CN111593054B - 一种广谱性有机磷农药适配体及方法和应用 - Google Patents

一种广谱性有机磷农药适配体及方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种广谱性有机磷农药适配体及方法和应用，该适配体的核苷酸序列为如SEQ.ID NO 7所示的序列。本发明的适配体，能够识别多种有机磷农药，且亲和力均比现有适配体有所提高，而且S4‑29仅具有29个碱基，序列较短，合成成本低，更有利于传感器的构建，能够应用于有机磷农药检测，检测的农药浓度范围为0.001～100nM，而且甲拌磷、氧化乐果、丙溴磷的浓度与信号值呈良好的线性关系，检测限分别为0.0016nM、0.0013nM、0.00125nM。

Description

一种广谱性有机磷农药适配体及方法和应用
技术领域
本发明涉及一种适配体，具体涉及一种广谱性有机磷农药适配体及方法和应用。
背景技术
有机磷农药是我国目前使用范围最广、用量最大的农药，可分为剧毒、高毒、中毒、低毒四类，人体接触少量的剧毒及高毒类即可中毒，且低毒类的大量进入体内亦可发生危害。因此，为保证人体的健康，建立高效、方便快捷的有机磷农药残留的检测方法具有重要意义。
适配体是二十世纪九十年代发展起来的新型检测元件，由DNA或RNA组成，通过折叠形成特定的三维结构，与靶标分子进行空间构象识别，具有高亲和力和高特异性。适配体在有机磷农药的检测中，有机磷农药是化学小分子，适配体结合有机磷农药，多余的核酸序列可能形成复杂的高级构象，反而不利于适配体识别；过长的核酸序列也不利于检测方法的构建，还增加合成成本。因此，更好的亲和力适配体的选择和核酸探针的合理设计是提高适配体的选择性尤为重要，也有利于适配体传感器的构建。
目前，张存政等人公开了基于分子信标的有机磷农药适配体活性位点分析及改造，通过逐步切除两条适配体二级结构中的茎环结构，通过比较分析其重要的茎环结构，截断其余茎环结构，把两条序列的重要结构重新组合形成一条新的适配体，序列长度由55个碱基截短至35个碱基，得到适配体S24，序列为5’-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3’，其二级结构为：
Figure BDA0002523187550000021
上述适配体的检测原理主要是：在无靶标(农药)存在时，分子信标(分子信标是一个简单的发夹结构，与适配体部分互补配对，两端分别携带荧光基团和荧光淬灭基团)与适配体互补配对，荧光强度较高；有靶标存在时，靶标与分子信标竞争结合适配体，荧光强度降低，与靶标浓度呈负相关。该检测方法的检测限为0.005mg/L，检测范围0.005-10.0mg/L。该方法实验繁琐、效率低，且截短后的适配体对部分农药的亲和力降低，而且检测方法灵敏度低，检测范围较窄。
发明内容
本发明的目的是提供一种广谱性有机磷农药适配体及方法和应用，解决了现有适配体检测灵敏度低的问题，能够提高与农药之间的亲和力，灵敏度高，且检测范围宽。
为了达到上述目的，本发明提供了一种广谱性有机磷农药适配体，该适配体的核苷酸序列为如SEQ.ID NO 7所示的序列。
优选地，核苷酸序列为如SEQ.ID NO 7所示的适配体，其二级结构为：
Figure BDA0002523187550000031
本发明的另一目的是提供一种所述的适配体在检测有机磷农药方面的应用。
优选地，所述有机磷农药的结构式为：
Figure BDA0002523187550000032
其中，A和A’各自独立地选自短链的烷氧基、烷硫基、芳氧基和胺基中任意一种；R选自脂肪烃基或芳香烃基；X和Y各自独立地选自O或S。
优选地，所述有机磷农药包含：水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷和氧化乐果中任意一种或两种以上。
本发明的另一目的是提供一种检测有机磷农药的方法，该方法包含：
将核壳型纳米磁珠Fe3O4@PPy加入5’端标记有6-羧基荧光素(FAM)的所述的适配体中，磁分离去除游离适配体，得到适配体与Fe3O4@PPy的复合物；
将所述复合物于结合缓冲液中，加入所述的有机磷农药，在室温下振荡孵育；待孵育结束后，磁分离，保留上清液，测定荧光强度。
本发明的方法，适配体通过π-π堆积作用吸附至Fe3O4@PPy表面，FAM荧光被淬灭，通过磁分离过程去除游离适配体，此时荧光强度最低。加入靶标有机磷农药之后，Fe3O4@PPy表面的适配体优先与有机磷农药结合，并被触发打开结构，形成有机磷农药-适配体复合物，抑制PPy吸附适配体，这种作用使Fe3O4@PPy释放5’端标记有6-羧基荧光素的适配体，荧光强度得到恢复。
优选地，该方法还包含：将所述复合物于结合缓冲液中，不加有机磷农药，在室温下振荡孵育；待孵育结束后，磁分离，保留上清液，测定荧光强度；将未加有机磷农药测定的荧光强度记为F1，将加有机磷农药测定的荧光强度记为F2；通过计算相对荧光强度[(F2-F1)/F1]来评估输出信号。
优选地，所述复合物，经核壳型纳米磁珠Fe3O4@PPy与适配体室温孵育，荧光淬灭，再磁分离后获得。
优选地，所述荧光强度由酶标仪测定，激发波长为485nm，发射波长为535nm。
优选地，该方法对有机磷农药的检测浓度范围为0.001～100nM。
本发明的广谱性有机磷农药适配体及方法和应用，解决了现有适配体检测灵敏度低的问题，具有以下优点：
本发明的适配体，能够识别多种有机磷农药，且亲和力均比现有适配体有所提高，而且S4-29仅具有29个碱基，序列较短，合成成本低，更有利于传感器的构建，能够应用于有机磷农药检测，如在食品(砂糖桔)中有机磷农药检测。
本发明的检测方法，能够检测的农药浓度范围为0.001～100nM，而且甲拌磷、氧化乐果、丙溴磷的浓度与信号值呈良好的线性关系，检测限分别为0.0016nM、0.0013nM、0.00125nM。
附图说明
图1为本发明实施例1及对比例1的适配体和现有适配体S4-54的二级结构图。
图2为本发明实施例1及对比例1的适配体和现有适配体S4-54和S24的结合曲线图。
图3为本发明的适配体S4-29和现有适配体S4-54的特异性实验结果。
图4为本发明的氧化乐果、甲胺磷或丙溴磷的荧光强度的变化结果。
注：图2中，A为各适配体对水胺硫磷的结合曲线图，B为各适配体对丙溴磷的结合曲线图，C为各适配体对甲拌磷的结合曲线图，D为各适配体对氧化乐果的结合曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种广谱性有机磷农药适配体，该适配体的核苷酸序列为如SEQ.ID NO7(S4-29)所示的序列，序列如下表1所示。
其中，适配体S4-29是在对比例1的适配体S4-27-1的基础上，经增加碱基获得的。
对比例1
一种有机磷农药适配体，该适配体的核苷酸序列为如SEQ.ID NO 2(S4-16)、SEQ.ID NO 3(S4-21)、SEQ.ID NO 4(S4-24)、SEQ.ID NO 5(S4-27)和SEQ.ID NO 6(S4-27-1)中任意一种所示的序列，该适配体的序列为通过对适配体S4-54的改进获得的，序列如下表1所示。其中，适配体S4-16是在适配体S4-54的基础上，经缺失38个碱基获得的。适配体S4-21是在适配体S4-54的基础上，经缺失33个碱基获得的。适配体S4-24是在适配体S4-54的基础上，经缺失30个碱基获得的。适配体S4-27是在本领域已知的现有适配体S4-54(核苷酸序列为如SEQ.ID NO 1所示)的基础上，经缺失27个碱基获得的。适配体S4-27-1是在适配体S4-27的基础上，经突变一个碱基获得的。
表1本发明实施例1的适配体与S4-54及对比例1的适配体的序列
Figure BDA0002523187550000051
Figure BDA0002523187550000061
实验例1适配体的结合自由能
如图1所示，为本发明实施例1与S4-54及对比例1的适配体的核苷酸序列的二级结构图，通过二级结构再获得适配体模型3D结构，并完成RNA与DNA结构的转换。优化农药(水胺硫磷、氧化乐果、甲胺磷和丙溴磷)结构，将优化的配体(农药结构)与适配体对接，得到复合适配体-配体结构的三维结构。
分子对接后得到结合自由能，如表2所示，以现有适配体S4-54和S24作为对照，可以看出，对比例1的适配体S4-16、S4-21和S4-24的结合能力均比现有适配体S4-54较差，较S24有所提高；适配体S4-27和S4-27-1较现有适配体S4-54对甲拌磷的结合能力有所提高，较S24对氧化乐果、甲胺磷和丙溴磷均有所提高；适配体S4-29较现有适配体S4-54和S24对水胺硫磷、氧化乐果、甲胺磷和丙溴磷的结合能力都有所提高。
表2本发明适配体及现有适配体S4-54和S24与配体对接后得到的结合自由能
Figure BDA0002523187550000062
实验例2适配体的亲和力分析
对本发明的适配体S4-16、S4-21、S4-24和S4-29及和现有适配体S4-54的亲和力进行分析，适配体在5’端标记荧光基团FAM，具体如下：
首先，用结合缓冲液(50mmol/L Tris、50mmol/L NaCl、10mmol/L KCl和10mmol/LMgCl2，pH 8.0)把适配体稀释至一定浓度，在90℃变性5min，立即冰浴。接着，用结合缓冲液制备高浓度的农药溶液，农药为水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷或氧化乐果，使用高浓度的农药溶液作为配体的最高浓度，并在10μL样品体积中使用1:1系列稀释策略制备16个样品。然后，每个样品中加入10μL的适配体溶液。所有样品室温避光反应30min，上样测定亲和力。
非线性拟合确定各适配体序列的解离常数KD值，见下表3，其结合曲线如图2所示。可以看出，相对现有适配体S4-54和S24，S4-29对水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷和氧化乐果的结合能力均有所提高，而且对丙溴磷的结合能力显著提高。
表3各适配体序列的解离常数KD值
Figure BDA0002523187550000071
注：未标明数值单位的，单位均为μM。
实验例3有机磷农药适配体的特异性分析
对本发明的适配体S4-29和现有适配体S4-54比较分析对水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷和氧化乐果四种农药的特异性，具体如下：
称取GO(氧化石墨烯)片层经超声分散配成GO水溶液，于室温保存待用。将5’-FAM标记的适配体与100nM的四种农药分别于25℃振荡孵育60min，并同时做空白对照。然后，加入一定浓度的GO水溶液，继续震荡20min，使荧光淬灭。
序列表
<110> 西华大学
<120> 一种广谱性有机磷农药适配体及方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aagctttttt gactgactgc agcgattctt gatcgccacg gtctggaaaa agag 54
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cttttttgag aaaaag 16
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aagctttttt gagaaaaaga g 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcttttttga ctgctggaaa aaga 24
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aagctttttt gactgctgga aaaagag 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aagctttttt gactgcagga aaaagag 27
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aagctttttt gactgcaggt gaaaaagag 29

Claims (8)

1.一种广谱性有机磷农药适配体，其特征在于，该适配体的核苷酸序列为如SEQ.ID NO7所示的序列。
2.根据权利要求1所述的广谱性有机磷农药适配体，其特征在于，核苷酸序列为如SEQ.ID NO 7所示的适配体，其二级结构为：
Figure FDA0003296160990000011
3.一种如权利要求1或2所述的适配体在检测有机磷农药方面的应用，其特征在于，所述有机磷农药选自水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷和氧化乐果中任意一种或两种以上。
4.一种检测有机磷农药的方法，其特征在于，该方法包含：
将核壳型纳米磁珠Fe3O4@PPy加入5’端标记有6-羧基荧光素的如权利要求1或2所述的适配体中，磁分离去除游离适配体，得到适配体与Fe3O4@PPy的复合物；
将所述复合物于结合缓冲液中，加入如权利要求3中所述的有机磷农药，在室温下振荡孵育；待孵育结束后，磁分离，保留上清液，测定荧光强度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法还包含：将所述复合物于结合缓冲液中，不加有机磷农药，在室温下振荡孵育；待孵育结束后，磁分离，保留上清液，测定荧光强度；
将未加有机磷农药测定的荧光强度记为F1，将加有机磷农药测定的荧光强度记为F2；通过计算相对荧光强度[(F2-F1)/F1]来评估输出信号。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述复合物，经核壳型纳米磁珠Fe3O4@PPy与适配体室温孵育，荧光淬灭，再磁分离后获得。
7.根据权利要求4-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述荧光强度由酶标仪测定，激发波长为485nm，发射波长为535nm。
8.根据权利要求4-6中任意一项所述的方法，其特征在于，该方法对有机磷农药的检测浓度范围为0.001～100nM。
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