CN104212804A - 用于铅离子定量快速检测的核酸适配体序列及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于溶液体系中进行铅离子定量检测的核酸适配体序列及其检测方法，该核酸适配体序列中含有特定长度鸟嘌呤G的类茎环DNA结构，在单链的5’端连接荧光基团，在3’端连接相应的荧光淬灭基团，形成一个自组装检测体系；当有二价铅离子存在时，茎环结构闭合，反应体系的荧光强度降低，最终荧光强度与汞离子的浓度成反比关系。本发明的核酸适配体序列应用到铅离子的检测中，灵敏度和选择性较高，检测成本低，检测时将待机样品直接加入到反应体系中，整个过程无需加入其它试剂，仅需一步即可得到检测结果，检测快速、操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于铅离子检测的核酸序列，特别是涉及一种用于溶液体系中进行铅离子定量检测的核酸适配体序列及其检测方法。
背景技术
重金属离子在生物体内具有易积累、毒性大等特点，因此建立痕量、超痕量重金属离子的分析检测技术极为重要。对于痕量重金属离子的检测，传统仪器分析方法有原子发射光谱法、原子吸收光谱法、等离子体质谱法、荧光谱法和溶出伏安法等。
原子发射光谱分析法（Atomic Emission Spectroscopy，AES）是化学元素的原子和离子在热激发或电激发下，利用发射特征的光波辐射而进行定性以及定量分析的方法。该方法特点是分析速度快、选择性好、灵敏度高和易操作等，可同时进行多元素的分析。但该方法所需成套设备昂贵，分析非金属元素硒、硫和卤素等的灵敏度较低，其准确度随待测元素含量的多少而有所不同，只限于元素分析，不能确定这些元素在样品中存在的化合物状态，且对于含量高的元素定量分析误差较大，对于超微量元素的定量分析灵敏度不够。
原子吸收光谱法（Atomic Absorption Spectroscopy，AAS）又称为原子吸收分光光度，简称原子吸收法，是20世纪50年代发展起来一种基于待测元素的基态原子蒸汽对该元素的原子特征谱线的吸收程度进行定量分析的一种方法，是目前应用最为广泛的对元素进行定性定量分析的方法，主要特点有：（1）能测定几乎所有的金属元素，是现代工业、农业、石油、化工、地质、大气和环保等行业不可缺少的标准分析方法；（2）选择性高，分析干扰少；（3）检出限低，检测灵敏度高；（4）仪器具有较高的精密度；（5）分析速度快，对处理好的待测试样，每样次的测定只需数秒到数十秒；（6）测定每种元素都需要相应的空心阴极灯，不能进行多元素的同时分析。
原子荧光光谱分析法（Atomic Fluorescence Spectroscopy，AFS）又称原子光致光谱分析法，是一种通过待测元素的原子蒸气在辐射能激发下所产生的荧光强度来确定其含量的一种分析方法。该方法具有灵敏度高、线性工作范围宽和分析谱线简单等优点。光谱分析是一种相对分析方法，一般需要与标准样品作对照，由于样品的组成和结构变化对测定结果的影响较大，因此对标样的要求较为严格。
溶出伏安法是电化学方法中一种重要的痕量分析方法，包括电解富集和电解溶出两个过程。通过适当的阴极或阳极过程，恒电位预电解一定时间之后，使痕量被测组分在电极上沉积，即电极富集；再将富集后的溶液静置 0.5-1 分钟后，用与预电解相反的电极过程，使富集在电极上的被测物质在短时间内重新溶解下来，即电解溶出过程。通过溶出过程的极化曲线获得溶出峰，而溶出峰的电流大小与被测物质的浓度成正比关系。该方法对一些物质的测定有很高的灵敏度、准确度和精密度，仪器设备简单，操作费用远远低于光谱法，所以实用性较高。
20 世纪 80 年代以来，电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）逐渐成为元素分析中最重要的技术之一。与传统的电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）相比，ICP-MS 得到的谱线非常简单，仅由各个元素的同位素组成。该技术对绝大多数元素都具有较高的灵敏度、准确度以及选择性。另外，此方法还具有线性范围宽、可进行多元素同时检测等优点，已广泛用于环境、石油、冶金以及生物学等领域。
上述这些传统方法虽然灵敏度高、特异性强，但同时存在着样品预处理过程复杂、操作耗时、仪器昂贵和运行费用高等缺点，且不能提供连续分析，难以满足实际环境中方便快速、实时检测的需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题：针对现有技术中金属离子检测时存在的问题，提供一种用于汞离子定量快速检测的核酸适配体序列及其检测方法，该方法具有灵敏度和选择性高、检测成本低等优点，并且检测快速、操作简便。
本发明的技术方案：
一种用于铅离子定量快速检测的核酸适配体序列，序列中含有鸟嘌呤G的特定长度的茎环结构，在茎环结构单链的5’端连接荧光基团，在3’端连接相应的荧光淬灭基团，形成一个自组装检测体系；当有铅离子存在时，茎环结构闭合，反应体系的荧光强度降低，荧光强度与铅离子浓度成反比关系。
所述核酸适配体序列为：荧光基团-G（m）-N（n）-G（m）-荧光淬灭基团；其中 G代表鸟嘌呤，N代表核酸中含氮碱基A、T和C中的一种或多种，但设计时应避免A与T同时存在，同时避免重复的C出现而与G产生自联；其中m为鸟嘌呤数目，n为核酸上含氮碱基数目。
当核酸适配体序列中鸟嘌呤G的数目m为4，含氮碱基的数目n为5-10时，铅离子的检测限及线性关系最佳。
所述荧光基团包括且不限于Alexa350、CF350、FAM、Alexa400、CF400、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、CY5、Quasar670、Aloxa647、CF647、Quasar705、Alexa680和CF680，所述荧光淬灭基团包括且不限于MGB、Dabcyl、Eclipso、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。
利用核酸适配体对水体中铅离子浓度进行检测的方法，包括以下步骤：
（1）将所述的核酸适配体用PBS溶液稀释，配制成浓度为50nM的核酸适配体溶液；将待检测的水样用滤纸过滤，除去杂质；
（2）分别将一定浓度梯度的铅离子的标准品溶液和待检测样品加入到相应的酶标板微孔中，50μl/孔，每个样品至少设定重复一次；
（3）将所述的核酸适配体溶液加入到酶标板相应的微孔中，50μl/孔，震荡混匀，37℃条件下避光孵育20min；
（4）将酶标板置于多功能酶标仪上，得出标准品溶液的荧光值和待检测样品的荧光值；
（5）计算样品的抑制率，然后计算出样品浓度的对数值，进而求出该对数值的反对数，并乘以相应的稀释倍数，即为样品中铅离子的浓度。
其中抑制率的计算方法如下：求出各标准品对应微孔荧光值的平均数B，除以标准浓度为0ng/ml时荧光值的平均值B0，计算得到样品的抑制率B/B0。
所述一定浓度梯度的铅离子标准品溶液的浓度分别为0、1、3、9、27、81ng/ml。
本发明的积极有益效果：
（1）本发明利用Pb2+与脱氧核糖核酸(DNA)中的鸟嘌呤碱基G高度特异性结合形成稳定的G-Pb2+-G配位化合物，这种伪Watson-Crick结构稳定性绝不亚于标准的Watson-Crick碱基配对，并且对Pb2+能高选择性的识别，该配位结构的发现，对Pb2+检测技术的研究和进一步实际应用有着重要意义。
（2）本发明利用在有铅离子存在的条件下，鸟嘌呤碱基G之间可以形成结合键，整个单链形成茎环结构，使两端的荧光基团和荧光淬灭基团相互靠近，从而利用荧光值的变化情况反映出铅离子的相对浓度，即铅离子的浓度高低与荧光强度成反比关系。
（3）本发明将荧光检测与淬灭基团设计到检测适配体中，可大大提高该模式检测铅离子的灵敏度，与其它检测方法相比，本发明仅需合成一条DNA单链，结构简单，操作方便，在20min内即可得到定量测定结果。
（4）本发明的检测方法，其灵敏度和选择性较高，检测成本低，试验过程仅需进行序列的化学合成，测定一个样品时适配体的浓度约为50nM，因此1OD含量的合成序列可检测的样本数超过1000个，目前平均单个样品的检测成本低于1元，检测成本仅为仪器分析方法（100-200元/样品）的1/100-1/200。
（5）本发明的检测方法，检测快速、操作简便，检测时将待机样品直接加入到反应体系中，整个过程无需再加入其它试剂，仅需一步即可得到检测结果。
附图说明
图1：本发明中测定铅离子的标准曲线图。
图中横坐标为铅离子浓度的对数值（以10为底），纵坐标为抑制率B/B0（%）。
具体实施方式
实例1：用于铅离子定量快速检测的核酸适配体序列
该核酸适配体序列为：荧光基团-G（m）-N（n）-G（m）-荧光淬灭基团；其中 G代表鸟嘌呤，N代表核酸中含氮碱基A、和C中的一种或多种，但设计时应避免A与T同时存在，同时避免重复的C出现而与G产生自联；其中m为鸟嘌呤数，n为核酸上含氮碱基数，其中核酸适配体均由引物合成公司进行商业化合成。
其中A代表腺瞟呤，G代表鸟瞟呤，C代表胞嘧啶，T代表胸腺嘧啶，它们是DNA链中的四种碱基。
当单链核酸序列中鸟嘌呤碱基的数m为4，核酸上含氮碱基的数n为5-10时，铅离子的检测限及线性关系最佳。
所述荧光基团包括且不限于Alexa350、CF350、FAM、Alexa400、CF400、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、CY5、Quasar670、Aloxa647、CF647、Quasar705、Alexa680、CF680等；其对应的荧光淬灭基团包括且不限于MGB、Dabcyl、Eclipso、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3等。
实例2：铅离子检测标准曲线的筛选
（1）据例1设计不同茎环长度的核酸适配体序列，在其5’端偶联FAM荧光基团，在其3’端偶联Dabcyl荧光淬灭基团，序列由商业引物公司合成；
（2）将浓度为0、1、3、9、27、81、243、729ng/ml的系列浓度铅离子标准品溶液分别加入到相应的酶标板（荧光用）微孔中，50μl/孔，每个样品至少设定重复一次；
（3）将不同鸟嘌呤长度的核酸适配体序列用PBS溶液稀释成50nM的溶液，加入到相应的酶标板微孔中，每孔50μl，并震荡器上混匀，37℃条件下避光孵育20min；
（3）将酶标板置于多功能酶标仪上进行读值。
实验结果：
（1）求出各标准品对应微孔荧光值的平均数B，除以标准浓度为0ng/ml时荧光值的平均值B0，计算得到样品的抑制率B/B0（%）。
即B/B0=标准品的荧光值×100%/标准浓度0对应的荧光值。
（2）以标准品的B/B0为纵坐标，以各标准品浓度的对数为横坐标，计算出回归曲线，见下表1。
| 鸟嘌呤G长度 | 标准曲线方程 | 相关系数 |
| 3 | Y=-30.265x+80.109 | R2=0.9631 |
| 6 | Y=-38.141x+84.705 | R2=0.9855 |
| 12 | Y=-40.378x+85.211 | R2=0.9732 |
| 24 | Y=-41.298x+85.967 | R2=0.9578 |
根据计算结果可看出，当鸟嘌呤G的数量为5-10时，其标准曲线方程的相关系数最好。
实例3：利用核酸适配体对水体中的铅离子进行浓度检测的方法
（1）将实例2中鸟嘌呤G长度为6的序列用PBS溶液配稀释成浓度为50nM的核酸适配体溶液；将待检测的水样用滤纸过滤，以除去杂质；
（2）将浓度为0、1、3、9、27、81ng/ml的铅离子标准品溶液和待检测样品，分别加入到相应的酶标板（荧光用）的微孔中（50μl/孔），每个样品至少设定重复一次；
（3）将稀释好的核酸适配体溶液（50nM）加入到相应的微孔中，50μl/孔，在震荡器上混匀，37℃条件下避光孵育20min；
（4）将酶标板置于多功能酶标仪上进行读值，得到标准品和待检测样品的荧光值。
实验结果处理：
（1）求出各标准品孔荧光值的平均数，除以标准浓度为0ng/ml时荧光值的平均值，计为抑制率B/B0；
即抑制率B/B0=标准品的荧光值（待检测样品的荧光值）×100%/标准浓度为0时对应的荧光值；
（2）以标准品的抑制率B/B0为纵坐标，以各标准品浓度的对数为横坐标，计算出回归曲线：
Y=-38.141x+84.705，R2=0.9855。
参见图1，图中Y轴为抑制率B/B0（%），X轴为铅离子浓度的对数值（以10为底）。
根据样品的B/B0值，计算样品浓度的对数值X，然后求出其反对数，并乘以相应的稀释倍数，即为样品中铅离子的浓度；
（3）举例说明：当待检测样品的抑制率B/B0为55.06%时，待检测样品中的铅离子浓度（ng/ml）=10(55.06-84.705)/(-38.141)=5.99(ng/ml)。
Claims (7)
1.一种用于铅离子定量快速检测的核酸适配体序列，其特征在于：所述核酸适配体序列中含有鸟嘌呤G的特定长度的茎环结构，在茎环结构单链的5’端连接荧光基团，在3’端连接相应的荧光淬灭基团，形成一个自组装检测体系；当有铅离子存在时，茎环结构闭合，反应体系的荧光强度降低，荧光强度与铅离子浓度成反比关系。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体序列，其特征在于：所述核酸适配体序列为：荧光基团-G（m）-N（n）-G（m）-荧光淬灭基团；其中 G代表鸟嘌呤，N代表核酸中含氮碱基A、T和C中的一种或多种，但设计时应避免A与T同时存在，同时避免重复的C出现而与G产生自联；其中m为鸟嘌呤数目，n为核酸上含氮碱基数目。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体序列，其特征在于：当核酸适配体序列中鸟嘌呤G的数目m为4，含氮碱基的数目n为5-10时，铅离子的检测限及线性关系最佳。
4.根据权利要求1-3任一项所述的核酸适配体序列，其特征在于：所述荧光基团包括且不限于Alexa350、CF350、FAM、Alexa400、CF400、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、CY5、Quasar670、Aloxa647、CF647、Quasar705、Alexa680和CF680，所述荧光淬灭基团包括且不限于MGB、Dabcyl、Eclipso、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。
5.根据权利要求4所述的核酸适配体对水体中铅离子浓度进行检测的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）将所述的核酸适配体用PBS溶液稀释，配制成浓度为50nM的核酸适配体溶液；将待检测的水样用滤纸过滤，除去杂质；
（2）分别将一定浓度梯度的铅离子的标准品溶液和待检测样品加入到相应的酶标板微孔中，50μl/孔，每个样品至少设定重复一次；
（3）将所述的核酸适配体溶液加入到酶标板相应的微孔中，50μl/孔，震荡混匀，37℃条件下避光孵育20min；
（4）将酶标板置于多功能酶标仪上，得出标准品溶液的荧光值和待检测样品的荧光值；
（5）计算样品的抑制率，然后计算出样品浓度的对数值，进而求出该对数值的反对数，并乘以相应的稀释倍数，即为样品中铅离子的浓度。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：抑制率的计算方法如下：求出各标准品对应微孔荧光值的平均数B，除以标准浓度为0ng/ml时荧光值的平均值B0，计算得到样品的抑制率B/B0。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于：所述一定浓度梯度的铅离子标准品溶液的浓度分别为0、1、3、9、27、81ng/ml。
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