CN1129461A - 改进的测定核酸序列的方法 - Google Patents
改进的测定核酸序列的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1129461A CN1129461A CN94192876A CN94192876A CN1129461A CN 1129461 A CN1129461 A CN 1129461A CN 94192876 A CN94192876 A CN 94192876A CN 94192876 A CN94192876 A CN 94192876A CN 1129461 A CN1129461 A CN 1129461A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- target
- rnaseh
- 000cpm
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
Abstract
公开了一种改进的循环探针反应。
Description
本发明是关于循环探针反应在测定某核酸序列存在方面的应用。
测定样品中特异性核酸序列存在的方法有许多种。方法之一是循环探针反应(CPR)。在该反应中,对需要测定的序列具有特异性的探针与靶单链核酸杂交形成核酸双链体。该探针包含一种可被切割的连接体,该连接体在形成双链体时变得易于切割。例如,一个DNA探针可包含有一个RNA序列片段。这样的探针与单链DNA分子之间双链体的形成产生了一个RNA:DNA杂合双链体。能够切割RNA:DNA杂合双链体中RNA链的RNA酶H被用于切割与靶连接的探针、测定就是基于该种杂交—特异性切割、被切割的探针与靶分离,靶能够与新的未被切割的探针进入循环。
CPR技术在1989年10月24日发布的Duck等的美国专利4,876,187和1991年4月30日发布的Duck等的美国专利5,011,069中有描述,将其并入本文作为参考。
本发明描述了一种测定单链靶核酸方法的特征。该方法包括:
a,提供一种反应混合物包括:靶核酸;互补的单链核酸探针,该探针相对于靶是摩尔数过量的并且具有[NA1-R-NA2]n的结构,其中NA1与NA2为DNA序列,R为可被切割的核酸连接体,n为1~10之间的一个整数;以及RNaseH,RNaseH化学势足以增加双链体形成的速率,即该速率大于RNaseH缺乏时双链体的形成速率,并促使靶—探针双链体的形成;
b,处理得自步骤(a)的靶—探针双链体,以便在可被切割的核酸连接体中预定的序列上切割探针,从而形成至少一个包含探针寡聚核苷酸片段的完整的DNA,如此的探针片段不再具有,或者经处理后不再具有与靶核酸杂交的能力;
c,重复步骤(a)和(b)的循环,并且
d,测定如此形成的包含片段的完整DNA,从而检测出单链靶核酸。
本发明还包括一种反应混合物,其中含有:
一种单链靶核酸;
一种互补的单链核酸探针,该探针相对于靶是摩尔数过量的,并且具有[NA1-R-NA2]n的结构,其中NA1和NA2是DNA序列,R是可被切割的核酸连接体,n是一个1~10之间的整数,以及
一种RNA酶H(RNaseH),RNaseH的化学势足以明显增加双链体形成的速率,即该形成速率大于RNaseH缺乏时的形成速率。
从以下的详细描述和权利要求中将明显看出本发明的其它特征和优点。
首先简单描述附图:
图1是一个改进的CPR图解。
图2是一个显示改进的CPR产物的凝胶电泳图。
Tm,在此处是指双链体向单链的解链过程的中点。
此处所用试剂的化学势是指当试剂被加入反应混合物时反应混合物自由能的改变。化学势是在一个给定的条件下一个给定反应中反应物活性的一个比较精确的量度,并且涉及到例如反应物能够与之反应的位点的数量以及是否所有的反应物分子都能进行反应。通过改变反应物的浓度,其化学势通常能够非常直接地被控制。化学势的单位是例如卡/摩尔或者焦尔/摩尔的自由能,但于此描述的方法中不要求确定绝对的化学势。此处所述的大多数方法要求反应混合物中两种反应物化学势的比或者说两种反应物化学势的差别应当符合如此的条件,那就是RNaseH的化学势足够驱使反应朝着双链体形成的方向进行。
兹所用的纯核酸,是指纯DNA或者RNA。此处的纯DNA,是指这样的DNA,它与两个编码序列均不直接相连,而在该DNA来源的有机体的天然存在的基因组中它与编码序列是直接相连的(即,一个在5’末端,一个在3’末端)。该术语包括,例如,被插入载体,如插入一个自主复制的质粒或者病毒,或者插入一个原核或者真核基因组DNA中的重组DNA,或者以不依赖于其它DNA序列的单独的分子形式存在(例如,一个cDNA或者由PCR或者由限制性内切酶处理而产生的基因组DNA片段)。此处纯RNA是指这样一种RNA,它基本不包含在产生该RNA的细胞中同时被发现的另一种RNA。当它与其它序列分离时,这种非天然存在的核酸序列就得到了纯化。
此处所用的纯天然产物,是指这样一种产物,它是由有机体产生的,并且基本不含有大分子,例如,蛋白质或者核酸,但它又与大分子相伴存在于产生它的有机体中。
此处所用的非天然存在于活细胞中的产物,是指这样一种物质,它不是由活细胞或者有机体合成或者产生的物质。
本发明的方法是用RNaseH来驱动CPR反应。这样,反应的速率就由RNA酶的浓度或化学势来控制,而不是由探针或者靶核酸来控制。CPR探针
本技术领域中已知CPR探针的制备和使用,参见例如Duck等的美国专利4,867,187和Duck等的美国专利5,011,069。
本发明技术中使用的核酸探针具有结构[NA1-R-NA2]n其中NA1与NA2为核酸序列,R为RNA序列,n为1~10之间的一个整数。
在本发明的一个具体实施方案中,核酸探针中的NA1与NA2分别独立地由0~20个核苷酸组成,R大约由1~100个核糖核苷酸组成,或者更多,以及n为1~10之间的一个整数。
在本发明的另一种实施方案中,核酸探针中的NA1与NA2为DNA序列。在更进一步的方案中,核酸探针中的NA1与NA2为RNA序列。在又一种方案中,核酸探针具有一种结构,其中NA1为RNA序列或DNA序列。
在一种实施方案中,用双链核糖核酸酶切开预先确定的RNA序列上的杂交探针。如此的核糖核酸酶从双链DNA-RNA杂交链上切开或者切除核糖核酸序列。用于本发明技术中的核糖核酸酶的一个例子就是RNaseH。其它核糖核酸酶和酶也可从RNA-DNA链中切开或切除RNA,如核酸外切酶III(ExoIII)和逆转录酶。
本发明中的分子可带有可检测的标记,该标记附着在一个或者多个核酸序列NA1或者NA2上。这种标记可以是任何可被检测的分子或者试剂。如此可被检测的分子有放射性同位素、放射性标记的分子、荧光分子、荧光抗体、酶,或者化学发光催化剂。另一种合适的标记是配体,该配体能够结合到被酶、荧光分子或者其它可检测分子标记的特异性的蛋白上。一种合适的配体是生物素,它将与抗生物素蛋白或者链霉抗生物素蛋白结合。
在本发明的一种实施方案中,核酸探针被固定在一种固体支持物上。在另一种方案中,核酸探针标有可检测的标记物。
当核酸序列NA1与NA2为DNA时,上面描述的R部分也可以确切地称作一个可被切割的连接体,在表达上与美国专利4,876,187保持一致。如此的连接体可被切割或者破裂,而不切割或破裂该分子自身的或靶核酸分子的核酸序列。此处所用的可被切割的连接体,即R可以是任何化学连接结构,该结构连接两个核酸序列并且可以被选择性地切割而不切割它所连接的核酸序列。该可被切割的连接体可以是单一的键或者多个单位的序列。此处所用的R表示一个核糖核酸(RNA)序列。改进的循环探针反应
图1描绘了通常称之为循环探针反应(CPR)的反应示意图的改进。在该反应中,探针与靶杂交形成双链体。该探针包含有可被切割的连接体,该连接体对双链体结构的切割是敏感的。例如,探针可含有一个RNA酶敏感的片段。如此的探针与单链DNA分子之间双链体的形成产生了一个RNA:DNA杂合双链体。当探针被结合在靶上时切RNA:DNA杂合体的酶,例如,RNaseH仅能切割探针。检测就是基于这种杂交—特异性切割。RNase结合于双链体,形成双链体RNase复合物,切割产生一个被切割探针:靶复合物。被切割探针与靶分离,靶可以再与新的未被切割的探针进入循环。
本发明的方法可用来改进该反应的进行。正如通常使用的那样,当存在的RNA酶H不足时,该方法就不适合检测靶序列。传统的做法是,增加探针的浓度,用以控制基本反应向右进行,正如描绘的那样,增加反应混合物中RNaseH的化学势也将有利于双链体的形成。因为RNaseH支配着双链体:RNaseH复合物的形成,所以增加反应混合物中该反应物的势能,必将促进双链体底物和随后的被切割探针(信号)的产生。因此,RNaseH的增加可用来提高敏感性。
该方法可用来检测单链靶核酸。在一种方案中,提供的反应混合物包括靶核酸,一种互补的单链核酸探针,该探针相对于靶是摩尔数过量的,并且具有结构
[NA1-R-NA2]n其中NA1与NA2为DNA顺序,R为一个可被切割的核酸连接体,n为1~10之间的一个整数,还包括RNaseH。存在的RNaseH的化学势足以明显增加双链体形成的速率,该速率大于RNaseH缺乏时双链体的形成速率。保持混合物处于靶—探针双链体形成的条件之下。处理得自步骤(a)的靶—探针双链体,以便在可被切割的核酸连接体的预先确定的序列上切割探针,从而形成至少一个完整的包含有来自探针的寡核苷酸片段的DNA分子,这样的片段不再能够或者经处理后不再能够与靶核酸分子杂交。然后重复循环步骤(a)和(b),检测如此形成的含有探针片段的完整的DNA,从而就检测了单链靶核酸。
在一个确定的方案中,在高于双链体Tm的温度下进行反应。例如,温度可以至少比Tm值高X℃,这里X为5、10、20、30、40、50、60、70、或80。
在一个优选方案中,通过加入RNaseH使双链体的形成速率增加至少Y倍,其中Y为2、5、10、50、100、500、103、104、105、106。在RNaseH缺乏时双链体的形成速率基本为零的条件下,可用RNaseH驱使双链体的形成。
在本发明的各种实施方案中,RNaseH的浓度、分子数或化学势大于探针的、靶的、探针与靶的、双链体的、或探针、靶与双链体总和的浓度、存在的分子数或化学势,例如大Z倍,这里Z为至少1、2、5、10、25、50、100、500、103、104、105或106。
在某些方案中,RNaseH的浓度、分子数或化学势足够满足:检测生物样品中的一种靶分子,优选使用标记活性为40,000cpm/μl的CPR探针,每反应用20,000cpm,检测浓度为10-5pMol或更低的靶链,优选用标记活性为40,000cpm/μl的CPR探针进行检测,每反应用20,000cpm;检测浓度为10-6pMol或更低的靶链,优选用标记活性为40,000cpm/μl的CPR探针进行检测,每反应用20,000cpm;检测浓度为10-7pMol或更低的靶链,优选用标记活性为40,000cpm/μl的CPR探针进行检测,每反应用20,000cpm;检测浓度为10-8pMol或更低的靶链,优选用标记活性为40,000cpm/μl的CPR探针进行检测,每反应用20,000cpm;检测浓度为10-9pMol或更低的靶链,优选用标记活性为40,000cpm/μl的CPR探针进行检测,每反应用20,000cpm;检测浓度为10-10pMol或更低的靶链,优选用标记活性为40,000cpm/μl的CPR探针进行检测,每反应用20,000cpm;检测浓度为10-11pMol或更低的靶链,优选用标记活性为40,000cpm/μl的CPR探针进行检测,每反应用20,000cpm;检测浓度为10-12pMol或更低的靶链,优选用标记活性为40,000cpm/μl的CPR探针进行检测,每反应用20,000cpm。
在上述反应混合物中,探针和靶可以取基本相等的量、浓度、分子数、或者化学势。探针对靶的重量、摩尔数、数量、浓度或者化学势的比率可以小于或等于1∶1,2∶1,5∶1,10∶1,25∶1,50∶1,100∶1,或者10m∶1,其中m为3~10之间的整数,包括3和10。NaseH对最高浓度的单链的重量、摩尔数、数量、浓度或者化学势的比率可以大于1∶1,2∶1,5∶1,10∶1,25∶1,50∶1,100∶1,或者10m∶1,其中m为3~10之间的整数,包括3和10。
在一个优选方案中,RNA酶H将增加双链体形成速率至少n倍,其中n为2,5,10,50,100,500,103,104,105,106。
以下的实施例说明了本发明的方法和组合物。实施例
下面描述了在对于双链体的形成来说RNA酶太少的条件下检测靶核酸,用RNA酶H的化学势驱动CPR反应中双链体的形成。驱动双链体形成的化学势是由高浓度的RNA酶H提供的。RNA酶H的酶活性切割探针,从而产生一个带有裂口的双链体,其中两个双链区域比原始的探针:靶双链体不稳定。在适当的实验条件下,这将促使反应进行和循环,即使反应在超过探针:靶复合物的Tm温度(65℃)下进行。
反应条件:使用下面的反应方案:将1μl5’末端32p标记的探针序列(该探针是一个复合的DNA-RNA分子,该分子有一个处于两个末端DNA区域之间的中心RNA区域,该探针长度为28个碱基对,并与靶序列互补)加入含有1μl同源靶DNA和0.5μl其组成为50mM Tris-Cl,10mM MgCl2的缓冲液(pH7.5)和2.5μlddH2O的试管中。再加入1μl高浓度的RNA酶H试液,然后将样品置于65℃。RNA酶H的浓度足够高,它能够促进双链体的形成并且能够切割如此形成的双链体,从而形成一种状态,在该状态下,酶的正向化学势驱使双链体的形成,而其逆向势能则促进产物的分离,从而“循环”得以发生(例如,多个探针可以与同样的靶进行反应)。为了估算由酶提供的化学势是否中足够检测一个靶分子,以十倍递增连续稀释靶的浓度(分子数)。
RNA酶H酶切消化DNA:RNA寡杂合体的程序如下,
1.标记探针:用激酶标记嵌合“探针”,然后用20%的丙烯酰胺凝胶进行分离。
2.稀释:靶样品以0.1X的稀释度进行连续稀释,从而获得所需浓度。连续稀释通常以1pmol/μl的浓度开始,经过连续稀释直到10-12pmol/μl。
3.试验范围:将1μl稀释的靶样品加入试管中。例如,从1pmol/μl试管中吸1μl样品加入带有1pmol靶反应标记的试管中。将2μl灭菌的ddH2O加入第一个对照管中[靶(-)/RNaseH(-)],以达到含有酶和靶的反应管中酶和靶所占有的体积。将1μl灭菌ddH2O加入第二个对照管[靶(-)/RNaseH(+)],以达到在含有靶的反应管中靶所占有的体积。
4.反应混合液:制备下列反应混合液:0.5μl的10×RNaseH缓冲液(10×RNaseH缓冲液中含有0.5M Tris-Cl,(pH7.5),0.1MMgCl2,必须灭菌)乘以反应数加1;Xμl探针(每反应用20,000cpm)乘以反应数加1;加Yμl灭菌ddH2O到3μl乘以反应数加1;3μl总体积乘以反应数加1。
为了测定探针检测从1pmol到10-12pmol靶的敏感性,需要13个靶稀释度和两个对照RNaseH(-)/靶(-)和RNaseH(+)/靶(-)。因此,总共15个反应。混合液包括:
a.在每反应基础反应体积为5μl的前提下,10×RNaseH反应缓冲液的量为:0.5μl乘以16(反应数加1),等于8.0μl的10×RNaseH反应缓冲液。
b.每反应用20,000cpm放射活性为40,000cpm/μl的探针,所需要的量为:每反应0.5μl探针×16(反应数加1),等于8.0μl探针。
c.所需ddH2O的量为能使每反应体积达到3μl。因为每反应中已加入0.5μl 10×RNaseH反应缓冲液和0.5μl的探针,总体积已有1μl,所以每反应还需加入2μlddH2O(3μl-探针体积-RNaseH缓冲液体积),乘以16(反应数加1)等于32μl ddH2O。
5.分配混合液:混合液每3μl一份加入各对照管和各靶反应管。(这保证每反应的基础体积为5μl)。
6.加RNA酶(RNase):将1μlRNaseH加入靶样品管和第二对照管[靶(-)/RNaseH(+)],第一对照管[靶(-)/RNaseH(-)]中不加RNaseH。这一步操作必须仔细,因为该酶通常存在于高浓度的甘油中比较难以吸取。酶可以加在试管壁上然后沉降至管内,或者酶可以直接加入管的液体中。此时每管的总体积为5μl。
7.温育:所有的反应均在65℃温育30分钟,反应时间结束后直接离心。
8.分析:加5μlRNA脲染色液(RNA脲染色液由0.44g脲溶于0.5ml的10mM Tris/HCl pH7.5,100mM的Na2 EDTA之中,1ml0.01BPB和XC组成),必要时再离心。然后将样品加到20%的变性聚丙烯酰胺凝胶上作进一步的分析。
图2显示了上述CPR的反应产物。从左至右各条带显示如下反应产物:对照1[RNaseH(-)/靶(-)];对照2[RNaseH(+)/靶(-)];靶浓度10-5pM;靶浓度10-6pM;靶浓度10-7pM;靶浓度10-8pM;靶浓度10-9pM;靶浓度10-10PM;靶浓度10-11pM;靶浓度10-12pM。上面的带表示探针,下面的带表示的是RNaseH切割的产物。
下列的权利要求包括其它实施方案。
Claims (26)
1.检测单链靶核酸的方法,包括:
a.提供一种反应混合物,包括:靶核酸;互补的单链核酸探针,该探针相对于靶是摩尔数过量的并且具有[NA1-R-NA2]n的结构,其中NA1与NA2为DNA顺序,R为可被切割的核酸连接体,n为1~10之间的一个整数;以及RNaseH,RNaseH的化学势足以明显增加双链体形成的速率,该速率大于RNaseH缺乏时双链体的形成速率,并促使靶—探针双链体的形成;
b.处理得自于步骤(a)的靶—探针双链体,以便在可被切割的核酸连接体中预先确定的序列上切割探针,从而形成至少一个包含探针寡核苷酸片段的完整的DNA,如此的探针片段不再具有或者经处理不再具有与靶核酸杂交的能力;
c.重复步骤(a)与(b)的循环;并且
d.检测如此形成的包含探针片段的完整的DNA,从而检测出单链靶核酸。
2.权利要求1的方法,该方法在超过上述双链体的Tm的温度下进行。
3.权利要求1的方法,其中上述温度至少超过上述TmX℃,其中X为5,10,20,30,40,50,60,70,或者80。
4.权利要求1的方法,其中加入RNaseH使双链体形成的速率增加至少Y倍,其中Y为2,5,10,50,100,500,103,104,105,106。
5.权利要求1的方法,其中在RNaseH缺乏时双链体形的速率基本为零。
6.权利要求1的方法,其中RNaseH的浓度、分子数或化学势大于上述探针的、靶的、探针与靶的、双链体的、或探针、靶与双链体总和的浓度、存在的分子数或化学势,例如大Z倍,这里Z为至少1、2、5、10、25、50、100、500、103、104、105或106。
7.权利要求1的方法,其中RNaseH的浓度、分子数、或者化学势足够允许:用标记活性为40,000cpm/μl的探针检测生物样品中的一个靶分子,每反应用20,000cpm,用标记活性为40,000cpm/μl的探针检测浓度在10-5pM或以下的靶链,每反应用20,0000cpm;用标记活性为40,000cpm/μl的探针检测10-6pM或以下浓度的靶链,每反应用20,000cpm;用标记活性为40,000cpm/μl的探针检测10-7pM或以下浓度的靶链,每反应用20,000cpm;用标记活性为40,000cpm/μl的探针检测10-8pM或以下浓度的靶链,每反应用20,000cpm;用标记活性为40,000cpm/μl的探针检测浓度为10-9pM或以下的靶链,每反应用20,000cpm;用标记活性为40,000cpm/μl的探针检测10-10PM或以下浓度的靶链,每反应用20,000cpm;用标记活性为40,000cpm/μl的探针检测10-11pM或以下浓度的靶链,每反应用20,000cpm;用标记活性为40,000cpm/μl的CPR探针检测10-12pM或以下浓度的靶链,每反应用20,000cpm。
8.权利要求1的方法,其中上述探针与上述靶在上述反应混合物中以基本相同的量、浓度、数、或者化学势存在。
9.权利要求1的方法,其中上述探针对上述靶的重量、摩尔量数、浓度、或者化学势的比率小于或等于1∶1,2∶1,5∶1,10∶ 1,25∶1,50∶1,100∶1,或者10n∶1,其中n为3~10之间的整数,包括3和10。
10.权利要求1的方法,其中RNaseH对最高浓度的单链的重量、摩尔量数、浓度,或者化学势的比率大于1∶1,2∶1,5∶1,10∶1,25∶1,50∶1,100∶1,或者10n∶1,其中n为3~10之间的整数,包括3,10。
11.权利要求1的方法,其中上述RNaseH使双链体形成的速率增加至少n倍,其中n为2,5,10,50,100,500,103,104,105,106。
12.权利要求1的方法,其中靶是一种DNA分子;靶是一种RNA分子;靶是合成的、天然纯化的、遗传工程的、或重组的DNA或RNA分子;靶是一种天然存在的核酸,例如,一种基因组分子、或者染色体,例如,病毒、细菌、植物、或者动物的核酸。
13.权利要求1的方法,其中步骤(b)的寡核苷酸片段带有可检测的标记物,标记的片段在步骤(d)进行检测。
14.权利要求1的方法,其中步骤(b)的寡核苷酸片段不被标记,但具有被可检测标记物标记的能力,该片段在步骤(c)或(d)之前被标记,在步骤(d)检测被标记的片段。
15.权利要求1的方法,其中可被切割的核酸连接体是一个RNA序列。
16.权利要求1的方法,其中NA1与NA2独立地由0至约20个脱氧核糖核苷酸组成,R由1至约100个核糖核苷酸所组成。
17.权利要求1的方法,其中n为2-10之间的整数,其中在探针内NA1或NA2之中至少有一个发生变化。
18.权利要求1的方法,其中n为1。
19.权利要求1的方法,其中步骤(b)中的处理包括双链特异性的核糖核酸酶与双链靶—探针复合体的接触。
20.权利要求1的方法,其中探针被固定在一个固体支持物上。
21.权利要求15的方法,其中未标记的片段有一个3’-羟基,片段的标记是在3’-羟基上加一个RNA尾。
22.用于检测单链靶核酸的反应混合物,包含:
一种单链靶核酸;
一种互补的单链核酸探针,该探针相对于靶是摩尔数过量的,并且具有[NA1-R-NA2]n的结构,其中NA1和NA2是DNA序列,R是可被切割的核酸连接体,n是一个1~10之间的整数,以及
一种RNA酶H(RNaseH),RNaseH的化学势足以明显增加双链体形成的速率,该形成速率超过了RNaseH缺乏时的形成速率。
23.权利要求22的反应混合物,其中检测是在超过上述双链体的Tm的温度下进行的。
24.权利要求22的反应混合物,其中通过加入RNaseH使双链体形成的速率增加至少n倍,其中n为2,5,10,50,100,500,103,104,105,106。
25.权利要求22的反应混合物,其中在RNaseH缺乏时双链体形成的速率基本为零。
26.权利要求22的反应混合物,其中RNaseH的浓度、分子数、或化学势大于上述探针的,上述靶的、上述探针和上述靶的,上述双链体的,或上述探针、上述靶、以及上述双链体的总和的浓度、存在的分子数或化学势,例如至少大n倍,其中n为至少1,2,5,10,25,50,100,500,103,104,105,或106。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US7875993A | 1993-06-17 | 1993-06-17 | |
US08/078,759 | 1993-06-17 | ||
US15353693A | 1993-11-17 | 1993-11-17 | |
US08/153,536 | 1993-11-17 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1129461A true CN1129461A (zh) | 1996-08-21 |
Family
ID=26760905
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN94192876A Pending CN1129461A (zh) | 1993-06-17 | 1994-06-16 | 改进的测定核酸序列的方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0708840A1 (zh) |
JP (1) | JPH09502084A (zh) |
KR (1) | KR960703175A (zh) |
CN (1) | CN1129461A (zh) |
AU (1) | AU7208894A (zh) |
BR (1) | BR9406898A (zh) |
CA (1) | CA2165545A1 (zh) |
WO (1) | WO1995000667A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101225434B (zh) * | 2007-01-18 | 2011-09-14 | 上海生物芯片有限公司 | Cpt基因芯片及其检测方法和应用 |
CN102002522B (zh) * | 2009-11-10 | 2014-07-09 | 复旦大学附属华山医院 | 一种检测肺炎支原体耐药突变的方法 |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU8102694A (en) * | 1993-11-17 | 1995-06-06 | Id Biomedical Corporation | Cycling probe cleavage detection of nucleic acid sequences |
WO1997011199A1 (en) * | 1995-09-22 | 1997-03-27 | Lane Michael J | Nucleic acid reactions |
US7381525B1 (en) | 1997-03-07 | 2008-06-03 | Clinical Micro Sensors, Inc. | AC/DC voltage apparatus for detection of nucleic acids |
US6274316B1 (en) * | 1997-07-03 | 2001-08-14 | Id Biomedical Corporation | Compositions and methods for detecting vancomycin resistant enterococci by cycling probe reactions |
US6503709B1 (en) | 1997-07-03 | 2003-01-07 | Id Biomedical Corporation | Methods for rapidly detecting methicillin resistant staphylococci |
US20060275782A1 (en) | 1999-04-20 | 2006-12-07 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
WO2000063437A2 (en) | 1999-04-20 | 2000-10-26 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
US8481268B2 (en) | 1999-05-21 | 2013-07-09 | Illumina, Inc. | Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays |
CA2380258C (en) | 1999-07-26 | 2008-07-15 | Clinical Micro Sensors, Inc. | Sequence determination of nucleic acids using electronic detection |
US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
CA2426824A1 (en) | 2000-10-24 | 2002-07-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Direct multiplex characterization of genomic dna |
AU2002327236A1 (en) | 2001-07-12 | 2003-01-29 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
WO2003064679A2 (en) | 2002-01-30 | 2003-08-07 | Id Biomedical Corporation | Methods for detecting vancomycin-resistant microorganisms and compositions therefor |
US20040259100A1 (en) | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping |
WO2017189878A1 (en) * | 2016-04-27 | 2017-11-02 | Roka Bioscience, Inc. | Compositions and methods for the detection of nucleic acids |
US10995104B2 (en) | 2017-05-30 | 2021-05-04 | Roche Molecular System, Inc. | Catalysts for reversing formaldehyde adducts and crosslinks |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5011769A (en) * | 1985-12-05 | 1991-04-30 | Meiogenics U.S. Limited Partnership | Methods for detecting nucleic acid sequences |
-
1994
- 1994-06-16 CN CN94192876A patent/CN1129461A/zh active Pending
- 1994-06-16 KR KR1019950705800A patent/KR960703175A/ko not_active Application Discontinuation
- 1994-06-16 BR BR9406898A patent/BR9406898A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-06-16 EP EP94921315A patent/EP0708840A1/en not_active Withdrawn
- 1994-06-16 CA CA002165545A patent/CA2165545A1/en not_active Abandoned
- 1994-06-16 AU AU72088/94A patent/AU7208894A/en not_active Abandoned
- 1994-06-16 WO PCT/US1994/006855 patent/WO1995000667A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-06-16 JP JP7502972A patent/JPH09502084A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101225434B (zh) * | 2007-01-18 | 2011-09-14 | 上海生物芯片有限公司 | Cpt基因芯片及其检测方法和应用 |
CN102002522B (zh) * | 2009-11-10 | 2014-07-09 | 复旦大学附属华山医院 | 一种检测肺炎支原体耐药突变的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1995000667A1 (en) | 1995-01-05 |
KR960703175A (ko) | 1996-06-19 |
JPH09502084A (ja) | 1997-03-04 |
EP0708840A1 (en) | 1996-05-01 |
AU7208894A (en) | 1995-01-17 |
CA2165545A1 (en) | 1995-01-05 |
BR9406898A (pt) | 1996-03-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1129461A (zh) | 改进的测定核酸序列的方法 | |
CN108350499B (zh) | 可转化标记组合物、方法及结合其的过程 | |
US5093245A (en) | Labeling by simultaneous ligation and restriction | |
CN1127887A (zh) | Dna分离、分级分离和分析方法及其系统 | |
US7052841B2 (en) | Systems, tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays | |
EP0310229B1 (en) | Selective amplification of target polynucleotide sequences | |
EP0359789B1 (en) | Amplification and detection of nucleic acid sequences | |
US7371580B2 (en) | Use of unstructured nucleic acids in assaying nucleic acid molecules | |
AU718610B2 (en) | Optimally fluorescent oligonucleotides | |
US6090591A (en) | Selective amplification of target polynucleotide sequences | |
EA005577B1 (ru) | Продукт, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, полученный способом с участием химерного олигонуклеотидного праймера, днк-полимеразы и эндонуклеазы | |
EP2143805A1 (en) | Asymmetric pcr amplification, its special primer and application | |
GB2332516A (en) | Amplifying target nucleic acid sequences | |
US5858731A (en) | Oligonucleotide libraries useful for producing primers | |
US5599921A (en) | Oligonucleotide families useful for producing primers | |
WO2012109574A2 (en) | Assay methods using dna binding proteins | |
KR20010111020A (ko) | 특정 핵산을 검출하고 정량하기 위한 아이소메트릭프라이머 연장 방법 및 키트 | |
US5663062A (en) | Oligonucleotide libraries useful for producing primers | |
WO1992007948A1 (en) | Compositions and methods for analyzing genomic variation | |
AU2020253585A1 (en) | Methods, systems, and apparatus for nucleic acid detection | |
CN101280338B (zh) | 一种检测核酸多态性的核酸扩增方法 | |
CN1091831A (zh) | 检测核酸的方法 | |
CN117255857A (zh) | 接头、接头连接试剂及试剂盒和文库构建方法 | |
CN115843315A (zh) | 用于校准流通池中核酸文库接种效率的方法 | |
CN113564235A (zh) | 脱氧核糖寡核苷酸测序方法和试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |