CN113702345A - 一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以2‑氨基嘌呤(2‑aminopurine，2‑AP)作为荧光信号探针，结合Pb²⁺的特异性核酸适配体以及核酸外切酶I(Exo I)的检测方法用于灵敏地检测Pb²⁺。延长Pb²⁺特异性适配体的3’端序列，使其形成自身互补的平末端发夹结构，延长的序列中使用2‑AP替换了其中一个腺嘌呤。Exo I几乎不能水解发夹结构的核酸，2‑AP嵌在双链中，体系荧光很低。当体系中存在Pb²⁺时，Pb²⁺诱导该核酸形成3’端携9个碱基序列的G‑四链体结构，2‑AP此时处于单链中，体系荧光上升。Exo I能够水解该结构，2‑AP游离出来，体系荧光进一步增强。Pb²⁺浓度在5‑60nM范围内与荧光回升强度(F₂‑F₁)之间存在线性相关，检出限为0.049nM。本发明灵敏度高、选择性好，实现了对实际样品中Pb²⁺的快速检测。

Description

一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法

技术领域

本发明涉及一种铅离子高效灵敏的检测方法，具体涉及一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法。

背景技术

铅(Pb)是环境中含量最高、毒性最强的金属之一，主要通过工业使用和家用物品(如铅基颜料和电池)释放到空气、土壤和水中。由于铅能够在生物体内积累，长期接触低水平的Pb也可能导致中毒。铅是一种全身毒性物质，影响肾脏、胃肠道、心血管、生殖和神经系统，从而导致多种疾病，其中神经系统是最脆弱的靶器官。研究发现，儿童更容易被铅的毒性影响身体健康，导致一系列问题。传统的铅离子检测方法依赖于实验室成熟且高灵敏度的分析技术，如原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子发射光谱法(AES)和X-射线荧光光谱法(XRF)等。这些技术可以准确测定铅离子浓度，但大多数都存在一定的局限性，如仪器庞大昂贵、设备运行成本高、需要专业的科研人员等，主要适用于实验室分析，很难应用于现场快速检测。因此开发简便快速的现场检测铅离子的方法是很有必要的。

核酸适配体(aptamer)是1990年首次发现的短单链RNA或DNA序列(20-60个核苷酸长度)，具有高灵敏度、高结合亲和力、高稳定性和良好的选择性。到目前为止，适配体被开发用于检测多种目标物，如小分子、离子、蛋白质和细胞等。Pb²⁺可以诱导设计的富含G的DNA序列转化为稳定的G-四链体构型，具有约10^-6mol的高亲和常数。

2-氨基嘌呤(2-aminopurine，2-AP)是腺嘌呤的类似物，可以取代腺嘌呤而不破坏DNA的结构，并与胸腺嘧啶形成稳定的配对。游离的2-AP具有较强的荧光信号，2-AP嵌入单链DNA时，由于碱基堆积相互作用，其荧光被猝灭，而嵌有2-AP的单链DNA与其互补链结合形成双螺旋结构时，荧光被进一步猝灭。基于2-AP构建的检测方法避免了标记额外的猝灭剂。此外，考虑到2-AP嵌入在DNA序列中，因此受到相邻碱基的保护，有望具有更强的抗干扰能力。

近年来，为了提高检测方法的灵敏度，研究人员开发了许多生物和化学信号放大策略，常见的包括杂交链式反应(hybridization chain reaction，HCR)、滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)、核酸工具酶辅助反应和基于纳米材料的反应等。与其他信号放大策略相比，核酸工具酶辅助信号放大策略具有许多突出的优点：(1)核酸工具酶对底物具有高效的催化作用，因此可以保证灵敏度；(2)所涉及的酶的反应条件温和；(3)部分核酸工具酶具有序列特异性或底物偏好性，利于设计新的检测方法；(4)来源于活细胞的核酸工具酶在生化分析中表现出更好的生物相容性。核酸外切酶I(Exo I)是一种与序列无关的酶，能够从3’端到5’端降解单链DNA，裂解核苷酸之间的磷酸二酯键，但不能催化双链DNA的水解。

本发明利用核酸适配体作为识别探针，2-氨基嘌呤作为荧光探针，结合酶切信号放大技术，构建了一种检测方法，实现了对铅离子的高效灵敏检测。

发明内容

本发明的目的是建立一种基于2-氨基嘌呤修饰DNA和酶切信号放大技术检测铅离子的方法，用于高效灵敏地检测铅离子。在Pb²⁺特异性适配体的3’端延长9个碱基，这9个碱基与适配体序列5’端碱基互补配对，形成平末端的发夹结构DNA，延长的9个碱基序列中间插入了一个2-AP，由于碱基堆积相互作用，此时2-AP的荧光被猝灭。当体系中没有Pb²⁺存在时，Exo I几乎不能水解平末端的发夹结构，体系荧光很低。当体系中加入Pb²⁺后，Pb²⁺诱导该DNA形成3’端携9个碱基序列的G-四链体结构，2-AP此时处于单链环境中，体系荧光上升。再加入Exo I后，Exo I能够从3’端开始水解DNA，2-AP被释放到溶液中，体系荧光进一步增强。该传感器利用Exo I放大体系的荧光信号，提高了灵敏度。

基于2-氨基嘌呤修饰DNA和酶切信号放大技术检测铅离子的方法，包括如下步骤：

(1)核酸链DNA在4℃条件下离心后用超纯水稀释至1μM。

(2)步骤(1)中制得的DNA加入到Pb²⁺标准溶液中，混合后的溶液静置在90℃恒温金属浴中加热10min，使DNA解旋，然后在25℃金属浴条件下缓慢降至室温，继续静置反应15min。

(3)在步骤(2)制得的溶液中加入7μL 10x反应缓冲液和Exo I，再加入超纯水将体系补齐至70μL，在37℃金属浴中静置反应35min，最后用超纯水将体系补齐至500μL，即建立了一种基于2-氨基嘌呤修饰DNA和酶切信号放大技术的检测方法。

步骤(1)中，所述DNA的序列为：5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGGCCT/2-aminopurine/CCCAC-3’，自身能够形成发夹结构。其中画线部分的序列为Pb²⁺特异性的核酸适配体。

步骤(2)中DNA和Pb²⁺标准溶液的体积比为1:1。

步骤(3)中DNA终浓度为50nM，Exo I终浓度为4U/mL。

步骤(3)中涉及到的10x反应缓冲液为：670mM甘氨酸-KOH(pH 9.5，25℃)，67mMMnCl₂，10mM DTT。

使用荧光分光光度计扫描步骤(3)中反应体系的荧光发射光谱，激发波长设置为310nm，激发和发射狭缝分别设为5nm和10nm，响应时间设置为0.1s，荧光发射光谱的扫描范围设置在350-450nm之间。根据加入铅离子前后体系荧光信号的变化，实现对铅离子的定量检测。

本发明机理如下：

2-AP在游离时荧光较强，嵌入DNA后荧光被猝灭，嵌入双链DNA中的2-AP荧光猝灭程度高于嵌入单链DNA中。因此，在Pb²⁺的特异性适配体的3’端延长碱基序列，使其自身能够形成互补的平末端发夹结构，2-AP嵌入到互补序列中间位置，荧光被猝灭。Pb²⁺能够诱导该核酸形成3’端携9个碱基序列的G-四链体结构，2-AP此时嵌在单链中，荧光回升。Exo I能够切割此结构的核酸，2-AP被释放到溶液中，体系荧光信号进一步回升。该方法能够简单、快速地检测Pb²⁺，被用于松花江水样和草鱼样品的实际样品检测。

本发明提供的这种基于2-AP和Exo I介导放大的荧光检测方法，为Pb²⁺检测建立新方法，为现场快检提供新思路，在环境监测、食品分析方面有着巨大应用前景，可以推广与使用。

附图说明

图1：实施例1所述，一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的原理示意图。

图2：实施例1所述，为对本方法的可行性验证，DNA、DNA+Pb²⁺、DNA+Exo I和DNA+Pb^{2 +}+Exo I的荧光光谱。

图3：实施例1所述，基于2-氨基嘌呤修饰DNA和核酸外切酶I实现对铅离子的有效检测，在DNA+Exo I体系(A)及单独DNA体系(B)中分别加入不同浓度Pb²⁺(0、5、10、20、30、40、50、60nM)的荧光光谱。

图4：实施例1所述，分别为有无Exo I情况下两种传感器荧光回升值(F₂-F₁和F_b-F_a)与Pb²⁺浓度的线性关系图。

图5：实施例2所述，本分析方法对不同金属离子的荧光信号强度响应图谱(黑色柱子)；其他金属离子与铅离子共存时对本分析方法检测铅离子的干扰反应(灰色柱子)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步地说明。

实施例1：基于2-氨基嘌呤修饰DNA和核酸外切酶I构建铅离子检测方法的荧光分析

基于2-AP独特的性质、Pb²⁺特异性核酸适配体以及核酸外切酶I(Exo I)能够水解单链DNA、几乎不能水解平末端双链DNA的性质，构建了一种检测铅离子的方法(图1)。在多个1.5mL离心管中分别加入25μL不同浓度的Pb²⁺标准溶液、25μL核酸链(DNA,1μM)混匀，混合后的溶液静置在90℃恒温金属浴中加热10min，使DNA解旋，然后在25℃金属浴条件下缓慢降至室温，继续静置反应15min，使解旋后的DNA与Pb²⁺结合形成3’端携9个碱基序列的G-四链体结构。随后加入7μL 10x反应缓冲液和2μL浓度为1U/μL的Exo I，再加11μL超纯水将体系补齐至70μL，在37℃金属浴中静置反应35min，最后用超纯水将体系补齐至500μL进行荧光测量。本方法原理可行(图2)，以铅离子浓度作为横坐标，铅离子引起的体系荧光强度回升值(F₂-F₁)作为纵坐标，建立了该检测方法的标准曲线，其中F₁、F₂分别表示DNA+Exo I体系以及DNA+Pb²⁺+Exo I体系在370nm处的荧光强度值。体系荧光强度随着铅离子的浓度增加而增加(图3A)。在铅离子浓度为5-60nM范围内，铅离子浓度与荧光的回升值(F₂-F₁)有良好的线性关系(R²＝0.996)(图4)，根据公式(LOD＝3σ/slope)计算得到该检测方法的检出限为0.049nM，灵敏度良好。为了评估该检测方法引入Exo I对该体系检测性能提升的效果，按照上述实验过程中不加Exo I，只利用DNA体系检测Pb²⁺进行了对照实验。使用荧光分光光度计扫描了不同浓度的Pb²⁺标准溶液(0、5、10、20、30、40、50、60nM)存在时体系的荧光发射光谱，考察该方法检测Pb²⁺的灵敏度。实验结果如图3B所示，体系的荧光强度随体系中Pb²⁺浓度的不断增加而增强。同样以体系中Pb²⁺浓度作为横坐标，体系中Pb²⁺引起的荧光强度在370nm处的回升值(F_b-F_a)为纵坐标，建立了标准曲线。实验结果如图4中拟合的直线b所示，Pb²⁺浓度在5-60nM范围内时，(F_b-F_a)与其呈现良好的线性关系。线性相关系数R²＝0.990，计算得到该方法的检出限为0.085nM。将拟合直线a与拟合直线b进行对比，可以明显看出，引入Exo I能够增强Pb²⁺引起的体系荧光回升强度，放大了荧光信号，拓宽了线性荧光回升范围，降低了检出限，提高了该方法检测Pb²⁺的灵敏度。

实施例2：基于2-氨基嘌呤修饰的DNA和核酸外切酶I构建铅离子检测方法的特异性分析

本发明构建的方法对多种常见的金属离子(Ca²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺、Ni^{2 +}、Zn²⁺)均没有响应，只有Pb²⁺(50nM)可引起体系荧光强度显著的变化(图5黑色柱子)，表明该方法对Pb²⁺具有很高的选择性。同时选用了上述金属离子与Pb²⁺混合均匀的溶液，进行荧光测试。如图5中灰色柱子所示，这几种常见的金属离子与Pb²⁺在体系中同时存在时，与单独的Pb²⁺存在时体系的荧光回升强度相比，荧光强度的回升值几乎没有变化，这说明了这些金属离子几乎不会影响该荧光法检测Pb²⁺的结果，表明该方法具有良好的抗干扰能力。

实施例3：实际样品中铅离子含量的测定

利用本发明，采用标准加入法，对环境和食品样品中的铅离子进行检测，研究其实际应用性。选取两种实际样品分别为松花江水和草鱼，将两种样品进行前处理，首先将草鱼样品制成鱼糜，然后称取0.5g，加入不同浓度的Pb²⁺标准溶液放入消解罐中，再添加5mL硝酸，用微波消解仪进行消解。冷却后进行赶酸，将上述得到的消化液转移到50mL容量瓶内，将洗涤消解罐的溶液也转入容量瓶内，最后用超纯水定容，混匀备用。取出部分溶液，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0左右，使草鱼样品中铅离子终浓度分别为0.207、0.622、1.036mg·kg^-1；松花江水先用三层滤纸过滤，然后再用0.45μm滤膜过滤，直接添加铅离子标准液，使松花江水样品中Pb²⁺终浓度分别为2.072、6.216、10.360μg·L^-1。但处理后的溶液中仍会含有较多干扰物质，这些物质可能影响该检测方法检测Pb²⁺含量的准确度。为了检测这些干扰物质是否会影响该方法的准确度，选择了鱼肉样品中常见的L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-丝氨酸、L-赖氨酸、L-丙氨酸、胆固醇、葡萄糖、硬脂酸、维生素B₁以及水样中常见的SO₄ ^2-、PO₄ ^3-、间苯二胺、苯酚、间苯二酚等干扰物质来测试该方法抗干扰的能力。结果显示(表1)，上述干扰物质引起的体系荧光强度变化率均在±10％之间，表明这些干扰物质对该方法检测Pb²⁺的结果的影响较小，抗干扰能力较强，为其应用于水样和鱼肉样品中检测Pb²⁺含量提供了可能性。接下来利用本研究体系开发的荧光方法对两种加标的实际样品进行检测，同时将本实验方法与国标中的铅离子检测方法(ICP-MS)进行对照。结果显示(表2)，实际样品中铅离子的加标回收率为90.63-100.26％，相对标准偏差(RSD)≤5.76％，且该方法与ICP-MS测得结果差别较小，以及该荧光法能够成功检测出水和鱼肉样品中低于限量标准的Pb²⁺含量，证明了该检测方法具有较好的准确度和实用性，能够应用于对水样和鱼肉样品等实际样品中Pb²⁺含量的检测。

表1干扰物质对该体系荧光强度的影响(n＝3)

表2荧光法和ICP-MS法检测实际样品中Pb²⁺的结果比较(n＝3)

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgggtaggg cgggttggcc tncccac 27

Claims (7)

1.一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法，其特征在于，包括修饰了2-氨基嘌呤的DNA序列和核酸外切酶，DNA中的部分序列可与目标物特异性结合，作为荧光基团的2-氨基嘌呤能够将DNA识别目标物及核酸外切酶酶切DNA所产生的变化转换为易观察的荧光信号。

2.如权利要求1所述的一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法，其特征在于，本发明使用的这条DNA链包括Pb²⁺的特异性适配体、2-氨基嘌呤以及在适配体的3’端延长的9个碱基序列；

所述DNA序列如SEQ No.1所示。

3.如权利要求1所述的一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法，其特征在于，核酸外切酶为Exo I。

4.如权利要求1-3所述的一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法，其特征在于，用于检测铅离子的荧光分析。

5.如权利3所述的一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备Exo I的10x反应缓冲液：670mM甘氨酸-KOH，pH 9.5，25℃，67mM MnCl₂，10mMDTT；

(2)绘制标准曲线：在多个1.5mL离心管中分别加入25μL不同浓度的Pb²⁺标准溶液、25μL核酸链DNA,1μM混匀，混合后的溶液静置在90℃恒温金属浴中加热10min，使DNA解旋，然后在25℃金属浴条件下缓慢降至室温，继续静置反应15min，使解旋后的DNA与Pb²⁺结合形成3’端携9个碱基序列的G-四链体结构；随后加入7μL 10x反应缓冲液和2μL浓度为1U/μL的ExoI，再加11μL超纯水将体系补齐至70μL，在37℃金属浴中静置反应35min，最后用超纯水将体系补齐至500μL进行荧光测量；以铅离子浓度作为横坐标，铅离子引起的体系荧光强度回升值F₂-F₁作为纵坐标，建立了该检测方法的标准曲线，其中F₂、F₁分别表示体系中有无Pb²⁺时的荧光强度值。

6.如权利要求4所述的一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法，其特征在于，标准曲线检测步骤使用激发波长为310nm进行荧光检测，最佳发射波长位于370nm处。

7.如权利要求4所述的一种基于2-氨基嘌呤和酶切放大技术检测铅离子的方法，其特征在于，标准曲线检测步骤荧光发射光谱的扫描范围设置在350-450nm之间。

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