JPH09502084A

JPH09502084A - 核酸配列検出の改良方法

Info

Publication number: JPH09502084A
Application number: JP7502972A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．レーン，マイケル; エス．ビナイト，アルバート; ディー．フォルダッツ，ブライアン
Original assignee: アイディーバイオメディカルコーポレイション
Priority date: 1993-06-17
Filing date: 1994-06-16
Publication date: 1997-03-04
Also published as: AU7208894A; KR960703175A; BR9406898A; CA2165545A1; WO1995000667A1; CN1129461A; EP0708840A1

Abstract

(57)【要約】改良された循環プローブ反応が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】核酸配列検出の改良方法発明の背景本発明は、核酸配列の存在を検出するための循環プローブ反応の使用に関する。試料中の特定の核酸配列の存在を検出する多くの方法が当該分野で公知である。そのような方法の一つは、循環プローブ反応(Cycling Probe Reaction:CPR)である。この反応では、同定すべき配列に特異的なプローブを標的一本鎖核酸にハイブリダイズさせ、二重鎖核酸を形成する。このプローブは、二重鎖の形成に際し開裂されやすくなる切断し得る結合を含む。例えば、DNAプローブは、RNA配列セグメントを含み得る。そのようなプローブと一本鎖DNA分子との間の二重鎖形成の結果、RNA:DNAハイブリッド二重鎖ができる。RNase Hは、RNA:DNAハイブリッド二重鎖のRNA鎖を切断し、標的に結合したプローブを切断するために用いられる。検出は、このハイブリダイゼーション特異的な開裂に基づく。切断されたプローブは、標的から離れ、そしてその標的は、新たな未切断のプローブとサイクルに入り得る。 CPR技術は、Duckら、米国特許第4,876,187号（1989年10月24日発行、本明細書に参考として援用する）、およびDuckら、米国特許第5,011,069号（1991年4月30 日発行、本明細書に参考として援用する）に記載されている。発明の要旨本発明は、一本鎖標的核酸を検出する方法を特徴とする。この方法は以下を包含する：ａ．反応混合物を提供する工程であって、該反応混合物が、標的核酸、相補的一本鎖核酸プローブ、およびRNase Hを含み、該プローブが、該標的に対してモル過剰で存在し、構造[NA₁-R-NA₂]_nを有し、ここでNA₁およびNA₂がDNA配列であり、ここでRが切断可能な核酸結合であり、そしてここでｎが１から10の整数であり、該RNase Hが、該RNase Hの非存在下で形成される二重鎖形成速度よりも二重鎖形成速度が実質的に増加するに十分な化学ポテンシャルで存在し、そして標的プローブ二重鎖を形成させる、工程；ｂ．工程(a)で得られた標的プローブ二重鎖を、切断可能な核酸結合の所定の配列内で該プローブを切断するように処理する工程であって、それによって該プローブから少なくとも１つのインタクトなDNA含有オリゴヌクレオチドフラグメントを形成し、このようなフラグメントが、もはや該標的核酸にハイブリダイズしたままであり得ないか、あるいはあり得ないように処理される、工程；ｃ．工程(a)および(b)のサイクルを繰り返す工程；およびｄ．このように形成されたインタクトなDNA含有フラグメントを検出し、それによって、一本鎖標的核酸を検出する工程、本発明はまた、以下を含む反応混合物を含む：一本鎖標的核酸；相補的な一本鎖核酸プローブであって、標的に対してモル過剰で存在し、そして[NA₁-R-NA₂]nの構造を有するプローブ（ここで、NA₁およびNA₂は、DNA配列であり、ここで、Rは、切断可能な核酸結合であり、そしてここで、nは、１〜10の整数である）；および RNase Hであって、RNase Hが存在しない場合に形成される場合より二重鎖の形成速度を実質的に速めるのに十分な化学ポテンシャルで存在するRNase H。本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および請求項から明らかとなるであろう。詳細な説明まず最初に図を簡単に説明する。図面図１は、改良CPRのダイアグラムである。図２は、改良CPRの産物を示すゲルの図である。本明細書中で用いられるTmは、二重鎖が一本鎖に融解して移行する中間点をいう。本明細書中で用いられる試薬の化学ポテンシャルは、その試薬が反応混合物に添加されたときの反応混合物の自由エネルギー変化をいう。化学ポテンシャルは、与えられたセットの条件下で与えられた反応中の種の活性のより正確な測定手段であり、例えば、反応し得る種の部位の数、および反応に種の全ての分子を利用し得るかどうかを考慮する。この種の化学ポテンシャルは、通常、種の濃度を変化させることにより最も直接的に操作し得る。化学ポテンシャルの単位は、自由エネルギー（例えば、cal/molまたはJ/mol）であるが、本明細書中の方法では、絶対化学ポテンシャルの測定の必要はない。本明細書中で開示されるほとんどの方法は、RNase Hの化学ポテンシャルが二重鎖に向けられた反応を行うのに十分であるような、２つの種の間の化学ポテンシャルの比、または２っの種の間の化学ポテンシャルの差を必要とする反応混合物を必要とする。本明細書中て用いられる精製核酸とは、精製DNAまたはRNAをいう。本明細書中で用いられる精製DNAとは、両方のコーディング配列に直接隣接しないDNAをいい、そのDNAが由来する生物の天然に存在するゲノム内てはそのコーディング配列にそのDNAは直接隣接する（すなわち、一方が５’末端で、他方か３’末端で）。この用語は、例えば、ベクター（例えば、自己複製プラスミドまたはウイルス）に組み込まれた組換えDNA、あるいは、原核生物又は真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNAまたは他のDNA配列とは独立した別の分子（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成したcDNAまたはゲノムDNAフラグメント）として存在する組換えDNAを含む。本明細書中で用いられる精製RNAとは、そのRNAを生成する細胞内で一緒に見出される別のRNA配列を実質的に有さない RNAをいう。非天然で生成する核酸配列は、それが実質的に他の配列を有さない場合に精製されている。本明細書中で用いられる精製された天然の産物とは、生物によって産生され、そしてそれが由来する生物中で一緒に存在する巨大分子（例えば、タンパク質、または核酸）を実質的に有さない産物をいう。本明細書中で用いられる生存細胞では天然に存在しない産物とは、生存細胞または生物によって合成されないかまたは産生されない産物をいう。本発明の方法は、RNase Hによって行われるCPR反応を可能にする。そのようにして、反応の速度はRNaseの濃度または化学ポテンシャルによって制御されるのであって、プローブまたは標的核酸によってではない。CPRプローブ CPRプローブの作製および使用は、当該分野では公知てある（例えば、Duckら、米国特許第4,876,187号、またはDuckら、米国特許第5,011,069号を参照）。本発明の実施に有用な核酸プローブは、以下の構造を含む： [NA₁-R-NA₂]n ここで、NA₁およびNA₂は核酸配列であり、ここてRは、RNA配列であり；そしてここで、nは約１〜約10の整数である本発明の１つの実施態様においては、核酸プローブ中のNA₁およびNA₂は、独立して約０〜約20のヌクレオチドを含み、Rは、約１〜約100またはそれ以上のリボヌクレオチドを含み、そしてnは、約１〜約10の整数である。本発明の別の実施態様においては、核酸プローブ中のNA₁およびNA₂はDNA配列である。さらなる実施態様においては、核酸プローブ中のNA₁およびNA₂は、RNA 配列である。さらに別の実施態様においては、この核酸プローブは、NA₁がRNAまたはDNA配列のいすれかである構造を含む。１つの実施態様においては、所定のRNA配列でハイブリダイズしたプローブにニックを入れること(nicking)は、二重鎖リボヌクレアーゼによって行われる。このようなリボヌクレアーゼは、二重鎖DNA-RNAハイブリダイズ鎖由来のリボ核酸配列にニックを入れるか切り出しを行う。本発明の実施に有用なリボヌクレアーゼの例はRNase Hである。他のリボヌクレアーゼおよび酵素、例えば、Exo III および逆転写酵素も、RNA-DNA鎖由来のRNAにニックを入れるかまたは切り出しを行うために適切であり得る。本発明の分子は、１以上の核酸配列、NA₁またはNA₂に付着している検出可能なマーカーを有し得る。このマーカーは、検出され得る任意の分子または試薬を意図する。このような検出可能な分子の例は、ラジオアイソトープ、放射ラベル分子、蛍光分子、蛍光抗体、酵素、または化学発光触媒である。他の適切なマーカーは、酵素、蛍光分子、または他の検出可能な分子によってラベルされた特定のタンパク質に結合し得るリガンドである。適切なリガンドの例は、アビジンまたはストレプトアビジンに結合するビオチンである。本発明の１つの実施態様においては、核酸プローブは、固体支持体に固定される。別の実施態様においては、この核酸プローブは、検出可能なマーカーでラベルされる。核酸配列、NA₁およびNA₂がDNAである場合、上記のR部分もまた、米国特許第4, 876,187号における使用と矛盾しない言葉で、適切に、切断可能な結合と呼ばれ得る。このような結合は、分子自身または標的核酸分子の任意の核酸配列も切断または崩壊させることなく切断または崩壊され得る結合である。本明細書中で用いられるように、そのような切断可能な結合（すなわち、R）は、２つの核酸配列を接続し、そしてそれに接続している核酸配列を開裂せずに選択的に切断され得る任意の連結化学構造である。この切断可能な結合は、単一の結合または複数単位の配列であり得る。本明細書中で用いられるRは、リボ核酸(RNA)配列を示す。改良循環プローブ反応(Improved Cycling Probe Reactions) 図１は、しばしば循環プローブ反応（CPR）といわれる反応スキームに関する改良を示す。この反応では、プローブを標的にハイブリダイズさせて二重鎖を形成させる。このプローブは、切断可能な結合を含み、それは、二重鎖の形成に際して開裂されやすくなる。例えば、このプローブは、RNase感受性セグメントを含み得る。そのようなプローブと一本鎖DNA分子との間の二重鎖の形成は、結果としてRNA:DNAハイブリッド二重鎖の形成に至る。RNA:DNAハイブリッドを切断する酵素、例えば、RNase Hは、プローブが標的に結合している場合にのみそのプローブを切断する。検出は、このハイブリダイゼーション特異的開裂に基づく。 RNaseは、この二重鎖に結合して、二重鎖：RNase 複合体を形成する。開裂の結果、切断されたプローブ：標的複合体ができる。この切断されたプローブは、標的から離れ、そしてこの標的は、新たな未切断プローブと共にサイクルに入り得る。本発明の方法を用いて、この反応の実施が改良され得る。しばしば用いられるように、このスキームは、十分なRNase Hが存在しない場合、標的配列の検出には不適当である。従来は、基本的な反応を正常に進ませるためにプローブの濃度を高くしていた。本明細書に記載されるように、反応混合物中のRNase Hの化学ポテンシャルを増加させることもまた、二重鎖の形成には好都合である。RNase Hは反応混合物中でこの種のポテンシャルを増加させて二重鎖：RNase H複合体の形成を指示するので、二重鎖基質の生成には好都合であり、このように、切断されたプローブ（シグナル）の生成にも好都合である。従って、RNase Hの添加を用いて感受性を高め得る。この方法は、一本鎖標的核酸の検出に用いられ得る。一つの実施態様においては、反応混合物が提供され、これは、標的核酸、相補的一本鎖核酸プローブであって、標的に対してモル過剰で存在し、以下の構造を有するプローブ [NA₁-R-NA₂]n ここで、NA₁およびNA₂はDNA配列であり、ここでRは切断可能な核酸結合であり、そしてnは１〜10の整数である、およびRNase Hを含む。このRNase Hは、RNase H の非存在下で形成される場合より二重鎖の形成速度を実質的に速めるに十分な化学ポテンシャルで存在する。この混合物を標的−プローブ二重鎖を形成させるような条件下に維持する。切断可能な核酸結合の所定の配列内のプローブを切断し、そしてそれによって少なくとも１つのインタクトなDNA含有オリゴヌクレオチドフラグメントをプローブから形成し、そのようなフラグメントが、標的核酸にもはやハイブリダイズしたままでは存在し得ない、またはハイブリダイズしたままでは存在し得ないように処理されることによって、工程(a)由来の標的−プローブ二重鎖を処理する。次いで、工程(a)および(b)のサイクルを繰り返し、そしてそのようにして形成されたインタクトなDNAを含むフラグメントが検出され、それによって一本鎖標的核酸を検出する。１つの特定の実施態様においては、この方法は、二重鎖のTmより高い温度で行われる。例えば、温度は、少なくともｘ℃であり得、ここで、ｘはTmより、５、 10、20、30、40、50、60、70、または80℃高い。好ましい実施態様においては、二重鎖形成速度は、RNase Hの添加によって少なくともｙ倍に増加し、ここで、ｙは、２、５、10、50、100、500、10³、10⁴、 10⁵、10⁶である。このRNase Hを用いて、RNase H非存在下での二重鎖形成速度が実質的に０である条件下で、二重鎖形成を行わせ得る。本発明の種々の実施態様において、RNase Hの濃度、分子の数、または化学ポテンシャルは、プローブ、標的、プローブと標的の両方、二重鎖、あるいは、プローブ、標的および二重鎖の組み合わせの、濃度、存在分子の数、または化学ポテンシャルより高く（例えば、少なくともｚ倍より高い）、ここで、ｚは、少なくとも１、２、５、10、25、50、100、500、10³、10⁴、10⁵、または10⁶である。特定の実施態様において、RNase Hの濃度、分子の数、または化学ポテンシャルは、以下を行わせるのに十分である：生物学的試料中の１個の標的分子の検出、好ましくは、１反応当たり20,000cpmを用いて40,000cpm/μlの活性でラベルしたCPRプローブによる検出；10^-5pMole以下の濃度での標的鎖の検出、好ましくは、この検出は、１反応当たり20,000cpmを用いて40,000cpm/μlの活性でラベルしたCPRプローブによって行われる；10^-6pMole以下の濃度での標的鎖の検出、好ましくは、この検出は、１反応当たり20,000cpmを用いて40,000cpm/μlの活性でラベルしたCPRプローブによって行われる；10^-7pMole以下の濃度での標的鎖の検出、好ましくは、この検出は、１反応当たり20,000cpmを用いて40,000cpm/μlの活性でラベルしたCPRプローブによって行われる；10^-8pMole以下の濃度での標的鎖の検出、好ましくは、この検出は、１反応当たり20,000cpmを用いて40,000cpm/ μlの活性でラベルしたCPRプローブによって行われる；10^-9pMole以下の濃度での標的鎖の検出、好ましくは、この検出は、１反応当たり20,000cpmを用いて40, 000cpm/μlの活性でラベルしたCPRプローブによって行われる；10^-10pMole以下の濃度での標的鎖の検出、好ましくは、この検出は、１反応当たり20,000cpmを用いて40,000cpm/μlの活性でラベルしたCPRプローブによって行われる；10^-11p Mole以下の濃度での標的鎖の検出、好ましくは、この検出は、１反応当たり20,0 00cpmを用いて40,000cpm/μlの活性でラベルしたCPRプローブによって行われる；10^-12pMole以下の濃度での標的鎖の検出、好ましくは、この検出は、１反応当たり20,000cpmを用いて40,000cpm/μlの活性でラベルしたCPRプローブによって行われる。このプローブおよび標的は、反応混合物中に、実質的に同じ量、濃度、数、または化学ポテンシャルで存在し得る。プローブの標的に対する重量、モル濃度、数、濃度、または化学ポテンシャルの比は1:1、2:1、5:1、10:1、25:1、50:1、1 00:1、または10^m:1以下であり得、ここで、ｍは、３から10以下の整数である。R Nase Hの一本鎖に対する重量、モル濃度、数、濃度、または化学ポテンシャルの比は、最も高い濃度で1:1、2:1、5:1、10:1、25:1、50:1、100:1、または10^m:1 以上であり得、ここで、ｍは、３から10以下の整数である。好ましい実施態様においては、RNase Hは、二重鎖形成の速度を少なくともn倍に加速し、ここで、nは、２、５、10、50、100、500、10³、10⁴、10⁵、10⁶である。本発明の方法および組成物を以下の実施例に示す。実施例二重鎖形成のためには少なすぎるRNaseが存在する条件下において標的核酸を検出するために、RNase Hの化学ポテンシャルによってCRP中で二重鎖形成を駆動することの例示を以下に示す。二重鎖形成を駆動させる化学ポテンシャルは高濃度のRNase Hによって提供される。RNase Hの酵素活性によって、ギャップのある二重鎖を生成するようにプローブを切断し、ここで両方の二本鎖領域は元のプローブ：標的二重鎖より不安定である。適切な実験条件下においては、プローブ：標的複合体のTmよりかなり高い温度(65℃)で反応が行われる場合でさえ、これは反応を進行させ、そしてサイクルさせる。反応条件：以下の反応スキームを用いた：１μlの5’³²Pラベル化プローブ配列（このプローブは２つの末端DNA領域の間に配置された中央RNA領域を有するDN A-RNA複合分子であり、28塩基の長さであり、そして標的配列に相補的である）を、１μlの標的に相同なDNAと、50mMのTris-Cl/10mM MgCl₂(pH7.5)および2.5μ LのddH₂Oから構成される0.5μlのバッファーとを含むチューブに加えた。次いで、高濃度のRNase Hの１μlのアリコートを加え、そして試料を65℃に置いた。酵素が駆動する二重鎖形成のための前向きの(forward)化学ポテンシャルならびに生成物解離のための後ろ向き(backward)ポテンシャルによって駆動される「循環」が起こる状況を創出するように、RNase H濃度は、二重鎖の形成を促進しかつ形成された二重鎖を開裂させるに十分な高濃度であった（例えば１つより多いプローブが同じ標的と反応し得る）。酵素によって提供される化学ポテンシャルで１個の標的分子が検出させるに十分かどうかを評価するために、標的濃度（分子数）を10倍づつ増しながら系列希釈した。 DNA：RNAオリゴハイブリッドのRNase H切断の手順は以下の通りであった：１．プローブのラベル化：キメラ「プローブ」をキナーゼでラベルし、そして 20％変性アクリルアミドゲルを用いて単離した。２．希釈：一連の0.1×希釈によって標的を系列希釈し、所望の濃度を得た。一連の希釈の最初は、通常、濃度１pmole/μlから開始し、そして10^-12pmole/μ まで系列的に希釈した。３．試験範囲：チューブに１μlの希釈した標的試料を加えた。例えば、１pmo leの標的反応のために印をつけたチューブに、１pmole/μlのチューブからの１ μlを入れた。酵素および標的を含むチューブにおいて酵素および標的が寄与する容量を補うために、２μlの滅菌ddH₂Oを第１のコントロールチューブ（-標的/ -RNase H）に加えた。標的を含むチューブにおいて標的が寄与する容積を補うために、１μlの滅菌ddH₂Oを第２のコントロールチューブ（-標的/+RNase H）に加えた。４．反応カクテル：以下の反応カクテルを作製した：反応回数＋１に合わせた 0.5μlの10×RNase Hバッファー（0.5M Tris-Cl(pH7.5)、0.1M MgCl₂からなり、滅菌されているべきである）；反応回数＋１に合わせたＸμlのプローブ（１反応当たり20,000cpm）;反応回数＋１に合わせたＹμlの滅菌ddH₂O(３μlまで)；および反応回数＋１に合わせた３μlの総容量。１pmoleから10^-12pmoleの、標的13個の個別の希釈物、および２個のコントロールを検出するためのプローブの感度を試験するために、-RNase H/-標的および +RNase H/-標的を必要とする。従って、全部で15の反応がある。従ってこのカクテルは以下を含む：ａ．１反応当たり５μlの基礎容量の10×RNase H反応バッファーの量：16（反応回数＋１）に合わせた0.5μl、これは8.0μlの10×RNase H反応バッファーに等しい；ｂ．１反応当たり0.5μlのプローブの16（反応回数＋１）に合わせた量の、活性40,000cpm/μlで、１反応当たり20,000cpmを用いるプローブ。これは8.0μlのプローブに等しい；ｃ．１反応当たり３μlの容量とするために必要な量のddH₂O。１反応当たり、 0.5μlの10×RNase H 反応バッファーと0.5μlのプローブ（全部で１μl）が加えられているので、１反応当たりさらに２μlのddH₂O（３μlからプローブの容量、10×RNase H 反応バッファーの容量を引く）の16（反応回数＋１）に合わせ、これは32μlのddH₂Oに等しい。５．カクテルの分配：カクテルのアリコート３μlを各コントロールおよび標的反応チューブに入れる。（これは１反応当たり５μlの基礎容量と見積もられる）。６．RNase Hの添加：１μlのRNase H酵素を標的試料チューブおよび第２のコントロール（-標的/+RNase H）に加える。第１のコントロール（-標的/-RNase H ）には酵素を加えない。この工程は注意深く行うべきである。なぜなら、酵素は通常、高濃度のグリセロール中にあり、そのためピペットを使用することが困難だからである。この酵素を反応チューブの側面から添加し得、次いで、酵素が中に入るようにチューブ中に回しながら垂らしていく(spun down)か、あるいはこの酵素をチューブ中に既に存在する液体容量に直接添加し得る。各チューブはこの時点で全量５μlである。７．インキュベート：すべての反応を65℃で30分間インキュベートする。反応時間の後に短時間、遠心分離する。８．分析：５μlのRNA尿素染料(0.5mlづつの10mM Tris pH7.5、100mM Na₂EDTA 、１ml中の0.01％BPB&XC中に0.44ｇの尿素からなるRNA尿素染料）を加え、そして必要であれば遠心分離する。次の分析のために、この試料を20％変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ得る。図２は、上記のように行ったCPRの反応生成物を示す。左から右に、レーンは以下の反応生成物を示す：コントロール１（-RNase H/-標的）；コントロール２（+RNase H/-標的）；標的濃度10^-5pMole；標的濃度10^-6pMole；標的濃度10^-7pM ole；標的濃度10^-8pMole；標的濃度10^-9pMole；標的濃度10^-10pMole；標的濃度1 0-¹¹pMole；標的濃度10^-12pMole。上のバンドはプローブを表し、そして下のバンドはRNase H開裂生成物を表す。他の実施態様は以下の請求項の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ビナイト，アルバートエス. アメリカ合衆国イリノイ 60193，シャウムバーグ，バレイビュウドライブ 1630 (72)発明者フォルダッツ，ブライアンディー. アメリカ合衆国マサチューセッツ 01754，メイナード，ベルビューテラス４

Claims

【特許請求の範囲】１．一本鎖標的核酸を検出する方法であって、ａ．反応混合物を提供する工程であって、該反応混合物が、標的核酸、相補的一本鎖核酸プローブ、およびRNase Hを含み、該プローブが、該標的に対してモル過剰で存在し、構造 [NA₁-R-NA₂]_n を有し、ここでNA₁およびNA₂がDNA配列であり、ここでRが切断可能な核酸結合であり、そしてここでｎが１から10の整数であり、該RNase Hが、該RNase Hの非存在下で形成される二重鎖形成速度よりも二重鎖形成速度が実質的に増加するに十分な化学ポテンシャルで存在し、そして標的プローブ二重鎖を形成させる、工程；ｂ．工程(a)で得られた標的プローブ二重鎖を、切断可能な核酸結合の所定の配列内で該プローブを切断するように処理する工程であって、それによって該プローブから少なくとも１つのインタクトなDNA含有オリゴヌクレオチドフラグメントを形成し、このようなフラグメントが、もはや該標的核酸にハイブリダイズしたままであり得ないか、あるいはあり得ないように処理される、工程；ｃ．工程(a)および(b)のサイクルを繰り返す工程；およびｄ．このように形成されたインタクトなDNA含有フラグメントを検出し、それによって、一本鎖標的核酸を検出する工程、を包含する方法。２．前記方法が該二重鎖のTmを超える温度で行われる、請求項１に記載の方法。３．前記温度が、少なくともｘ℃であり、ここでｘが前記Tmより5、10、20、30、40、 50、60、70または80高い、請求項１に記載の方法。４．RNase Hの添加によって、前記二重鎖形成速度が少なくともｙ倍に増大し、ここでｙが2、5、10、50、100、500、10³、10⁴、10⁵、10⁶である、請求項１に記載の方法。５．RNase Hの非存在下で前記二重鎖形成速度が実質的にゼロである、請求項１に記載の方法。６．前記RNase Hの濃度、分子数、または化学ポテンシャルが、前記プローブ、前記標的、該プローブと該標的の両方、前記二重鎖、または該プローブ、該標的、および該二重鎖の組合せの、濃度、存在分子数、または化学ポテンシャルより、例えば少なくともＺ倍大きく、ここでｚが1,2、5、10、25、50、100、500、10³、10⁴、1 0⁵、または10⁶である、請求項１に記載の方法。７．前記RNase Hの濃度、分子数、または化学ポテンシャルが、以下を可能にするに充分である、請求項１に記載の方法：活性40,000cpm/μlでラベルされたプローブを反応当たり20,000cpm使用して、生物学的試料中の１個の標的分子を検出し；活性40,000cpm/μlでラベルされたプローブを反応当たり20,00Ocpm使用して検出を行い、濃度10^-5pMole以下で標的鎖を検出し；活性40,000cpm/μlでラベルされたプローブを反応当たり20,000cpm使用して検出を行い、濃度10^-6pMole以下で標的鎖を検出し；活性40,000cpm/μlでラベルされたプローブを反応当たり20,000cpm使用して検出を行い、濃度10^-7pMole以下で標的鎖を検出し；活性40,000cpm/μlでラベルされたプローブを反応当たり20,000cpm使用して検出を行い、濃度10^-8pMole以下で標的鎖を検出し；活性40,000cpm/μlでラベルされたプローブを反応当たり20,000cpm使用して検出を行い、濃度10^-9pMole以下で標的鎖を検出し；活性40,000cpm/μlでラベルされたプローブを反応当たり20,000cpm使用して検出を行い、濃度10^-10pMole以下で標的鎖を検出し；好ましくは活性40,000cpm/μlでラベルされたプローブを反応当たり20,000cpm使用して検出を行い、濃度10^-11pMole以下で標的鎖を検出し；あるいは活性40,000cpm/μlでラベルされたCPRプローブを反応当たり20,000cpm使用して検出を行い、濃度10^-12pMole以下で標的鎖を検出する。８．前記プローブと前記標的とが、実質的に等しい量、濃度、数、または化学ポテンシャルで前記反応混合物中に存在する、請求項１に記載の方法。９．前記プローブの前記標的に対する、重量、モル濃度、数、濃度、または化学ポテンシャルの比が、１：１、２：１、５：１、10：１、25：１、50：１、100 ：１、または10ⁿ：１と等しいかあるいはそれ以下であり、ここてｎが３から10 以下の整数である、請求項１に記載の方法。１０．前記RNase Hの前記一本鎖に対する、重量、モル濃度、数、濃度、または化学ポテンシャルの比が、最も高い濃度で、１：１、２：１、５：１、10：１、 25：１、50：１、100：１、または10ⁿ：１より大きく、ここでｎが３から10以下の整数である、請求項１に記載の方法。１１．前記RNase Hが二重鎖形成の速度を少なくもｎ倍加速し、ここでｎが2、5、1 0、50、100、500、10³、10⁴、10⁵、10⁶である、請求項１に記載の方法。１２．前記標的がDNA分子であり；前記標的がRNA分子であり；前記標的が合成の、精製された天然の、遺伝子工学的に設計された、あるいは組換えDNAまたはRNA 分子であり；前記標的が天然に存在する核酸、例えばゲノム分子であり、または染色体、例えばウイルス、細菌、植物、または動物の核酸である、請求項１に記載の方法。１３．工程(b)のオリゴヌクレオチドフラグメントが検出可能なマーカーでラベルされ、そしてラベルされたフラグメントが工程(d)で検出される、請求項１に記載の方法。１４．工程(b)の前記オリゴヌクレオチドフラグメントがラベルされていないが、検出可能なマーカーでラベルされ得、該フラグメントが工程(c)または(d)の前にそのようにラベルされ、そしてラベルされたフラグメントが工程(d)で検出される、請求項１に記載の方法。１５．前記切断可能な核酸結合がRNA配列である、請求項１に記載の方法。１６．NA₁およびNA₂が独立して０から約20個のデオキシリボヌクレオチドを含み、そしてRが１から約100個のリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。１７．ｎが２から10の整数であり、そしてNA₁またはNA₂のうち少なくとも１つがプローブ内で変化する、請求項１に記載の方法。１８．ｎが１である、請求項１に記載の方法。１９．工程(b)における処理が、二本鎖標的−プローブ複合体と二本鎖特異的リボヌクレアーゼとを接触させることを包含する、請求項１に記載の方法。２０．前記プローブが固体支持体上に固定化されている、請求項１に記載の方法。２１．前記ラベル化されていないフラグメントが3'-ヒドロキシル基を有し、そしてここで該フラグメントのラベル化が、該3'-ヒドロキシル基からのRNAテーリングを含む、請求項１５に記載の方法。２２．一本鎖標的核酸の検出のための反応混合物であって、一本鎖標的核酸；該標的に対してモル過剰で存在し、構造[NA₁-R-NA₂]_nを有し、ここでNA₁およびNA₂がDNA配列であり、ここでRが切断可能な核酸結合であり、そしてここでｎが１から10の整数である、相補的一本鎖核酸プローブ；および RNase Hであって、該RNase Hの非存在下で形成される二重鎖形成速度よりも実質的に増加した速度で二重鎖を形成するに充分な化学ポテンシャルで存在するRN ase H を含有する、反応混合物。２３．前記検出が該二重鎖のTmを超える温度で行われる、請求項２２に記載の反応混合物。２４．前記RNase Hの添加によって二重鎖形成の速度が少なくもｎ倍加速され、ここでｎが2、5、10、50、100、500、10³、10⁴、10⁵、10⁶である、請求項２２に記載の反応混合物。２５．RNase Hの非存在下の前記二重鎖形成速度が実質的にゼロである、請求項２２に記載の反応混合物。２６．前記RNase Hの濃度、分子数、または化学ポテンシャルが、前記プローブ、前記標的、該プローブと該標的の両方、前記二重鎖、または該プローブ、該標的、および該二重鎖の組合せの、濃度、存在分子数、または化学ポテンシャルより、例えば少なくともｎ倍大きく、ここでｎが1,2、5、10、25、50、100、500、10³、10⁴、 10⁵、または10⁶である、請求項２２に記載の反応混合物。