JPH06327499A

JPH06327499A - 塩基配列検出方法

Info

Publication number: JPH06327499A
Application number: JP14274593A
Authority: JP
Inventors: Satoru Hase; 哲長谷; Masaomi Iwasaki; 匡臣岩崎; Harumi Masubuchi; 晴美増渕
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd; Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd; Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1993-05-21
Filing date: 1993-05-21
Publication date: 1994-11-29

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】本発明は、操作性、定量性、感度等に優れる塩
基配列の検出方法の提供を目的としている。【構成】ＤＭＳＯのような反応促進剤の存在下、標的配
列と２本鎖を形成したプローブＤＮＡをエクソヌクレア
ーゼＩＩＩの作用により３’側から分解させ、生成する
分解産物を検出することによる塩基配列検出方法。【効果】本発明は、標的配列の増幅、ならびに検出にお
いて次のような利点を持つ。１．温度制御が不要である２．反応が直線的で定量性や感度に優れる３．増幅時のコンタミネーションの影響を受けにくい４．プローブＤＮＡの合成が容易

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、試料中に存在する特
定の塩基配列（以下標的配列という）の検出方法に関す
るものである。プローブＤＮＡを用いた遺伝子診断法
は、遺伝的疾患や感染症の診断に有効である。検体中に
目的の遺伝子が存在するか否かを見るために、検体より
抽出した核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）と標識したプロ
ーブＤＮＡとを混合し、特異的にハイブリダイズした標
識体の量を測定することにより目的の遺伝子を検出する
事が行われている。

【０００２】

【従来技術の問題点】核酸塩基配列の相補性に基づく分
析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することができ
るため、遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には有力な
手段である。また遺伝子を検出対象とするために、培養
のような時間のかかる操作を省略できる場合も有る。し
かし、検体中に目的の遺伝子量が少ない場合の検出は容
易ではなく、標的遺伝子そのものあるいは検出シグナル
等を増幅することが必要となる。標的遺伝子を増幅する
方法のひとつにＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）
法が知られている。ＰＣＲ法はin vitroにおける核酸の
増幅技術としてもっとも一般的な方法であるが、次のよ
うな問題点が指摘されている。すなわち、実施のために
特別な温度調節装置が必要なこと、増幅反応が対数的に
進むことから定量性に問題があること、増幅した産物に
よるコンタミネーションが起こり易いこと等の問題点が
知られている。コンタミネーションとは以前の反応で生
じた増幅産物がつぎの反応液に誤って混入する事をい
い、ＰＣＲのようにＤＮＡを数百万倍にまで増幅させる
反応では混入した微量ＤＮＡも同様に増幅されるため誤
った結果を与える。これは特に多数の検体を同時に扱う
場合には重大な問題となる。

【０００３】他方、検出シグナルを増幅する方法として
はＱβレプリカーゼでシグナルＲＮＡを増幅する方法
（Bio/Technology,6,1197-1202(1988)P.M.Lizardieta
l.）が報告されている。しかしこの方法は増幅させる配
列をレプリカーゼが認識する配列内に挿入する必要があ
り、その立体構造上の制約から挿入の位置や配列が制限
される等の問題がある。これらの方法は検出対象となる
塩基配列を増幅するものであるが、以下に述べるような
分解産物を検出するシグナル増幅法も考案されている。
たとえば、標的核酸にオリゴプローブＤＮＡをハイブリ
ダイズさせた後制限酵素処理し、切断されたプローブ断
片を検出するシグナル増幅法が知られている（ＥＰ−０
４５５５１７／Ａ１）。この方法は検出感度も比較的良
く、定量性があり、特別な装置を必要としない等の利点
がある。しかし、この方法を遂行するにはプローブＤＮ
Ａ以外に反応が繰り返し起こるようにするための特異的
な配列を持つ第二のオリゴヌクレオチドを共存させる必
要がある。また検出する部位に制限酵素切断部位が必要
であるために検出部位が制限される等の欠点も持つ。

【０００４】そのほかに２本鎖ＤＮＡを特異的に切断す
るλエクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッセイ
法も開発されている（BioTechniques Vol.13,No.6(199
2)）。この方法は、オリゴヌクレオチドプローブが相補
的な配列とハイブリダイズして形成された２本鎖ＤＮＡ
にλエクソヌクレアーゼを作用させ、プローブＤＮＡが
２本鎖を維持出来ない程度まで分解されると新たなプロ
ーブＤＮＡと置き替わり、続いてこの新たなプローブも
分解されることによりサイクリング反応が起こるという
ものである。この分解産物を検出する事により特定のＤ
ＮＡ配列の有無を判定できる。この方法は原理がシンプ
ルであり、また検出部位の配列が制限されないという点
では制限酵素を用いる方法よりも有利である。しかしλ
エクソヌクレアーゼは、基質として５’末端がリン酸化
されたプローブＤＮＡを要求する。ＤＮＡ合成機を用い
てプローブＤＮＡを化学合成した場合５’末端はリン酸
化されておらず、そのため合成後改めて末端をリン酸化
する必要がある。しかし、５’末端が完全にリン酸化さ
れているのかどうかを確認することが難しいためプロー
ブ調製の再現性の点で問題が残る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、特殊な装置
が要求される複雑な温度制御によらず、シンプルな反応
系でコンタミネーションの影響を受け難い塩基配列の検
出技術の提供を目的としている。また本発明は、これら
の目的を達成するために検出対象となる塩基配列の制限
やプローブＤＮＡ合成時の付加的な作業等をともなわな
い、汎用性に優れる検出技術を提供するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、一本鎖ＤＮＡには作用せずハイブリダイズしたプロ
ーブＤＮＡのみを切断し、かつ塩基配列には限定されな
いヌクレアーゼ活性を利用したシグナル増幅法を開発
し、本発明を完成した。すなわち本発明は、次の工程Ａ
とＢを反応促進剤の存在下で繰り返すことによって産生
されるプローブＤＮＡ分解産物を検出することを特徴と
する塩基配列検出方法である。Ａ）標的ＤＮＡを含む検体に相補的なプローブＤＮＡを
ハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡを形成させる工程、Ｂ）Ａで形成された２本鎖ＤＮＡにエクソヌクレアーゼ
ＩＩＩ（以下ＥＸＯと省略する）を作用させてプローブ
ＤＮＡを３’側から分解する工程

【０００７】本発明において利用する標的ＤＮＡと相補
性を持つプローブＤＮＡは、核酸合成機を用いて化学的
に合成することができる。また微生物やＰＣＲ法を利用
して生物学的に増幅したＤＮＡをプローブＤＮＡとする
ことも可能である。本発明のプローブＤＮＡの鎖長は、
標的配列に対する特異性と反応時間等を考慮して約１０
〜１００の間で設定する。プローブＤＮＡの鎖長が短す
ぎると特異性やＥＸＯの作用で断片化されたものと分離
の点で問題を生じ易く、他方不必要に長いプローブＤＮ
Ａを用いるとＥＸＯによる分解に時間がかかり反応のサ
イクル数を減らす結果につながりかねない。標的配列と
ホモロジーの高い配列が検体中で共存しているというよ
うな特殊な条件でなければ、１５〜４０塩基程度の鎖長
とすれば十分な特異性で必要な反応サイクルを維持する
ことができる。本発明で用いるプローブＤＮＡは、たと
えば５’末端のリン酸化というような特殊な処理は不要
であるが、検出を容易にするためにあらかじめ標識して
おくとよい。標識には、一般に核酸の標識技術として知
られている方法を利用する。具体的には、ラジオアイソ
トープ、ビオチン、発光成分、蛍光成分、酵素、ハプテ
ン等を例示することができる。プローブＤＮＡは必ずし
も標識される必要はなく、たとえばＥＸＯの作用で分解
され反応系に蓄積する特定の鎖長の断片の増加を追跡す
れば塩基配列の検出は可能である。

【０００８】これらの標識はプローブＤＮＡの任意の位
置に導入することができるが、導入位置によって検出対
象が違ってくる。つまり３’側のＥＸＯの作用でモノヌ
クレオチドに分解される部分を標識したときには、モノ
ヌクレオチドが検出の対象となる。他方５’付近の短く
なって標的配列から外れる部分を標識したときには、プ
ローブＤＮＡの断片を検出する必要が有る。ＥＸＯの酵
素活性が標識によって立体障害を受ける可能性、またＥ
ＸＯの作用を受け２本鎖を維持できなくなって外れてく
るプローブ断片のみを確実に検出することを考慮すると
５’末端の標識が好ましい。

【０００９】プローブＤＮＡとしてアプリン酸、アピリ
ミジン酸等のアベイシック部位を含むものを使用した場
合は、ＥＸＯは上記の３’末端からの分解と共にこれら
の部位をエンドヌクレオテックに切断する。この特性を
利用すればプローブＤＮＡの分解が３’末端のみならず
複数位置で生じることになる。標識の検出にあたって
は、ＥＸＯの作用を受けていない完全長のプローブＤＮ
Ａに由来する標識の信号と、ハイブリダイズ〜ＥＸＯに
よる分解を受けた産物に由来する標識の信号とを区別す
る必要がある。もっとも単純な方法は、両者を分子量の
差に基づいて物理的に分離してしまう方法である。具体
的には、液体クロマトグラフィーや電気泳動等の手法が
応用できる。この他にもアポ酵素で標識しておきプロー
ブＤＮＡがＥＸＯの作用で短くなったときにだけ立体障
害が除去されて液相中のホロ酵素と複合化し酵素活性を
発現するというＣＥＤＩＡ法（Clinica Chimica Acta,
vol.185, 231-240 (1989)）等の検出系の応用も可能と
考えられる。その他、前記アベイシック部位を導入した
時にはアベイシック部位を挟んで特定の組み合せからな
る標識を結合させておけば更に簡便な分析系を構成する
ことができる。標識の組み合せとしては、発光−消光標
識の組み合せ、蛍光−偏光標識の組み合せ等を例示する
ことができる。このような標識の組み合せを利用すれ
ば、両者の物理的な距離の変化を信号の変化として追跡
することができるので、均一系での分析が可能となる。

【００１０】他方、本発明におけるＥＸＯは、ＥＸＯ活
性を持つものであればその由来は問わない。現在のとこ
ろ大腸菌由来のものが市販されているが、これに限定さ
れるものではなく、他の微生物やあるいは遺伝子組み換
えによって得られたものであっても利用することができ
る。

【００１１】つづいて標的配列とプローブＤＮＡのハイ
ブリダイズについて説明する。両者はハイブリダイズ可
能な条件下で接触させる。この時の条件は特に限定され
ないが、ＥＸＯの存在下で全ての反応を進行させること
に注意を向ける必要が有る。ＥＸＯはＰＣＲ法で用いら
れるＴａｑポリメラーゼのような高い耐熱性を持たない
ので、ＥＸＯの活性を維持できる条件を採用しなければ
ならない。また温度以外の緩衝液の選択やｐＨの設定等
も、ハイブリダイズのみならずＥＸＯの活性が十分に発
現できる条件を選択すべきである。具体的な条件を例示
すれば、緩衝液としてトリス−塩酸緩衝液等を用いたと
き、ｐＨは約７〜９とし、２０〜４５℃で反応を行わせ
る。特に好ましい条件としては、ｐＨ７．５〜８．５、
温度は３０〜４０℃を示すことができる。

【００１２】本発明においては、プローブＤＮＡの使用
量も反応の結果を左右する要素となる。すなわち、標的
配列に対してあまりにも少量のプローブＤＮＡしか存在
しない時には十分な感度を得られなくなるおそれがあ
る。標的配列の量をあらかじめ予想することは困難であ
るが、少なくとも希望する検出範囲の量に対して１０倍
を越える量を、好ましくは１００倍以上の大過剰量でプ
ローブＤＮＡを用いることが高い感度を確保するうえで
重要な条件となる。

【００１３】本発明による塩基配列の検出方法において
は、ハイブリダイズ〜ＥＸＯによる分解にいたる反応を
反応促進剤の存在下で行うことが必須条件である。本発
明における反応促進剤とは、標的配列とプローブＤＮＡ
とのハイブリダイズを促進ししかもＥＸＯの活性を阻害
しない化合物と定義することができる。好ましい反応促
進剤としては、ジメチルスルフォキシド（以下ＤＭＳＯ
と省略する）、エチレングリコール（以下ＥＧと省略す
る）、およびプロピレングリコール（以下ＰＧと省略す
る）等を示すことができる。これらの反応促進剤は、反
応液中で５〜５０%(W/V)、好ましくは１０〜３０%(W/V)
の濃度で用いる。

【００１４】なお、実施例で反応液に添加されている牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）はＥＸＯ蛋白質の安定化剤と
して用いるものであるのでＢＳＡ以外の蛋白であっても
よく、１０−５００／mlの濃度で使用すればよい。また
メルカプトエタノールは酸化防止剤として用いるもので
あるので、これ以外にジチオスレオトール（ＤＴＴ）等
も使用できる。

【００１５】以上のような本発明に必要な各種成分は、
あらかじめ組み合せた試薬の形で供給することができ
る。あらためて本発明による塩基配列検出用試薬の構成
を次に示す。以下に示す試薬には、更に標識の検出に必
要な資材や反応液を構成する緩衝剤、あるいは陰性や陽
性の対照等の任意の成分を組み合せてキットの形とする
こともできる。本発明による塩基配列検出用試薬の構成：・標的配列に相補的なプローブＤＮＡ・ＥＸＯ・反応促進剤

【００１６】次に本発明の反応原理を述べる。本発明に
よる反応は図１に示すようなサイクルで進行する。すな
わち、まずプローブＤＮＡが標的配列にハイブリダイズ
して２本鎖を形成する。このとき一般的には標的配列を
含むＤＮＡが、プローブＤＮＡの５’末端と３’末端の
方向につきでた構造となる。（もちろん標的配列がＤＮ
Ａの５’末端に位置している時には３’側のみがつきで
た構造となる。）ついでこの２本鎖となった部分の３’
側からＥＸＯによる分解が開始され、プローブＤＮＡが
モノヌクレオチドに分解される。ＥＸＯはＤＮＡの２本
鎖部分の３’末端からしか作用できないので、標的配列
を含むＤＮＡやハイブリダイズしていない遊離のプロー
ブＤＮＡはＥＸＯによる分解を受けない。ＥＸＯによる
プローブＤＮＡの分解が進行すると、標的配列とプロー
ブＤＮＡの間に形成された塩基対が減少し、やがて２本
鎖構造を維持できなくなってプローブＤＮＡが外れ標的
配列を含むＤＮＡはもとの１本鎖にもどる。こうして標
的配列を含むＤＮＡはもとの１本鎖となって新たなプロ
ーブＤＮＡとハイブリダイズし、他方ＥＸＯの作用で断
片化されたプローブＤＮＡが反応液中に遊離し蓄積され
るのである。この反応原理からわかるように、標的配列
はＤＮＡの３’末端に位置しないように設定しなければ
ならない。標的配列が３’末端に位置すると、プローブ
ＤＮＡと同様ＥＸＯの作用によって分解されてしまい以
降のハイブリダイズが不可能になってしまうためであ
る。

【００１７】本発明は特定の塩基配列が分析対象となる
ＤＮＡの中に存在するかどうかを高い精度と感度で検出
するための技術を提供する。本発明の分析対象は、動
物、植物、細菌、酵母、糸状菌、マイコプラズマ、リケ
ッチア、ウイルス他あらゆるものにおよぶ。またＤＮＡ
としては、ゲノミックＤＮＡはもちろん、ＲＮＡウイル
スやｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを分析対象とする
ことも可能である。

【００１８】

【作用】本発明におけるＥＸＯは、標的配列とハイブリ
ダイズしたプローブＤＮＡのみを特異的に加水分解する
作用を持つ。標的配列が存在しない時にはプローブＤＮ
Ａの分解は起こらず、またたとえ標的配列が存在してい
てもプローブＤＮＡがハイブリダイズしない限り加水分
解されることはない。ＥＸＯのこのような特性により、
本発明における反応液中に蓄積するプローブＤＮＡの分
解産物は直線的に増加し、定量性の高い分析が可能とな
るのである。本発明の反応促進剤は、標的配列とプロー
ブＤＮＡのハイブリダイズを促進する作用を持つ。本発
明は、この反応促進剤の存在によって迅速で定量性に優
れた反応系を提供することができるのである。以下、実
施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。

【００１９】

【実施例】

１．ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検出ＨＢＶ・ＤＮＡのＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子のＥＸＯによる
検出を試みた。ＥＸＯには大腸菌由来のものを、反応促
進剤にはＤＭＳＯ、ＥＧ、およびＰＧを、またプローブ
ＤＮＡには以下示す塩基配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成して用いた。塩基配列１：5'-AATGCCCCTATCTTATCAACACTTC-OH

【００２０】１−ａ．プローブＤＮＡの調整プローブＤＮＡに用いたオリゴヌクレオチドは、ホスホ
アミダイド法によりCyclone plus DNA synthesizer（Mi
lligen/Biosearch製、登録商標）にて合成した。合成し
たオリゴヌクレオチドはOligo-pakカートリッジカラム
（Milligen/Biosearch製、登録商標）により精製した。
得られたオリゴヌクレオチドは、γ-³²PATPとT4キナー
ゼを用いて５’末端を³²Pラベルした。ここで作成した3
2P標識オリゴヌクレオチドを未標識オリゴヌクレオチド
と混合し、以下の実験の³²P標識プローブＤＮＡとし
た。なお、検出はオートラジオグラムにより行うのでそ
の都合上 ³²P標識オリゴヌクレオチド量は一反応あたり
約１０４cpmになるように添加した。

【００２１】１−ｂ．標的配列の検出³² P標識したプローブＤＮＡを、標的配列となるＨＢＶ
・ＤＮＡを一部にもつＭ１３ファージＤＮＡと混合し、
実際に本発明による反応を行わせた。具体的な反応液の
組成は次に示すとおりである。反応液の組成：標的配列（Ｍ１３ファージＤＮＡ上にＨ
ＢＶ−ｅ抗原遺伝子領域を持つ１本鎖ＤＮＡ、１０fmo
l）³² P標識したプローブＤＮＡ、１pmol ５０mM Tris/HCl（ｐＨ８．０）５mM MgCl₂ １０mM ２メルカプトエタノール５０mM NaCl １００μg/ml牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）２０% ＤＭＳＯ（あるいはＥＧ、ＰＧ）この反応液を３７℃で１０分間プレインキュベート後、
ＥＸＯ５U（宝酒造製）を添加し３７℃で６０分間反応
させた。反応後１０μlの停止液を添加し、６５℃で５
分間処理して反応を停止させた。続いて１９%ポリアク
リルアミドゲル（７M尿素含有）で電気泳動し、オート
ラジオグラフィーにより断片化したプローブＤＮＡを検
出した。結果は図２に示した。停止液：８０ %ホルムアミド１５mM Tris/HCl （ｐＨ７．６）５mMＥＤＴＡ０．１%W/V ＢＰＢ（Bromophenol Blue）０．１%W/V ＸＣ−ＦＦ（Xylene Cyanol FF）

【００２２】図２から明らかなように、２０%のＤＭＳ
Ｏ、ＥＧ、或いはＰＧ存在下ではサイクリング反応が起
こり易くなる事が分かった（レーン４，６，８）。従っ
て、この条件下では鋳型となる標的配列の量以上のプロ
ーブＤＮＡが分解され、その結果シグナルの増幅が起こ
る事が明らかとなった。なお、同様の条件でハイブリダ
イズ促進剤として知られているラクトース、レハロー
ス、グルコース、サッカロース、マルトース、α-メチ
ル−Ｄ-グルコシド、硫化ジメチル、ジメチルスルホ
ン、硫酸ジメチル、アセトアミド、チオアセトアミド、
尿素、チオ尿素、ホルムアミド、アセトン、ポリエチレ
ングリコール、ポリビニルピロリドン、硫安、スペルミ
ジン、スペルミン、グリセリン、ジメチルホルムアミ
ド、デンハルト溶液（０．０２%フィコール、０．０２%
ポリビニルピロリドン、０．０１%ＢＳＡ）、フィコー
ルについての実験も行ったが、反応促進効果はほとんど
認められなかった。

【００２３】２．ＤＭＳＯの至適濃度１．と同じ条件でＤＭＳＯの濃度のみを１０〜５０%に
変えてＤＭＳＯの至適濃度を調査した。結果は図３に示
した。ＤＭＳＯの濃度が１０〜３０%では反応の進行が
認められるが、４０%以上では無添加のときと同様にほ
とんど反応が進行しなくなることが分かった。従って、
至適濃度は２０%程度であることが明らかとなった。
（レーン３）

【００２４】３．反応促進剤の作用反応促進剤の作用を確認するために次の実験を行った。
反応促進剤には２０%のＤＭＳＯ、ＥＧ、およびＰＧを
用い、その他の条件は１．にしたがった。なおハイブリ
ダイズしたＤＮＡを同時に検出するため、反応停止液を
添加後の６５℃で５分間の熱処理を除き、直接ポリアク
リルアミドゲルにて電気泳動をおこなった。

【００２５】３−ａ．標的配列を含むＭ１３ファージＤ
ＮＡと³²P標識プローブＤＮＡを混合し、６５℃で１０
分加熱後３７℃で１０分間アニール処理を行いハイブリ
ダイズさせた。続いてＥＸＯを添加し３７℃で６０分間
分解反応をおこなった。

【００２６】３ーｂ．始めにハイブリダイズしていたプ
ローブが分解された後、フリーとなった標的配列に新た
なプローブが再びハイブリダイズして起こるサイクリン
グ反応（図１の２ラウンド目以降の反応）を見るため、
３−ｂの実験を行った。標的配列を含むＭ１３ファージ
ＤＮＡと標識していないプローブＤＮＡとを混合し６５
℃１０分間加熱後３７℃で１０分間アニール処理を行い
ハイブリダイズさせた。続いてＥＸＯ、³²P標識プロー
ブＤＮＡを添加し、３７℃で６０分間分解反応をおこな
った。

【００２７】いずれの場合も分解反応の終了後に１．と
同じ様に反応液をオートラジオグラフィーにより分析し
た。結果を図４に示す。レーン１〜３が３−ａ．に、レ
ーン４〜６が３−ｂ．に対応している。なお図４にはＤ
ＭＳＯの結果しか示さないが、他の反応促進剤において
もほぼ同様の実験結果を得た。反応促進剤非存在下では
アニール処理によってハイブリダイズしていたプローブ
ＤＮＡは分解されるが（レーン２）、２ラウンド目以降
の３７℃でのハイブリダイゼーションと分解反応からな
るサイクリング反応が起こりにくいことがわかった（レ
ーン５）。

【００２８】３−ｃ（実験結果は示さない）．反応促進
剤の作用を確認するために単にハイブリダイズに対する
促進効果のみを調査した。実験として次に示す温度条件
で等量の32P標識プローブＤＮＡと標的配列のハイブリ
ダイズに及ぼす反応促進剤の影響を観察した。反応後は
１．と同様にオートラジオグラフィーにより分析した。
温度条件として次の３点を調べた。条件Ａ：煮沸２分／６５℃で１０分／３７℃で１０分条件Ｂ：６５℃で１０分／３７℃で１０分条件Ｃ：３７℃で１０分反応液はハイブリダイゼーションの効率のみを見るた
め、³²P標識プローブ５０fmol、標的配列を含むＭ１３
ファージＤＮＡ（５０fmol）を使用し、反応促進剤２０
%（ＤＭＳＯ、ＰＧ、またはＥＧ）を添加した。その他
の反応液の組成は実験１．と同様である。その結果、反
応促進剤が存在する場合はいずれの温度条件でも十分に
ハイブリダイズしていたが、反応促進剤が存在しない時
には温度条件にはかかわらずわずかのハイブリダイズし
か確認されなかった。特に条件Ｃ（３７℃で１０分）で
は反応促進剤が無ければ痕跡程度のハイブリダイズしか
観察されず、反応促進剤がハイブリダイズを促進してい
ることが明らかとなった。以上の実験により、一定温度
（３７℃）の条件下での標的配列とプローブＤＮＡのハ
イブリダイズの効率を添加剤が促進していることがわか
った。またＥＸＯに対しては少なくともプローブＤＮＡ
分解活性を阻害しないため、図１のサイクリング反応が
進行すると考えられる。

【００２９】４．ＤＭＳＯ存在下での検出感度１．と同じ操作で検出対象となるＤＮＡ量を０〜１pmol
に変化させて本発明による検出方法の感度を確認した。
結果を図５に示す。１０fmol程度のＤＮＡを検出可能な
ことが確認された。本発明による検出方法の感度がきわ
めて高いことがわかる。

【００３０】５．反応特異性本発明による検出方法の反応特異性を確認した。検出対
象として次のようなＤＮＡを用い、操作は１．にしたが
った。結果を図６に示す。検出対象としたＤＮＡ：・プローブＤＮＡと相補的な配列をもつＭ１３ファージ
環状１本鎖ＤＮＡ（レーン３）・プローブＤＮＡと同じ配列（方向性が同一であるため
相補的ではない）を持つＭ１３ファージ環状１本鎖ＤＮ
Ａ（レーン４）・挿入配列を持たないＭ１３ファージ１本鎖環状ＤＮＡ
（レーン５）・プローブＤＮＡと相補的な配列をもつＭ１３直鎖状Ｄ
ＮＡ（ＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子領域を持つＭ１３ＲＦ・Ｄ
ＮＡを制限酵素EcoRIで切断して直鎖状とし９５℃で加
熱処理して変性させたもの、レーン６）・対照として、プローブＤＮＡのみを泳動した（レーン
１）、・標的配列の無い状態でＥＸＯを反応させた（レーン
２）。図から明らかなように、プローブＤＮＡの分解は検出対
象となるＤＮＡが標的配列を含む場合にのみ観察され
（レーン３、６）、本発明による検出方法が特異的であ
ることが確認された。データは示さないが、この他にも
サケ精子ＤＮＡを対象とした場合にもプローブＤＮＡの
分解が起きないことを確認した。

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば、特別な温度制御操作を
することなく塩基配列の増幅と検出を行うことができる
ので自動化が容易である。また本発明による反応では、
生成物の増加が直線的に進むので標的核酸の定量性に優
れる。ＰＣＲ法では生成物が指数的に増加するため増幅
率には優れるものの反応条件を厳しく管理しても定量性
には限界があるが、本発明では反応条件の管理が容易な
うえ十分な定量性を維持することが可能である。本発明
の利点の一つに、コンタミネーションの影響を受け難い
ことがあげられる。すなわち本発明ではＥＸＯによって
分解したプローブを検出するので、たとえ増幅後の核酸
がコンタミネーションを起こしても増幅につながるおそ
れはない。ＰＣＲ法では誤って増幅された配列が新たな
鋳型として機能するため、特に反応初期のクロスコンタ
ミネーションは結果に重大な影響をおよぼす。このよう
な特性から見ても本発明の定量性が優れているというこ
とができる。更に本発明の付随的な効果として変異位置
の特定に応用可能なことがあげられる。標的核酸に変異
部位が存在する時は、プローブＤＮＡとのミスマッチの
位置でＥＸＯによる分解が起こりにくくなる。したがっ
て、分解後のプローブＤＮＡの長さを測定する事により
標的核酸上の変異の位置が限定出来得る。以上のように
この本発明による塩基配列の検出方法は種々の利点を有
するものであり、遺伝子の分析において有効な方法とな
ることが期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の反応原理を示す模式図である。

【図２】図２は本発明によるＨＢＶ−ｅ抗原遺伝子の検
出方法によって得られたオートラジオグラフィーの結果
を示す模式図である。レーン１，３，５，７：標的配列非存在下に反応させ
た。レーン２，４，６，８：標的配列（１０fmol）存在下
反応させた。レーン１，２：添加剤を加えない条件下反応させた。レーン３，４：添加剤としてＤＭＳＯ(20%)を加えて
反応させた。レーン５，６：添加剤としてＰＧ(20%)を加えて反応
させた。レーン７，８：添加剤としてＥＧ(20%)を加えて反応
させた。

【図３】図３はＤＭＳＯ濃度を変化させて至適濃度を調
査したオートラジオグラフィーの結果を示す模式図であ
る。レーン１：ＤＭＳＯを添加せず反応させた。レーン２：１０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。レーン３：２０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。レーン４：３０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。レーン５：４０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。レーン６：５０%ＤＭＳＯ存在下反応させた。

【図４】図４は、反応促進剤の作用を調査したオートラ
ジオグラフィーの結果を示す模式図である。レーン１〜
３が３−ａ．に、レーン４〜６が３−ｂ．に対応してい
る。レーン１，４：プローブＤＮＡのみ。レーン２，５：ＤＭＳＯを添加しない。レーン３，６：２０%ＤＭＳＯを添加した。レーン１，２，３：³²P標識プローブをはじめから添加
しＥＸＯ処理した。レーン４，５，６：未標識プローブをハイブリダイズさ
せた後、ＥＸＯと³²P標識プローブを添加した。

【図５】図５は標的配列の濃度を変化させて感度を調査
したオートラジオグラフィーの結果を示す模式図であ
る。レーン１：標的配列を含むＤＮＡを添加せず、反応させ
た。レーン２：標的配列を含むＤＮＡを１pmol添加し反応さ
せた。レーン３：標的配列を含むＤＮＡを１００fmol添加し反
応させた。レーン４：標的配列を含むＤＮＡを１０fmol添加し反応
させた。レーン５：標的配列を含むＤＮＡを１fmol添加し反応さ
せた。

【図６】図６は検出対象となるＤＮＡを変化させて特異
性を調査したオートラジオグラフィーの結果を示す模式
図である。レーン１：プローブＤＮＡのみ。レーン２：標的配列を含むＤＮＡを添加せず反応させ
た。レーン３：プローブＤＮＡと相補的な配列をもつＭ１３
ファージ環状１本鎖ＤＮＡ。レーン４：プローブＤＮＡと同じ配列（相補的ではな
い）をもつＭ１３ファージ環状１本鎖ＤＮＡ。レーン５：挿入配列を持たないＭ１３ファージ１本鎖環
状ＤＮＡ。レーン６：プローブＤＮＡと相補的な配列をもつ二本鎖
直鎖状のＤＮＡ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者増渕晴美栃木県大田原市下石上1381−３栄研化学株式会社免疫化学研究所内

Claims

【整理番号】Ｐ−０００２７７【特許請求の範囲】

【請求項１】次の工程ＡとＢを反応促進剤の存在下で繰
り返すことによって産生されるプローブＤＮＡ分解産物
を検出することを特徴とする塩基配列検出方法。Ａ）標的ＤＮＡを含む検体に相補的なプローブＤＮＡを
ハイブリダイズさせて２本鎖ＤＮＡを形成させる工程、Ｂ）Ａで形成された２本鎖ＤＮＡにエクソヌクレアーゼ
ＩＩＩを作用させてプローブＤＮＡを３’側から分解す
る工程
【請求項２】プローブＤＮＡを予想される標的ＤＮＡの
量に対して過剰量で用いることを特徴とする請求項１の
塩基配列検出方法。
【請求項３】反応促進剤が、ジメチルスルフォキシド、
エチレングリコール、およびプロピレングリコールから
なる群から選ばれる請求項１の塩基配列検出方法。
【請求項４】標的ＤＮＡに相補的なプローブＤＮＡの
５’末端が標識されていることを特徴とする請求項１の
塩基配列検出方法。
【請求項５】標的ＤＮＡが逆転写酵素によってＲＮＡか
ら誘導されたｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１
の塩基配列検出方法。
【請求項６】標的ＤＮＡに相補的なプローブＤＮＡ、エ
クソヌクレアーゼＩＩＩ、および反応促進剤とで構成さ
れることを特徴とする塩基配列検出用試薬。
【請求項７】反応促進剤が、ジメチルスルフォキシド、
エチレングリコール、およびプロピレングリコールから
なる群から選ばれる請求項６の塩基配列検出用試薬。