CN100487432C

CN100487432C - 采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法

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Publication number: CN100487432C
Application number: CNB2006100279975A
Authority: CN
Inventors: 王剑; 刘建华
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2006-06-22
Filing date: 2006-06-22
Publication date: 2009-05-13
Anticipated expiration: 2026-06-22
Also published as: CN1865934A

Abstract

本发明涉及一种采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法，利用核糖核酸酶H分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链的特性，根据含有1个或以上核糖核苷酸的核酸链水解情况确定被检测目标分子DNA的特性和含量。首先针对要检测的核酸分子序列设计嵌合分子信标，其环区域核苷酸序列与被测序列互补配对，且中间含有1个或几个核糖核苷酸。针对单链DNA，双链DNA，RNA等不同种类的被测样品，制备单链DNA以用作检测模板，将待检测样品放入核酸酶H反应混合液中混合，置于荧光检测仪于37℃温浴，实时检测反应溶液的荧光强度，根据荧光值可以指示被检测核酸分子的含量及其特性。

Description

采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法

技术领域

本发明涉及一种采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法，可对核酸(DNA、RNA)信号进行恒温放大和检测，属于基因定性和定量检测领域。

背景技术

DNA检测技术包括核酸杂交、序列测定和多聚酶链式反应(PCR)扩增等。核酸杂交技术包括RNA杂交(Northern Blot)和DNA杂交(Southern Blot)。前者用于RNA测定，后者用于DNA测定。这两种测定技术都是基于碱基配对原则，需要使用特殊基团标记核酸探针，如放射性同位素、荧光或其它可测定的基团。杂交反应后需要进行分离，以消除没有参与杂交的核酸，操作复杂。PCR扩增检测是利用耐高温的DNA聚合酶进行的聚合酶延伸反应，需要循环进行DNA变性、退火和DNA延伸，产物必须分离鉴定。DNA序列测定就更为繁琐，检测条件要求更高。恒温进行的、不需要分离就可以检测DNA的技术是核酸检测领域的发展方向。

分子信标(molecular beacon)为DNA的恒温检测提供了可能[Tan，W.，X.Fang，J.Li，and X.Liu.Molecular beacons：a novel DNA probe for nucleic acid andprotein studies.Chemistry 2000.6(7)：1107-1111.]。分子信标是一种短的寡核苷酸单链构成的茎环结构。寡核苷酸链一端为荧光基团标记，另一端为淬灭基团标记。由于两端的核苷酸序列互补，其荧光基团和淬灭基团相互靠近发生能量共振，被激发后荧光基团产生的光子被淬灭基团淬灭。如果被检测的核酸分子能够与分子信标的单链环区域杂交，分子信标的茎结构遭到破坏，增加了荧光基团与淬灭基团之间的空间距离，不能产生荧光能量共振转移，就能够检测被激发后荧光基团产生的荧光信号。但是在整个检测过程中，荧光信号的强弱依赖于被检测的DNA分子的含量，不存在信号放大，因此直接用分子信标杂交目标核酸的检测技术，其灵敏度不理想。

核糖核酸酶H(RNase H)是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。在分子生物学，生物技术领域有着广泛的运用。传统运用核酸酶H分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链特性的方法如RNA片断的释放、凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)都存在同位素标记、耗时、劳动量大等缺点。J.Rizzo等人在2002年首次运用分子信标方法来检测核酸酶H的动力学和酶切机制[J.Rizzo，L.K.Gifford，X.Zhang，A.M.Gewirtz and P.Lu(2002).Chimeric

molecular beacon assay for ribonuclease H activity.Molecular andCellular Probes16，277-283]。但是目前为止未有任何文献和专利报导关于核糖核酸酶H结合分子信标来检测核酸分子的含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法，该方法能在恒温条件下(37℃)进行核酸信号放大、定性定量检测，检测方便，灵敏度高，特异性强。

为实现这一目的，本发明利用核糖核酸酶H分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链的特性，根据含有1个或1个以上核糖核苷酸的核酸链水解情况确定被检测目标分子DNA的特性和含量。首先针对要检测的核酸分子序列，设计嵌合分子信标，其环区域的核苷酸序列与被测序列互补配对，且中间含有一个或几个核糖核苷酸。根据被检测样品种类不同如单链DNA，双链DNA，RNA等，制备成单链DNA以用作检测模板。将待检测的样品放入100微升核糖核酸酶H反应混合液中混合，置于荧光检测仪于37℃温浴25分钟，实时检测反应溶液的荧光强度，根据荧光值可以指示被检测核酸分子的含量及其特性。

本发明方法的具体步骤如下：

1、分子信标的设计和合成：

根据被检测核酸分子的序列设计嵌合分子信标，其环区域的核苷酸序列能够与被检测核酸的序列互补配对，其序列中间有1个或几个核糖核苷酸。分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，且5—9对序列为互补配对。

2、被检测DNA样品的制备：

针对不同种类的被测样品制备检测模板。1)若被检测样品是单链DNA，例如M13类噬菌体DNA，则可以直接用于检测。2)若被检测样品是双链DNA，则要用碱变性、热变性等方法使双链DNA解链成单链DNA，如乙型肝炎病毒(HBV)基因组、人类基因组DNA等。3)若被检测样品是RNA，如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、病毒RNA或其它RNA分子，则先用反转录酶将RNA分子反转录成单链cDNA，cDNA可以在除去RNA后进行检测，也可以直接用于检测。

3、核糖核酸酶H酶切反应：

在100微升含有10ul 1x核糖核酸酶H缓冲液的反应混合液中，加入100皮摩尔量的分子信标，再加入3—5微升被检测的单链DNA分子，混合后置于实时定量PCR仪、荧光计、或荧光扫描仪等荧光检测仪，于37℃温浴，温浴时间是20分钟—3小时，实时检测反应溶液的荧光强度，每隔2—3分钟读荧光值一次。其中所述1x核糖核酸酶H缓冲液的组分为：10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，50毫摩尔氯化钠，5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔β—巯基乙醇，10微克每毫升小牛血清蛋白，10个活力单位的衣原体核糖核酸酶H，pH 8.0。

4、荧光数值分析：

根据荧光数值与被检测核酸分子含量的线性关系，得到被检测样品的核酸分子含量，并且针对不同水平的被检测样品，根据不同的荧光值反映出不同的特性而进行定性分析。

本发明的原理为分子信标单链区含有1个或1个以上的核糖核苷酸，能够与被检测DNA杂交配对。杂交后的分子信标被核糖核酸酶H类酶活性裂解，产生分子信标半分子。分子信标半分子与被检测样品DNA结合力弱，发生解离。被检测样品DNA又能够与溶液中游离的分子信标结合，进入新一轮的核糖核酸酶H酶切，产生恒温循环信号放大。在这个反应中，(1)被检测样品DNA没有改变，只是作为分子信标水解的指导序列；(2)分子信标的裂解反应依赖于RNA-DNA杂合双链，因此没有与被检测样品DNA结合的游离分子信标不受影响；(3)每轮反应的结果是与被检测样品DNA摩尔量相当的分子信标发生水解，使分子信标半分子产量以被检测样品DNA摩尔量增加，对被检测样品DNA信号进行线性扩增；(4)分子信标的5’-和3’-半分子构成的DNA双链很短，不稳定，在特定温度下5’-半分子和3’-半分子解离，被激发的荧光基团产生的荧光信号可被检测。

本发明在恒温条件下对被检测核酸分子进行定性、定量分析，具有显著的有益效果：第一，对被检测核酸分子进行线性的荧光信号放大，克服了PCR对被检测样品指数信号放大所引起的偏差；第二，特异性高，核糖核酸酶H酶切体系中不需要引物，克服了PCR引物非特异性扩增的缺点；第三，操作简便，检测是在恒温条件下进行，不需要温度循环变化。

附图说明

图1为本发明嵌合体分子信标的核糖核酸酶H酶切反应检测核酸的原理图。

图2为单链DNA浓度测定实例中分子信标释放的荧光信号与寡核苷酸目标序列浓度的对应关系。

图3为HBV基因组拷贝数测定实施例中分子信标释放的荧光信号与HBVDNA含量的对应关系。

图4为大肠杆菌β-半乳糖苷酶表达受异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后mRNA浓度测定实例中分子信标释放的荧光信号与mRNA含量的对应关系。

图5为人染色体数目测定实例中分子信标释放的荧光信号对21号染色体和X染色体在男女性别的差异关系。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本发明的限定。

图1是本发明的原理图。如图1所示，嵌合体分子信标与被检测样品DNA杂交配对，核糖核酸酶H能够酶切嵌合体分子信标，产生分子信标半分子。半分子与被检测样品DNA所形成的双链不稳定，发生解离。游离的被检测样品DNA又与分子信标结合，进入下一轮反应。如此循环，导致核酸信号放大。

实施例1 单链DNA浓度测定

1、分子信标的设计和合成：

根据被检测核酸分子寡核苷酸序列的序列为5’—dTTGATATCGAATTCCTGCAGC—3’，设计嵌合分子信标，其环区域的核苷酸序列则为5’—dGCTGCAGGAArUTCGATATCAA—3’，能够与被检测核酸的序列(dTTGATATCGAATTCCTGCAGC)互补配对，其序列中间含有1个核糖核苷酸rU。分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团如FAM和荧光淬灭基团DABCYL标记，且6对序列为互补配对形成茎结构，如5’(6-FAM)-dCGGGCT和dAGCCCG-(DABCYL)3’。分子信标序列为5’(6-FAM)-dCGGGCTGCTGCAGGAArUTCGATATCAAAGCCCG-3’

2、被检测DNA样品的制备：

被检测样品是单链DNA，可以直接用分光光度计粗步定量，用于检测。

3、核糖核酸酶H酶切反应：

在6管100微升反应混合液中含有10ul 1x核糖核酸酶H缓冲液[10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，50毫摩尔氯化钠，5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔β—巯基乙醇，10微克每毫升小牛血清蛋白，10个活力单位的衣原体核糖核酸酶H，pH 8.0]，100皮摩尔量的分子信标，再每管各加入5000法摩尔、2500法摩尔、1250法摩尔、625法摩尔、312法摩尔、0法摩尔被检测的单链DNA分子至6管反应混合液中各自混合，置于荧光扫描仪于37℃温浴25分钟，实时检测反应溶液的荧光强度。

4、荧光数值分析：

分子信标释放的荧光信号与寡核苷酸目标序列浓度的对应关系如图2所示，其中，分子信标释放的荧光信号取决于寡核苷酸目标序列的浓度。图2中，(A)图是用不同浓度(5000法摩尔、2500法摩尔、1250法摩尔、625法摩尔、312法摩尔、0法摩尔)的被检测单链寡核苷酸指导分子信标降解的时间过程；(B)图表明了在37℃反应第25分钟，分子信标降解所释放的荧光信号强度与反应溶液中的被检测DNA含量呈线性关系。第25分钟所取的荧光值能线性反映被检测DNA的含量，荧光值(Y)与被检测DNA含量(X)的斜率为Y＝0.3681X+0.0605，方差R²＝0.9918。

实施例2 双链DNA浓度测定

1、分子信标的设计和合成：

根据被检测核酸分子为HBV基因组复制必需SP I基因的核酸序列5’-dCTGTCCTTGAGTATTTGGTGT-3’(nt2241-2261)序列，设计嵌合分子信标，其环区域的核苷酸序列则为5’—dACACCAAATArCTCAAGGACAG—3’，能够与被检测核酸的序列(dCTGTCCTTGAGTATTTGGTGT)互补配对，其序列中间含有1个核糖核苷酸rC。分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团如FAM和荧光淬灭基团DABCYL标记，且6对序列为互补配对形成茎结构，如5’(6-FAM)-dCGGGCT和dAGCCCG—(DABCYL)3’。分子信标序列为5’(6-FAM)-dCGGGCTACACCAAATArCTCAAGGACAGAGCCCG-3’。

2、被检测DNA样品的制备：

被检测样品是双链DNA，先要用碱变性、热变性等方法使双链DNA解链成单链DNA，再用分光光度计粗步定量，用于检测。

3、核糖核酸酶H酶切反应：

在7管100微升反应混合液中含有10ul 1x核糖核酸酶H缓冲液[10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，50毫摩尔氯化钠，5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔β—巯基乙醇，10微克每毫升小牛血清蛋白，10个活力单位的衣原体核糖核酸酶H，pH 8.0]，100皮摩尔量的分子信标，再每管加入1000法摩尔、500法摩尔、250法摩尔、125法摩尔、62法摩尔、31法摩尔、0法摩尔被检测的单链DNA分子至7管反应混合液中各自混合，置于荧光扫描仪于37℃温浴40分钟，实时检测反应溶液的荧光强度。

4、荧光数值分析：

本实施例中分子信标释放的荧光信号与HBV DNA含量的对应关系如图3所示，图3中，(A)图是用不同梯度浓度(1000法摩尔、500法摩尔、250法摩尔、125法摩尔、62法摩尔、31法摩尔、0法摩尔)的HBV DNA指导分子信标降解的时间过程；(B)图表明了在37℃反应第25分钟，分子信标所释放的荧光信号强度与HBV DNA含量呈线性关系。第25分钟所取的荧光值能线性反映被检测DNA的含量，荧光值(Y)与被检测DNA含量(X)的斜率为Y＝5.0077X+0.1329，方差R²＝0.9928。

以上实施例1、2证明，本发明采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法，可以根据实时检测的反应溶液的荧光值，确定被检测目标分子DNA的含量。

实施例3 mRNA浓度测定

1、分子信标的设计和合成：

根据被检测核酸分子为大肠杆菌lacZ的核酸序列5’-dAGCGGTCAAAACAGGCGGCAG-3’(nt321-341)序列，设计嵌合分子信标，其环区域的核苷酸序列则为5’—dCTGCCGCCTGrTTTTGACCGCT—3’，能够与被检测核酸的序列(dAGCGGTCAAAACAGGCGGCAG)互补配对，其序列中间含有1个核糖核苷酸rT。分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团如FAM和荧光淬灭基团DABCYL标记，且6对序列为互补配对形成茎结构，如5’(6-FAM)-dCGGGCT和dAGCCCG—(DABCYL)3’。分子信标序列为5’(6-FAM)-dCGGGCT CTGCCGCCTGrTTTTGACCGCT AGCCCG-3’。

2、被检测DNA样品的制备：

被检测样品是mRNA，大肠杆菌β-半乳糖苷酶受IPTG诱导表达，其mRNA水平可以用这种分子信标测定。在LB液体培养基中培养大肠杆菌DY328。A组用IPTG诱导，B组无IPTG诱导。当大肠杆菌在液体培养基中生长到A_600mm＝0.5时，离心收集细菌。并用商品的RNA抽提试剂盒抽提大肠杆菌总RNA。用随机序列的寡核苷酸引物反转录，100ul反应混合物中含有大肠杆菌总RNA 3ug，1x反转录缓冲液，dNTP各0.5mM，10pM随机引物，10 unit RNasin，10 unitM-MLV反转录酶。于37℃反应60分钟。柱层析除去没有参与的脱氧核糖核苷三磷酸，回收cDNA，并溶于100ul水，用碱变性、热变性等方法使双链DNA解链成单链DNA，再用分光光度计粗步定量，用于检测。

3、核糖核酸酶H酶切反应：

在2管100微升反应混合液中含有10ul 1x核糖核酸酶H缓冲液[10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，50毫摩尔氯化钠，5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔β—巯基乙醇，10微克每毫升小牛血清蛋白，10个活力单位的衣原体核糖核酸酶H，pH8.0]，100皮摩尔量的分子信标，再每管5微升被检测的单链DNA分子(A管为受IPTG诱导过的，B管为未受IPTG诱导过的)至2管反应混合液中各自混合，置于荧光扫描仪于37℃温浴25分钟，实时检测反应溶液的荧光强度，并实时检测反应系统所产生的荧光信号强度。

4、荧光数值分析：

图4为本实施例中分子信标释放的荧光信号与mRNA含量的对应关系。图4中，(A)图是不同培养基中培养的大肠杆菌总RNA反转录成cDNA后，指导分子信标降解的时间过程；(B)图表明了在37℃反应第25分钟，受IPTG诱导和未受IPTG诱导的样品分子信标所释放的荧光信号不同。第25分钟所取的荧光值能线性反映被检测DNA的含量，A组样品与分子信标所释放的荧光值为17.23，反映出样品DNA含量为339法摩尔，而B组样品与分子信标所释放的荧光值为1.836，反映出样品DNA含量为18法摩尔，其结果荧光值高的A组反映出A组为受IPTG诱导组，荧光值低的B组反映出B组为未受IPTG诱导组，因此针对不同水平的被检测样品，根据不同的荧光值反映出不同的特性从而进行定性分析。

实施例4 染色体数目测定

染色体异常会导致严重的遗传疾病。其中21号三体患者智力低下，丧失学习和工作能力，给社会和家庭造成严重负担。因此，产前诊断确定胚胎是否21号染色体三体是非常必要的。采用细胞培养、荧光原位杂交技术(FISH)而无法诊断。本技术进行的恒温信号放大技术属于信号线性放大(而PCR属于指数放大)，对于细微的差别，能够更为准确定量，适合于染色体三体诊断。例如21号染色体三体诊断。

1、分子信标的设计和合成：

根据被检测核酸分子为21号染色体特有的单拷贝基因—淀粉状蛋白基因(AP)的核酸序列5’-dTGATGCCCTTCTCGTTCCTGA-3’(nt372-392)，设计嵌合分子信标₂₁，其环区域的核苷酸序列则为5’—dTGATGCCCTTrCTCGTTCCTGA—3’，能够与被检测核酸的序列(dTGATGCCCTTCTCGTTCCTGA)互补配对，其序列中间含有1个核糖核苷酸rC。分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团如FAM和荧光淬灭基团DABCYL标记，且6对序列为互补配对形成茎结构，如5’(6-FAM)-dCGGGCT和dAGCCCG—(DABCYL)3’。分子信标₂₁序列为5’(6-FAM)-dCGGGCTTGATGCCCTTrCTCGTTCCTGAAGCCCG-3’。

根据被检测核酸分子为x号染色体DMD基因特异核酸序列5’-dCTATGTAATACAGAATCTTTC-3’(nt1571-1591)，设计嵌合分子信标₂₁，其环区域的核苷酸序列则为5’-dGAAAGATTCTrGTATTACATAG-3’，能够与被检测核酸的序列(dCTATGTAATACAGAATCTTTC)互补配对，其序列中间含有1个核糖核苷酸rG。分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团如HEX和荧光淬灭基团DABCYL标记，且6对序列为互补配对形成茎结构，如5’(6-HEX)-dCGGGCT和dAGCCCG—(DABCYL)3’。分子信标₂₁序列为5’(6-HEX)-dGAAAGATTCTrGTATTACATAG AGCCCG-3’。

2、被检测DNA样品的制备：

用基因组抽提试剂盒分别从正常男性人群和正常女性人群血液样品中抽提基因组DNA，因被检测样品是双链DNA，先要用碱变性，热变性等方法使双链DNA解链成单链DNA，再用分光光度计粗步定量，用于检测。

3、核糖核酸酶H酶切反应：

在2管100微升反应混合液中含有10ul 1x核糖核酸酶H缓冲液[10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，50毫摩尔氯化钠，5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔β—巯基乙醇，10微克每毫升小牛血清蛋白，10个活力单位的衣原体核糖核酸酶H，pH 8.0]，各加入100皮摩尔量的分子信标₂₁，分子信标x，再加入每管男性血样5微升被检测的单链DNA分子(A管为分子信标₂₁，B管为分子信标x)至2管反应混合液中各自混合，被检测的单链DNA分子至2管反应混合液中各自混合，置于荧光扫描仪于37℃温浴150分钟，实时检测反应溶液的荧光强度。

在2管100微升反应混合液中含有10ul 1x核糖核酸酶H缓冲液[10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，pH 8.0，50毫摩尔氯化钠，5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔β—巯基乙醇，10微克每毫升小牛血清蛋白，10个活力单位的衣原体核糖核酸酶H]，各加入100皮摩尔量的分子信标₂₁，分子信标x，再加入每管女性血样5微升被检测的单链DNA分子(A管为分子信标₂₁，B管为分子信标x)至2管反应混合液中各自混合，被检测的单链DNA分子至2管反应混合液中各自混合，置于荧光扫描仪于37℃温浴150分钟，实时检测反应溶液的荧光强度。

4、荧光数值分析：

图5为本实施例中分子信标释放的荧光信号对21号染色体和X染色体在男女性别的差异关系。图5中，(A)图表明了正常男性人群基因组的21号染色体指导分子信标₂₁裂解的水平是其X染色体指导分子信标_x裂解的水平的两倍左右(在20分钟至30分钟之间)；(B)图表明了正常女性人群基因组的21号染色体指导分子信标₂₁裂解的水平与其X染色体指导分子信标x裂解的水平相当。第25分钟所取的荧光值能线性反映被检测DNA的含量，对于不同水平的被检测样品，根据分子信标₂₁和分子信标_x的荧光值比例不同，从而进行定性分析，以此判断被检测的样品是男性还是女性。

用这两种分子信标同时检测21号染色体和X染色体数目，根据两者之间的比例，确定染色体是否异常。适合于染色体三体诊断，例如21号染色体三体诊断。

以上实施例3、4进一步证明，本发明的方法可以根据实时检测的反应溶液的荧光值，确定被检测目标分子DNA的含量，同时可以针对不同水平的被检测样品，根据不同的荧光值反映出不同的特性从而进行定性分析。

Claims

1、一种采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)分子信标的设计和合成：根据被检测核酸分子的序列设计嵌合分子信标，分子信标的环区域的核苷酸序列能够与被检测核酸的序列互补配对，其序列中间有1个或几个核糖核苷酸；分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，且分子信标的茎结构中5—9对序列为互补配对；

2)被检测DNA样品的制备：针对不同种类的被测样品制备检测模板，若被检测样品是单链DNA，则直接用于检测；若被检测样品是双链DNA，则采用变性方法使双链DNA解链成单链DNA；若被检测样品是RNA，则先用反转录酶将RNA分子反转录成单链cDNA，再将单链cDNA除去RNA后进行检测或直接将单链cDNA用于检测；

3)核糖核酸酶H酶切反应：在100微升含有10ul1x核糖核酸酶H缓冲液的反应混合液中，加入100皮摩尔量的分子信标，再加入3—5微升被检测的单链DNA分子，混合后置于荧光检测仪，于37℃温浴20分钟～3小时，实时检测反应溶液的荧光强度，每隔2—3分钟读荧光值一次；其中所述1x核糖核酸酶H缓冲液的组分为：10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸，50毫摩尔氯化钠，5毫摩尔氯化镁，1毫摩尔β一巯基乙醇，10微克每毫升小牛血清蛋白，10个活力单位的衣原体核糖核酸酶H，pH8.0；

4)荧光数值分析：根据荧光数值与被检测核酸分子含量的线性关系，得到被检测样品的核酸分子含量；并且针对不同水平的被检测样品，根据不同的荧光值反映出不同的特性而进行定性分析。