica (A-PCR) de pacientes con HH (hemocromatosis hereditaria) para confirmar la utilidad de ensayos de tipo sándwich organizados en matrices para genotipar muestras de pacientes con respecto a dos mutaciones prevalentes. También se desarrolló un ensayo de OLA modelo que revela la capacidad para detectar la escisión de un solo enlace de la estructura.

Discriminación de Apareamientos Erróneos Puntuales en Oligonucleótidos Modelo de 76 pb de VIH o HFE dentro del Dominio de Unión a Sonda Superficial Usando un Ensayo de Tipo Sándwich

Introducción: El oligonucleótido modelo del VIH de 76 nucleótidos (D765) y su sonda superficial de 22 nucleótidos correspondiente (D761), así como una diana modificada con una sustitución de un solo nucleótido y una sonda de captura modificada con una sustitución complementaria se usaron en un ensayo de tipo sándwich del VIH (véanse los Materiales y Procedimientos). El oligonucleótido diana original sin modificar se designó como la diana de tipo silvestre (D765), mientras que el oligonucleótido diana con un nucleótido modificado se designó la diana mutante (D941). Una sonda superficial de 21 nucleótidos (D1182), con una base menos que la D761, se designó como tipo silvestre y el oligonucleótido sonda superficial con un nucleótido modificado se designó como mutante (D1181).

Se preparó un oligonucleótido de HFE de 76 nucleótidos (D1117) para servir como diana modelo de tipo silvestre para la localización CYS282Y, así como su sonda superficial de 21 nucleótidos correspondiente (D1183) y su oligonucleótido señal (D1138). El oligonucleótido D1118 sirve como diana modelo mutante y su sonda superficial de 21 nucleótidos correspondiente es D1184. La señalización del oligonucleótido D1138 es compatible con las secuencias diana tanto del C282 de tipo silvestre como del Y282 mutante.

La segunda mutación más común asociada con la HH se localiza en la posición 63 (mutación H63D, una transversión de C a G). D1121 es la diana modelo de tipo silvestre para H63 y D1122 es la diana modelo mutante para D63 (Beutler et al., Mutation analysis in hereditary hemochromatosis. Blood Cells, Molecules, and Diseases 22: 187-194,1996) (Bulaj et al. Clinical and biochemical abnormalities in people heterozygotes for hemochromatosis. N. Engl. J. Med. 335: 1799-1805,1996) (Feder et al. A novel MHC Class I-like gene is mutated in patients with hereditary hemochromatosis. Nature Genetica 13: 399-408, 1996) (Witte et al. Hereditary hemochromatosis. Practice Guideline Development Task Force of the College of American Pathologists. Clin. Chem. Acta 245: 139-2000,1996). Las sondas de captura y de señalización correspondientes para las dianas modelo de H63D se designan como D1185 (de captura de tipo silvestre), D1186 (de captura mutante) y D1139 (de señalización común), como se muestra en los Materiales y Procedimientos.

Las consideraciones termodinámicas nos conducen a especular que las dianas de tipo silvestre y mutante se asociarán de forma diferencial con sondas diana perfectamente apareadas y apareadas erróneamente después de la hibridación y la posterior exposición a una temperatura elevada. El punto de fusión, Tm, se define como la temperatura a la que el 50% de las cadenas hermanas en solución están en el estado de dúplex y el 50% están en forma de cadena sencilla. La Tm de parejas apareadas erróneamente (diana de tipo silvestre hibridada con sonda mutante o diana mutante hibridada con sonda de tipo silvestre) es inferior que la de la pareja perfectamente apareada (diana de tipo silvestre con sonda de tipo silvestre o diana mutante con sonda mutante).

Se predice que dianas perfectamente apareadas y dianas apareadas erróneamente mostrarán una disparidad similar en la estabilidad al aumento de temperatura en el detector como se observa en solución. En concreto, se predijo que se disociaría la pareja apareada erróneamente y disminuiría la señalización electroquímica, mientras que la pareja apareada permanecería hibridada y continuaría produciendo una señal electroquímica. Sin embargo, se consideró que la mejor temperatura para observar la diferencia en la superficie podía diferir de la Tm en solución.

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Materiales y Procedimientos 1: Oligonucleótidos de ADN Preparados

(D765): Diana WT

5'GACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATA GAG
{}\hskip0.4cm TGC-ATCCAGT-3'

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(D941): Diana mut D765

5'GACATCAAGCgGCtATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAG AG
{}\hskip0.4cm TGCA-TCCAGT-3'

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(D772): Señal WT

[N6]C[N6]G[N6]C[N6]GCTTA[N6]C[N6]G[N6]C[N6]G[C131]TTTGCATGGCTGCTTGATGTC-3'

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(D761): Superficial WT

5'-TCATTGATGGTCTCTTTTAACA(P282)-3'

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(D1181): D761 mut

5'-CATTGATGGTGTCTTTTAACA(P282)-3'

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(D1182): D761 WT

5'-CATTGATGGTCTCTTTTAACA(P282)-3'

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(D1183): superficial WT1 C de HFE

5'-AGATATACGTGCCAGGTGGAGp(282)-3'

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(D1184): superficial mut1 C de HFE

5'-AGATATACGTACCAGGTGGAGp(282)-3'

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(D1138): señal1 C de HFE

5'-(N6)C(N6)G(N6)C(N6)GCTTA(N6)C(N6)G(N6)C(N6)G(C131) CACCCAGGCCTGGATCAGC-3'

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(D1117): diana WT1 C de HFE

5'GCTGATCCAGGCCTGGGTGCTCCACCTGGCACGTATATCTCTGCTCTTCCCCAGGGGGTACA GCCA
{}\hskip0.4cm AGG-TTATCCA-3'

\vskip1.000000\baselineskip

(D1118): diana mut1 C de HFE

5'GCTGATCCAGGCCTGGGTGCTCCACCTGGTACGTATATCTCTGCTCTTCCCCAGGGGGTACA GCCA
{}\hskip0.4cm AGG-TTATCCA-3'

\vskip1.000000\baselineskip

(D1185): superficial WT2 H de HFE

5'-GTTCTATGATCATGAGAGTCGp(282)-3'

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(D1186): superficial mut2 H de HFE

5'-GTTCTATGATGATGAGAGTCGp(282)-3'

\vskip1.000000\baselineskip

(D1139): señal H de HFE

5'-(N6)C(N6)G(N6)C(N6)GCTTA(N6)C(N6)G(N6)C(N6)G(C131) CCGTGTGGAGCCCCGAACT-3'

\vskip1.000000\baselineskip

(D1121): diana WT2 H de HFE

5'AGTTCGGGGCTCCACACGGCGACTCTCATGATCATAGAACACGAACAGCTGGTCATCCACGTA GCC
{}\hskip0.4cm CAA-AGCTTCA-3'

\vskip1.000000\baselineskip

(D1122): diana mut2 H de HFE

5'AGTTCGGGGCTCCACACGGCGACTCTCATCATCATAGAACACGAACAGCTGGTCATCCACGTA GCC
{}\hskip0.4cm CAA-AGCTTCA-3'

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CebadorF1 C de HFE de PCR

5'-TGGCAAGGGTAAACAGATCC-3'

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CebadorR1 C de HFE de PCR

5'-CTCAGGCACTCCTCTCAACC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

CebadorF2 H de HFE de PCR

5'-ACATGGTTAAGGCCTGTTGC-3'

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CebadorR2 H de HFE de PCR

5'-GCCACATCTGGCTTGAAATT-3'

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2: Microplacas Preparadas

Las soluciones de deposición se mezclaron con sondas superficiales como se ha descrito anteriormente. Las sondas de ADN se depositaron sobre microplacas como anteriormente de la forma siguiente: D1183 (HFE-C, WT), D1184 (HFE-C mut), D1185 (HFE_H WT), D1186 (HFE_H, mut), D761/D1182 (VIH, WT), y D1181 (VIH, mut) sobre microplacas, seguido de postratamiento de las microplacas con M44/Acetonitrilo/Calor como anteriormente. Las microplacas se montaron en cartuchos.

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3: Preparar Tampón de Hibridación con Oligonucleótidos Diana y de Señalización

Se combinó sangre completa humana con un volumen equivalente de tampón de lisis AL (de Qiagen) y 1/8 del volumen de sangre de Proteinasa K (20 mg/ml) y después se incubó a 70ºC durante 10 minutos. Se añadieron oligonucleótidos Diana y de Señalización, a 0,5 \muM y 1,25 \muM respectivamente, a la sangre lisada junto con NaClO4 2 M (1/1 en volumen) y se realizó la hibridación durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las matrices de electrodos se colocaron en un termociclador y se alcanzó la temperatura deseada mediante el control de una matriz separada que se había rellenado con glicerol y que contenía una sonda de termómetro. La señal electroquímica para cada adaptador de electrodo se midió usando el sistema DAQ-o-Matic (a diferentes temperaturas).

Resultados y Discusión: La respuesta electroquímica se examinó en función de la temperatura para apareamientos y apareamientos erróneos usando dianas de VIH de tipo silvestre (D765) o mutadas (D1095) y el oligonucleótido de señalización D772. Los análisis se realizaron con 0,5 \muM de diana y 1,25 \muM de oligonucleótido de señalización que hibridaron con matrices de electrodos de tipo silvestre durante 20 minutos a 25ºC. Después, las microplacas se cambiaron a un termociclador para alcanzar una temperatura deseada durante 2 minutos y se midieron las señales electroquímicas (Figura 19). De acuerdo con el gráfico de la Figura 19, la pareja de oligonucleótidos diana de tipo silvestre/superficial de tipo silvestre perfectamente apareado presenta una Tm de aproximadamente 54ºC y la pareja de oligonucleótidos diana mutante/superficial de tipo silvestre apareada erróneamente presenta una Tm de aproximadamente 38ºC. A 45ºC, los complejos perfectamente apareados y apareados erróneamente presentan diferencias significativas en la se-
ñalización electroquímica con respecto al punto de partida (definido como del 100% para la salida inicial a 25ºC).

Los resultados que se presentan en la Figura 19 sugerían que el genotipado de los oligonucleótidos de VIH de tipo silvestre y mutante podía conseguirse por comparación de la salida de señal para muestras homogéneas y heterogéneas a 25ºC y 45ºC. Cuando la solución de hibridación contiene solamente diana de VIH de tipo silvestre o mutante, la señal electroquímica de las parejas perfectamente apareadas presentan una señal de 2 a 20 veces superior a la de las parejas apareadas erróneamente, en temperatura rigurosa (Figura 20, se muestran tres microplacas para cada condición). Obsérvese que la discriminación máxima de la diana de tipo silvestre sobre la sonda de captura mutante se consiguió a 45ºC, mientras que la discriminación máxima de la diana mutante sobre la sonda de tipo silvestre requirió del análisis a 55ºC. Esta última observación es probablemente una consecuencia de la naturaleza específica del par de bases apareado erróneamente, puesto que se sabe que los apareamientos erróneos varían en sus efectos desestabilizantes.

La capacidad para discriminar dúplex apareados erróneamente cuando las matrices se expusieron a una diana homogénea, de tipo silvestre o mutante, sugerían que se podría ser capaz de genotipar con la matriz. En concreto, se pensó en la hipótesis de que las matrices hibridadas con cantidades equimolares de diana de tipo silvestre y mutante generarían una salida similar tanto en los electrodos que contienen sonda de captura de tipo silvestre como mutante a elevadas temperaturas. La Figura 21 representa gráficamente los resultados de tres matrices separadas (Mezcla 1 a 3) expuestas a dicha mezcla de oligonucleótidos de VIH de tipo silvestre y mutante. La señal electroquímica es superior a 25ºC, similar a los resultados obtenidos con dianas homogéneas. Sin embargo, al contrario que los resultados observados con dianas homogéneas, las señales electroquímicas de adaptadores que contienen sondas de captura de tipo silvestre o mutantes se diferencian en dos veces entre sí, a 45ºC y 55ºC (Figura 21). Se interpreta que estos descubrimientos indican que cada electrodo hibridaba inicialmente tanto con dianas perfectamente apareadas como con apareadas erróneamente, y cada uno retiene las dianas perfectamente apareadas y, por lo tanto, continúa generando una señal a igual intensidad a elevadas temperaturas.

Se observó que la salida de señal de los apareamientos perfectos disminuye, en general, a medida que la matriz se calienta de 45ºC a 55ºC. Se razonó, sin embargo, que si se mantenía una señal suficiente en el electrodo que albergaba apareamientos perfectos, una sola temperatura podría facilitar el genotipado. Para ensayar esta hipótesis, se usó una condición de hibridación rigurosa (52ºC) en un intento por diferenciar muestras que contienen oligonucleótidos de tipo silvestre, mutantes o una mezcla de tipo silvestre y mutantes. La Figura 22 muestra los resultados a partir de dicho análisis. Los resultados muestran claramente que las muestras pueden genotiparse después de 3 minutos 52ºC. En concreto, las muestras que contienen una diana homogénea presentan típicamente una diferencia de 10 veces o superior entre los tipos de electrodo a temperatura elevada, aunque la muestra que contiene una carga de diana heterogénea genera señales con una diferencia de menos de 2 veces entre los tipos de electrodo. Obsérvese que se indica una señal absoluta a la izquierda y el resultado de salida normalizado se indica a la derecha.

Dado el éxito en el genotipado de muestras de VIH, se procedió a analizar los oligonucleótidos diana modelo de la HFE. La Tm de cada oligonucleótido se determinó teóricamente y se seleccionaron temperaturas elevadas que se predijo facilitarían la discriminación de apareamientos erróneos para las dos dianas diferentes (C2828Y y H63D) bajo estudio. La Figura 5 presenta los resultados gráficamente. El porcentaje de G+C de la sonda de captura C282Y es superior (52%) que el de la H63D (43%). Por lo tanto, la temperatura que se usó para diferenciar el mutante del tipo silvestre para el modelo C282Y es de 52ºC y la temperatura usada para el modelo H63D es de 46ºC. La señal electroquímica se reduce a temperatura elevada para apareamientos erróneos entre 4 y 20 veces dependiendo de qué pareja de sonda diana y de captura se considere. Al contrario, muestras que contienen ambas dianas a concentraciones equimolares dan como resultado diferencias de menos de 2 veces entre tipos de electrodos a la temperatura elevada. Por lo tanto, puede usarse la matriz de detectores para genotipar oligonucleótidos de HFE modelo que representan las dos mutaciones más comunes en el gen.

Ejemplo Comparativo 3

Determinación del Genotipo de la Hemocromatosis Hereditaria por Detección del Apareamiento Erróneo de un Solo Nucleótido en Productos de PCR Asimétrica (A-PCR)

Objetivo: Confirmar que el ensayo de tipo sándwich que se desarrolló para la detección de apareamientos erróneos de dianas de modelo de HFE puede usarse para detectar la misma mutación en un producto de A-PCR.

Introducción, La Hemocromatosis Hereditaria es la enfermedad hereditaria identificada más prevalente. La HH con frecuencia cursa sin diagnosticar y frecuentemente es la causa raíz de muchos trastornos metabólicos.

La mutación más común de la HH es una mutación de cisteína a tirosina en la posición 282 (mutación C282Y), dando como resultado una transición de guanina a adenina. El CebadorF1_C y CebadorR1_C, enumerados en los Materiales y Procedimientos, se diseñaron originariamente para el diagnóstico por PCR de la mutación de HH en la posición 282. El procedimiento original usa esta pareja de cebadores para amplificar un fragmento de 388 pb por PCR y el genotipo se determina por digestión de restricción con Rsa I posterior y electroforesis en gel de agarosa. El producto de PCR mutado tiene un sitio Rsa I extra y generará un fragmento extra de 111 pb después del tratamiento con Rsa I.

La segunda mutación más común asociada con la HH aparece en la posición 63 (mutación H63D, una mutación de G a C). El CebadorF1_H y el CebadorR1_C, enumerados en los Materiales y Procedimientos, se diseñaron originariamente para el diagnóstico por PCR de la mutación de HH en posición 63. El procedimiento original usa esta pareja de cebadores para amplificar un fragmento de 209 pb y el genotipo se determina después de una digestión con Dpn II. El producto de PCR de tipo silvestre tiene un sitio de Dpn II y dará como resultado fragmentos de 139 pb y 70 pb después del tratamiento con Dpn II, mientras que el producto de PCR mutante, que carece de un sitio Dpn II, conservará el fragmento de 209 pb intacto después del tratamiento con Dpn II.

En los experimentos, se usaron las parejas de cebadores en una proporción asimétrica (Cebador_R con respecto a Cebador_F era de 5 a 1) para producir productos de PCR que contengan ADN monocatenario. Después de confirmar la identidad correcta de los productos de PCR mediante digestión de restricción, se mezclaron los productos de A-PCR y los oligonucleótidos de señalización (D1138 o D1139) en tampón de hibridación, como se describe en los Materiales y Procedimientos. Después, los productos de A-PCR se detectaron en un ensayo de HFE de tipo sándwich.

Materiales y Procedimientos 1: Oligonucleótidos de ADN Preparados

CebadorF1 C de HFE de PCR

5'-TGGCAAGGGTAAACAGATCC-3'

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CebadorR1 C de HFE de PCR

5'-CTCAGGCACTCCTCTCAACC-3'

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CebadorF2 H de HFE de PCR

5'-ACATGGTTAAGGCCTGTTGC-3'

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CebadorR2 H de HFE de PCR

5'-GCCACATCTGGCTTGAAATT-3'

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2: Microplacas que se usaron para el ensayo de tipo sándwich de modelo de HFE (anteriormente)

Las condiciones de PCR son: de 50 a 100 ng de ADN genómico en reacción de PCR de 50 \mul con dNTP 1 mM, MgCI2 2 mM, tampón de PCR 1X, 600 nM de Cebador_R, 120 nM de Cebador_F, desnaturalización a 95ºC, hibridación a 53ºC y elongación a 72ºC, 50 segundos para cada etapa durante 42 ciclos.

10 \mul del producto de PCR se digirieron con enzima de restricción para confirmar el genotipo de muestras individuales. Se incubó Rsa I (Fragmento_C) o Dpn II (Fragmento_H) con productos de PCR a 37ºC durante una hora y los fragmentos de muestra se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2% y posteriormente se tiñeron con bromuro de etidio.

Se mezclaron 20 \mul de producto de PCR con oligonucleótido de señalización 125 nM (D1138 para el fragmento_C, D1139 para el fragmento_H), se calentó a 100ºC durante 1 minuto, se enfrió en hielo durante 3 minutos y después se mezcló con tampón de hibridación (sangre lisada con perclorato de sodio). El tampón de hibridación que contenía los productos de A-PCR se inyectó en microplacas de HFE a temperatura ambiente y se dejaron hibridar durante 4 horas.

Medición de la señal electroquímica en DAQ-o-Matic a 25, 45 y 50ºC.

Si la señal detectada después de 4 horas de hibridación era inferior a 10 nA, se purificaba el producto de PCR con el kit de purificación de PCR de Qiagen y después se usaba una décima parte de este producto purificado como molde de ADN para producir un segundo producto de A-PCR con sólo un único cebador. Los productos de la segunda A-PCR se analizaron después en la microplaca de genotipado de HH.

Resultados

Se hibridaron por separado productos de A-PCR de Fragmento_C (388 pb) o Fragmento_H (209 pb) sobre electrodos que contenían las sondas superficiales para el ensayo de tipo sándwich de modelo de HFE. Según el caso para los oligonucleótidos diana modelo, la temperatura a la que se conseguía la discriminación era diferente entre las dos dianas, 45ºC para el Fragmento_H y 50ºC para el Fragmento_C. Se analizó la señal electroquímica a 25ºC y posteriormente a una temperatura elevada. Los resultados se presentan gráficamente en la Figura 24. Aunque la salida de señal disminuye en todos los adaptadores a las temperaturas elevadas, la salida de señal de los complejos apareados erróneamente muestra un descenso mayor. En concreto, la salida de señal de los complejos de tipo sándwich perfectamente apareados es de 3 a 30 veces superior que la de los adaptadores apareados erróneamente a la temperatura elevada (por ejemplo, 50WT-C y 45mut-D). Como se observó con los oligonucleótidos modelo, las muestras que contenían dianas heterogéneas dieron como resultado una salida de señal que difería en menos de 2 veces entre los dos tipos de electrodos a temperatura elevada (50mix-CY y 45mix-HD).

El éxito en el genotipado de los dos amplicones de HFE individualmente animaba a intentar una reacción de PCR múltiple seguida de un análisis de una sola sonda de los productos de A-PCR para un genotipado completo con respecto a C282Y y H63D en una sola microplaca. Una muestra de paciente previamente caracterizada se sometió a dos series de A-PCR como se ha descrito anteriormente. Los productos de A-PCR se hibridaron sobre dos matrices de electrodos durante 4 horas y después se midió la señalización electroquímica a 25ºC y 43ºC (después de 2 minutos de calentamiento). Los resultados se presentan gráficamente en la Figura 25. A 43ºC, los electrodos que se aparean perfectamente con la mutación 282Y presentan una salida de señal menor de 1/3 de la de los electrodos que contienen el apareamiento perfecto para el alelo de tipo silvestre. La observación sugiere que el genoma es homocigoto de tipo silvestre en la posición 282. Al contrario, a la temperatura elevada, los electrodos de H63D presentan resultados de señal que se diferencian en 2 veces entre sí. Esta última observación sugiere que el genoma analizado es heterocigoto en la posición 63. Los resultados del genotipado concuerdan con la caracterización previa de esta muestra de paciente.

Ejemplo 4 Direccionamiento de Oligonucleótidos a Electrodos en Virtud de Apareamientos Erróneos de una Sola Base

Objetivo: Establecer un protocolo para la localización selectiva de oligonucleótidos en electrodos específicos en virtud de la variación de un solo nucleótido.

Introducción: Se usaron dos moléculas de Ferroceno diferentes N6 y W97, como se representan en la Figura 1, para marcar oligonucleótidos de VIH de tipo silvestre o mutantes respectivamente. Los "dos colores", es decir, los dos potenciales redox diferentes, proporcionan un medio de diferenciación de los dos oligonucleótidos durante el análisis de la señalización electroquímica. Cuando las moléculas marcadas están capturadas en superficies por hibridación con las sondas de captura depositadas previamente, el VIH de tipo silvestre con N6 proporciona una señal a aproximadamente 160 mV y el VIH mutante con W97 proporciona una señal a aproximadamente 350 mV. En base a la altura de los picos que son el resultado de la señalización de ferroceno a 160 ó 350 mV, se predijo que se podría determinar la proporción de hibridación de parejas perfectamente apareadas y parejas apareadas erróneamente. Se predijo que a medida que la condición de hibridación se hacía más rigurosa, la pareja de oligonucleótidos apareados erróneamente se desnaturalizaría más que el oligonucleótido perfectamente apareado. Además, se especuló que se podría dirigir a los oligonucleótidos exclusivamente a los electrodos en los que se aparearan perfectamente mediante series repetidas de fluctuación de temperatura.

Materiales y Procedimientos 1: Oligonucleótidos de ADN Preparados

Captura Directa con 2(N6), unión a D761:

D1102 (de tipo silvestre de VIH):

5'-TCTACAG(N6)C(N6)TGTTAAAA G AGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATA-3'

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Captura Directa con 2 (W97), unión a D761 mut (D1181):

D1250: D1102 mut: (mutante de VIH)

5'-TCTACAG(W97)C(W97)TGTTAAAAGA C ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATA-3'

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2: Preparación de microplaca: Las dos soluciones de deposición se mezclaron y las sondas se depositaron de la forma siguiente: D1181 para los adaptadores 4, 6, 9; D1182 para los adaptadores 8, 10, 14 (VIH); D365 para los adaptadores 3, 5, 7; D660 para los 11, 13, 12, 15, 16 en las microplacas de 500 nm. Postratamiento de las microplacas con M44/Acetonitrilo/Calor. Las microplacas se montan con cartuchos pequeños.

3: Tampón de Hibridación Preparado con Oligonucleótidos Diana y de Señal

Se trató sangre completa humana con un volumen equivalente de tampón de lisis AL (de Qiagen) y 1/8 del volumen de sangre de Proteinasa K (20 mg/ml) y se incubó a 70ºC durante 10 minutos. Se hibridan D1102 o D1250 0,25 \muM con oligonucleótidos sonda superficiales en lisado de sangre con NaClO4 a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se mide la señal electroquímica.

Resultados y Discusión

Se introdujeron los oligonucleótidos marcados de forma diferencial en solitario o en combinación y se analizó su distribución con respecto a los electrodos que contenían sondas de captura perfectamente apareadas y electrodos que contenían sondas de captura apareadas erróneamente.

Cuando los oligonucleótidos se introdujeron en solitario, se unieron y generaron señales en electrodos en los que estaban perfectamente apareados y electrodos en los que estaban apareados erróneamente. Por el contrario, cuando se introdujeron los oligonucleótidos en combinación, los oligonucleótidos se separaron hacia sus sondas de captura perfectamente apareadas sin manipulación de la temperatura.

Estos resultados muestran que los oligonucleótidos compiten por la hibridación con las sondas de captura cuando se introducen simultáneamente. Sin estar ligado a teoría alguna, se especula que las constantes de disociación son significativamente superiores en electrodos saturados.

Se examinó la competición potencial entre dianas en el contexto de su adición secuencial a la matriz; los resultados se muestran en la figura 26. 0,25 M de D1102 se hibridaron primero con una matriz de sondas superficiales de tipo silvestre y mutantes. Después de 20 minutos de hibridación, se inyectó una mezcla de D1250 y D1102 a 0,25 \muM en el cartucho, después de que se hubiera retirado el primer volumen. Después de la adición de la solución que contenía dianas heterogéneas, la señal electroquímica se registró a diversos puntos de tiempo. A los 10 minutos después del cambio, la señal electroquímica a 160 mV (el marcador sobre el oligonucleótido de tipo silvestre) había disminuido, aunque había surgido una señal a 375 mV (el marcador sobre el oligonucleótido mutante). Los datos concuerdan con el reemplazo de oligonucleótidos apareados erróneamente sobre sondas de captura con dianas perfectamente apareadas. Después de 2 horas, ¾ de la salida de señal en los electrodos que contenían sondas de captura mutantes procede de oligonucleótidos mutantes. En la misma matriz, la salida de señal de los electrodos que contienen sondas de captura de tipo silvestre permanece en gran medida sin cambios y se correlaciona con la presencia exclusiva del oligonucleótido de tipo silvestre durante todo el periodo de dos horas. Los descubrimientos sugieren que los oligonucleótidos compiten, al menos a altas concentraciones, por la unión a sondas de captura inmovilizadas en electrodos. Los resultados sugieren que el direccionamiento de oligonucleótidos hacia electrodos específicos mediante la discriminación de diferencias de un solo nucleótido basada en hibridación puede conseguirse en la matriz detectora.

Ejemplo Comparativo 5

Estudio Modelo para la Detección de Productos de Ensayo de Ligación de Oligonucleótidos (OLA)

Objetivo: Para desarrollar metodologías para la discriminación de sustratos y productos de la reacción de OLA en el detector.

Introducción: Se diseñaron dos sistemas de oligonucleótidos de ADN marcados con N6 para mimetizar el sustrato y el producto de una reacción de OLA. D1102, un oligonucleótido de 50 nucleótidos que se corresponde con una porción del genoma de VIH se usó para representar un producto de OLA. Se generaron dos oligonucleótidos adicionales para representar sustratos del producto de 50 nucleótidos. El D1274 (D1102_corto.a) se corresponde con la mitad del sustrato marcada con N6, mientras que D1275 (D1102_corto.b) se corresponde con la mitad sin marcar. El D1102 (producto) hibrida a lo largo de la longitud completa de D1182 (sonda superficial de tipo silvestre del VIH), mientras que D1274 y D1275 (sustratos) hibridan con la mitad de cada sonda de captura. En base a la discriminación de apareamientos erróneos, se predijo que se podría identificar una temperatura a la que el producto de longitud completa permanecería hibridado y generaría una señal, pero las mitades del sustrato se disociarían y no generarían señal.

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Materiales y Procedimientos 1: Oligonucleótidos de ADN Preparados

Captura Directa con 2(N6), unión a D761 y D1182:

D1102 (de tipo silvestre de VIH):

5'-TCTACAG(N6)C(N6)TGTTAAAAGA G ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATA-3'

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(D1274): D1102 corto.a:

5'-TCTACAG(N6)C(N6)TGTTAAAAGAG

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(D1275): D1102 corto.b:

5'-ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATA-3'

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(D1182): D761 WT

5'-CATTGATGGTCTCTTTTAACA(P282)-3'

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2. Las microplacas se prepararon como anteriormente.

Resultados y Discusión

D1102, un fragmento completo ligado, o D1274 + D1275, los oligonucleótidos no ligados (sustrato) hibridaron con sangre lisada y Perclorato de Sodio durante 20 minutos a temperatura ambiente por encima de las matrices de electrodos que contenían sondas de captura de VIH. Se midieron las señales electroquímicas en función de la temperatura en dos microplacas, tres adaptadores de D1182 para cada microplaca a 25, 15 ó 10 y 40ºC. La media de las mediciones se presenta la Figura 27. Nota: El valor descrito para los sustratos a 40ºC está predicho y no medido. Sin embargo, después del calentamiento a 25ºC una segunda vez, el valor para los sustratos era de "0".

Ejemplo 6 Genotipado de una diversidad de muestras Genotipado de múltiples sistemas en la misma reacción

Se realizaron experimentos para hacer múltiples ensayos de genotipado en un sistema: PIC1, Hfe-H63D y Hfe-C282Y. Se realizó la hibridación sobre matrices de optimización de SNP de DC237, de acuerdo con la Figura 33A.

En un intento por genotipar Hfe-C282Y, se usaron dos combinaciones miméticas de sonda señal/diana diferentes (larga y corta). El sistema original estaba compuesto por una sonda señal de 19 pares de bases ("corta") y miméticos diana de 76 pares de base tanto para WT como para mut, que contenían un apareamiento erróneo de una sola base entre los dos. El tipo "largo" se refiere a una sonda señal de 28 pares de bases y a miméticos diana de 69 pares de bases correspondiente (modificadas 9 bases hacia el extremo 5') tanto para WT como mut, que contenían un apareamiento erróneo de una sola base entre los dos. Debido a las temperaturas de fusión variables de las sondas de captura entre los diferentes sistemas, las microplacas se calentaron a dos temperaturas diferentes para conseguir la diferenciación máxima entre el alelo A/G (PIC1) y entre WT/mut (Hfe-H63D, Hfe-C282Y). La medición y el calentamiento se produjeron de la siguiente forma:

1.

Todos los adaptadores se midieron a 25ºC.

2.

Los adaptadores Hfe-H63D (6, 8, 9, 14) se midieron a 48ºC.

3.

Los adaptadores PIC1 (3, 4, 7, 11) y Hfe-C282Y (10, 12, 13, 15) se midieron a 56ºC.

Los resultados representan datos de microplacas hibridadas durante 2 horas antes de la medición y se muestran en las Figuras 33B, 33C y 33D. Se hibridaron cuatro microplacas con mimético diana PIC1A, se hibridaron 3 microplacas con PIC1G y se hibridaron 3 microplacas con el heterocigoto (PIC1A/PIC1G). Estos genotipos eran claramente diferenciables entre sí y dan valores de proporciones comparables a los valores de proporciones observados cuando las microplacas hibridan solamente con las dianas del sistema PIC1. En el sistema Hfe-H63D, los genotipos WT, heterocigoto y mut se separan hacia posiciones en las que pueden caracterizarse.

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El intento de genotipar Hfe-C282Y era más difícil que en los sistemas anteriores. Se presentan a continuación resultados de ensayos múltiples tanto para las sondas de señalización de tipo más corto como más largo y las dianas correspondientes. Tanto en las sondas más largas como en las más cortas, los genotipos WT se separan de los genotipos heterocigoto y mut, con la excepción de una microplaca que contiene grandes desviaciones típicas. Sin embargo, la sonda de señalización más larga y la diana correspondiente no muestran separación entre los genotipos heterocigoto y mut. La sonda de señalización más corta y la diana correspondiente muestran una mayor separación entre el heterocigoto y el mut, pero mayores desviaciones típicas impiden un genotipado definitivo. El genotipado de Hfe-C282Y sin ninguna otra molécula diana o de señalización presente ha producido los mismos resultados que se observan en la gráfica anterior.

Conclusión: La realización de ensayos múltiples de varios SNP diferentes sobre una microplaca no afecta al genotipado de SNP individuales. Mientras que el genotipado de PIC1 y Hfe-H63D era relativamente fácil, no se pudo genotipar el Hfe-C282Y. En los adaptadores Hfe-C282Y_mut el apareamiento erróneo representa una hibridación G-T. Esta unión es casi tan fuerte como el apareamiento perfecto y hace que el genotipo mut sea muy difícil de diferenciar del heterocigoto. Sin embargo, la dificultad en el genotipado de Hfe-C282Y no se aumentaba por la realización de ensayos múltiples con otros SNP.

Uso de un sistema de dos potenciales

El sistema detección de SNP de Dos Potenciales se usó para genotipar con precisión fragmentos de los genes VIH, HFE C282Y, HFE H63D y PIC1. Una monocapa convencional, que consiste en captura marcada con H6, M44 y N152, proporciona un entorno extraordinario para la competición de sondas. Además, tanto los motivos que contienen ferroceno como los oligonucleotídicos de las sondas de señalización (SP) desempeñan un papel en la competición. El N6 y W97, usados en este ensayo, son diferentes en la eficacia de señalización, respuesta de frecuencia e hidrofilicidad. Se realizan ajustes de acuerdo con esas diferencias para equilibrar sus actividades. Las sondas optimizadas para el Sistema de Dos Potenciales tienen las siguientes dos características: 1. Una de las sondas está marcada con un motivo 4 N6 mientras que la otra está marcada con un motivo 8 W97. Hay diecisiete nucleótidos con una base de identificación de SNP localizada en la mitad de las secuencias. El ensayo puede llevarse a cabo con una hibridación simple a temperatura ambiente sin aplicar ninguna rigurosidad tal como una rampa de temperatura o lavado. No obstante, la interferencia del ensayo es de casi cero. El ensayo también puede llevarse a cabo a una temperatura ligeramente elevada (35ºC) a la que la cinética del ensayo se acelera y la interferencia del ensayo se reduce adicionalmente.

I. Se consiguió el genotipado de miméticos de dianas de ADN de VIH, HFE y PIC usando el Sistema de Dos Potenciales 1. Genotipado de Miméticos de Diana de VIH

Para el ensayo de Dos Potenciales, la proporción de diana y SP se mantuvo siempre a una proporción de 1 a 5. En el genotipado del VIH, un combinado de la SP marcada con 4-N6 de tipo silvestre (WT) (D1864) y la SP marcada con 8-W97 mutante (mut) (D1835) se hibridó con cada D765 WT (50 nM), D999 mut (50 nM) y dianas D765 + D999 (25 nM cada una) en tampón C6. Después de 20 minutos de hibridación a temperatura ambiente, se consiguió el genotipado correcto de estas dianas de VIH (Figura 1). El log_{2} de la proporción de señal WT con respecto a mut de la muestra de VIH WT homocigota era de 0,96, de -0,65 para la mut homocigota y de 0,24 para la muestra de VIH heterocigota. Las proporciones mejoraron a 1,36, -2,43 y -0,06 respectivamente durante el transcurso de tiempo de 2 horas de incubación. Se realizaron estudios adicionales con concentraciones de diana y SP disminuidas. El genotipado correcto para diana o dianas 1 nM y 5 nM de cada SP se produjo después de la 7ª hora (470 min) de incubación (Figura 2). El log_{2} de la proporción de señal WT con respecto a mut de diana WT homocigota era de 2,11, de diana mut homocigota era de -1,15 y de las dianas heterocigotas era de 1,15. Una incubación prolongada (de hasta 24 horas) permitió que se desarrollara la competición de sondas durante un tiempo más prolongado y se consiguiera una diferenciación incluso mejor de los genotipos.

El intento de obtener un nivel de señal de genotipado superior de dianas de VIH 1 nM mediante el uso de una mayor concentración de SP no tuvo éxito, pero permitió un genotipado más temprano. Usando una diana o dianas 1 nM y 20 nM de cada SP permitió genotipar en la 5ª de hora de hibridación (Figura 3). El log_{2} de la proporción de señal WT con respecto a mut era de 2,01 para WT homocigotas, de -0,87 para mut homocigotas y de 0,032 para dianas heterocigotas. Pero en términos de altura de picos y proporciones de señal, una proporción de diana con respecto a SP de 1:20 no parecía tener ninguna ventaja sobre la proporción de 1:5 descrita justo anteriormente. Así, se planeo mantener la proporción de diana con respecto a SP en 1:5 para los ensayos de Dos Potenciales por el momento.

2. Detección de mutantes C282Y de HFE emergentes

El sistema de 2 potenciales permitió detectar presencia minoritaria (10%) de una población C282Y de HFE mut en una gran población de la diana WT. Un combinado de la SP marcada con 8-W97 WT D1954 y la SP marcada con 4-N6 mut D1955 hibridó con muestras que contenían HFE WT (D1749) y mut (D1750) a una concentración total combinada de 50nM. Estas muestras contenían HFE mut en un incremento del 10% de la concentración con respecto a la del WT. Así, las dianas variaban de WT homocigota al 100% a heterocigota al 50%/50% y a homocigota 100%. En correspondencia con el aumento de mut emergente, había un aumento en las señales de N6 mut y una disminución en las de W97 WT (Figura 4). Por lo tanto, existe un aumento en la proporción de señal mut con respecto a WT. Pueden detectarse tan pocas como un 10% de especies mut usando el sistema de 2 potenciales; y era posible la diferenciación entre especies de HFE mut del 0, 10 y 20%.

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Este estudio se repitió con 5 nM de dianas totales y 25 nM de cada SP (LC087). Las proporciones no permitían diferenciar los grados variables de población mut tan bien. En lugar de tener una proporción de N6/W97 de 1:1 cuando había un 50% de dianas WT y un 50% mut, la proporción 1:1 aparecía cuando había aproximadamente un 60-70% de diana mut; pero se observaba la tendencia esperada de aumento de la proporción de mut con respecto a WT. Además, había una gran cantidad de variaciones de una microplaca a otra y de un adaptador a otro. Aunque muchas de las proporciones N6/W97 se incluían en la tendencia esperada, las alturas de señal reales entre las microplacas variaban. Y cuando había un 100% de diana mut, algunos adaptadores mostraban señales de W97 WT crecientes después de la 4º hora. La degradación de la plata puede ser la causa de este aumento en la señal de W97. Una vez que se resuelva el problema de la variación entre microplacas, se será capaz de detectar mutantes emergentes de una forma cuantitativa usando el sistema de Dos Potenciales.

3. Genotipado de H63D de HFE

Después de que se consiguiera el genotipado de miméticos de diana de VIH y C282Y de HFE usando el sistema 2 potenciales, se procedió a ensayar el sistema con dianas H63D de HFE y PIC 1 (descritas en la Sección 4). Una solución de combinado de SP de la D2004 marcada con 8-W97 WT y la D2005 marcada con 4-N6 mut se añadió a tampón de hibridación C6 que contenía cada diana H63D de HFE D1121 WT (50 nM), D1122 mut (50 nM) y D1121 + D1122 (25 nM cada una). Se hibridaron y se incubaron a 35ºC. El primer procesamiento de ACV se produjo a las 2,5 h de la hibridación y dio como resultado proporciones de apareamiento/apareamiento erróneo de 209 para WT homocigota y de 195 para mut homocigota. La proporción de N6/W97 para las dianas heterocigotas era de 2,32. La diferenciación de las tres muestras diferentes se consiguió de manera inconfundible (Figura 5).

4. Genotipado de PIC1

Un combinado de SP de la D1875 marcada con 8-W97 WT y la D2006 marcada con 4-N6 mut se combinó con cada diana PIC1A 50 nM (D1775), PIC1G 50 nM (D1776) y heterocigota D1775 + D1776 (5 nM cada una) en tampón de hibridación. El primer ACV se realizó a las 2,5 h. A diferencia de HFE-H, no se pudieron distinguir las tres dianas diferentes. En las tres situaciones, solamente aparecía la señal de N6 de PIC1G, con prácticamente ningún indicio de señales de PIC1A (Figura 6). Incluso en el caso en el que no había dianas PIC1G, sólo se observó la señal de PIC1G. Un experimento similar en el que las dianas y el tampón se añadieron primero a las microplacas, se dejó hibridar las sondas de captura durante 2 horas y después se añadieron las SP también tuvo el mismo resultado (LC096).

El genotipado de PIC1 sin éxito puede deberse a que la base de identificación de SNP Guanina (G) de la SP PIC1G se unía a la Timina (T) de la diana PIC1A con una afinidad que era tan buena como la SP de PIC1A unida a la diana PIC1A (un emparejamiento A, T). Además, el N6 parecía tener ventaja sobre W97 en la estabilización de la SP sobre la monocapa, que puede explicar por qué fracasaba el genotipado de PIC1. Para equilibrar todos los factores que estaban influyendo en el resultado de la competición de sondas, la sonda (17 nucleótidos) que está perfectamente apareada con PIC1G se marcará con N6 mientras que la sonda PIC1A (17 nucleótidos) se marcará con W97.

Antes de obtener las nuevas sondas, se usaron sondas PIC 1 de Bruce (D1890 y D1876, 19 nucleótidos) que tenían exactamente los mismos motivos de ferroceno unidos como se deseaba. Se añadió un combinado de SP de marcada con 4-N6 de PIC1A (D1890) y marcada con 8-W97 de PIC1G (D1876) a cada diana PIC1A y PIC1G homocigota y heterocigota. Aunque existía un inconveniente no deseado de que la primera base de los extremos 5' de SP competía con la base del extremo 3' de la sonda de captura por la hibridación con la diana, el genotipado se consiguió en 70 minutos porque el log_{2} de la proporción de WT con respecto a mut era de 1,64 para dianas WT homocigota, de -1,11 para mut homocigota y de 0,74 para la heterocigota (Figura 7). Este experimento se repetirá con sondas de señalización de 17 nucleótidos sin la competición de la zona de captura y la sonda de señalización por la diana.

II. Optimización del Ensayo 1. Procedimientos de Hibridación

La siguiente etapa después del genotipado de miméticos de oligonucleótidos de diana de VIH y HFE es genotipar amplicones de A-PCR de muestras de pacientes. Para genotipar con precisión es necesario ensayar qué procedimiento de hibridación funcionaría mejor y, por lo tanto, daría las mejores señales. Se compararon tres procedimientos. Para los dos primeros procedimientos, se dejó hibridar un control de diana C282Y de HFE heterocigota de APCR con un combinado de SP marcada con 8-W97 WT (D1954) y SP marcada con 4-N6 mut (D1955) y después se calentó a 100ºC durante 3 minutos. Una se colocó en hielo durante 10 minutos mientras que la otra se dejó enfriar en la mesa de trabajo durante 10 minutos. Después, las muestras se mezclaron con tampón C6 y se aplicaron a la microplacas para una hibridación adicional. Para el tercer procedimiento, la diana, el combinado de SP y el tampón se combinaron; se calentaron a 100ºC; y se enfriaron sobre la mesa de trabajo. En base a las señales (LC091), los dos procedimientos en los que los componentes se enfriaron sobre la mesa de trabajo funcionaron mejor. El tercer procedimiento era el más robusto, en el que las dianas, las SP y el tampón se combinaron antes de la etapa de calentamiento, y se usará para los experimentos futuros. Se experimentaron problemas con la plata en este experimento. Para algunos adaptadores de los tres procedimientos, las señales de N6 eran similares a las de W97 en 60 minutos en hibridación; pero a lo largo del tiempo, las señales de N6 permanecían iguales (o aumentaban ligeramente) mientras que las de W97 aumentaban. Debe tenerse cuidado con estas consecuencias potenciales en los experimentos adicionales.

2. Aceleración de la Cinética de Hibridación con Temperatura de Incubación Elevada

Un producto de A-PCR del mutante C282Y de HFE se dejó hibridar con un combinado de SP marcada con 8-W97 WT (D1954) y SP marcada con 4-N6 mut (D1955). La hibridación se llevó a cabo a tres temperaturas diferentes, 25ºC, 30ºC y 35ºC. Se realizó una exploración después de 2 horas de incubación. Como se muestra en la Figura 8, la incubación a 35ºC produjo la señal más intensa (17 nA) seguida de la de 30ºC (11 nA) y 25ºC (5,5 nA), un indicio de que una temperatura de hibridación superior aceleraba la cinética.

3. Proporciones de Cebadores de A-PCR

Para genotipar con precisión, es necesario encontrar el mejor procedimiento de A-PCR del que pueda obtenerse la mayor cantidad de dianas de cadena sencilla. Se combinaron once soluciones de amplicones de C282Y de HFE antisentido producidos cada uno a partir de diferentes concentraciones de cebadores anidados con tampón de hibridación C6 y un combinado de SP de D2007 marcada con 8-W97 WT y D2008 marcada con 4-N4 mut (cada SP = 250 nM). Se hibridaron y se exploraron a 35ºC. Nueve se genotiparon como HFE C WT (Figura 9). Una de las dos que no tenía señales (Nº 5) era una solución de ADN genómico bicatenario y la otra (Nº 11) era un control en blanco de producto de A-PCR. De las nueve que se genotiparon como dianas WT, la que usaba 24 pmol de cada cebador directo e inverso generando ADN bicatenario a partir de ADN genómico y después se amplificaba con cebador anidado directo 2 pmol e inverso 100 sobre ADN bicatenario purificado (Nº 4), y otra que usaba 48 pmol de cada cebador generando un ADN bicatenario a partir de ADN genómico y después se amplificaba con cebador anidado directo 2 pmol e inverso 100 pmol (Nº 10) dieron señales que estaban entre las mejores. Las dos (Nº 4 y Nº 10) tenían señales muy intensas (-18 nA) en 30 minutos y alcanzaban la saturación en 3 horas. Muchas de los otras dianas de A-PCR (Nº 1, 2, 7) comenzaban con señales muy bajas (menores de 5 nA) en 30 minutos y no alcanzaban la saturación hasta después de la 13ª hora de hibridación. Esas tenían claramente concentraciones bajas de dianas de cadena sencilla para comenzar y necesitaban un tiempo mucho mayor para saturar los adaptadores, mientras que la Nº 4 y la Nº 10 tenían altas concentraciones de dianas de cadena sencilla (casi tan altas como el control de mimético de diana WT 50 nM Nº 12, de 22 nA en 30 minutos) y alcanzaban la saturación mucho antes. Se usará un procedimiento de A-PCR Nº 10 en futuros experimentos porque no requiere una etapa de purificación antes de las etapas de A-PCR, que se usó en el Nº 6.

Materiales y Procedimientos

Los oligonucleótidos usados en estos experimentos se enumeran en la siguiente tabla.

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Microplacas: DC213, DC225, DC236, DC273

Hibridación: Se añadieron soluciones de combinado de las sondas de señalización WT y mut a dianas y tampón de hibridación C6 y se dejaron hibridar a temperatura ambiente (a menos que se indique otra cosa). Su usaron cartuchos pequeños en estos experimentos. Los resultados se muestran en la Figura 34.

Se realizaron experimentos adicionales para valorar las proporciones detectables.

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Ejemplo 7 Desplazamiento de una primera SAM con una segunda SAM para aumentar la señalización

Sin estar ligado a teoría alguna, parece que la transferencia de electrones de un ETM a la superficie del electrodo se facilita mediante electroconductos. Teóricamente, cuanto más disponible la superficie del electrodo, mejor la señalización. Basándose en esta hipótesis, se generaron procedimientos para hacer la superficie más disponible para la señalización, usando alquiltioles terminados en hidroxi cortos (C2 a C6) para reemplazar alquiltioles terminados en aromáticos cortos (tales como grupos 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilo). Estos últimos bloquearán la pérdida de ferricianuro(III) de potasio. Un ejemplo es W150, que se sintetiza y se usa para preparar una SAM usando técnicas convencionales. Esto da como resultado una monocapa que no es permeable al ferricianuro(III) de potasio; sin embargo, la adición de mercaptoetanol durante periodos de tiempo cortos da como resultado una señal electroquímica a partir del ferricianuro(III) de potasio.

Por consiguiente, se ensayó un sistema de modelo. Usando SAM que comprenden M44 (el aislante alquilo convencional) o W150, junto con una sonda de captura positiva o dos sondas de capturas negativas diferentes (es decir, estas sondas no son complementarias a la secuencia diana), se obtuvieron los siguientes resultados. Como una cuestión preliminar, en comparación con M44, W150 siempre proporcionaba señales positivas superiores y señales negativas inferiores, por ejemplo, usando una secuencia diana que comprende 20 ferrocenos a una frecuencia de CA de 10.000 Hz, las monocapas que comprenden M44 dieron Ip de 67,2 nA, mientras que las monocapas de W150 dieron Ip de 1700 nA. Las señales positivas podían reforzarse adicionalmente a alta frecuencia (1000 Hz o superior) después de que las microplacas se empaparan en mercaptoetanol 1 mM en tampón SSC 6X: antes de empaparlas, la Ip a 10.000 Hz era de 1700 nA y después de empaparlas era de 8740 nA. Sin embargo, a baja frecuencia, el empapamiento no tenía efectos sobre la señalización.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

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Claims (14)

1. Composición que comprende:

a)

un primer ácido nucleico de cadena sencilla que comprende una primera porción de transferencia de electrones (ETM) con un primer potencial redox; y

b)

un segundo ácido nucleico de cadena sencilla que comprende un segundo ETM con un segundo potencial redox;

en la que el primer y segundo ácidos nucleicos son sustancialmente complementarios al mismo dominio de una secuencia diana y en la que el primer y segundo potenciales redox son diferentes.

2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que las secuencias de dicho primer y segundo ácidos nucleicos difieren solamente en una base en una posición de interrogación.

3. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

a)

un tercer ácido nucleico de cadena sencilla que comprende un tercer ETM con un tercer potencial redox; y

b)

un cuarto ácido nucleico de cadena sencilla que comprende un cuarto ETM con un cuarto potencial redox;

en la que dicho primer, segundo, tercero y cuarto ácidos nucleicos son sustancialmente complementarios al mismo dominio de una secuencia diana.

4. Composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicho primer, segundo, tercer y cuarto ácidos nucleicos difieren solamente en una base.

5. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho primer y segundo ETM son ferroceno.

6. Composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho ferroceno es un derivado de ferroceno.

7. Procedimiento de determinación de la identificación de un nucleótido en una posición de detección en una secuencia diana que comprende:

a)

proporcionar un sustrato con al menos un electrodo que comprende una sonda de captura;

b)

poner en contacto dicho electrodo con:

i)

dicha secuencia diana; y

ii)

una pluralidad de sondas de detección, comprendiendo cada una:

1)

un nucleótido único en una posición de interrogación; y

2)

un ETM con un potencial redox único;

en condiciones tales que se forme un complejo de hibridación de dicha sonda de captura, al menos una sonda de detección y dicha secuencia diana;

c)

detectar una señal de al menos uno de dichos ETM para identificar dicho nucleótido en dicha posición de detección.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que se forman complejos de hibridación con dos de dichas sondas de detección.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que dicho sustrato comprende una pluralidad de electrodos, cada uno con una sonda de captura diferente, y se forman una pluralidad de complejos de hibridación con una pluralidad de dichas sondas de captura.

10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicha secuencia diana se pone en contacto con dichas sondas de detección antes del contacto con dicho electrodo.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicha secuencia diana se pone en contacto simultáneamente con dichas sondas de detección.

12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que dicho electrodo comprende además una monocapa autoensamblada (SAM).

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho ETM es un ferroceno.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho ferroceno es un derivado de ferroceno.