CN109943650A - 一种采用特异性引物鉴定乌梢蛇中药材真伪的实时荧光pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属中药及中药材鉴定技术领域，为解决目前乌鞘蛇检测方法容易出现假阳性结果，无法应用于市场快速检测等问题，提供一种采用特异性引物鉴定乌梢蛇中药材真伪的实时荧光PCR方法，用于鉴别乌鞘蛇中药材真伪的特异性引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；探针序列如SEQ ID NO：3所示。通过DNA快速提取、实时荧光PCR特异性扩增，即可完成对样品真伪的鉴别。本发明具有引物探针双重特异性其特异性更高、荧光检测灵敏度更高、无需电泳过程方法检测时间短，药典检测方法需要4小时左右，本方法仅需1.5h、所需仪器设备少可应用于快检车服务市场等优点。
Description
技术领域
本发明属于中药及中药材鉴定技术领域，具体涉及一种采用特异性引物鉴定乌梢蛇中药材真伪的实时荧光PCR方法。
背景技术
乌梢蛇是我国传统名贵药材，《中国药典》(2015年版)规定其正品为游蛇科动物乌梢蛇（Zaocys dhumnades）的干燥体。多于夏、秋二季捕捉，剖开腹部或先剥皮留头尾，除去内脏，盘成圆盘状，干燥。有祛风，通络，止痉等功效。用于风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼哨斜，半身不遂，破伤风等。由于其养殖成本高、价格昂贵，而需求量极大，因此市售药材中常有混伪品充斥。
第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。
第二代PCR技术为实时定量荧光PCR技术，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光 PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同 步，相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。
乌梢蛇的现行质量评价方法有很多，传统鉴别是通过性状差异、理化方法进行区分，传统的鉴别方法需要经验积累且主观性强，鉴别时间长、成本高。并且，乌梢蛇在干燥和制成饮片过程中性状的可塑性很大，导致理化性状鉴别效果不理想，难以满足对乌梢蛇鉴定的准确、快速和客观的要求。因此，为乌梢蛇的实时荧光PCR鉴别真伪鉴别提供一种简便实用、准确性高的方法尤为重要。《中国药典》中已收录PCR方法鉴定乌梢蛇药材的方法，中国专利数据库中涉及动物源性成分鉴定的PCR技术的专利申请件已有百余件，但多为普通PCR方法或实时荧光PCR染料法，普通PCR方法所需仪器较多需要电泳检测设备需求大，所需检测时间也较长，无法应用于市场快速检测，并且该方法为仅有引物特异性，结果判断以人肉眼判断为主灵敏度低；而实时荧光PCR染料法引物中的双链DNA，当一些非特异性扩增和引物二聚体出现，并且实验要求扩增片段较短单纯引物的特异性可能无法满足生物出多样性的要求出现假阳性结果，影响实验结果判断。
发明内容
本发明为了解决目前乌鞘蛇检测方法容易出现假阳性结果，无法应用于市场快速检测等问题，提供了一种采用特异性引物鉴定乌梢蛇中药材真伪的实时荧光PCR方法，该方法简单、快速、特异性强且灵敏地检鉴别乌梢蛇中药材真伪。
本发明由如下技术方案实现的：用于鉴别乌鞘蛇中药材真伪的特异性引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO：1所示：5’-aaaaattgctaggtccacggatg-3’和SEQ ID NO：2所示：5’ -caccagcactactcctacttctatc-3’所示；所述探针序列如SEQ ID NO：3所示FAM ：5’-agccggcactgggtgaacagta-3’TAMRA。
所述引物特异性识别如SEQ ID NO：4所示的乌梢蛇的线粒体CO1序列。
含有所述的特异性引物和探针的用于鉴别乌鞘蛇中药材真伪的检测试剂盒。
采用所述的特异性引物和探针鉴别乌鞘蛇中药材真伪的方法，利用所述的引物和探针或权利要求2所述的试剂盒对乌鞘蛇中药材进行检测。
所述的方法在鉴别中药材乌鞘蛇及其中药饮片、中成药、保健品、中药配方颗粒中的应用。
步骤如下：
（1）待测样的DNA提取：依照快速提取试剂盒要求进行对样品DNA的提取；碱裂解法提取组织DNA（整个提取过程半小时左右，药典方法大约两小时左右）；
（2）实时荧光PCR反应：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光扩增，扩增条件为：95℃预变性20s；95℃ 3s，60℃ 30s，35个循环，获得扩增结果（整个过程仅需40分钟左右可以得出结果，而药典方法扩增电泳整个过程需要1.5h）；
（3）分析判断扩增结果。
所述DNA模板提取浓度为10nmol/L至100nmol/L。
步骤（2）中实时荧光PCR反应体系为20μL，为：模板1μL，特异性引物和探针浓度为10nmol/mL各0.5μL，PCR Mix 10μL，ddH2O 7.5μL。
判断扩增结果的方法为：①质控标准：阳性对照的反应体系中，FAM荧光有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和对数增长，且Ct值≥35.0； ②样品检测结果的判断：样品的乌梢蛇成分检测的实时荧光PCR反应体系中，FAM有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则含有相应的乌梢蛇成分；若上述荧光无信号及对数增长，则不含相应的乌梢蛇成分；若30.0<Ct值<35.0时，重复实验，Ct值≥35.0时，则检测结果为阴性，Ct值仍为30.0<Ct值<35.0时，则检测结果为阳性。
本发明的通过引物或探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光PCR 检测方法特异性高，假阳性低；可采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性，缩短了反应时间。检测PCR扩增后的荧光，放大了反应信号，灵敏度大大提高。本发明的方法巧妙地运用PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确、灵敏度高等优点。本发明所述方法更快速、特异性更强且灵敏度更高、可应用于快速检检鉴别乌梢蛇中药材真伪。
附图说明
图1为使用乌梢蛇特异性引物探针特异性检测结果。图中1为乌梢蛇对照药材（121591-201602），2-23依次为金环蛇、银环蛇（3批）、赤链蛇（2批）、赤练华游蛇（2批）、蕲蛇（3批）、黑眉锦蛇（1批）、虎斑游蛇、玉斑锦蛇、滑鼠蛇、王锦蛇、草蛇、灰鼠蛇、红点锦蛇、渔游蛇及空白对照；图2为使用乌梢蛇引物探针覆盖度检测结果；图3为使用乌梢蛇实时荧光PCR法绝对灵敏度检测结果与药典方法对比检测结果，将100ng的乌梢蛇DNA模板10倍递减稀释，稀释至10-5，每个梯度做5个平行实验，分别进行实时荧光PCR扩增和药典方法扩增电泳,进行结果分析。3-1表示乌梢蛇实时荧光PCR法灵敏度试验扩增曲线，3-2表示乌梢蛇实时荧光PCR法的标准曲线；图4为药典方法灵敏度试验结果；图5为Snapgene上比对的结果。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
实施例1：检索NCBI的数据库和查找Genbank后获得乌梢蛇、灰鼠蛇、滑鼠蛇等样品相关序列数十条，首先用 Snap gene软件比对出保守序列，结果如图5所示。再经过Oligov7.0.1和NCBI的 Primer-Blast，设计出能够用于乌梢蛇真伪鉴别的实时荧光PCR检测引物和探针；所述特异性鉴别乌梢蛇真伪的特异性寡核苷酸引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，上游引物：5’-AAAAATTGCTAGGTCCACGGATG-3’下游引物：5’ -CACCAGCACTACTCCTACTTCTATC-3’。所述探针序列如SEQ ID NO：3所示，探针 ：FAM 5’-AGCCGGCACTGGGTGAACAGTA-3’TAMRA，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。该引物可特异性识别乌梢蛇的线粒体CO1序列。
以NCBI查到的如SEQ ID NO：4所示的乌梢蛇CO1基因标准序列为目标，设计了能特异性检测乌梢蛇真伪的引物和探针，靶序列128 bp，目标序列第280bp开始至407bp为靶序列，保证能从乌梢蛇药材中检测乌梢蛇成分。扩增片段长度128 bp。特异性扩增反应条件为：95℃预变性 20s；95℃ 3 s，60℃30s，35个循环。
实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条DNA链，就有一个荧光分子形成，整个PCR反应过程随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct(cycle threshold,Ct )值。Ct值，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小，从而实现对起始模板定量及定性的分析，从而可检测待测成分。
所有实验步骤如下：
一、试验材料：特异性实验材料见表1；检测覆盖度试验材料见表2。
表1：特异性实验材料
表2：检测覆盖度试验材料
二、主要试剂与仪器
试剂：DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products（Tkara9178）、引物、探针由上海生工生物公司合成、ABI TaqMan™ Fast Universal PCR Master Mix (2X)购自赛默飞世尔科技有限公司。
主要仪器：力康Neofuge 13R高速冷冻离心机，香港力康；ABI7500fast荧光定量PCR 仪，美国热电公司；BIO-RAD C1000 TOUCH梯度 PCR仪、Power Pac Basic电泳仪、凝胶成像系统、均购自美国伯乐公司。
三、所有样品DNA提取方法：取20mg的实验材料，放入装有 0.5 ml ExtractionSolution 试剂的 Microtube 中。如果为固态样品，需用灭过菌的剪刀将试剂中的样品尽量剪碎。盖紧 Microtube 盖，70℃（Heat Block 或水浴锅）加热处理 10 分钟，加热过程中每隔 2-3 分钟用手 轻弹混匀。加热后立即进行 4℃、12,000 rpm 离心 10 分钟，离心后的 Microtube 中。用移液枪吸取水层，吸取时注意避免取到表面油脂层、树脂以及组织残渣，吸取的水层可直接作为 PCR 反应的模板。
四、扩增试验：使用分光光度计，测定样品中 DNA 含量，测定O260/O280比值。实时荧光PCR反应体系配制：模板1μL，特异性引物和探针浓度为10nmol/mL各0.5μL，PCR Mix 10μL，ddH2O 7.5μL。实时荧光PCR反应体系见表3。
实时荧光PCR反应：以提取的DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光扩增，扩增条件为：95℃预变性20s；95℃ 3s，60℃ 30s，35个循环，获得扩增结果。
分析判断扩增结果：判断扩增结果的方法为：①质控标准：阳性对照的反应体系中，FAM荧光有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和对数增长，且Ct值≥35.0； ②样品检测结果的判断：样品的乌梢蛇成分检测的实时荧光PCR反应体系中，FAM有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则含有相应的乌梢蛇成分；若上述荧光无信号及对数增长，则不含相应的乌梢蛇成分；若30.0<Ct值<35.0时，重复实验，Ct值≥35.0时，则检测结果为阴性，Ct值仍为30.0<Ct值<35.0时，则检测结果为阳性。
表3：实时荧光PCR反应体系
将上述样品分别提取样品DNA，分别进行实时荧光PCR扩增,进行结果分析；图1为使用乌梢蛇特异性引物探针特异性检测结果。图中1为乌梢蛇对照药材（121591-201602），2-23依次为金环蛇、银环蛇（4批）、赤链蛇（2批）、赤练华游蛇（2批）、蕲蛇（3批）、黑眉锦蛇（2批）、虎斑游蛇、玉斑锦蛇、滑鼠蛇、王锦蛇、草蛇、灰鼠蛇、红点锦蛇、渔游蛇及空白对照为水；除中检院乌梢蛇标准品Ct值小于35，在35个循环内产生明显的对数扩增曲线，其余非乌梢蛇类样品Ct值均大于35，在35个循环内未产生明显对数扩增曲线，故本发明所述方法有很强的特异性能够准确的鉴别乌梢蛇中药材的真伪。
图2为使用乌梢蛇引物探针覆盖度检测结果。图中乌梢蛇共7批样品，一批新鲜乌梢蛇样品，三批乌梢蛇中药材未炮制样品，三批乌梢蛇炮制品,将上述样品分别提取样品DNA，分别进行实时荧光PCR扩增,进行结果分析；三批乌梢蛇炮制品Ct值小于35，在35个循环内可产生对数扩增曲线，该方法可以应用市场乌梢蛇类样品。
图3为使用乌梢蛇实时荧光PCR法绝对灵敏度检测结果与药典方法对比检测结果，将100ng的(WSS001)乌梢蛇DNA模板10倍递减稀释，稀释至10-5，每个梯度做5个平行实验，分别进行实时荧光PCR扩增和药典方法扩增电泳,进行结果分析。如图3-1所示，样品在稀释度10-5~100时，Ct值均<35，且曲线有明显的对数增长，扩增结果具有良好的重复性，相对标准偏差RSD均＜3.5%，本方法灵敏度高达10-5。以稀释度对Ct值作图，其线性关系如图3-2所示，线性相关系数 R² =1，线性方程为y=-3.557g（x）+14.232，线性范围为 10-5~100，该方法有良好的线性。
如图4所示药典方法灵敏度仅能达到10-4，说明乌梢蛇实时荧光PCR法灵敏度要较药典实验方法高十倍。
本发明的通过引物或探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光PCR 检测方法特异性高，假阳性低；可采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性，缩短了反应时间。检测PCR扩增后的荧光，放大了反应信号，灵敏度大大提高。本发明的方法巧妙地运用PCR 技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确、灵敏度高等优点。
采用Takaraextraction（货号9178）提取试剂盒，微型离心机（转速达到12000转），Mygopro微型离心机所需位置小可以更好地应用与快检车上。
序列表
<110> 太原市食品药品检验所
<120> 一种采用特异性引物鉴定乌梢蛇中药材真伪的实时荧光PCR方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaattgct aggtccacgg atg 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccagcact actcctactt ctatc 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agccggcact gggtgaacag ta 22
<210> 4
<211> 709
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccggtgacca aaaaatcaga acaggtgttg gaacaggaca gggtcccctc ccccacacgg 60
gtcgaagaaa gaggtgttga ggtttcgatc ggtaagtagt attgtgattg ctgctgctaa 120
taccggcaag gccagtagta gtataatggc ggtgataagt actgatcaaa caaacagggg 180
gatgttgaat attggtatgg acttgggttt catattgata catgttgtaa tgaagttaat 240
tgcccccagg atggaggagg cgcctgctag gtgtagggaa aaaattgcta ggtccacgga 300
tgggcctgag tgtaccaggt ttcctgatag gggggggtat actgttcacc cagtgccggc 360
tccggcttca acataagagg aggatagaag taggagtagt gctggtggta gcaaccagaa 420
gctcatgttg tttatgcgtg ggaaggctat gtctggcgct ccgattatta gggggattag 480
tcagttccca aagcctccaa ttataatggg tataactata aagaaaatta tgatgaaagc 540
atgggctgtt actagtacat taaagatctg gtcgctgcct agaagggatc ctggttgtgt 600
tagctccatt cgtattagaa tgcttaggca tgccccgatt aggccggatc atgcgccaaa 660
tagtaggtat agggttccaa tatctttatg ttttggtttg accaccatg 709
Claims (9)
1.用于鉴别乌鞘蛇中药材真伪的特异性引物和探针，其特征在于：所述引物序列如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述探针序列如SEQ ID NO：3所示，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
2.权利要求1所述的用于鉴别乌鞘蛇中药材真伪的特异性引物和探针，其特征在于：所述引物特异性识别如SEQ ID NO：4所示的乌梢蛇的线粒体CO1序列。
3.含有权利要求1所述的特异性引物和探针的用于鉴别乌鞘蛇中药材真伪的检测试剂盒。
4.采用所述的特异性引物和探针鉴别乌鞘蛇中药材真伪的方法，其特征在于：利用权利要求1所述的引物和探针或权利要求2所述的试剂盒对乌鞘蛇中药材进行检测。
5.权利要求3所述的方法在鉴别中药材乌鞘蛇及其中药饮片、中成药、保健品、中药配方颗粒中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤如下：
（1）待测样的DNA提取：依照快速提取试剂盒要求进行对样品DNA的提取；
（2）实时荧光PCR反应：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光扩增，扩增条件为：95℃预变性20s；95℃ 3s，60℃ 30s，35个循环，获得扩增结果；
（3）分析判断扩增结果。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述DNA模板提取浓度为10nmol/L至100nmol/L。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤（2）中实时荧光PCR反应体系为20μL，为：模板1μL，特异性引物和探针浓度为10nmol/mL各0.5μL，PCR Mix 10μL，ddH2O 10.5μL。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：判断扩增结果的方法为：①质控标准：阳性对照的反应体系中，FAM荧光有荧光对数增长，且Ct值≤30.0，阴性对照和空白对照均无荧光信号和对数增长，且Ct值≥35.0； ②样品检测结果的判断：样品的乌梢蛇成分检测的实时荧光PCR反应体系中，FAM有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则含有相应的乌梢蛇成分；若上述荧光无信号及对数增长，则不含相应的乌梢蛇成分；若30.0<Ct值<35.0时，重复实验，Ct值≥35.0时，则检测结果为阴性，Ct值仍为30.0<Ct值<35.0时，则检测结果为阳性。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN114657257A (zh) * | 2020-12-23 | 2022-06-24 | 广东一方制药有限公司 | 用于乌梢蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒pcr鉴别的引物组合及其应用、鉴别方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104164494A (zh) * | 2014-07-21 | 2014-11-26 | 晁志 | 基于dna条形码的鉴别乌梢蛇的引物及pcr-rflp方法和试剂盒 |
| CN104862311A (zh) * | 2015-05-05 | 2015-08-26 | 广州维伯鑫生物科技有限公司 | 一种基于Taqman探针检测扬子鳄的实时荧光定量PCR引物、试剂盒及方法 |
-
2019
- 2019-05-10 CN CN201910386731.7A patent/CN109943650A/zh active Pending
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