CN1274847A

CN1274847A - 标记信号放大探针的制备方法

Info

Publication number: CN1274847A
Application number: CN 00116306
Authority: CN
Inventors: 缪晓辉; 孔宪涛; 戚中田
Original assignee: Shanghai Changzheng Hospital
Current assignee: Shanghai Changzheng Hospital
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2000-11-29

Abstract

一种标记信号放大探针的制备方法,步骤包括:“探针－引物”的设计与合成,“探针”由16～30个核苷酸(nt)组成,位于5′端;“引物”位于3′端,长为16～30nt;“探针”和“引物”由“连接臂”连接;“探针－引物”作上游引物,以一种基因为模板,与下游引物一起作聚合酶链反应,获得一端为单链,其余部分为双链的DNA片段,且通过PCR,在双链中掺入标记物,获得标记信号放大探针。利用该放大探针可建立各种基因的体外杂交检测技术。本发明制备方法简单、易行,信号放大倍数可在一定范围内调整。用于检测乙肝病毒基因组,灵敏度高、特异性强、操作简便、省时、省材,实用性很强。

Description

标记信号放大探针的制备方法

本发明涉及病毒基因检测技术领域，具体地讲是涉及一种标记信号放大探针的制备方法，制得的放大探针能使杂交信号放大，从而提高检测灵敏度，可用于各种核酸分子杂交检测。

八十年代末期，美国Chiron公司的研究人员Horn、Urdea和Hendricks等(Horn T and Urdea MS：Nucleic Acid Res 1989；17：6959，Urdea MS，Running JA，Horn T，et al；Gene 1987；61：253，Hendricks DA，Stowe BJ，HooBS，et al：Am J Clin Pathol 1995；104：537)建立了一种以多组化学合成的寡核苷酸探针为基本成份的病毒基因固相分子杂交定量分析技术。在他们的定量分析系统中，“分枝链DNA信号放大探针”是一个关键性成份，因该探针的分子结构呈疏齿状或树枝状，故其定量分析系统被称为“分枝链DNA技术(branched DNA，bDNA)”。bDNA技术是目前公认的较为完善的病毒基因分析方法，其操作方便，敏感度高，重复性好。但该技术的缺陷在于信号放大探针制备方式上难度较大且过于繁琐。如首先要合成一定长度主链寡核苷酸，再合成较短的分枝链寡核苷酸；然后将两种寡核苷酸以不同浓度和固定方向，用T4连接酶在一定条件下连为一体，最后采用分子筛技术或高效液相技术分离、纯化连接物，以去除未连接的主链或枝链寡核苷酸，以及主链上枝链连接数过少的分子成份。另外，这种信号放大探针上不含有标记物，必须另设一组与枝链互补的标记探针。如图1所示的Urdea等的分枝DNA放大探针示意图，这个如电视接受天线的结构，是由寡核苷酸组成的。中间的“主轴”的功能是：一端携带信号分子，携带的信号分子数决定放大的倍数；另一端为单链，可与目的基因互补，进而与目的基因连接。

目前在临床上用于基因检测的技术分为两大类，即杂交法和PCR法。前者不放大被检测的目的基因，因此敏感度比较低，但特异性比较强；后者通过数十万乃至数百万倍地扩大被检测基因，因此灵敏度很高，但也因此产生了产物污染、假阳性率高、技术要求高等问题。目前的现状是两大技术共存，视需要而选用。bDNA技术属于传统的杂交技术，如斑点杂交法，但它与斑点杂交法相比有两大进步：第一，整个杂交过程，或称检测过程不是在膜上进行，而是在微量反应板上操作，因此要比膜斑点杂交简单得多；第二，它使用了一种放大探针，这种放大探针可以把检测的基因信号放大，不放大基因本身，因而在灵敏度比传统的膜斑点杂交法提高的同时，特异性不下降。目前国内已有数个医疗机构引进该技术于临床检测，可惜检测费用很高，难以在国内推广。如前所述，bDNA技术的关键成分，是一种信号放大探针。这种信号放大探针的制备方法尚处于保密状态，未曾公开。

本发明的目的是提供一种标记信号放大探针的制备方法，它采用一种设计的引物，利用PCR技术制备一种易于控制放大倍数、含有标记物的信号放大探针。

本发明标记信号放大探针的制备方法的关键技术是设计并合成一种特殊的“探针-引物”分子，利用该分子与另一根引物及相应模板一起进行PCR，可以扩增一段部分单链的DNA片段，且在PCR过程中掺入标记物。该制备方法包括下列步骤：

一、“探针—引物”的设计与合成

“探针—引物”是本发明的最关键成分，利用这个成分就可以制备成一种特殊的核酸结构。这种核酸的一头是单链的，但比较短，仅16～30个核苷酸，另一头是双链的，长度可设计成500～1000bp。

“探针—引物”由三部分组成：“探针”部分长16～30个核苷酸(nt)，位于5′端，与夹心杂交定量分析系统中的第二夹心探针的一段互补。在制备信号放大探针时，这段“探针”不因为PCR的过程而成为双链结构，保持单链状态，借此，信号放大探针可与被检测基因连接；“引物”部分位于3′端，亦由16～30nt组成，在制备放大探针的过程中，充当上游或下游引物，在选定模板之后可与另一根引物一起作PCR。“探针”和“引物”之间由称之为连接臂(Spacer)的任何化学物质连接，例如由1～3个-CH₂-CH₂-OH-结构连接。“探针—引物”被连接臂连成了一体，不可分离。在下面步骤利用PCR法制备信号放大探针过程中，“探针—引物”实际上只充当了一根引物。“探针—引物”采用化学方法合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或高效液相纯化。

二、PCR模板的选择与制备

用于制备放大探针的模板，取自于任何一段一定长度的DNA片段。选择原则是：避免与待检测的目的基因(如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒基因)序列同源或近源。如有同源，信号放大探针被用于基因检测时，有可能因为与同源部分形成三链结合而影响特异性。本发明分别选择了蚊虫基因库DNA及各种质粒DNA作为模板，并据此模板确定引物的序列，其中一个序列构成“探针-引物”中的“引物”部分。

三、标记信号放大探针的制备

采用PCR掺入法：以“探针—引物”充当上游引物，以蚊虫基因库DNA或质粒DNA为模板，与另一条下游引物一起作聚合酶链反应(即PCR)。底物dNTP中dATP为2/3用量，余1/3为生物素标记的dUTP(Biotin-16-dUTP)。经过一定循环数的PCR之后，Biotin-16-dUTP被掺入到双链DNA部分。在每一个PCR循环，下游引物链向3′延伸时将终止在互补链上“探针—引物”的引物与连接臂的交界处，因此得到的产物是一种部分单链的含生物素的DNA分子，该分子的结构示意图见图2，它是按实施例1制得的生物素标记放大探针，图中Spaser是由3个-CH₂-CH₂-OH-组成的连接臂，Bio是生物素，通过PCR扩增掺入DNA双链中。

四、标记信号放大探针的纯化与鉴定

上述PCR过程所得到的产物不纯，必须去除杂物，尤其是要去除在PCR过程中尚未被完全消耗的“探针—引物”，否则会干扰以后的基因检测过程(降低灵敏度)。纯化的产物必须进行鉴定，目的是证实四个问题：第一，分子大小是否与设计相符；第二，是否为部分单链；第三，生物素是否的确被有效地掺入到双链DNA分子中；第四，有否实际使用价值，即能否与被检测基因结合，并能起到放大信号的作用。

(一)纯化方法采用柱抽提法纯化；

(二)鉴定方法 (1)琼脂糖凝胶电泳；(2)膜斑点杂交；(3)S1核酸酶消化试验。(4)利用信号放大探针检测乙型肝炎病毒基因。

利用标记信号放大探针可建立或开发各种基因检测技术，在膜或微孔板上作杂交反应以检测各种基因，包括各种病原体、肿瘤以及各种生物体基因组，均可采用标记信号放大探针，实现信号检测、信号放大、提高灵敏度。利用标记信号放大探针在微反应板上进行酶联杂交定性和定量，检测病原体基因，例如HBV基因(质粒HBV DNA)和乙型肝炎病人的血清标本(见实施例2和3)，证实了生物素标记信号放大探针的实用价值。

本发明的优点：与bDNA系统的信号放大探针及传统的标记探针相比，本发明有以下优点：第一，信号放大探针的制备工艺十分简便易行。合成一对特殊引物，选择合适模板，一次PCR及对PCR产物作常规纯化后即可完成探针制备；第二，探针的放大倍数可在一定范围内任意调整。由于该放大探针的放大倍数是由探针的双链DNA长度及标记物的掺入数决定的，因此在一定范围内，双链DNA越长，放大倍数越大；如长度固定，还可以通过掺入两种标记核苷使放大效率倍增；第三，探针制备过程的可选择性较大：①变换下游引物，即可按需要制备不同长度的探针。②可选择各种DNA或者cDNA(如质粒DNA、各种基因cDNA等)作为模板，设计特异性引物，扩增放大探针。③放大探针上的单链部分，是真正的互补探针结合位置，该部分的核苷酸序列和长度可按需要来设计，从而能保证探针的特异性以及选择合适的杂交温度；第四，信号放大探针在制备过程中掺入标记物(包括各种同位素、生物素、地高辛、荧光以及其它任何标记物)，因而在检测系统中无须另设一组标记探针，简化了检测步骤；第五，目前实验室常用的标记探针多为双链DNA，且无放大特性。本探针不仅具备放大效果，而且在杂交结合部分为单链结构，杂交反应前无需变性解链；第六，由于制备简单，而且可按需要随时制备，因此非常经济。

下面结合附图和实施例作进一步的阐述，但并不限止本发明的范围。

附图说明

图1是Urdea等的分枝DNA放大探针示意图。

图2是本发明生物素标记信号放大探针示意图。

图3是生物素标记信号放大探针电泳图。

泳道1和5：DNA分子量标志；

泳道2：双链520 DNA；

泳道3：未标记含部分单链520 DNA；

泳道4：生物素标记的信号放大探针。

图4是微孔酶联夹心杂交检测示意图。

A(Pa)：捕获探针，21nt，5’-端氨标记；

B(Pb10)：第一组夹心探针，10套，

3’-端(20nt)与捕获探针互补，

5’-端(21nt)与HBV DNA结合

C(Pc15)：第二组夹心探针，15套，

3’-端(20nt)与放大探针互补，

5’-端(21nt)与HBV DNA结合

D(Pd)：生物素标记信号放大探针。

图5是酶联杂交定量检测标准曲线图。

实施例1.制备生物素标记信号放大探针

一、“探针—引物”(Psp)的设计与合成

“探针—引物”由三部分组成：探针部分长20个核苷酸(nt)，位于5′端，与夹心杂交定量分析系统中的第二夹心探针的一段互补；引物部分位于3′端，亦由18nt组成，在制备放大探针的过程中，充当上游或下游引物，与蚊虫基因库DNA(500bp片段)退火。“探针”和“引物”之间由称之为连接臂的3个-CH₂-CH₂-OH-结构连接，“探针—引物”的序列用电子计算机软件HYBsimulator Version 4.0设计，采用化学方法合成(由上海生工生物工程公司提供服务)，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相纯化。

二、模板制备

选择蚊虫基因库DNA作为原始模板，设计一对特异性引物：上游引物Pmu，长度为21nt；下游引物Pmd，长度为28nt(由上海生工生物工程公司合成)，用PCR法扩增出一段长为500bp的DNA片段。

反应体系配方：

成份加样量(μl)

10×缓冲液 5

15mmol/L MgCl₂ 5

dNTP混合液(各10mmol/L) 2

Pmu(25μmol/L) 1

Pmd(25μmol/L) 1

蚊虫基因cDNA(μg/L) 1

Taq DNA聚合酶(1u/μl) 1

双蒸馏水 34

PCR扩增参数：94℃，5分钟后94℃，1分钟；52℃，45秒钟；72℃，1分钟。共35个循环，再72℃延伸5分钟。

将上述PCR产物用DNA抽提柱纯化，去除引物等。纯化物用紫外分光光度计法定量，所得纯品用作制备放大探针的模板，命名为MDNA500。

三、生物素标记信号放大探针的制备、纯化和鉴定

(一)制备采用PCR掺入法。上游引物(即“探针-引物”)Psp，下游引物为Pmd。

反应体系配方如下：

成份加样量(μl)

10×缓冲液 10

15mmol/L MgCl2 10

2mmol/L dATP 1.3

2mmol/L dCTP 2

2mmol/L dTTP 2

Biotin-16-dUTP(50nmol/50μl) 5

Psp(25μmol/L) 1

Pmd(25μmol/L) 1

MDNA500(1μg/L) 1

Taq DNA聚合酶(1u/μl) 1

双蒸馏水 13.7

为产物鉴定，另设一对照管，配方内不含生物素Biotin-16-dUTP，四种dNTP浓度均等，其余同上。

PCR扩增参数：94℃，1分钟；54℃，45秒；72℃，1分钟；共40个循环，再72℃延伸5分钟。

(二)纯化将上述PCR产物上样于1.5％琼脂糖凝胶，电泳并用溴化乙锭染色后，切取550bp左右处光亮带的凝胶，再用DNA纯化柱分离胶内DNA。纯品经定量后用稀释液(含1％BSA，1mg/ml鲑鱼精DNA，2×SSC)作适当稀释，-20℃保存。

(三)鉴定

1.琼脂糖凝胶电泳将等量模板(MDNA500)、对照管产物及放大探针作琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为2％，溴化乙锭染色后发现，模板MDNA500泳动速度最快，对照产物(未标记生物素)次之，生物素标记放大探针最慢(图3)，与推测的结果一致。这一鉴定结果说明经过PCR的过程已经获得了与预期片段大小一致的产物。

2.膜斑点杂交将放大探针纯品、对照产物及模板(阴性对照)点样于硝酸纤维膜，经烘干、预杂交后，将膜置于稀释后的链亲和素-碱性磷酸酶复合物中，经温育和漂洗之后，用不溶性底物显色。结果，在放大探针的点样位置显现清晰的蓝色，对照管产物和模板均为极淡蓝色。这一步骤说明，PCR扩增后所得到的放大探针已经按预期掺入了生物素Biotin-16-dUTP。

3.微反应板酶联杂交

(1)设计和合成连接探针：该探针为50nt寡核酸，5′端30nt与HBV DNAS区基因的负链互补，3′端的20nt与信号放大探针的5′端单链部分互补。采用化学法合成，PAGE纯化。

(2)酶联杂交检测：步骤如下：①adr株HBV DNA稀释于DNA结合缓冲液(1mmol/L KH₂PO₄，1mol/L MgCl₂)，经100℃热变性解链10分钟，立即冰浴，然后包被于聚丙乙稀微孔反应板，每孔加样50μl，置4℃过夜；②用包被液洗两次，加杂交液缓冲液(50％甲酰胺，5×SSC，1％FPG，25mmol/L磷酸钾，25μg/ml小牛胸腺DNA，5％硫酸葡聚糖，0.2％SDS)，50℃预杂交1小时；③弃预杂交液，加连接探针(经杂交液稀释，浓度为20nmol/L)，置62℃杂交45分钟；④弃杂交液，并用洗涤液洗两遍后加入标记信号放大探针，浓度为5nmol/L(仍用杂交液洗释)，50℃温育30分钟；⑤洗涤后加亲和素-碱性磷酸酶复合物(用酶复合物稀释液作1∶1000稀释)，置37℃，18分钟；⑥用碱性磷酸酶底物pNPP显色。

另外设置了两种阴性对照孔：(1)不加连接探针。(2)S1核酸酶消化处理(取1μg纯化的标记信号放大探针，加入S1核酸酶1u，37℃温育30分钟，通过本步骤可将信号放大探针5′端的单链DNA，即连接探针的5′端互补部分消化掉)后的放大探针。阳性和阴性对照组均设三个复孔，计算其平均OD值。结果，阳性孔OD值为0.631；两个阴性对照组的平均OD值分别为0.274，0.291；零孔OD值为0.227，S/N比值分别为：8.59，5.77。

这一过程说明，标记信号放大探针可以与被检测的目的基因互补结合，因此具备了探针应有的两大共性，即：特异互补结合和携带信号物质。

上述鉴定结果证实生物素标记信号放大探针符合设计要求。

实施例2 微反应板酶联夹心杂交定量检测乙型肝炎病毒基因组(质粒HBV DNA)

一、主要材料

(一)HBV DNA质粒：pADR-1 DNA，由adr型HBV全基因经BamHI酶切后克隆至pBR322载体。质粒由第二军医大学分子生物学教研室胡为江博士惠赠。

(二)高分子量DNA定量标准品：Gibco-BRL产品。

(三)链亲和素-碱性磷酸酶复合物(Sav-Ap)：Gibco-BRL产品。

(四)微量条排反应板(DNA-BIND^TM)：条排板孔表面带有NOS基团，可与氨基化学结合，Corning Costar公司生产。

(五)ELISA放大系统：适用于AP系统，Gibco-BRL产品。

(六)生物素化信号放大探针(Pd)：本室制备。

(七)酶联杂交检测用缓冲液及配方：①结合缓冲液(Bb)：50mmol/LNa₂HPO₄，1mmoL/L EDTA，0.02％NaN₃，pH8.5。②20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L枸缘酸钠。③2×杂交缓冲液：10×SSC，0.2％ N-lauroyl-sarcosine，0.1mg/ml鲑鱼精DNA，0.05％NaN₃，2.0％ BSA，0.04％ SDS。④马来酸盐缓冲液：0.1mol/L顺丁稀二酸，0.15mol/L NaCl，pH7.5。⑤Sav-Ap缓冲液：马来酸盐缓冲液中含3％BSA，0.05％吐温-20，0.02％ NaN₃。⑥洗涤液I：2×SSC，含0.1％SDS。⑦洗涤液II：马来酸盐缓冲液中含0.05％吐温-20。⑧AP底物(pNPP)缓冲液：30mmol/L三乙醇胺，1mmol/L MgCl₂。

二、制备HBV DNA标准品

(一)HBV DNA质粒扩增和纯化按常规进行扩增，采用柱分离加酚氯仿抽提法纯化。

(二)质粒鉴定和定量采用琼脂糖凝胶电泳与定量标准品对比法及紫外分光光度计法。纯化质粒用BamH I酶切使之成线性。

三、探针设计与合成

(一)捕获探针(Pa) 由21个核苷酸(nt)组成，Tm＝68℃，5′端用氨基修饰。序列如下。

5′-amine-C₁₂-GCACA TGCTG CTGAC CTGCG A-3′

(二)夹心探针根据HBV基因组较为保守的S和C区基因的负链序列，利用寡核苷酸设计软件(HYBsimulator Version 4.0)，设计了两组夹心探针。第一组夹心探针(Pb10)：共10套(长度均为41nt)，每套探针3′端方向21nt序列与捕获探针互补，5′端方向20nt序列与HBV DNA的S或C区负链特定区域互补；第二组夹心探针(Pc15)：共15套(均为42nt)，5′端方向的20nt与HBV负链互补，3′端方向的20nt与放大探针的5′端单链区互补。上述探针由北京赛百盛生物工程公司合成。两组探针的序列分列如下：

第一组夹心探针：

1、5’-ACCCAGGTGGCCAGATTCATTCGCAGGTCAGCAGCATGTGC-3’

2、5’-TTGTACAGACTTGGCCCCCATCGCAGGTCAGCAGCATGTGC-3’

3、5’-CAGAGCTGAGGCGGTGTCAATCGCAGGTCAGCAGCATGTGC-3’

4、5’-TGCGAATCCACACTCCAAAATCGCAGGTCAGCAGCATGTGC-3’

5、5’-TAGGGGCATTTGGTGGTCTGTCGCAGGTCAGCAGCATGTGC-3’

6、5’-TGCCTCGTCGTCTAACAACATCGCAGGTCAGCAGCATGTGC-3’

7、5’-GGTTGGTGAGTGATTGGAGGTCGCAGGTCAGCAGCATGTGC-3’

8、5’-ACGCCGCAGACACATCCTAAACGCAGGTCAGCAGCATGTGC-3’

9、5’-CCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCGCAGGTCAGCAGCATGTGC-3’

10、5’-CAAAGCCCAAAAGACCCACATCGCAGGTCAGCAGCATGTGC-3’

第二组夹心探针：

1、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGCAGCGGTATGGTGAGGTGAGCA-3’

2、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGCACGAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3’

3、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGTCGAGAAACGGACTGAGGCCCA-3’

4、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGACCTTCCTGACTGCCGATTGGT-3’

5、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGGGCGCTCCTACCTGATTTGCCT-3’

6、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGTGTGAATGTGAGGAAAGGAGGG-3’

7、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGACTCAACAAGAAAAACCCCGCC-3’

8、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGGCGAGGACAAACGGGCAACATA-3’

9、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGCGGCCCTACGAACCACTGAACA-3’

10、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGCGAGCAGCAGGATGAAGAGGAA-3’

11、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGGTAGGCACAGCTTGGAGGCTTG-3’

12、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGAGCCTGGATGCTGGGTCTTCCA-3’

13、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGCAGTGTTCTCCATGTTCGGTGC-3’

14、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGCACCACCACGAGTCTAGACTCT-3’

15、5’-ACTACTGACAATCTGAACTGATAGGAATCGTGCAGGTCTTGC-3’

四、杂交定量(见图4)

(一)捕获探针与第一夹心探针在反应板外杂交取等摩尔数Pa和Pb10，置于1.5ml Eppendorf管，加入20×SSC和双蒸馏水，使SSC终浓度为8×。于58℃杂交1hr.，然后用乙醇沉淀，沉淀物用Bb溶解，命名为Pab，分装后-40℃保存。

(二)包被用Bb稀释Pab成一定浓度，加入微反应板，50μl/孔；置37℃，1hr.，或4℃过夜；弃去包被物，用Bb洗板两次，或在移去包被物后加入100μl 50％甘油，再弃之，用封孔膜封闭反应板，置4℃备用，使用前以Bb充分洗去孔内甘油。

(三)夹心杂交双蒸水或TE稀释HBV DNA标准品至一定浓度，100℃解链10min.，与已用2×杂交液稀释的Pc15等体积(各25μl)加入反应孔内；封孔后置55℃，2.5hr.，或过夜；然后弃杂交反应物，用洗涤液I洗三次，第一次立即甩干。后两次加洗液后置55℃，5min.，再弃洗涤液，拍干。

(四)放大探针与第二夹心探针杂交：用1×杂交液稀释Pd至3pmol/L，每孔加50μl，置板于52℃，30min.，然后用洗液I洗三次，每次52℃，5min.。

五、信号检测

用Sav-AP缓冲液按1∶1000稀释Sav-AP(链亲和素-碱性磷酸酶)复合物，然后取50μl加入反应孔，置37℃，20min；用洗涤液II洗四次，每次3min.，拍干后加50μl AP底物(pNPP)，置37℃2hr.后直接读取405nm OD值；或加50μl ELISA放大底物，置室温15min.，加50μl显色液，再置室温15min后加50μl2mol/LH₂SO₄终止反应，读492nm OD值。

六、定量范围、灵敏度及标准曲线

由标准曲线可见(图5)，本方法定量检测HBV DNA的范围为20pg-20ng/ml，但灵敏度可达到2pg/ml。

七、特异性和精确度分析

分别将1ng/ml pBR322载体、pGEM载体、HCV cDNA及及蚊虫cDNA解链后进行杂交反应，均未检出阳性信号；一份取自慢性HBV感染者血清标本(用竞争PCR法检测，HBV DNA含量为1000pg/ml)，在3个月内，我们对该标本进行了9次酶联夹心杂交检测，求得CV值为12.33％。同一份标本同时作10个反应孔，得CV值为7.81％。

上述结果表明，以生物素标记信号放大探针为基础建立的微反应板酶联杂交技术可用于定量检测乙型肝炎病毒基因组。

实施例3.微反应板酶联夹心杂交检测病人血清中的乙型肝炎病毒基因组

一、主要材料

(一)血清标本：共收集了100份HBsAg、HBeAg、抗HBcAg均阳性(即所谓“大三阳”)的血清标本，其中45份取自血透患者，40份取自慢性乙型肝炎患者，15份来自原发性肝癌患者。标本分别由长征医院血液净化中心，长征医院感染科，长征医学科学公司肝炎免疫车间及东方肝胆外科医院检验科提供。上述所有标本均PCR定性技术检测证实乙型肝炎病毒基因(HBV DNA)阳性。

(二)血清裂解用试剂及血清DNA抽提试剂：蛋白酶K，Merck公司产品；裂解缓冲液：10mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，1.0％SDS。

二、血清标本处理

采用经典的酚氯仿抽提法：在0.5mlEppendorf管内，加入100μl待测血清及100μl裂解液(含2mg/ml蛋白酶K)，置于65℃ 1小时，或37℃过夜。加酚-氯仿200μl，混匀后离心12000rpm，10min.，将上清移入另一0.5mlEppendorf管，加入等体积氯仿-异戊醇，混匀后离心12000rpm，5min.。再将上清移入一洁净的1.5ml Eppendorf管，加入2.5倍体积冷无水乙醇及1μl 3mmol/L三氯醋酸钠，置-20℃，10min.。4℃离心12000rpm，10min.。沉淀用80％冷乙醇洗一遍后抽干，加TE(pH8.0)溶解，TE量与乙醇沉淀前的体积相同。

三、微反应板酶联夹心杂交定量检测

所用材料及检测方法与实施例2相同，但检测标本是经处理的病人血清。结果：100份PCR法HBV DNA阳性的血清标本，用本杂交法检测，有57份阳性，阳性率为57％。其中乙型肝炎病人标本阳性率为65％(26/40)，血透病人标本为51.1％(23/45)，肝癌病人标本为53.3％(8/15)。

本实施结果说明，以生物素标记信号放大探针为基础建立的微反应板酶联杂交技术可用于定量检测病人血清中的乙型肝炎病毒基因组。因此具有临床应用价值。

Claims

1、一种标记信号放大探针的制备方法，其特征在于该制备方法包括下列步骤：

一、“探针—引物”的设计 “探针—引物”由三部分组成：“探针”部分由16～30个核苷酸组成，位于5′端；“引物”部分位于3′端，长为16～30核苷酸；“探针”和“引物”之间由化学物质的连接臂连接；

二、PCR模板的选择与制备

选择与待检测目的基因序列不同源或不近源的基因或基因组为模板，并据此模板确定引物的序列；

三、标记信号放大探针的制备

以“探针—引物”充当上游引物，以选择的基因或基因组为模板，与下游引物一起作聚合酶链反应获得一端为单链，其余部分为双链的DNA片段，且通过PCR的过程，在双链中掺入标记物，即制得标记信号放大探针。

2、按权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述“探针”和“引物”之间的连接臂是1-3个-CH₂-CH₂-OH-结构。

3、按权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述“探针”和“引物”之间的连接臂是3个-CH₂-CH₂-OH-结构。

4、按权利要求1所述的制备方法，其特征在于是选择蚊虫基因库DNA为模板。

5、按权利要求1所述的制备方法，其特征在于制得的标记信号放大探针中双链DNA片段长度为500-1000bP。

6、按权利要求1所述的制备方法，其特征在于在双链中掺入的标记物包括同位素、生物素、地高辛、荧光。

7、按权利要求6所述的制备方法，其特征在于在双链中掺入的标记物是生物素Biotin-16-dUTP。