CN108645825A - 酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法 - Google Patents

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Abstract

酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，是利用核酸适配体的特异性识别能力和酶切循环放大策略构建了一种可以快速检测土霉素的核酸适配体荧光传感器；当土霉素不存在时，SGI插入双链结构中，体系得到很高的荧光强度；而当体系中存在土霉素时，目标物会并破坏双链结构，体系荧光强度下降；通过测定加入目标物前后体系荧光强度变化，可以实现对土霉素的定性和定量检测；另外，在体系中加入核酸外切酶Exo I可以形成酶切循环放大的功效；本方法的建立包括以下步骤：建立SGI与双链核酸荧光体系；建立核酸适配体传感器荧光检测方法；测定所建立的核酸适配体传感器对土霉素的选择性；运用所建立的核酸适配体传感器测定实际牛奶样品中的土霉素。

Description

酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法
技术领域
酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
四环素发现在20世纪中叶，无论是在医学还是在兽药领域都占有十分重要的地位。而土霉素作为四环素类抗生素的一种，同样是十分出色的广谱抗菌抗生素。因此，土霉素经常被添加在牲畜家禽的饲料中，用于预防各种动物传染病和促进生长。四环素类抗生素在低剂量下可以在短时间内通过代谢排出体外，但如果剂量过高就会蓄积在动物体内。若长时间摄入土霉素残留过高的动物源食品会对人体的骨骼和脏器造成损害，如过敏、毒性效应、耐药性等等。因此动物源性食品中的土霉素残留检测一直是监管的重点。
关于土霉素残料的常规检测方法有很多种，其中最主要、常见的是色谱法。包括高效液相色谱法(HPLC)，液相色谱质谱联用法，气相色谱法等等。尽管这些方法有很好的准确性和再现性，但样品处理过程过于繁琐复杂、所需的仪器设备也十分昂贵。另外，酶联免疫分析法(ELISAs)也是检测土霉素的常用方法之一。其原理在于将抗原或抗体固定在固相载体上并与某种酶结合，形成酶标抗原或抗体后与受检测物进行反应，最后通过染色观察目标物在底物中含量。然而，酶联免疫法的背景吸收强，底物和酶需要长时间的反应以及多次清洗步骤、复杂费时，反应容易受到环境的影响和样品基质的干扰。因此，开发一种更加简洁有效、灵敏度高、选择性强的土霉素检测技术十分有必要。适配体一种通过SELEX技术特殊筛选的寡糖核苷酸序列，一般有几十个碱基构成，可以明确识别和结合不同的目标。如金属离子、氨基酸、蛋白质、有机分子、甚至整个细胞。核算适配体有不弱于抗体的生物识别能力。并且合成简单，适配体批次之间有很好的重现性，只要序列已知就可以用化学标记和化学固定随时修改，是一种良好的检测工具。因为这些优点，核酸适配体被广泛应用于食品药品检测领域，以及分子识别探针和生物传感器技术方面的探究。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸适配体传感器与酶切循环放大策略检测土霉素的方法，以快速、简单、灵敏地检测牛奶中土霉素的残留量。
技术问题：酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素基于以下原理：
酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，是利用核酸适配体的特异性识别能力和核酸染色剂SYBR GREEN I(SGI)对于双链DNA的染色特性，构建了一种可以灵敏、快速检测土霉素的核酸适配体荧光传感器；在不存在土霉素的情况下，SGI插入土霉素适配体和其互补序列形成双链结构，能在495nm的激发光下得到很高的荧光强度；而当体系中存在土霉素时，目标物会和适配体特异性结合并将其从双链DNA中剥离开，导致SGI从氢键中释放，体系荧光强度明显降低；通过测定加入目标物前后体系荧光强度变化，可以实现对三聚氰胺的定性和定量检测。
本发明的技术方案：
包括以下步骤：建立SGI与双链核酸荧光体系；基于核酸适配体传感器与酶切放大循环策略检测土霉素的可行性分析；建立核酸适配体传感器荧光检测方法；测定所建立的核酸适配体传感器对土霉素的选择性；运用所建立的核酸适配体传感器测定实际牛奶样品中的土霉素。
(1)建立SGI与双链核酸荧光体系
首先用Tris HCl缓冲溶剂稀释土霉素适配体和相应的互补序列至浓度为10μM，接着在1.5mL的小离心管中加入50μL浓度为10μM的土霉素适配体和50μL浓度为10μM互补序列cDNAs，涡旋振荡均匀后放入水浴锅中，在95℃下加热10min解除自身螺旋；最后待加热后的核酸混合物冷却至室温复性，并用二重蒸馏水稀释100倍；土霉素适配体和其互补序列合成的双链DNA(dsDNA)50nM在4℃冰箱过夜保存以备使用。
(2)基于核酸适配体传感器与酶切放大循环策略检测土霉素的可行性分析
验证适配体传感器：
取8个1.5mL的离心管，编号为a、b、c、d、e、f、g、h，分别进行如下操作：a管中加入100μL 50nM的dsDNA和15μL 1μg/mL的SG染料反应7min后，用Tris-HCl缓冲液补齐500μL体系；b管中加入100μL 50nM的dsDNA和15μL 1μg/mL的SGI染料反应7min后，再加入50μL 100μg/mL的土霉素工作液后用Tris-HCl缓冲液补齐500μL，混合反应30min；c管中加入100μL50nM的dsDNA和15μL 1μg/mL的SG染料反应7min后，再加入50μL 100μg/mL的土霉素工作液、25U Exo.I、50μL外切酶10x buffer后用Tris-HCl缓冲液补齐500μL体系，接着在37℃的水温下反应30min，最后在80℃水温下水浴15min停止外切酶反应；d管中加入100μL 50nM的Apt和15μL 1μg/mL的SG染料反应7min后，用Tris-HCl缓冲液补齐500μL体系；e管中加入100μL 50nM的cDNA和15μL 1μg/mL的SG染料反应7min后，用Tris-HCl缓冲液补齐500μL体系；f管中加入50μL 100μg/mL的土霉素工作液，用Tris-HCl缓冲液补齐500μL体系；g管中加入15μL 1μg/mL的SGI染料，用Tris-HCl缓冲液补齐500μL体系；h管中加入50μL 100μg/mL的土霉素工作液与15μL 1μg/mL的SGI染料，用Tris-HCl缓冲液补齐500μL体系；最后用荧光分光光度计分别测定a、b、c、d、e、f、g、h体系的荧光光谱图，激发波长为495nm，荧光范围为510nm到650nm，激发和发射狭缝都设置为5nm。
验证酶切放大循环：
称取1.0g琼脂糖与50mL TBE缓冲液(0.01M Tris borate–EDTA buffer)在烧杯中混合，制备用于进行电泳实验的琼脂糖凝胶；接着将混合好的琼脂糖凝胶放入微波炉中加热30s融化凝胶，并加10μL核酸染料GelRed工作液混合染色；将凝胶放入凝胶池中在室温下冷却25min待凝胶凝固，接着将TBE缓冲液加入到电泳池中没过凝胶表面；样槽1中加入20μL浓度为1M的土霉素适配体，以及10μL的DNA loading buffer；样槽2中加入20μL土霉素适配体与外切酶Exo I的反应产物(OTC aptamer:1M,Exo I:25U)，以及10μL的DNA loadingbuffer；样槽3中加入20μL土霉素适配体与土霉素的反应产物(OTC aptamer:1M,OTC:100μg/mL)，以及10μL的DNA loading buffer；样槽4中加入20μL土霉素适配体、外切酶Exo I、土霉素混合反应产物(OTC aptamer:1M,Exo I:25U,OTC:100μg/mL)，以及10μL的DNA loadingbuffer；样槽5中加入20μL土霉素适配体与适配体互补链形成的双链(OTC aptamer:1M.cDNA:1M)，以及10μL的DNAloading buffer；样槽6中加入20μL双链与外切酶Exo I反应物(OTC aptamer:1M,cDNA:1M,Exo I:25U)，以及10μL的DNAloading buffer；最后凝胶电泳的电压设置为200V时间为半小时，在紫外显像器下观察凝胶电泳的图像。
(3)建立核酸适配体传感器荧光检测方法
首先将15μL SGI标准工作液加入到100μL制备好的dsDNA(50nM)溶液中，并在室温下涡旋反应7min；接着用二重蒸馏水配制好100μg/mL土霉素储备液，将5、10、15、25、35、45、55μL的土霉素储备液加入混合物中(土霉素终浓度为1、2、3、5、7、9、11μg/mL)，接着加入25Uexonuclease I和50μL外切酶10x buffer，Tris HCl缓冲溶剂补齐500μL体系。将混合物放入水浴锅中，在37℃的水温下反应30min。最后在80℃水温下水浴15min停止外切酶反应，在室温下进行荧光光谱扫描。以荧光信号的下降比率(F0-F)/F0为纵坐标建立土霉素的标准曲线，其中F和F0分别为体系中存在与不存在目标物时在525nm处的荧光信号强度。空白对照实验用等量的二重蒸馏水代替土霉素溶液，按照相同步骤检测荧光光谱；结果显示，525nm处荧光峰值差F-F0与三聚氰胺的浓度之间呈良好的线性关系(R＝0.9964)，经3σ/S(3σ/S，3倍的背景标准偏差除以标准曲线斜率)计算，方法检出限为0.157μg/mL，说明了该荧光传感器可以实现对土霉素简单、灵敏、高效的定性定量检测。
(4)测定所建立的核酸适配体传感器对土霉素的选择性
选择实际样品中易出现残留的与土霉素结构相似的抗生素进行了选择性实验，分别为四环素(TET)，强力霉素(DOX)，洛美沙星(LOM)，氧氟沙星(OFLX)；首先，分别配制等浓度土霉素(OTC)，四环素(TET)，强力霉素(DOX)，洛美沙星(LOM)，氧氟沙星(OFLX)的标准溶液；接着等量抗生素溶液分别加入环境条件相同的上述实验体系中，并按照技术方案(3)中步骤反应；经过相同反应时间后用RF-5301荧光分光光度计检测加入抗生素前后体系的荧光强度，各抗生素在体系中的终浓度为10μg/mL；结果显示只有加入土霉素的体系荧光强度会出现明显的下降，即该基于酶切循环核酸适配体传感器检测土霉素的方法具有较好的选择性。
(5)运用所建立的核酸适配体传感器测定实际牛奶样品中的土霉素
首先，在15mL离心管中依次加入4ml生牛奶，6mL水和2mL的10％三氯乙酸，涡旋混合一分钟除去牛奶中的蛋白质和有机物；之后混合物在20℃下超声15min，然后以13,000rpm的速度离心10分钟用以分离样品；将离心得到的上清液转移到另一个离心管中，在10,000rpm速度下再次离心10min去除沉淀物，按照技术方案(3)所述的方法，测定上清液中土霉素；结果显示加入土霉素后的荧光猝灭率(F0-F)/F0与牛奶中土霉素的浓度之间具有良好的线性关系(R＝0.9906)，说明该荧光传感器在实际样品的背景下，仍然具有良好的检测能力。
本发明的有益效果：
本发明建立了一种对牛奶中的土霉素残留有高选择性，同时又简单、快速、灵敏的分析检测方法，具有良好的实用价值，对抗生素类药物快速检测技术的开发提供了参考。
附图说明
图1原理可行性分析实验中荧光染料SGI和不同物质结合的荧光光谱；土霉素，10.00μg/mL；土霉素适配体：10.00nM；双链DNA：10.00nM；适配体互补链cDNA：10.00nM；SGI染料：1μg/mL；外切酶Exo I：50U/mL.
图2原理可行性分析实验中土霉素适配体和酶切消解物的琼脂糖凝胶电泳图像；土霉素，100μg/mL；土霉素适配体，1M；适配体互补链，1M；外切酶Exo I，25U.
图3土霉素加入后体系荧光猝灭率(F0-F)/F0与土霉素浓度呈良好的线性关系与土霉素浓度之间的线性标准曲线(空白对照组荧光峰值记为F0，样品组荧光峰值记为F)；土霉素1.00,2.00,3.00,5.00,7.00,9.00,11.00μg/mL；双链DNA，10.00nM；SGI，1μg/mL；外切酶Exo I，50U/mL.
图4土霉素及其类似物分别加入后，体系的荧光猝灭率(F0-F)/F0(空白对照组荧光值记为F0，样品组记为F)；土霉素、强力霉素、四环素、洛美沙星、氧氟沙星浓度均为1.0μg/mL.
图5牛奶样品上清液加入后，体系荧光猝灭率与在牛奶基质中土霉素浓度之间的线性工作曲线；土霉素浓度分别为1,2,4,6,8,10μg/mL；双链DNA，10nM；互补链，0.1μM；Tb3+,10μM；SGI，1μg/mL；外切酶Exo I，50U/mL.
具体实施方式
(1)建立SGI与双链核酸荧光体系
材料/试剂：土霉素核酸适配体、互补链均购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)。
方法：将购买的核酸适配体及互补链在-4℃、2500转/分钟条件下离心5min，配制pH 7.5的Tris-HCl缓冲液稀释土霉素适配体和相应的互补序列至浓度为10μM，接着在1.5mL的小离心管中加入50μL浓度为10μM的土霉素适配体和50μL浓度为10μM互补序列cDNAs，涡旋振荡均匀后放入水浴锅中，在95℃下加热10min解除自身螺旋；最后待加热后的核酸混合物冷却至室温复性，并用二重蒸馏水稀释100倍；土霉素适配体和其互补序列合成的双链DNA(dsDNA)50nM在4℃冰箱过夜保存以备使用。
结果：核酸适配体与互补链充分杂交，形成双链结构。
(2)SGI和双链DNA加入量的优化、染料与双链DNA的反应时间等实验条件对于研究核酸适体荧光传感器检测土霉素的性能有着重要影响，因此需要对上述实验条件进行优化。
材料/试剂：土霉素购买自阿拉丁试剂公司；土霉素核酸适配体、互补链均购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)。
方法：将15μL 1μg/mL的SGI染料分别加入到70,80,90,100,110,120,130μL的50nMdsDNA中反应7min分钟，接着加入50μL 100μg/mL的土霉素工作液按照技术方案(3)的方法进行实验，并计算双链DNA与SGI染料在不同比例下体系的荧光猝灭率。
结果：结果表明，双链DNA与SGI染料最佳加入量比例为100:15。
方法：首先将15μL 1μg/mL的SGI染料分别加入到100μL双链核酸配体工作液中，用缓冲溶液补齐500μL体系，分别涡旋混合不同时间(1,3,5,7,9,11,13,15min)检测体系荧光光谱。
结果：SGI与体系中的DNA在7min后配位完全，体系荧光达到稳定。
(3)建立核酸适配体传感器荧光检测方法
材料/试剂：土霉素购买自阿拉丁试剂公司；TbCl3购自西格玛试剂公司；三聚氰胺核酸适配体、互补链均购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)。
方法：首先将15μL SGI标准工作液加入到100μL制备好的dsDNA(50nM)溶液中，并在室温下涡旋反应7min；接着用二重蒸馏水配制好100μg/mL土霉素储备液，将5、10、15、25、35、45、55μL的土霉素储备液加入混合物中(土霉素终浓度为1、2、3、5、7、9、11μg/mL)，接着加入25U exonuclease I和50μL外切酶10x buffer，Tris HCL缓冲溶剂补齐500μL体系。将混合物放入水浴锅中，在37℃的水温下反应30min。最后在80℃水温下水浴15min停止外切酶反应，在室温下进行荧光光谱扫描。以荧光信号的下降比率(F0-F)/F0为纵坐标建立土霉素的标准曲线，其中F和F0分别为体系中存在与不存在目标物时在525nm处的荧光信号强度。空白对照实验用等量的二重蒸馏水代替土霉素溶液，按照相同步骤检测荧光光谱；
结果：525nm处荧光峰值差F-F0与三聚氰胺的浓度之间呈良好的线性关系(R＝0.9964)，方法检出限为0.157μg/mL。
(4)测定所建立的核酸适配体传感器对土霉素的选择性
材料/试剂：土霉素、四环素，强力霉素，洛美沙星，氧氟沙星买自西格玛试剂公司；土霉素核酸适配体、互补链均购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)。
方法：选择实际样品中易出现残留的与土霉素结构相似的抗生素进行了选择性实验，分别为四环素(TET)，强力霉素(DOX)，洛美沙星(LOM)，氧氟沙星(OFLX)；首先，分别配制等浓度土霉素(OTC)，四环素(TET)，强力霉素(DOX)，洛美沙星(LOM)，氧氟沙星(OFLX)的标准溶液；接着等量抗生素溶液分别加入环境条件相同的上述实验体系中，并按照技术方案(3)中步骤反应；经过相同反应时间后用RF-5301荧光分光光度计检测加入抗生素前后体系的荧光强度，各抗生素在体系中的终浓度为10μg/mL；用光分光光度计测定体系光谱，得到荧光峰值F；空白对照实验用等量的二重蒸馏水代替抗生素溶液，按照相同步骤测定荧光光谱，得到荧光峰值F0，并计算5种物质引起的荧光猝灭率(F0-F)/F0。
结果：结果显示加入土霉素的体系中荧光猝灭率显著高于其他四种干扰物质，即该基于核酸适配体传感器与酶切循环放大策略检测土霉素的方法具有良好的选择性。
(5)运用所建立的核酸适配体传感器测定实际牛奶样品中的土霉素
材料/试剂：土霉素购买自阿拉丁试剂公司；土霉素核酸适配体、互补链均购买于生工生物工程股份有限公司(中国上海)；牛奶购买于当地农场。
方法：首先，在15mL离心管中依次加入4ml生牛奶，6mL水和2mL的10％三氯乙酸，涡旋混合一分钟除去牛奶中的蛋白质和有机物；之后混合物在20℃下超声15min，然后以13,000rpm的速度离心10分钟用以分离样品；将离心得到的上清液转移到另一个离心管中，在10,000rpm速度下再次离心10min去除沉淀物，按照技术方案(3)所述的方法，测定上清液中土霉素；土霉素终浓度分别为：1,2,4,6,8,10μg/mL)。根据(F0-F)/F0与土霉素浓度之间的线性关系的关系建立工作曲线，最后用本方法检测牛奶基质中浓度分别为2、4、6μg/mL的土霉素，根据工作曲线计算本方法的回收率。
结果：加入土霉素后的荧光猝灭率(F0-F)/F0与牛奶中土霉素的浓度之间具有良好的线性关系(R＝0.9906)，检测加标牛奶样品中土霉素的回收率如表1所示，回收率范围为89.8到97.2％。
表1基于核酸适配体传感器与酶切循环放大策略检测土霉素的加标回收率
序列表
<110> 吉林大学
<120> 酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法
<141> 2018-04-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtacggaat tcgctagcgg gcgggggtgc tgggggaatg gagtgctgcg tgctgcgggg 60
atccgagctc cacgtg 76
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccccgcagca cgcagcactc cattccccca gcacccccgc ccgctagcga attccgtacg 60

Claims (5)

1.酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，其特征在于利用核酸适配体与土霉素的特异性结合能力，核酸染料SYBR GREEN I(SGI)的光学性能，以及外切酶对体系的循环放大作用实现对牛奶中土霉素的定量检测，包括以下步骤：建立SGI与双链核酸荧光体系；建立核酸适配体传感器荧光检测方法；测定所建立的核酸适配体传感器对土霉素的选择性；运用所建立的核酸适配体传感器测定实际牛奶样品中的土霉素。
2.如权利要求1所述的酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，其中建立SGI与双链核酸荧光体系的步骤如下：首先用Tris HCl缓冲溶剂稀释土霉素适配体和相应的互补序列至浓度为10μM，接着在1.5mL的小离心管中加入50μL浓度为10μM的土霉素适配体和50μL浓度为10μM互补序列cDNAs，涡旋振荡均匀后放入水浴锅中，在95℃下加热10min解除自身螺旋；最后待加热后的核酸混合物冷却至室温复性，并用二重蒸馏水稀释100倍；土霉素适配体和其互补序列合成的双链DNA(dsDNA)50nM在4℃冰箱过夜保存以备使用。
3.如权利要求1所述的酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，其中建立核酸适配体传感器荧光检测方法的步骤如下：首先将15μL SGI标准工作液加入到100μL制备好的dsDNA(50nM)溶液中，并在室温下涡旋反应7min；接着用二重蒸馏水配制好100μg/mL土霉素储备液，将5、10、15、25、35、45、55μL的土霉素储备液加入混合物中(土霉素终浓度为1、2、3、5、7、9、11μg/mL)，接着加入25U exonuclease I和50μL外切酶10x buffer，TrisHCl缓冲溶剂补齐500μL体系；将混合物放入水浴锅中，在37℃的水温下反应30min；最后在80℃水温下水浴15min停止外切酶反应，在室温下进行荧光光谱扫描；以荧光信号的下降比率(F0-F)/F0为纵坐标建立土霉素的标准曲线，其中F和F0分别为体系中存在与不存在目标物时在525nm处的荧光信号强度；空白对照实验用等量的二重蒸馏水代替土霉素溶液，按照相同步骤检测荧光光谱；结果显示，525nm处荧光峰值差F-F0与三聚氰胺的浓度之间呈良好的线性关系(R＝0.9964)，经3σ/S(3σ/S，3倍的背景标准偏差除以标准曲线斜率)计算，方法检出限为0.157μg/mL，说明了该荧光传感器可以实现对土霉素简单、灵敏、高效的定性定量检测。
4.如权利要求1所述的酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，其中测定所建立的核酸适配体传感器对土霉素的选择性的实验步骤如下：选择实际样品中易出现残留的与土霉素结构相似的抗生素进行了选择性实验，分别为四环素(TET)，强力霉素(DOX)，洛美沙星(LOM)，氧氟沙星(OFLX)；首先，分别配制等浓度土霉素(OTC)，四环素(TET)，强力霉素(DOX)，洛美沙星(LOM)，氧氟沙星(OFLX)的标准溶液；接着等量抗生素溶液分别加入环境条件相同的上述实验体系中，并按照权利要求3中步骤反应；经过相同反应时间后用RF-5301荧光分光光度计检测加入抗生素前后体系的荧光强度，各抗生素在体系中的终浓度为10μg/mL；结果显示只有加入土霉素的体系荧光强度会出现明显的下降，即该基于酶切循环核酸适配体传感器检测土霉素的方法具有较好的选择性。
5.如权利要求1所述的酶切循环核酸适配体传感器检测牛奶中土霉素的方法，其中所述运用所建立的核酸适配体传感器测定实际牛奶样品中的土霉素的测定步骤如下：首先，在15mL离心管中依次加入4mL生牛奶，6mL水和2mL的10％三氯乙酸，涡旋混合一分钟除去牛奶中的蛋白质和有机物；之后混合物在20℃下超声15min，然后以13,000rpm的速度离心10分钟用以分离样品；将离心得到的上清液转移到另一个离心管中，在10,000rpm速度下再次离心10min去除沉淀物，按照权利要求3所述的方法，测定上清液中土霉素；结果显示加入土霉素后的荧光猝灭率(F0-F)/F0与牛奶中土霉素的浓度之间具有良好的线性关系(R＝0.9906)，说明该荧光传感器在实际样品的背景下，仍然具有良好的检测能力。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109975561A (zh) * 2019-04-25 2019-07-05 河北医科大学 一种基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法
CN110791551A (zh) * 2019-09-17 2020-02-14 北京化工大学 一种无载体氯霉素适配体信号放大传感器的建立方法
CN112229992A (zh) * 2020-10-26 2021-01-15 烟台大学 一种基于核酸外切酶信号放大的比色检测方法
CN112345506A (zh) * 2020-11-06 2021-02-09 济南大学 一种检测汞离子的荧光生物传感器
CN112697763A (zh) * 2021-01-21 2021-04-23 南京师范大学 一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法和应用
CN113702345A (zh) * 2021-08-31 2021-11-26 吉林大学 一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1865934A (zh) * 2006-06-22 2006-11-22 上海交通大学 采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法
CN103616423A (zh) * 2013-12-02 2014-03-05 济南大学 一种检测土霉素的竞争型适配体传感器的制备方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1865934A (zh) * 2006-06-22 2006-11-22 上海交通大学 采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法
CN103616423A (zh) * 2013-12-02 2014-03-05 济南大学 一种检测土霉素的竞争型适配体传感器的制备方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNYAN SUN等: "Label-free fluorescent sensor based on aptamer and thiazole orange for the detection of tetracycline", 《DYES AND PIGMENTS》 *
LING KONG等: "A universal and label-free aptasensor for fluorescent detection of ATP and thrombin based on SYBR Green I dye", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
ZHANG HUI等: "Upconversion luminescence resonance energy transfer-based aptasensor for the sensitive detection of oxytetracyline", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
文立 等: "核酸外切酶辅助的信号放大策略在生化分析中的应用进展", 《分析化学》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109975561A (zh) * 2019-04-25 2019-07-05 河北医科大学 一种基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法
CN109975561B (zh) * 2019-04-25 2021-11-09 河北医科大学 一种基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法
CN110791551A (zh) * 2019-09-17 2020-02-14 北京化工大学 一种无载体氯霉素适配体信号放大传感器的建立方法
CN112229992A (zh) * 2020-10-26 2021-01-15 烟台大学 一种基于核酸外切酶信号放大的比色检测方法
CN112345506A (zh) * 2020-11-06 2021-02-09 济南大学 一种检测汞离子的荧光生物传感器
CN112345506B (zh) * 2020-11-06 2022-08-26 济南大学 一种检测汞离子的荧光生物传感器
CN112697763A (zh) * 2021-01-21 2021-04-23 南京师范大学 一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法和应用
CN112697763B (zh) * 2021-01-21 2024-03-01 南京师范大学 一种基于染料GelRed免标记核酸适配体传感器检测链霉素的方法和应用
CN113702345A (zh) * 2021-08-31 2021-11-26 吉林大学 一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法

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