CN1091831A - 检测核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
利用核酸探针检测核酸的方法,包括样品与荧光
标记的RNA探针混合,RNA探针在其末端用荧光
标记来标记并具有单链靶DNA的互补序列,因此样
品与靶DNA杂交,之后加入核糖核酸酶H与杂合
体反应,核糖核酸酶H特异性地降解DNA-RNA
杂合体中的双链RNA,所以形成RNA探针片段并
释放下来。而RNA探针再与恢复单链形成的靶
DNA杂交,然后以同样的方式用核糖核酸酶H降
解。反应过程自动重复,通过重复释放大量的RNA
探针片段,终止反应后,反应液经电泳来确定降解的
RNA片段。用这种方法,DNA或RNA可以被高
灵敏度地检测出来。
Description
本发明是关于检测RNA或DNA的方法,也涉及DNA(基因)诊断。
DNA或RNA的检测被用于诊断遗传病和病毒性传染病。对于一些稀有的病例来说,被检测的病毒拷贝数只有几十个或更少,因此利用PCR(聚合酶链反应)或NASBA(核酸碱基序列扩增;Na-ture,350,91-92(1991)扩增DNA或RNA的方法已用于病毒的检测。用PCR和NASBA方法,分别扩增特定的DNA区域或特定的RNA区域,例如,用PCR法,扩增的DNA区域位于与目标双链DNA(+)链和(-)链杂交的两个寡聚物之间。双链DNA在高温(90℃)下变性,使(+)链和(-)链分开,随后降低温度(60℃),用像Taq这样的热稳定的DNA聚合酶,DNA寡聚物与单独的链杂交合成互补链,再升高温度使(+)链和(-)链分开。通过重复升温和降温循环,DNA链成二倍增殖。已知经过这样一次热循环,大约扩增1.6倍,所以经过30次重复拷贝数扩增至106倍。在凝胶电泳上分离以这种方式合成的DNA并分析扩增的DNA的长度,来检测靶DNA存在与否。
这样的PCR方法有缺点,它需要昂贵的热稳定酶来扩增DNA拷贝,需要一个系统来重复升温和降温,工作烦琐和费时,并且DNA扩增需要二个寡聚物(引物)。此外,PCR产物需在电泳上分离,需要艰苦的工作和劳动,特别在某些情况下,扩增目标的两个引物很难选定。本发明的目的就是解决这些缺点并提供一个取代PCR的简单和高度灵敏地检测DNA或RNA方法,同时也提供采用此方法的DNA(基因)诊断。
本发明的第一方面包括用荧光标记的RNA寡聚物或DNA-RNA共聚体作为探针。这样的寡聚物或共聚物与靶DNA杂交,用核糖核酸酶降解DNA-RNA双链部分,检测缩短的探针从而检测靶DNA(核酸)的存在,本发明也阐述了所用的探针的特性,探针具有DNA和RNA结合部份重复二次以上的结构并且在重复的DNA部分有一个荧光标记位点;或者至少在探针一端具有固相化的颗粒的RNA链,此RNA链与靶DNA杂交,RNA链位于探针固相化颗粒位点和荧光标记位点之间。
RNA探针和RNase(核糖核酸酶H等)加到样品溶液中,只有当目标(互补部分)DNA序列存在时RNA探针才形成DNA-RNA杂合体。因为RNase只降解杂合体的RNA区域,所以RNA探针被缩短并从靶DNA链、上释放下来,靶DNA链再与RNA探针杂交。之后,没有反应的RNA探针与样品溶液中的DNA杂交,接着用RNase缩短RNA探针。反应(杂交和降解)可以在37℃重复进行,所以当样品溶液中存在与RNA探针有互补序列的DNA时,形成了比DNA数量大许多的缩短的RNA探针。通过分析缩短的RNA探针可以检测出痕量目标DNA。当用DNA-RNA共聚物做探针时,只有探针的RNA部分被降解,因为缩短的DNA寡聚物不再有较强的结合力,所以荧光标记的缩短的DNA寡聚物从靶DNA链上释放下来。因此,重复杂交反应和降解反应形成大量的荧光标记的缩短的DNA寡聚物并释放下来,所以靶DNA可以高灵敏度地检测出来。
当具有多个DNA部份并且在多个重复的DNA部份有荧光标记位点的DNA-RNA共聚物作探针时,只有探针的RNA部份被降解,因此探针以DNA部份与靶DNA链杂交的形式被修饰成片段寡聚物。如果DNA部分的长度足够短,因其结合力太弱而从靶DNA链上释放下来,这样就形成多个荧光标记的缩短的DNA探针并从上述探针中释放出来。杂交和降解,然后释放缩短的DNA探针过程重复进行。把所用探针的DNA部分制备成相等长度,在电泳分离时所有释放的DNA可检测成一个峰,这样靶DNA的存在以高灵敏度检测出来。
利用上述任何一种RNA探针,由DNA-RNA共聚物构成的探针和具有荧光标记位点的多个重复DNA部分结构的探针,将探针一端固相化在颗粒上,而可与靶DNA杂交的RNA链位于探针固相化部位和荧光标记位点之间,从而形成探针和靶DNA杂合体。由于RNase裂解杂合体中的RNA部份,当用磁珠作为这种颗粒时,裂解反应后没有裂解的探针可用磁铁快速除去,而含有荧光标记的裂解探针仍留在容器中。通过测量荧光标记位点上的标记荧光产生的荧光,很容易检测样品DNA。
为了检测痕量靶DNA,与靶DNA杂交的核酸探针要以高灵敏度检测出来。当含有RNA的标记探针与特异地降解DNA-RNA双链的RNA(杂交瘤)的核酸酶(如:核糖核酸酶H等)共存时,只降解与靶DNA形成杂合的探针并改变探针长度的反应被称为靶DNA催化反应,酶作为催化剂,反应探针的降解不可逆地进行。因此即使只有痕量靶DNA存在,仍产生大量的降解和修饰探针,这样获得高灵敏的DNA检测结果。用凝胶电泳根据分子大小从没有反应的探针中分离降解的探针,把探针固相化在颗粒或磁珠上,可以用非常简单的方式从完整的探针中分离降解产物。本发明方法不同于常规的PCR及其相似的方法。只要简单地把探针和酶加到样品中,因而本发明的方法是高度有效的,因为反应系统可被简化。
下文将叙述本发明的第二个方面。用核酸寡聚物(核酸探针)进行DNA分析,与靶DNA杂交的DNA或RNA探针被降解,其长度因此被缩短。然后,完整的探针或部分缩短的探针从反应液中除去。用一种具有核酸外切酶活性或一种核糖核酸酶H活性的酶,或者这二种酶一起来缩短与靶DNA杂交的DNA或RNA探针。DNA探针由二条链组成,第一条链部分具有像荧光团这样的化学品标记的位点、第二条链具有像生物素这样的化学品标记的位点,后者用来从没有反应的探针中分离降解的DNA探针。像生物素这样的分离标记可以通过抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素连到磁珠上。DNA探针与靶DNA杂交后,用像核酸外切酶或核糖核酸酶H这样的酶使第一条链部分和第二条链部分分开,与磁珠相连的抗生物素蛋白与生物素结合,之后用磁珠除去完整的(没有反应的)DNA探针。而保留下来的带有检测标记的缩短的探针可以被检测。
电磁场和磁珠一起使用或使用分子筛膜,除去完整的或部分缩短的探针。所用的探针第一条链部分含有一个用于检测的标记化合物,第二条链部分含有一个固相化的分离标记的位点,此位点用于检测反应后欲从溶液中除去的反应物和反应产物。此外在探针缩短反应期间,探针的两部分互相分离。用于检测的标记材料可以选自荧光团,化学发光物、染料和分散剂如颗粒。用于分离的标记物可以选自生物素、磁珠和颗粒。
另外,探针具有一个标记区域,这一区域在离5′末端6个碱基之内至少有一个检测标记;在离检测标记10个碱基之内趋向于3′末端方向有一个生物素标记;在探针3′末端有一个至少含5个或更多碱基的DNA链。同样探针可能具有一个标记区域,这一区域在离5′末端6个碱基之内至少有一个检测标记,在离检测标记10个碱基以内趋向于3′末端方向有一个生物素标记;在探针3′末端有至少含5个碱基的DNA链,而且,在标记区域和3′末端DNA链之间,探针至少有一处含有RNA链,此处3′末端被阻断以防止核酸外切酶降解。
下面将讨论总长32-mers的DNA嵌段共聚物探针。作为DNA探针,在5′末端有荧光标记,离5′末端第十个核酸上有生物素标记,DNA从生物素标记向3′末端延长了10个核苷酸,接着是6-mers的RNA部份,之后是6-mer或更长的DNA部份。此DNA部份被固相化在颗粒上。当探针加到含有靶DNA的DNA溶液中时,DNA探针与靶DNA杂交;当加入核糖核酸酶H和核酸外切酶Ⅲ时,双链DNA探针的RNA部分被首先降解;然后靠核酸外切酶前移从DNA3′末端降解,直至探针大小被修饰成离5′末端约6-mers为止。在内部的生物素标记位点被毫无阻止地降解,缩短的探针从靶DNA上脱离下来,然后重复这样的反应,一个新的DNA探针与靶DNA杂交。因此形成大量的缩短的探针。为了阻断单链上发生这样的反应,探针3′末端被阻断以防止这样的反应。反应终止后,与磁珠相连的抗生物素蛋白加到的反应混合液中,与探针上的生物素结合,除了缩短的探针外其它探针通过生物素与抗生物素蛋白的结合被固相化在磁珠上,这样没有反应的探针被快速除去。测量保留在溶液中的缩短的探针的荧光,靶DNA以简单的方式被高灵敏度地检测出来,而不需任何热循环和分离手段。
如上所述,利用具有生物素标记位点的探针(生物素标记位点位于检测的荧光或其相似物标记位点附近),作为检测痕量靶DNA存在的探针,用核酸外切酶或核糖核酸酶选择性地降解和缩短杂交的探针,然后用磁珠除去未曾反应的探针,不需繁琐工作在短时间内就可以获得高灵敏度的检测结果。本方法只需要廉价的酶和探针,所以是非常经济和省时的。
附图的简要说明
图1是描绘根据本发明实施例1的反应过程的图。
图2是描绘经根据本发明实施例1反应过程的反应液的电泳结果图。
图3是描绘根据本发明实施例2反应过程的图。
图4是描绘根据本发明实施例3反应过程的图。
图5A至5D是描绘根据本发明使用的DNA探针的结构的图。
图6是描绘根据本发明实施例5反应过程的图。
图7是描绘根据本发明实施例6反应过程的图。
现在参照实施例解释本发明。在图1,3,4,5A至5D,6和7中,相关的数字“3′”和“5′”分别代表核酸分子链的3′末端和5′末端。在下面的实施例中,使用硫氰酸胺101(发射波长,615nm),FITC(荧光素异硫氰酸盐,发射波长,525nm),或TRITC(四甲基若丹明异硫氰酸盐,发射波长,580nm)及其相似物。上面任何一种标记物通过氨基接头与RNA分子共价结合。
实施例1
图1描绘了根据本发明实施例1的过程。制备具有单链靶DNA101互补序列并具有荧光标记110的RNA探针,例如,硫氰酸胺101(发射波长,615nm)标记在5′末端形成荧光标记的RNA探针102。荧光标记的RNA探针102大约长20-mers至50-mers才比较合适。理由是如果荧光标记的探针被缩短,杂交结合力下降;如果荧光标记的探针太长,将产生不利的可导致探针降解的非特异性杂交。在37℃将样品与0.1pmol荧光标记的RNA探针102混合,探针与靶DNA101杂交。然后加入1个单位的核糖核酶H保温20分钟。核糖核酸酶H降解DNA-RNA杂合体103的RNA部分,但不降解单链RNA,单链DNA或双链DNA。这样,只有杂交的含有RNA的探针被选择性地降解,如果样品中存在单链靶DNA101,RNA探针102与靶DNA杂交,然后RNA探针被核糖核酸酶H降解成片段104,这些片段从靶DNA101上释放下来。(如果靶是双链DNA,DNA需先变性形成二条单链,然后每一条单链与RNA杂交,或用核酸外切酶进行双链末端降解制备成单链然后再检测)。另一个RNA探针102与释放了降解的RNA探针的靶DNA101杂交,然后用核糖核酸酶H降解新杂交的RNA探针,形成片段RNA探针105。这个反应过程自动地重复,降解的RNA探针片段数量随着重复次数(n)增加。反应20分钟后,将反应温度升高至90℃来热降解和失活酶,反应终止。反应产物在聚丙烯酰胺凝胶(6w/v%)上电泳,较满意的迁移长度为10cm至30cm,这里假设在15cm处。在电泳通道的底部用594nm的氦氖激光器照射,检测通过的RNA片段发射的荧光。电泳通道可以由任何毛细管和平底平板制成。反应产物包含完整的RNA探针和降解的RNA探针,许多情况下降解产物是5-mers或更短。因为电泳时RNA片段的迁移速度依赖于其长度,所以降解的RNA探针121从完整的RNA探针122中分离出来并如图2所示来进行检测。通过检测降解的RNA探针121,可以证实靶DNA101的存在。因此,显而易见利用标准曲线常规定量方法可以定量地检测靶DNA101的存在。
实施例2
在上面所述的实施例1中,使用了荧光标记的RNA探针。但是如图3所示,也可用DNA链132和RNA链133连在一起的DNA-RNA共聚物130。荧光标记的DNA-RNA共聚物探针130由二部分组成,即在末端或靠近末端有荧光标记110的4或5-mers的DNA寡聚物132和20至50-mers的RNA寡聚物133。核酸序列与靶DNA101互补。与靶DNA杂交的荧光标记的DNA-RNA共聚物130用核糖核酸酶H降解,此酶不降解DNA-DNA双链,只降解DNA-RNA双链,所以只有荧光标记的DNA-RNA共聚物探针130中的RNA链部分133被降解,形成片段寡聚物135,然后片段寡聚物135从靶DNA101上脱离下来。因为用荧光标记的缩短的DNA寡聚物132是4至5-mer,结合力不足以保持杂合体状态,因此寡聚物从样品(靶)DNA101上释放下来。之后如实施例1,杂交作用和降解作用重复进行,扩增缩短的、荧光标记的DNA寡聚物136的数量,靠此可以高灵敏度检测靶DNA101的存在。在本实施例中利用了荧光标记的DNA-RNA共聚物探针,此探针由4至5-mersDNA寡聚物和20至50-mersRNA寡聚物连在一起构成。降解产物具有荧光标记的DNA部分的长度。其优点是在电泳上分离和分析DNA时,荧光标记的DNA以高灵敏度在相等泳动距离上检测出来。使用具有DNA和RNA结合部分重复多次的结构形式的探针较好,此种探针将在下文解释。
实施例3
下面将解释利用由荧光标记的DNA-RNA的嵌段共聚物组成的探针的实施例,此探针有多个DNA和RNA部分重复出现。图4描绘了荧光标记的DNA-RNA嵌段共聚物探针131和靶DNA101反应过程的示意图。荧光标记的DNA-RNA嵌段共聚物探针131中的DNA部分132是用荧光团110标记的。DNA部分由7-mers组成,其中的用荧光团110标记,RNA部分133是5-mers,探针总长为65-mers。显而易见,DNA部分132的数量和长度与RNA部分133的数量和长度都可以被修饰。当荧光标记的DNA-RNA嵌段共聚物探针131加到样品中,探针与靶DNA101中的互补部分杂交。参考数字“134”代表“荧光标记的DNA-RNA嵌段共聚物探针处于杂交状态”,也就是说杂合体是由DNA-DNA和DNA-RNA杂交部分构成的,但是当核糖核酸酶H加到杂合体中,探针的RNA部分被降解成片段135,这些片段135随后从靶DNA101上释放下来,所以形成DNA部分132和靶DNA101杂交形式。然而,因为在图4所描绘的实施例中DNA部分132是7-mers,所以它与靶DNA101的结合力不足以保持其结合在靶DNA101上,故形成了5个荧光标记的DNA探针136并从一个这样的荧光标记的DNA-RNA嵌段共聚物探针131上释放下来。或者,如果荧光标记的DNA-RNA嵌段共聚物探针131中的DNA部分132的长度是长的,那么探针131被降解形成标记DNA探针,此探针不脱离靶DNA101。这样只有RNA部分133被完全降解。在图4显示的实施例中,荧光标记的DNA-RNA嵌段共聚物131与靶DNA101杂交并用核核糖酸酶H重新降解杂交产物。重复这一过程,缩短的标记DNA探针136的数量随着时间而增加。因为所有荧光标记的DNA部分132是7mers,所以当缩短的标记DNA探针136的拷贝数是靶DNA101拷贝数的5倍时,缩短的标记DNA探针是等长的。重复上面所述的过程n次形成的拷贝数量是5n。在这种情况下,用高度敏感的荧光计(能够检测<10-12mol/带)可以检测几百个拷贝数的样品DNA。而且利用本实施例荧光标记的DNA-RNA嵌段共聚物探针能够检测出DNA链上一至二个碱基的突变。如荧光标记的DNA-RNA共聚物探针和靶DNA形成的杂合体中存在非互补区,那么不互补的RNA部分不被核糖核酸酶H降解,因为它不和靶DNA形成双链。这样,片段部分包括没有配对的聚核苷酸以较长片段的形式释放下来。然后通过分析较长片段,可以获得有关突变位点的信息,这一方面适用于DNA(基团)诊断。
实施例4
本实施例是利用至少在其一端具有像颗粒或蛋白质这样大分子的探针的实施例。像本实施例的颗粒,可以由磁珠、聚苯乙烯颗粒、胶乳颗粒及其相似物制成;而像本实施例的蛋白质,可以由抗生蛋白链菌素,抗生物素蛋白及其共聚体制成。探针可以是实施例1,实施例2和实施例3所用的任何形式的荧光标记的RNA探针,这些探针至少有一端被固相化在像颗粒或蛋白质这样的大分子上。利用实施例2和实施例3所用的任何形式的探针,像颗粒或蛋白质这样的大分子及其相似物可能被固相化在RNA部分的末端。这样的探针被核糖核酸酶H降解,从固相化在颗粒(或蛋白质)上的部分释放用荧光及其相似物标记的部份。与样品DNA杂交的探针被核糖核酸酶H降解,然后含有荧光标记的部分从颗粒上释放下来。如果颗粒是磁珠,降解后颗粒可以用磁铁除去,这样含有荧光团的部分仍留在容器中。通过分析荧光,样品DNA可以很容易地检测出来。实施例2和实施例3所用的任何形式的探针的降解产物,通过制备相等长度的荧光标记的DNA部分,可以用电泳高灵敏度检测出来,当用有机珠和蛋白质代替磁珠时,用分子筛膜和凝胶分离后只分析带有标记荧光团的降解探针。
如上所述,已解释了实施例1至4。实施例2和4的探针可以设计成各种DNA长度,所以探针片段的长度很大程度上依赖于靶DNA,因此可以很容易地检测各种各样的靶DNA。
图5A至5D描绘了用于实施例5和6的探针结构。为了检测图5A至5D的标记,和实施例1至4一样可以由荧光团、染料、颗粒、化学发光物及其相似物制成。图5A至5D所显示的每个探针的基本功能是相同的。因此,下面将解释最简单的实施例和最复杂的实施例。
实施例5
本实施例是检测靶DNA的最简单的实施例,图6描绘了其利用图5所示探针的过程。如图6所示的本实施例所用探针在5′末端有荧光团1构成的荧光标记,在离5′末端第10个核酸上插入生物素标记2;总长度为40-mers。为了防止从3′末端降解,像荧光团这样的大分子3可能接到3′末端。对于DNA探针的荧光标记1,使用了FITC(荧光素异硫氰酸盐,发射波长525nm)含有样品DNA9的溶液中加入0.1pmol的DNA探针,总体积达到9μl,接着在95℃变性1分钟,然后65℃放置5分钟,再在37℃放置5分钟,经过这个过程,一部分DNA探针与样品DNA9中的靶DNA杂交。之后,加入1个单位的核酸外切酶Ⅲ10,保温10分钟,核酸外切酶Ⅲ具有从3′末端一个碱基接一个碱基降解双链的特性。将最后降解的探针部分5的双链DNA被快速降解,直至DNA被修饰成离5′末端约6-mers长为止,此时探针被修饰成缩短形式4并从样品DNA9上释放下来。之后,为了重复这样降解过程。另一个探针2与样品DNA9中的靶DNA部分杂交。
重复(n次)的结果,在5′末端有荧光标记长6-mers的DNA(缩短的探针4)的数量得以增加。这与用核酸外切酶Ⅲ降解DNA探针的反应和模板DNA做为催化剂是相当的。因此,形成缩短的探针4,探针4的数量比含有靶DNA的样品DNA9的数量大许多。为了从没有反应的探针中分离缩短的探针,可以利用探针在凝胶电泳上迁移速度不同的方法,但是这样的操作是繁琐的。在本实施例中利用磁珠来分离两种类型的探针。将温度升高至60℃或更高或者加入变性剂(如甲酰胺)来终止核酸外的切酶Ⅲ的降解作用,即在终止与互补链反应和降解反应后,连接了抗生物素蛋白12的磁珠8加入到反应液中使他们混合在一起,因为抗生物素蛋白12能与生物素2结合,具有生物素结合位点的没有反应的DNA探针和降解的DNA探针与磁珠8结合,之后利用电磁场通过例如磁铁13,与磁珠8结合的没有反应的DNA探针随降解的DNA探针一起除去,这样缩短的DNA探针保留在溶液中。用辐射光来激发荧光团,然后测量荧光发射来确定靶DNA的量。这种程序的测量极限与意外的单链DNA降解作用是否形成缩短的DNA探针有关。实际上单链DNA也被核酸外切酶10降解,但是较慢。单链DNA降解是从3′末端逐个消除核苷酸,即随着反应时间的推移,总长度被逐渐缩短。为了除去部分缩短的DNA探针。探针被设计成将具有生物素2的生物素标记位点尽可能也靠近(10个核酸以内)具有荧光标记1的荧光标记位点。因为从生物素标记位点到3′末端距离越长,核酸外切酶Ⅲ对单链DNA探针的降解率越低。
实施例6
如图7所示,实施例6是一个由在DNA探针中含有RNA部分6的DNA探针构成的实施例。如图7所示,在所用探针中,RNA部分6接到实施例5(图5D)的DNA探针的3′末端,探针DNA7具有5至7-mers互补序列,并进一步与3′末端结合,而3′末端通过一个接头与颗粒连在一起(在此使用了磁珠8做为颗粒)。因为探针3′末端用颗粒保护起来,单链状态的探针不能暴露出来而被核酸外切酶10降解。探针与样品DNA9中的靶DNA杂交后,变成双链,形成的RNA部分6首先被具有核糖核酸酶H活性的酶切开,当RNA部分6被降解并从样品DNA9上释放下来时,DNA的3′末端暴露出来,在核酸外切酶10存在的情况下,从3′末端降解探针DNA。接下来的反应与实施例5相同。通过接上RNA部分6,可以阻止单链DNA被核酸外切酶Ⅲ降解,同样,当RNA部分具有部分互补序列时RNA部分6可能最后被降解;但是当RNA部分不与靶DNA杂交时单链降解过程非常缓慢以致于DNA可能很难被缩短。即只有几乎完全杂交的部分被缩短的探针。当探针被修饰成缩短形式的缩短探针4并从样品DNA9中的靶DNA上释放下来时,如降解的DNA片段11,最后切除(降解)的探针5双链DNA被快速降解直至DNA长度被修饰成离5′末端的6个碱基为止,之后另一个DNA探针再杂交重复这样的降解作用,重复(n次)的结果增加了在5′末端具有荧光标记大约长6-mers的DNA(缩短探针4)的数量。接着以实施例5相同的方式终止重复反应,之后连接了抗生物素蛋白12的磁珠与溶液混合。因为抗生物素蛋白12能与生物素2结合,具有生物素位点的没有反应的DNA探针和降解的DNA探针与磁珠8结合,之后用电磁场通道例如磁铁13除去连有抗生物素蛋白12的磁珠8及磁珠8固相化在一起的没有反应的DNA探针和部分降解的DNA探针,这样缩短的DNA探针留在溶液中。用光照射留在容器中的荧光标记的缩短的DNA探针4,检测荧光发射从而确定靶DNA的量。如上所述,已经解释了使用图5和7所示的DNA探针的实施例,但即使使用图5B、5C和5D所示的DNA探针也产生与实施例5和6相同的结果。这样可以使用这样一个DNA结构即DNA7探针具有连到最后降解的探针部分5上的RNA探针部分6,在末端也具有像荧光团那样的大分子3,它与RNA部分6的3′方向连接(图5B)。在上述结构的DNA探针中,像荧光团那样的另一个大分子可以连到靠近RNA部分6最后降解的探针部分5中的位点上(图5C)。磁珠8可以固相化在DNA7探针末端(图5D)。通过设计这样结构的探针,可以阻止核酸外切酶10降解单链DNA的作用。进一步,利用具有像荧光和染料那样的发射颜色(发射波长)的多个探针可以同时检测多个靶DNA。更进一步,通过在DNA探针5′末端连上一个臂从而改变缩短反应后DNA探针分子重量和电泳速度,可以根据其电泳长度同时分离并检测多个靶DNA。在这种情况下,因为不可能含有通过不完全缩短反应形成的DNA探针,所以有利于精确分析。如果含有不完全缩短的DNA探针,他们的信号重叠,则光谱不能被分析。
Claims (38)
1、利用核酸探针检测核酸的方法,包括:
(a)核酸与样品杂交的步骤,
(b)用核糖核酸酶降解与样品杂交的核酸探针的步骤,
(c)为检测靶核酸而检测步骤(b)形成的降解产物的步骤。
2、根据权利要求1用核酸探针检测核酸的方法,其中核酸探针具有用荧光团或染料标记的标记位点。
3、根据权利要求2利用核酸探针检测核酸的方法,其中核酸探针包含RNA。
4、根据权利要求2利用核酸探针检测核酸的方法,其中核酸探针包含DNA-RNA共聚物并且在DNA部分具有标记位点。
5、根据权利要求2利用核酸探针检测核酸的方法,其中核酸探针含有一个RNA和DNA结合部分多次重复并且在每一个重复的DNA部分具有标记位点的结构。
6、根据权利要求3或4或5利用核酸探针检测核酸的方法,其中核酸探针至少在其一端具有与磁性颗粒固相化的颗粒固相化位点,并且具有能与颗粒固相化位点和标记位点之间的靶DNA杂交的RNA链。
7、根据权利要求1利用核酸探针检测核酸的方法所用的核苷酸探针,包括DNA-RNA共聚物或RNA。
8、根据权利要求2利用核酸探针检测核酸的方法所用的核苷酸探针,包括DNA-RNA共聚物和在DNA部份具有标记位点。
9、根据权利要求2利用核酸探针检测核酸的方法所用的核苷酸探针,包括DNA和RNA多个结合部分和在每个多次重复的DNA部份具有标记位点的结构。
10、根据权利要求7或8或9利用核酸探针检测核酸的方法所用的核酸探针,其中核酸探针具有至少固相化在一端的磁性的颗粒和可与颗粒固相化位点和标记位点之间的靶DNA杂交的RNA链。
11、根据权利要求2利用核酸探针检测核酸的方法所用的核苷酸探针,其中核酸探针由4至7个碱基的DNA和20至50个碱基的RNA组成共聚物并在DNA部分具有标记位点。
12、根据权利要求2利用核酸探针检测核酸的方法所用的核苷酸探针,含有与RNA结合的4至7个碱基的DNA部分多次重复并在每个多次重复的DNA部分具有标记位点的结构。
13、根据权利要求11或12的核酸探针,其中核酸探针具有至少在一端有固相化颗粒和可与颗粒固相化位点和标记位点之间的靶DNA杂交的RNA链。
14、利用核酸探针检测核酸的方法,包括:
(a)把核酸探针、样品和核糖核酸酶混合在一起的步骤,
(b)核酸探针与样品杂交的步骤,
(c)为缩短探针长度用核糖核酸酶降解与样品杂交的核酸探针的步骤,
(d)重复步骤(b)和(c)的步骤,
(e)终止步骤(c)的步骤,和
(f)为检测靶核酸而检测步骤(d)形成的降解产物的步骤。
15、根据权利要求14利用核酸探针检测核酸的方法,其中核糖核酸酶降解DNA-RNA杂合体中的RNA部分。
16、根据权利要求14利用核酸探针检测核酸的方法,其中核苷酸探针具有用荧光团或染料标记的标记位点。
17、根据权利要求14利用核酸探针检测核酸的方法,其中核苷酸探针包含RNA。
18、根据权利要求16利用核酸探针检测核酸的方法,其中核苷酸探针由DNA-RNA共聚物组成并在DNA部分具有标记位点。
19、根据权利要求16用核酸探针检测核酸的方法,其中核酸探针包含与RNA结合的DNA部分多次重复,并在每个多次重复的DNA部份具有标记位点的结构。
20、根据权利要求17或18或19利用核酸探针检测核酸的方法,其中核酸探针至少一端具有与磁性颗粒固相化的颗粒固相化位点和具有与位于颗粒固相化位点和标记位点之间的靶DNA杂交的RNA链。
21、利用核酸探针检测核酸的方法,包括
(a)包括DNA探针或RNA探针的核酸探针与靶DNA杂交的步骤,
(b)为缩短探针长度而降解与靶DNA杂交的核酸探针的步骤,
(c)终止步骤(b)反应的步骤,
(d)从反应液中除去完整或部分缩短的DNA或RNA探针的步骤。
22、根据权利要求21利用核酸探针检测核酸的方法,其中在步骤(b)中使用具有核酸外切酶活性的酶或具有核糖核酸酶H活性的酶或用此二种酶。
23、根据权利要求21利用核酸探针检测核酸的方法,其中步骤(d)中完整的或部分降解的核酸探针用电磁场除去。
24、根据权利要求21利用核酸探针检测核酸的方法,其中步骤(d)中完整的或部分降解的核酸探针用分子筛膜除去。
25、根据权利要求21利用核酸探针检测核酸的方法,其中核苷酸探针具有包含有检测标记的标记该点的第一条链部分,这一位点用于检测靶DNA的存在;并具有包含有分离标记的固相化位点的第二条链部分,这个位点用于检测从步骤(d)反应液中除去反应底物或反应产物,在步骤(b)核酸探针缩短反应期间第一条链部分和第二条链部分是彼此分开的。
26、根据权利要求25利用核酸探针检测核酸的方法,其中检测标记为任何荧光团、化学发光物、染料或颗粒。
27、根据权利要求25利用核酸探针检测核酸的方法,其中分离标记是生物素、磁珠或颗粒中的任何一种。
28、根据权利要求25利用核酸探针检测核酸的方法,其中核苷酸探针5′末端具有第一条链部分,在离5′末端至少6个碱基之内有检测标记,在离检测标记3′末端方向10个碱基之内有作为分离标记的生物素标记,核基酸探针3′末端具有5个或更多的碱基的DNA链。
29、根据权利要求25利用核酸探针检测核酸的方法,其中核苷酸探针5′末端具有第一条链部分,在离5′末端至少6个碱基之内有检测标记,在离检测标记3′末端方向10个碱基之内有作为分离标记的生物素标记,核酸探针3′末端具有5个或更多碱基的DNA链,还在DNA链和第一条链部分趋向于3′末端之间至少在一个位点有RNA链,3′末端被阻断来防止核酸外切酶的降解。
30、利用核酸探针检测核酸的方法。
(a)包含DNA或RNA探针的核酸探针与含有靶DNA的样品混合的步骤,
(b)核酸探针与靶DNA杂交的步骤,
(c)降解与靶DNA杂交的核酸探针来缩短探针长度的步骤,
(d)重复步骤(b)和(c)的步骤,
(e)终止步骤(d)反应的步骤,
(f)从步骤(d)反应液中除去完整的或部分缩短的DNA或RNA探针的步骤。
31、根据权利要求30利用核酸探针检测核酸的方法,其中在步骤(c)中使用具有核酸外切酶活性的酶或具有核糖核酸酶H活性的酶或用此二种酶。
32、根据权利要求30利用核酸探针检测核酸的方法,其中步骤(f)中完整的或部分降解的核酸探针用电磁场除去。
33、根据权利要求30利用核酸探针检测核酸的方法,其中步骤(f)中完整的或部分降解的核酸探针用分子筛膜除去。
34、根据权利要求30利用核酸探针检测核酸的方法,其中核苷酸探针具有包含检测标记的标记位点的第一条链部分,这一位点用于检测靶DNA的存在;并具有包含有分离标记的固相化位点的第二条链部分,这一位点用于检测从步骤(d)反应液中除去反应物和反应产物,在步骤(b)核酸探针缩短反应期间第一条链部分和第二条链部分是彼此分开的。
35、根据权利要求34利用核酸探针检测核酸的方法,其中检测标记是任何荧光团、化学发光物、染料或颗粒。
36、根据权利要求34利用核酸探针检测核酸的方法,其中分离标记是任何生物素、磁珠或颗粒。
37、根据权利要求34利用核酸探针检测核酸的方法,其中核苷酸探针5′末端具有第一条链部分,在离5′末端至少6个碱基之内有检测标记,在离检测标记3′末端方向10个碱基之内有作为分离标记的生物素标记,核酸探针3′末端具有5个或更多碱基的DNA链。
38、根据权利要求34利用核酸探针检测核酸的方法,其中核酸探针5′末端具有第一条链部分,在离5′末端至少6个碱基之内有检测标记,在离检测标记3′末端方向10个碱基之内有作为分离标记的生物素标记,核酸探针3′末端具有5个或更多碱基的DNA链,还在DNA链和第一条链部分趋向于3′末端之间至少在一个位点有RNA链,3′末端被阻断来防止核酸外切酶的降解。
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- 1993-12-09 CN CN 93120194 patent/CN1091831A/zh active Pending
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