CN103224936B - 一组特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素a的核酸适配体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体，属于食品安全生物技术领域。针对现有技术中尚无金黄色葡萄球菌肠毒素A核酸适配体的缺陷，本发明通过SELEX技术12轮的反复筛选、亲和力和特异性试验的分析验证，获得了一组与金黄色葡萄球菌肠毒素A亲和性和特异性均良好的核酸适配体。该组核酸适配体为分析检测食品或环境中的金黄色葡萄球菌肠毒素A提供了一种特异高效的识别配体，为开发替代现有依赖抗体检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全生物技术领域，具体是指利用分子生物学和体外化学合成结合的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一组与金黄色葡萄球菌肠毒素A高特异性高亲和力的核酸适配体，为基于核酸适配体识别-金黄色葡萄球菌肠毒素A的新型检测技术发展提供科学依据和理论基础。
背景技术
金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcus aureus Enterotoxins，简称SEs)是一组由金黄色葡萄球菌分泌到细胞外的小分子量(26-30kDa)耐热性蛋白质毒素。由该肠毒素引起的食物中毒在细菌性食物中毒中占有相当高的比例，是一个世界性公共卫生问题，其中75％以上是由金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)引起的，其次依次是SED、SEC和SEB。该类肠毒素的中毒症状主要表现为在摄入2-6小时内出现恶心、呕吐、腹泻等不良反应，通常在24小时内症状减弱。在个别案例中，具有超抗原特性的SEs会引起严重的过敏和自身免疫反应，甚至引起毒性-休克综合症。由于以上这些原因，SEs不仅是食品安全危害，如果将SEs纯化后蓄意添加入食物中，还构成了食品安全恐怖。快速、准确、直接的检测食品中的SEA，进而有效预防和控制食物污染，一直是食品安全生物技术科学家及有关科研工作者所追求的目标。
迄今为止，SEA的检测方法主要基于免疫反应，涉及应用抗体识别毒素抗原。抗体一般需要通过实验动物或杂交瘤细胞获得，制备费时且成本高，而且所得抗体与其他蛋白一样易受温度影响，使得检测方法的发展和实际应用很受限制。核酸适配体是一种相对于抗体特异性更强、稳定性更高、更易于合成和修饰的低成本新型分子识别元件，可通过SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，即配体指数富集的系统进化)体外筛选获得。如能筛选得到SEA特异识别核酸适配体，即可取代以抗体为识别元件的传统细菌毒素检测技术方法，构建以核酸适配体为识别元件的新型高效检测方法。
目前，国内外已有的通过SELEX技术筛选得到蛋白类靶物质核酸适配体相关报道主要包括凝血酶、IgE、HIV-1逆转录酶、神经肽Y、蓖麻毒素、肉毒杆菌毒素、前列腺特异抗原、DNA-脱烷烃酶和金黄色葡萄球菌肠毒素B等，未见关于金黄色葡萄球菌肠毒素A核酸适配体序列报道。而SEA抗体难以获得且制备成本昂贵，使用时受到诸多条件约束，适配体相对于抗体的优势更为显著，但其优势在该方面研究中还未得到利用，因此相关研究工作亟需加强。
发明内容
本发明的目的在于提供一组能与金黄色葡萄球菌肠毒素A特异性结合的核酸适配体序列，并用于开发细菌毒素新型检测方法，特别涉及基于该组核酸适配体识别、快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法，从而克服现有技术中的不足。
为实现上述发明目的，本发明方法利用SELEX技术，以金黄色葡萄球菌肠毒素A为靶标，筛选获得与靶标高亲和性、高特异结合的适配体，通过羧基荧光素(FAM)标记等荧光标记技术实现对食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素A的高效检测。
本发明的优点：
(1)与抗体相比，核酸适配体更为稳定，可直接大量体外合成、功能化修饰，制备方法简单、成本低廉，操作更加方便。
(2)该组序列是从保守序列显著、二级结构稳定且与目标毒素具有不同亲和力的10条适配体序列中选取出的亲和力、特异性均表现优秀的一组核酸适配体序列，能够特异识别金黄色葡萄球菌肠毒素A。
附图说明
图1是A1、A15、A23.2核酸适配体的二级结构图
图2是A1、A15、A23.2核酸适配体的饱和结合曲线图
图3是A1、A15、A23.2核酸适配体的特异性试验结果
具体实施方式
本案发明人经长期和实践发现，单链核酸碱基之间存在的相互作用可使其形成很多可能的空间结构，包括发卡、假结、凸环以及G-四链体等，这些结构易于与各种靶分子发生构象结合。基于这种构象识别，采用一个足够容量(1014-1015)的核酸文库能够包容尽可能的立体结构，因此有可能从中筛选得到任何种类靶物质的高亲和力适配体。利用SELEX技术，靶毒素SEA对每轮筛选核酸文库的指数级进化富集作用，通过数十轮重复筛选，反筛与负筛相结合，最终获得亲和力高且特异性好的核酸适配体序列。
根据上述发现，本案发明人提出了一组通过SELEX技术筛选得到与金黄色葡萄球菌肠毒素A特异结合的核酸适配体序列。下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不限制本发明。
竞争SELEX筛选金黄色葡萄球菌肠毒素A的特异性结合核酸适配体，方法大致如下：
(1)体外化学合成初始随机单链DNA(ssDNA)文库及引物
序列如下：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG(40N)CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′(由美国Integrated DNA Technologies公司完成)；构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40nt的随机序列，库容量为1014以上；
上游引物：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′；
下游引物：5′-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′；
5′-磷酸化下游引物：5′-P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3′；
将随机ssDNA文库、上游引物和5′-磷酸化下游引物均用TE缓冲液配制成100μM贮存液于-20℃贮存备用。
(2)SELEX筛选
首轮将2nmol随机单链文库溶于500μL结合缓冲液，热变性约5分钟，冰浴数分钟后加入已经结合缓冲液洗涤数次、偶联了金黄色葡萄球菌肠毒素A的磁纳米粒子(即磁珠)，37℃缓慢振荡，孵育1小时。磁性分离上清，结合缓冲液冲洗磁珠数次，热解离洗脱，将洗脱液作为模板进行不对称PCR，上下游引物浓度比例范围为10∶1-100∶1。PCR结果通过PAGE电泳验证，出现唯一的80-nt目标条带并将扩增产物合并作为待切产物，用于单链制备。采用Lambda核酸外切酶消化法将待切产物进行酶切反应，灭酶后将酶切产物经尿素变性PAGE电泳验证，稀释后的80-nt核酸单链文库作为对照，出现唯一的与对照条带一致酶切产物即可进行纯化。采用饱和酚提纯、乙醇沉淀法对制备的核酸单链文库纯化，复溶后经NanoDrop2000超微量分光光度计测定ssDNA浓度，定量200pmol投入下一轮筛选。从第四轮开始，每轮先进行负筛，循环反复，直到第十二轮进行反筛(SEC1等类似物作为反筛靶标)。将第十二轮筛选得到的核酸适配体PCR结果送至上海博尚生物技术有限公司进行克隆测序，获得40条核酸单链序列。采用DNAMAN软件对核酸单链序列进行一级结构分析，获得40条序列的同源性信息；同时进行同源树分析，依据序列之间的同源性、保守序列的显著性将该40条序列分为10个家族。然后用RNA Structure4.2软件对核酸适配体序列的二级结构(如说明书附图1所示)的稳定性进行分析。结合两种软件的分析结果，从每个家族中挑选出一条能级较低、结构稳定、保守序列集中的序列为代表，由上海生工生物技术公司合成5′-FAM荧光标记的核酸适配体序列，以作进一步的亲和力、特异性分析。
(3)一组金黄色葡萄球菌肠毒素A核酸适配体的亲和力分析
将合成的10条FAM荧光标记的金黄色葡萄球菌肠毒素A适配体均用结合缓冲液稀释成100nM贮存液于-20℃贮存备用。将该10条适配体分别进行浓度梯度稀释，范围为10-300nM，体积各500μL。取等量偶联金黄色葡萄球菌肠毒素A的磁珠悬浮液经结合缓冲液冲洗，将热变性后冰浴处理过的适配体梯度溶液与磁珠37℃孵育1小时，磁性分离后用结合缓冲液洗涤数次，热解离洗脱两次，将洗脱液合并后用Hitachi F-7000荧光光谱仪测定荧光强度。每个数据做三个平行样，整个过程注意避光操作。
将测得的荧光强度值利用GraphPad Prism5软件计算各适配体的解离常数Kd值，如下表所示，并绘制其饱和结合曲线，如说明书附图2所示。
(4)一组金黄色葡萄球菌肠毒素A核酸适配体的特异性分析
根据上述亲和力分析的结果，挑选A1、A15、A23.2(分别对应于序列表中序列1、2、3)三条金黄色葡萄球菌肠毒素A适配体进行特异性分析。基于氧化石墨烯吸附核酸适配体使其荧光标记淬灭、靶物质加入体系后引起适配体构象变化进行折叠从而脱离氧化石墨烯表面引起荧光恢复的原理，根据靶物质引起恢复的荧光强度大小进行特异性分析。首先对淬灭FAM标记核酸适配体所需氧化石墨烯用量进行摸索，取50pmol核酸适配体溶液300μL，氧化石墨烯通过结合缓冲液进行梯度稀释，范围为30-180ng/μL，确定氧化石墨烯用量的临界值。将上述体系于37℃缓慢振荡20分钟，再加入等量蛋白类物质：SEA、SEB、SEC1、IgG、BSA和干酪素于37℃孵育45分钟，同时做一个空白对照(不加蛋白类物质)，用Hitachi F-7000荧光光谱仪测定荧光强度。每个数据做三个平行样，整个过程注意避光操作。
将测定的荧光强度值利用GraphPad Prism5软件作出结果分析图，显示金黄色葡萄球菌肠毒素A适配体与靶毒素SEA的结合力和特异性良好，如说明书附图3所示。
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一组特异性识别金黄色葡萄球菌肠毒素A的核酸适配体，其特征在于：所述的核酸适配体为序列表SEQ ID NO：1-3所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A适配体，其特征在于其5′-端或3′-端进行生物素、FITC、FAM、巯基、地高辛的化学修饰。
3.如权利要求1或2所述金黄色葡萄球菌肠毒素A核酸适配体在分离富集或分析检测金黄色葡萄球菌肠毒素A中的非疾病诊断和治疗方法应用。
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