CN104597022B - 一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体是一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法。其检测的原理为将核酸适体5′末端标记上荧光基团，设计了一段与核酸适配体互补杂交的序列并在3′末端标记猝灭基团，核酸适体与互补序列杂交时荧光信号很弱，水胺硫磷、丙溴磷识别结合核酸适体时会引起互补序列解离而荧光信号增强，利用荧光信号的变化来建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围，根据标准曲线判断样品中靶标分子的含量。该方法快速简单，具有较高的灵敏度和选择性，适用于样品中水胺硫磷和丙溴磷的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法。
背景技术
有机磷农药是我国杀虫剂的主体，国家标准规定农产品中有机磷农药的最大允许残留量为0.2mg/kg(GB/T5009.199-2003)。水胺硫磷为高毒禁用的农药，丙溴磷为限量使用的有机磷农药。但近年来，由于农药的不合理的使用，导致农产品中农药残留严重超标，引起的食物中毒事件逐渐增多，已严重的危害到我国的食品安全。2010年的毒豇豆事件就是高毒农药水胺硫磷的超范围使用引起的。农药残留的监控离不开快速、灵敏的检测技术。
核酸适体(Aptamer)是通过SELEX技术，从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中，反复筛选得到的。目前，越来越多的核酸适体在抗生素、重金属食源性致病菌、生物毒素等食品安全检测领域得以成功应用。经过多轮SELEX筛选得到的核酸适体本身不具有信号转换的功能，当其与靶分子结合时不能产生可以检测的信号，因此必须经过合理的修饰使其与靶分子特异性识别时能够转换成易于检测的物理信号，才能在分析检测中应用。结构转换信号核酸适体是Nutiu和Li提出的(Nutiu and Li，2003)，他们巧妙的将核酸适体构建到DNA杂交双链体系中，当没有靶标分子存在时，DNA双链的杂交使荧光基团和猝灭基团靠近，荧光基团的荧光被猝灭，荧光强度很低，当靶标分子存在时，由于核酸适体和靶标分子的特异性结合形成适体-靶分子的复合物，使得荧光基团和猝灭基团远离，荧光强度增强。这种方法可以将荧光基团和淬灭基团灵活地设计在不同的杂交位置，非常灵活和方便。
目前核酸适体仿生分子识别体系的研究在国际、国内均受到广泛重视，相关研究进展不断出现，但是在食品安全领域中的应用仍处于起步阶段。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的欠缺之处，本发明要解决的技术问题是提供一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法，利用核酸适体的特异性识别作用，建立基于核酸适体结构转换信号的荧光检测方法，实现对水胺硫磷与丙溴磷的检测。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法，基于核酸适体结构转换信号，包括如下步骤：
1)、将核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B杂交；
2)、加入标准品、样品组进行反应，并预留空白实验作为对照组，标准品含有系列浓度的水胺硫磷和丙溴磷；
3)、检测各体系的荧光强度，计算荧光强度的变化；
4)、建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围；
所述核酸适体F-ssDNA是5′末端标记荧光基团FAM的识别水胺硫磷和丙溴磷的35个碱基的单链DNA，序列为：
5′-FAM-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3′；
所述互补序列Q-B是3′末端标记DABCYL的15个碱基的单链DNA，序列为：
5′-GAATCGCTGCAGCAA-DABCYL-3′；
所述互补序列Q-B与核酸适体F-ssDNA杂交的部位从核酸适体5′末端起第4个碱基至第18个碱基，杂交后双链的序列为：
所述步骤1)中核酸适体F-ssDNA、互补序列Q-B的缓冲溶液为A buffer缓冲体系(Abuffer缓冲体系组成为300mmol/L NaCl、50mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、50mmol/L Tris，体系pH值为8.3)。
所述步骤1)中核酸适体F-ssDNA的浓度为0.1μmol/L，互补序列Q-B的浓度为0.2μmol/L，核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B的摩尔比为1：2，体积比为1：1。
所述步骤1)中核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B的杂交条件为避光的室温下杂交20min。
所述步骤2)中对照组、标准品、样品组的缓冲体系为含有1％(体积百分比)丙酮的A buffer缓冲体系，对照组、标准品和样品组与步骤1)杂交后体系的体积比均为1：1。
所述步骤2)中的反应时间为60min。
所述步骤3)中荧光强度检测的方法为：取体积为100μL的检测样液，加入黑色96孔板，在多功能读板机上进行，激发波长为485nm、发射波长为535nm。
样品组前处理：取待测蔬菜样品，擦去表面泥土后研碎，取1g放入试管中，加入5mL丙酮，室温下超声波振荡提取10min，过滤，在沸水浴上将丙酮挥发干，用1mL含有1％丙酮的A buffer振荡溶解提取物，过0.45μm滤膜后待测。
本发明的基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法，将识别水胺硫磷、丙溴磷的核酸适体5′末端标记荧光基团，设计了一段15个碱基3′末端标记猝灭基团的互补序列，核酸适体与互补序列杂交时荧光信号很弱，水胺硫磷、丙溴磷识别结合核酸适体时会引起互补序列解离而荧光信号增强，利用荧光信号的变化可以检测分析水胺硫磷、丙溴磷，本发明正是利用该原理建立了基于核酸适体结构转换信号的水胺硫磷、丙溴磷的检测方法。
具体检测样品中水胺硫磷和丙溴磷的方法为：将核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B杂交，加入系列浓度的水胺硫磷和丙溴磷使互补序列与核酸适体解离，根据体系荧光强度的变化来建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围，根据标准曲线判断样品中靶标分子的含量。
本发明的基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法快速简单，具有较高的灵敏度和选择性，适用于样品中水胺硫磷和丙溴磷的快速检测，对水胺硫磷的检测线性范围为50-500μmol/L，检出限为30.224μmol/L；对丙溴磷的检测线性范围为100-500μmol/L，检出限为86.874μmol/L。
附图说明
图1是本发明的检测原理图。
图2是水胺硫磷检测的标准曲线。
图3是丙溴磷检测的标准曲线。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不仅限于实施例，在未脱离本发明宗旨的前提下，所作的任何改进均落在本发明的保护范围之内。
基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法，请一并参阅图1，具体步骤如下：
1)、将核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B杂交。
核酸适体F-ssDNA是5′末端标记荧光基团FAM的识别水胺硫磷和丙溴磷的35个碱基的单链DNA，序列为：
5′-FAM-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3′。
互补序列Q-B是3′末端标记DABCYL的15个碱基的单链DNA，序列为：
5′-GAATCGCTGCAGCAA-DABCYL-3′。
互补序列Q-B与核酸适体F-ssDNA杂交的部位从核酸适体5′末端起第4个碱基至第18个碱基，杂交后双链的序列为：
核酸适体F-ssDNA、互补序列Q-B的缓冲溶液为A buffer缓冲体系(A buffer缓冲体系组成为300mmol/L NaCl、50mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、50mmol/L Tris，体系pH值为8.3)。
核酸适体F-ssDNA的浓度为0.1μmol/L，互补序列Q-B的浓度为0.2μmol/L，核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B的摩尔比为1：2，体积比为1：1。
核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B的杂交条件为避光的室温下杂交20min。
2)、加入标准品、样品组进行反应，并预留空白实验作为对照组，标准品含有系列浓度的水胺硫磷和丙溴磷。
对照组、标准品、样品组的缓冲体系为含有1％(体积百分比)丙酮的A buffer缓冲体系，对照组、标准品和样品组与步骤1)杂交后体系的体积比均为1：1，杂交后体系与标准品、样品组反应时间为60min。
样品组的前处理步骤为：取待测蔬菜样品，擦去表面泥土后研碎，取1g放入试管中，加入5mL丙酮，室温下超声波振荡提取10min，过滤，在沸水浴上将丙酮挥发干，用1mL含有1％丙酮的A buffer振荡溶解提取物，过0.45μm滤膜后待测。
3)、检测各体系的荧光强度，计算荧光强度的变化。
取体积为100μL的检测样液，加入黑色96孔板，在多功能读板机上进行，激发波长为485nm、发射波长为535nm。
4)、建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围。
对水胺硫磷和丙溴磷检测的标准曲线分别如图2、3所示，由此可知，对水胺硫磷的检测线性范围为50-500μmol/L，线性回归方程为y＝227.20x+33325，线性回归系数为0.9978，检出限为30.224μmol/L。对丙溴磷的检测线性范围为100-500μmol/L，线性回归方程为y＝195.20x-18519，线性回归系数为0.9975，检出限为86.874μmol/L。
以上内容仅仅是对本发明的结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种基于核酸适体的水胺硫磷和丙溴磷的荧光检测方法，基于核酸适体结构转换信号，其特征是包括如下步骤：
1)、将核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B杂交；
核酸适体F-ssDNA是5′末端标记荧光基团FAM的识别水胺硫磷和丙溴磷的35个碱基的单链DNA，序列为：
5′-FAM-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3′；
互补序列Q-B是3′末端标记DABCYL的15个碱基的单链DNA，序列为：
5′-GAATCGCTGCAGCAA-DABCYL-3′；
互补序列Q-B与核酸适体F-ssDNA杂交的部位从核酸适体5′末端起第4个碱基至第18个碱基，杂交后双链的序列为：
核酸适体F-ssDNA、互补序列Q-B的缓冲溶液为A buffer缓冲体系(A buffer缓冲体系组成为300mmol/L NaCl、50mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、50mmol/L Tris，体系pH值为8.3)；
核酸适体F-ssDNA的浓度为0.1μmol/L，互补序列Q-B的浓度为0.2μmol/L，核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B的摩尔比为1：2，体积比为1：1；
核酸适体F-ssDNA与互补序列Q-B的杂交条件为避光的室温下杂交20min；
2)、加入标准品、样品组进行反应，并预留空白实验作为对照组，标准品含有系列浓度的水胺硫磷和丙溴磷；
对照组、标准品、样品组的缓冲体系为含有1％(体积百分比)丙酮的A buffer缓冲体系，对照组、标准品和样品组与步骤1)杂交后体系的体积比均为1：1，杂交后体系与标准品、样品组反应时间为60min；
样品组的前处理步骤为：取待测蔬菜样品，擦去表面泥土后研碎，取1g放入试管中，加入5mL丙酮，室温下超声波振荡提取10min，过滤，在沸水浴上将丙酮挥发干，用1mL含有1％丙酮的A buffer振荡溶解提取物，过0.45μm滤膜后待测；
3)、检测各体系的荧光强度，计算荧光强度的变化；
取体积为100μL的检测样液，加入黑色96孔板，在多功能读板机上进行，激发波长为485nm、发射波长为535nm；
4)、建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围；
对水胺硫磷的检测线性范围为50-500μmol/L，线性回归方程为y＝227.20x+33325，线性回归系数为0.9978，检出限为30.224μmol/L；对丙溴磷的检测线性范围为100-500μmol/L，线性回归方程为y＝195.20x-18519，线性回归系数为0.9975，检出限为86.874μmol/L。
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