CN104845975A - 小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体多肽片段的dna核酸适体 - Google Patents
小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体多肽片段的dna核酸适体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体多肽片段Pro-GRP31-98的DNA核酸适体序列，涉及化学生物学技术领域。该DNA核酸适体序列是通过基于亲和磁珠分离法的SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，通过指数富集对配体的系统进化）筛选方法，从单链DNA文库中筛选出来；然后对筛选出的DNA适体文库经PCR扩增后，以大肠杆菌为受体细胞通过基因克隆技术对DNA适体文库中的DNA核酸适体进行分离；最后通过测序技术对各条DNA核酸适体进行测序得到的。结合实验结果表明：本发明得到的DNA核酸适体序列与胃泌素释放肽前体片段高亲和度高特异性结合。
Description
技术领域
本发明涉及化学生物学技术领域，更具体地说是涉及小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体多肽片段的DNA核酸适体的序列筛选。
背景技术
核酸适体(Aptamers)是从大容量的随机寡核苷酸序列库中针对非核酸靶分子选择得到的能与该靶分子高亲合度高特异性结合的单链DNA或RNA分子，是通过体外重复的吸附、恢复、再放大过程，从而实现对与靶分子相结合的寡核苷酸序列的指数富集而得到的。这种选择核酸适体的方法叫SELEX(SystematicEvolution of Ligands by Exponential enrichment，通过指数富集对配体的系统进化)，在1990年分别由Tuerk and Gold(文献：C.Tuerk,L.Gold,Systematic evolutionof ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNApolymerase,Science,1990,249:505-510)以及Ellington and Szostak(文献：A.D.Ellington,J.W.Szostak,In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands,Nature 1990,346:818-822)两个研究小组独立报导。核酸适体除了具有与抗体相似的对靶分子的高亲合度和高特异性结合外，还具有如下抗体所不具备的优点：1)容易生产，生产周期短；2)靶分子适应范围宽：核酸适体的靶分子包括各种蛋白质(酶、膜蛋白、病毒蛋白、细胞因子和生长因子、免疫球蛋白等)、氨基酸、药物、金属离子、其他生物/无机/有机小分子、以及整个细胞，而抗体只能被用于免疫源性化合物；3)生产成本低；4)易于修饰；5)化学稳定性以及热稳定性强，储存寿命长。核酸适体自出现以后，就得到了各个领域的广泛关注，特别是近年来在生物传感器、新药开发等领域的应用取得了一定的成果。最近，小细胞肺癌标志物胃泌素释放肽前体(pro-gastrin-releasing peptide，Pro-GRP(1–98a.a.))的DNA核酸适体被报道(M.Mie,T.Kai1,T.Le,A.E.G.Cass,E.Kobatake,Selection of DNA aptamers with affinity for pro-gastrin-releasingpeptide(proGRP),a tumor marker for small cell lung cancer,Applied Biochemistryand Biotechnology,2013,169:250-255)。Pro-GRP是一种小细胞肺癌肿瘤标志物。研究表明，Pro-GRP的活性位点位于其31-98a.a，因而，Pro-GRP的31-98a.a.多肽片段(Pro-GRP31-98)是一种新的、敏感、特异、可靠的小细胞肺癌肿瘤标志物。目前未见筛选Pro-GRP31-98的DNA核酸适体序列的相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供针对Pro-GRP31-98的DNA核酸适体序列，为后期生物传感器、临床诊断试剂研发提供方便。
为实现本目的，本发明通过基于亲和磁珠分离法的SELEX筛选方法，从单链DNA(ssDNA)文库中筛选出Pro-GRP31-98的DNA核酸适体文库，然后对筛选出的DNA适体文库经聚合酶链式反应(PCR)扩增后，以大肠杆菌为受体细胞通过基因克隆技术对DNA适体文库中的DNA核酸适体进行分离，通过测序技术确定各条DNA核酸适体的序列，最后通过电化学发光(ECL)法，以[Ru(bpy)2dppz]2+为DNA分子开关和ECL试剂，对各条DNA核酸适体针对Pro-GRP31-98的结合特异性和结合力进行分析检测，确定针对Pro-GRP31-98的高亲和力、特异性DNA核酸适体序列。
原理及具体技术方案如下：
SELEX筛选过程由构建DNA文库、孵育、分离和PCR扩增四个步骤组成。其中孵育、分离和PCR扩增步骤交替重复12次。构建的DNA文库序列为：5'-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-(48nt)-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3'。
DNA文库序列委托生物技术公司化学合成。然后将Pro-GRP31-98通过酰胺键固定在羧基修饰的磁珠上，与合成的随机DNA文库孵育。经磁力吸附将孵育后的磁珠与溶液分离。然后以结合寡核苷酸的磁珠为PCR扩增的模板，用荧光修饰的正向引物和生物素修饰的反向引物进行PCR扩增。该PCR扩增过程在DNA文库中引入荧光标记，并同时在DNA文库的互补链上引入生物素。PCR扩增后得到的荧光/生物素修饰的双链DNA与链霉亲和素修饰的磁珠通过形成链霉亲和素-生物素复合物进行结合。然后通过碱变性和磁力吸附分离得到荧光ssDNA文库。分离得到的荧光ssDNA文库进入下一轮的孵育、分离和PCR扩增程序。在筛选过程中，与荧光ssDNA文库孵育后的Pro-GRP31-98包被磁珠在分离后进行荧光检测以实时监测筛选的进程。
上述筛选过程进行6轮后每隔1-3轮将上轮得到的荧光ssDNA文库与固定了牛血清白蛋白的磁珠以及固定了牛胰岛素的磁珠分别孵育，进行反筛，以提高DNA适体文库对酶切的结合特异性。经磁力吸附将孵育后的磁珠与溶液分离，然后将得到的溶液作为荧光ssDNA文库进入下一轮的孵育、分离和PCR扩增程序。
最后，经12轮筛选后得到的DNA适体文库经PCR扩增后，利用TA克隆，克隆到T载体中，转化Trans5α感受态大肠杆菌受体细胞，在含有Amp(Amp终浓度为100μg/ml)，IPTG和X-gal的LB固体培养基上37℃培养过夜，通过蓝白斑筛选阳性克隆。然后从过夜培养的平板上挑取白色菌落，用通用引物做菌落PCR验证克隆的阳性。挑选阳性重组子接种于含有Amp的LB液体培养基中37℃振荡过夜，提取质粒进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶，进一步鉴定克隆的阳性。对阳性克隆进行测序，得到Pro-GRP31-98的核酸适体序列。
经过序列同源性比对和OligoAnalyzer 3.1在线工具模拟二级结构分析，选择其中某些代表序列，并对其序列进行部分修改，对Pro-GRP31-98进行亲和力和结合特异性的检测及鉴定。
亲和力的检测及鉴定方法如下：
委托生物技术公司化学合成DNA核酸适体。将合成的DNA核酸适体用Binding Buffer(含100mM NaCl，20mM Tris-HCl，2mM MgCl2，5mM KCl，1mM CaCl2，和0.02％Tween 20，pH＝7.6)溶解。DNA溶液的标准浓度通过测定溶液在紫外可见光谱260nm波长处的吸光度，由Lambrt-Beer定律A＝ξ*c*L计算得到。式中A为吸光度、ξ为摩尔消光系数、c为溶液浓度、L为液层厚度。
然后，将10μL 100μM的DNA核酸适体的TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH＝8.0)溶液经热变性处理后与1mL 20μM的[Ru(bpy)2dppz]2+(bpy：联吡啶；dppz：二吡啶并吩嗪)的5mM草酸溶液室温混合，用玻碳电极和电化学发光分析仪实时检测记录该溶液的电化学发光信号。待信号稳定后(ECL0)，在溶液中梯度批量加入Pro-GRP31-98溶液，并检测记录不同Pro-GRP31-98浓度(C)下的稳定电化学发光信号(ECL1)。由药学公式ΔECL＝ΔECLmaxC/(Kd+C)，推导出1/ΔECL＝Kd/(ΔECLmaxC)+1/ΔECLmax。其中Kd为DNA核酸适体与Pro-GRP31-98的解离常数，ΔECL＝ECL0-ECL1。由1/ΔECL与1/C的线性关系直线，根据直线斜率与截距的比值计算得到DNA核酸适体与Pro-GRP31-98之间的Kd值。
结合特异性的检测及鉴定方法如下：
将10μL 100μM的DNA核酸适体的TE溶液经热变性处理后与1mL 20μM的[Ru(bpy)2dppz]2+的5mM草酸溶液室温混合混合，用玻碳电极和电化学发光分析仪实时检测记录该溶液的电化学发光信号(ECL0)。待信号稳定后，分别在溶液中加入50μL 1.2mg/ml的不同的蛋白质或多肽，包括Pro-GRP31-98、牛胰岛素(Insulin)、牛血清白蛋白(BSA)、和伴刀豆球蛋白(ConA)。在一次实验的溶液中只加入一种蛋白质或多肽。加入蛋白质或多肽后检测记录对应的稳定电化学发光信号(ECL1)。将不同蛋白质或多肽的(ECL0-ECL1)/ECL0值做柱方分析图。
本发明创新点在于：
1)通过SELEX技术，得到了1条与Pro-GRP31-98高亲和力、特异性结合的DNA核酸适体：Aptamer-18。其DNA见序列表。
2)对DNA核酸适体Aptamer-18的序列进行修改，得到另外2条针对Pro-GRP31-98的高亲和力、特异性DNA核酸适体：Aptamer-18＇和Aptamer-18〞。其DNA见序列表。
3)将上述三条DNA核酸适体针对Pro-GRP31-98进行亲和力和结合特异性检测实验，确定其是Pro-GRP31-98的高亲合度、高特异性DNA核酸适体。
4)通过对上述三条DNA核酸适体的二级结构进行比对，推断该三条DNA核酸适体与Pro-GRP31-98的主要结合位点为序列Aptamer-18B：5’-ccagatagtccctgg-3’。
本发明所述Pro-GRP31-98的DNA核酸适体DNA序列见序列表中NO1，NO2，NO3。NO1为Pro-GRP31-98核酸适体Aptamer-18的DNA序列；NO2为Pro-GRP31-98核酸适体Aptamer-18＇的DNA序列；NO3为Pro-GRP31-98核酸适体Aptamer-18〞的DNA序列。NO1，NO2，NO3序列长度为10nt到150nt。
附图说明
图1为通过蓝白斑筛选DNA适体文库阳性克隆实验后得到的部分白色菌落的PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图。图中从左到右的泳道依次为1-24号菌落和Marker。Marker的分子大小由上到下依次是5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。结果表明大部分白色菌落为阳性菌落，目的片段插入到了载体中，并且片段大小正确，为345bp。阳性菌落将用于下一步的质粒提取、酶切及测序。大于500bp的片段可能是由载体自连造成的。
图2是由阳性克隆提取的质粒DNA用EcoR I酶切后得到的产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图。图中从左到右的泳道依次为Marker和12个不同质粒酶切后的产物。Marker的分子大小由上到下依次是5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。酶切实验结果与理论上得到126bp和3004bp两条片段相符，进一步证明所选白色菌落为阳性菌落。
图3为本发明DNA核酸适体与其靶物质或干扰蛋白质结合前后的电化学发光强度―电压曲线，及反映结合前后电化学发光强度变化的柱方图。其中A，B展示了草酸体系(5mM,pH＝5.5)中DNA核酸适体Aptamer-18(1μM)与[Ru(bpy)2dppz]2+(20μM)结合后的ECL0-电压曲线(a)，及其进一步与60μg mL-1的(A)Pro-GRP31-98或(B)干扰蛋白质BSA结合后的ECL1-电压曲线(b)。曲线c为草酸溶液中只存在[Ru(bpy)2dppz]2+时的电化学发光强度―电压曲线。可以看出，Aptamer-18结合Pro-GRP31-98后ECL值明显降低(降低了47％)，而与干扰蛋白质BSA孵育后ECL值没有明显改变。C为Aptamer-18，Aptamer-18＇和Aptamer-18〞在[Ru(bpy)2dppz]2+存在下与60μg mL-1不同蛋白质(或多肽)结合前后ECL峰值的相对变化值：(ECL0-ECL1)/ECL0的柱方图。结果显示，Aptamer-18，Aptamer-18＇和Aptamer-18〞三条DNA核酸适体与Pro-GRP31-98结合后，其与[Ru(bpy)2dppz]2+结合而产生的ECL信号明显降低，降低比例分别为47％，44％和81％；而与所检测干扰蛋白质(或多肽)孵育后ECL信号或没有明显变化，或变化值大大小于与Pro-GRP31-98结合的ECL信号变化值。该结果说明这三条DNA序列均是针对Pro-GRP31-98的高特异性DNA适体，能与Pro-GRP31-98特异性结合，与所检测干扰蛋白质(或多肽)没有明显的结合。
图4为草酸体系(5mM,pH＝5.5)中DNA核酸适体Aptamer-18(1μM)与[Ru(bpy)2dppz]2+(20μM)结合后，在梯度批量加入不同浓度的Pro-GRP31-98时，Pro-GRP31-98的浓度(C)的倒数1/C(μM-1)与ECL变化值的倒数1/ΔECL的线性回归关系曲线:1/ΔECL＝2.3×10-3/C+3.7×10-4。由该直线得出Aptamer-18与Pro-GRP31-98之间的解离常数Kd为6.2μM。采用同样的方法，得出Aptamer-18＇和Aptamer-18〞与Pro-GRP31-98之间的解离常数分别为8.6和8.1μM。该结果说明Aptamer-18、Aptamer-18＇和Aptamer-18〞均可以与Pro-GRP31-98高亲和力结合。
图5为采用Integrated DNA Technologies公司OligoAnalyzer 3.1在线工具对Aptamer-18，Aptamer-18＇和Aptamer-18〞模拟的二级结构。Aptamer-18＇是本发明对Aptamer-18序列在不改变二级结构的条件下减少核苷酸数目得到的序列。Aptamer-18，Aptamer-18＇均含有两个小的、主要以G-C配对形成的颈环结构。Aptamer-18〞含有四个小的主要以G-C配对形成的颈环结构。Aptamer-18，Aptamer-18＇和Aptamer-18〞均含有由5'-CCAGATAGTCCCTGG-3'序列形成的具有4个碱基对颈的颈环结构(如图5中箭头指示的圆圈区域)，推测其为与Pro-GRP31-98结合的主要结合位点，其应为Pro-GRP31-98的DNA核酸适体序列。
图6为草酸体系(5mM,pH＝5.5)中Aptamer-18(1μM)在[Ru(bpy)2dppz]2+(20μM)存在下对(a)0，(b)0.48，(c)1.44，(d)1.92，(e)2.40，(f)2.88和(g)3.36μM Pro-GRP31-98响应的ECL信号-电压曲线。插图为加入Pro-GRP31-98后ECL峰信号强度的变化值(ΔECL)与对应Pro-GRP31-98浓度的关系曲线。采用该ECL法对Pro-GRP31-98的最低检测极限达到了1×10-8M(信噪比＝3)。在所测的Pro-GRP31-98浓度范围(0.48μM―3.36μM)内，ECL峰信号的变化值与Pro-GRP31-98的浓度成线性正相关，线性相关系数为0.9969。
具体实施方式
为对本发明进行更好的说明，对磁珠上偶联蛋白及上述SELEX筛选过程的具体操作步骤及方法描述如下：
实施例：
(1)为了在羧基修饰的微米磁珠上偶联蛋白，首先对磁珠上的羧基用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)进行活化；活化后的磁珠用0.01M MES缓冲液(2.13g/L吗啉-乙磺酸·H2O，0.31g/L硼酸，pH＝9.0)洗涤后，与需要偶联的蛋白质或多肽在MES(0.01M，pH＝9.0)溶液中在分子杂交仪上30℃振荡反应过夜。反应结束后，磁珠经磁回收，然后重悬于0.05M磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)中，形成1mg/mL的磁珠溶液。
(2)SELEX筛选过程中DNA孵育及PCR扩增的操作步骤：
首先取30μL浓度为1mg/mL的Pro-GRP31-98包被磁珠，用Binding Buffer充分洗涤，然后将其重悬于300μL Binding Buffer中备用。将溶解于BindingBuffer中的ssDNA文库分装到四个500μL的离心管中，95℃热变性10min后立即置于冰浴中冷却10min。然后将经过变性处理的ssDNA立即加入到上述靶蛋白磁珠溶液中，在分子杂交仪上37℃振荡孵育2h。最后，用强磁力收集并用无菌水洗涤磁珠，以该磁珠作为PCR的模板，分装到10个25μL PCR管中，每管中加入1μL浓度为10μM的正向引物F-FAM：5'-FAM-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-3'，1μL浓度为10μM的反向引物R-Biotin：5'-Biotin-AGTGTCCGCCTATCTCGTCTCC-3'，2μL浓度为2.5mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，0.25μL TransTaq-T DNA聚合酶(5units/μL)，2.5μL 10×TransTaq-T Buffer，18.25μL高纯水，进行PCR扩增。PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，扩增15-30轮，最后72℃再延伸10min。磁分离收集PCR扩增产物(即上清液)，以进行DNA单链分离。
(3)SELEX筛选过程中DNA单链分离的操作步骤：
PCR扩增产物为双链DNA，然后采用链霉亲和素包被磁珠法将其分离生成ssDNA：将2mL 1mg/mL的链霉亲和素包被磁珠溶液经TE-NaCl溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl，pH＝8.0)充分洗涤后，溶于200μLTE-NaCl溶液中，然后在该溶液中加入PCR扩增后的上清液，孵育30min；孵育结束后，将磁珠用强磁性分离并洗涤，然后在磁珠中加入100μL的0.15MNaOH溶液，孵育10min；然后在磁分离得到的上清液中加入50μL左右的0.3MHCl，中和反应体系中的NaOH，最后加入50μL Binding Buffer，涡旋混匀，得到约200μL的ssDNA溶液，作为下一轮筛选的ssDNA文库。
应用例:
本发明得到了三条能与Pro-GRP31-98高亲和力、高特异性结合的DNA核酸适体，并将本发明得到的DNA核酸适体成功应用于在草酸体系中以及[Ru(bpy)2dppz]2+存在下对Pro-GRP31-98进行灵敏、特异的ECL检测。Primer-18Aptamer-18＇和Aptamer-18〞对Pro-GRP31-98的最低检测极限均达到了10-8M。在所测的Pro-GRP31-98浓度范围(0.48μM―3.36μM)内，ECL峰信号的变化值(ΔECL)与Pro-GRP31-98的浓度成线性正相关，线性相关系数为0.9969。
本发明所述的胃泌素释放肽前体，其概念等同于胃泌素释放前体肽。
Claims (5)
1.胃泌素释放肽前体Pro-GRP 31-98 a.a.多肽片段的DNA核酸适体，其特征在于，其DNA序列为NO1。
2.胃泌素释放肽前体Pro-GRP 31-98 a.a.多肽片段的DNA核酸适体，其特征在于，其DNA序列为NO2。
3.胃泌素释放肽前体Pro-GRP 31-98 a.a.多肽片段的DNA核酸适体，其特征在于，其DNA序列为NO3。
4.如权利要求1―3其中之一所述的DNA核酸适体，其特征在于，序列长度为10 nt到150 nt。
5.胃泌素释放肽前体Pro-GRP 31-98 a.a.多肽片段的DNA核酸适体，其特征在于，含有如下DNA序列：
ccagatagtc cctgg。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150819 |