CN110191950B - 用于识别候选核酸试剂的组合物、方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于产生具有期望性质比如特异性结合靶标性质的核酸试剂的组合物、方法和系统。更特别地，本发明提供用于产生包含修饰的成员的池的组合物、方法和系统，所述池包含具有无限范围的化学多样性的修饰的核酸试剂。

Description

用于识别候选核酸试剂的组合物、方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月29日提交的美国临时申请No.62/401,559的权益。
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种用于识别候选核酸试剂的组合物、方法和系统。
背景技术
自从其最初描述，适体作为单克隆抗体的合成替代物显示出相当大的前景。它们具有许多重要的优点，包括热稳定性、易于化学合成和修饰，及可逆折叠的能力，所有这些特征在分子诊断学和治疗学中的多种应用都是有价值的。
令人遗憾地，标准适体产生过程(即，指数富集的配体系统进化技术(SELEX))通常不能得到对于抗体具有可比较的亲和性和特异性的适体。此外，已经推断完全基于天然核苷酸而没有化学修饰的适体仅提供有限的化学相互作用且仅能够靶向约30％的人类蛋白质组。另外，由于天然核苷酸易于发生核酸酶降解，其将限制适体的体内半衰期。
因此，需要将修饰的核苷酸整合到所发现过程中，例如通过产生基本上修饰或甚至完全修饰的适体的文库或池。
然而，将修饰的核苷酸整合到适体发现中可能在技术上具有极大挑战性。例如，一个典型的适体发现过程循环可包括3个步骤：1)将包含大量随机核苷酸序列的起始文库暴露于感兴趣的靶标；2)选择对于靶标显示出高亲和性的核苷酸序列；和3)扩增所选择的序列，例如，通过PCR或RT-PCR。然后，来自步骤3的扩增序列池可再次用于下一个选择循环的步骤1中。
当修饰的核苷酸参与典型的适体发现过程时，存在大量挑战。例如，大多数情况，对于现有聚合酶，包含修饰的核苷酸的核酸试剂不能起模板作用，因此不能通过PCR或RT-PCR进行酶扩增，或者只能以低效率和/或高偏差扩增。
尽管可以使用化学合成产生包含大量不同修饰的核酸试剂的文库，但是在可用于进一步筛选的池或文库中以克隆方式(即，用在溶液中簇集在一起的相同修饰的核酸试剂的多个拷贝)产生和保存它们极其费力且昂贵，尤其是当池中的不同核酸试剂的数量巨大时。而且，即使可以制备这样的初始文库，但是在筛选之后，选择的修饰的核酸试剂不能扩增产生富集池用于进一步筛选循环。开发高效适体需要反复筛选，因此对于适体发现，该挑战严重限制修饰的核苷酸的应用范围。
这些挑战阻碍了适体的广泛应用，并且迫切需要可以一致地产生对较宽范围的靶标具有更好亲和性和特异性的方法。
发明内容
本发明提供用于产生具有期望性质(例如，特异性结合靶标(比如蛋白质靶标)性质)的核酸试剂的组合物、方法和系统。更特别地，本发明提供用于产生包含具有无限范围化学多样性的修饰的成员的池的组合物、方法和系统。
本申请中提供的组合物、方法和系统能够以克隆方式同时产生许多不同修饰的核酸试剂(例如，适体)，从而以经济有效地方式提供修饰的核酸试剂的池或文库。在某些实施方案中，本申请的组合物、方法和系统也能够识别和/或进一步扩增所述池中的任何修饰的核酸序列，从而提供可用于进一步筛选的富集池。
在一个方面，本发明提供包含多种固定至其上的核酸试剂的颗粒。所述多种核酸试剂可以包括第一群(例如，候选核酸试剂)和第二群(例如，识别核酸试剂)；第一群中的核酸试剂可以与第二群中的不同。第一群可以包含多个单一候选核酸试剂种类的相同拷贝。第二群可以包含至少一种核酸试剂，并且所述至少一种核酸试剂能够使得包含与第一群中包含的候选核酸试剂相同核酸序列的核酸试剂扩增。
所述第二群中包含的至少一种核酸试剂(例如，识别核酸试剂)可以包含所述第一群中的候选核酸试剂的核酸序列信息。在某些实施方案中，所述第二群中包含的至少一种核酸试剂是所述第一群中包含的候选核酸试剂的独特识别符。
在某些实施方案中，所述第二群中包含的至少一种核酸试剂包含至少一种识别核酸试剂。例如，所述第二群中包含的核酸试剂可以是识别核酸试剂。
在某些实施方案中，所述第一群中包含的单一种类的候选核酸试剂能够特异性结合靶标。例如，所述靶标可以是蛋白质靶标。例如，所述第一群中包含的单一种类的候选核酸试剂可以是适体。
在某些实施方案中，所述第一群中包含的每种候选核酸试剂包含至少一种修饰。在某些实施方案中，所述至少一种修饰包含至少一种修饰的核苷酸(例如，修饰的核酸试剂)。
在某些实施方案中，所述第一群中包含的每种候选核酸试剂基本上由修饰的核苷酸组成。
在某些实施方案中，所述第一群中包含的候选核酸试剂中没有一种能够在核酸扩增反应中直接起模板作用。例如，所述第一群中包含的每种候选核酸试剂可以包含至少一种修饰的核苷酸(例如，修饰的核酸试剂)，并且可能在核酸扩增反应中不能直接起模板作用。
所述修饰的核苷酸可以包含在独立地选自下组一个或多个位点的化学取代或修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。例如，所述修饰的核苷酸可以包含在独立地选自下组一个或多个位点的一种或多种化学修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。
例如，修饰的核苷酸可以包含独立地选自下组的一种或多种修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5’-溴尿嘧啶的取代、5’-溴脱氧尿苷的取代、5’-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。
5-位修饰的嘧啶可以独立地选自下组：5-羧基-2’-脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷、5-羧基-2’-脱氧胞苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
所述第二群中包含的至少一种核酸试剂(例如，识别核酸试剂)能够在核酸扩增反应中扩增和/或测序。所述第二群可以包含多个所述至少一种核酸试剂(例如，识别核酸试剂)的相同拷贝。
在某些实施方案中，所述第二群中包含的至少一种核酸试剂(例如，识别核酸试剂)包含与所述第一群中的核酸试剂(例如，候选核酸试剂)相同的核酸序列。
在某些实施方案中，所述第二群中包含的至少一种核酸试剂(例如，识别核酸试剂)与所述第一群中的候选核酸试剂相同，不同在于所述第二群中包含的至少一种核酸试剂不包含任何修饰(例如，修饰的核苷酸)，而所述第一群中包含的候选核酸试剂包含至少一种修饰(例如，修饰的核苷酸)。
所述第二群中包含的至少一种核酸试剂(例如，识别核酸试剂)可以基本上由天然核苷酸组成。在某些实施方案中，所述第二群中包含的至少一种核酸试剂(例如，识别核酸试剂)由天然DNA组成。
第一群中包含的候选核酸试剂与第二群中包含的候选核酸试剂(例如，识别核酸试剂)的比例可以为约1010:1至约1:1。
一种或多种固定在颗粒的核酸试剂(例如，候选核酸试剂和/或识别核酸试剂)可以包括共轭在其上的分子。所述分子可选自小分子、荧光团、肽、治疗活性组分和siRNA。
所述颗粒可以是无磁性的、磁性的或顺磁性的。所述颗粒可以具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。
多种固定至颗粒的核酸试剂可以包含约10至约1010种核酸试剂。
所述第一群中包含的核酸试剂能够特异性结合靶标，Kd为约1pM至约100μM。
所述固定至颗粒的核酸试剂可以包括单链核酸试剂、双链核酸试剂或其组合。
在另一个方面，本发明提供颗粒文库，其中所述文库可以包含约10至约1015个本发明的不同颗粒。在某些实施方案中，所述文库为富集颗粒池。
在某些实施方案中，对于所述颗粒文库中包含的任何颗粒，固定至其上的核酸试剂的核酸序列都与所述文库中固定至至少一种其它颗粒上的核酸试剂的核酸序列不同。在某些实施方案中，所述文库中固定至任何颗粒上的核酸试剂的序列多样性都小于所述文库中所有颗粒包含的全部核酸试剂的序列多样性。
在一个方面，本发明提供一种从候选核酸试剂的混合物中识别具有期望性质的核酸试剂的方法。所述方法可包括：a)得到本发明的一种或多种颗粒或本发明的颗粒文库；b)将所述颗粒暴露于靶标，由此确定存在或不存在期望的性质；c)分离具有固定在其上的具有期望性质的核酸试剂的一种或多种颗粒；和d)从所述分离的颗粒识别具有期望性质的核酸试剂。
在所述方法中，所述靶标可以是蛋白质靶标、小分子靶标、全细胞、细胞组分或脂质体。所述期望的性质可以是靶向结合活性或靶向结合诱导活性。所述靶向结合活性可以是亲和性、特异性或双特异性。所述靶向结合诱导活性可以是催化活性、抑制活性、活化活性、结构转换活性和/或协作活性。所述期望的性质可以是第一群的核酸试剂的性质。具有期望性质的核酸试剂的特性可以由第二群中包含的至少一种核酸试剂决定。例如，具有期望性质的核酸试剂(例如，修饰的核酸试剂，比如包括一种或多种修饰的核苷酸的适体)的特性可以经由对第二群中包含的至少一种核酸试剂(例如，识别核酸试剂，比如包括天然核苷酸的相应DNA分子)测序确定。
在一个方面，本发明提供一种产生本发明的颗粒或本发明的颗粒文库的方法。
在一个方面，本发明提供产生一种或多种具有固定在其上的核酸试剂的修饰的颗粒(比如本发明的颗粒或颗粒文库)的方法。所述方法可包括：a)获得一种或多种模板颗粒，各自具有多种固定在其上的双链核酸试剂，每种双链核酸试剂可以包含正向链和反向链。对于每种颗粒，多种双链核酸试剂可以包含第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)和第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)，第一双链群中包含的核酸试剂可以与第二双链群中包含的核酸试剂不同。所述方法可以进一步包括：b)处理a)中得到的模板颗粒，得到修饰的颗粒，其中每种修饰的颗粒可以包含至少一种来源于第一双链群的修饰的候选核酸试剂(例如，双链候选核酸试剂)和至少一种来源于第二双链群的识别核酸试剂(例如，双链识别核酸试剂)；所述至少一种修饰的核酸试剂(例如，修饰的候选核酸试剂)可以包含至少一种修饰的核苷酸，并且在核酸扩增反应中不能直接起模板作用；及所述至少一种识别核酸试剂能够使得包含与来源于第一双链群的修饰的核酸试剂相同的核酸序列的核酸试剂扩增。
所述方法可以进一步包括c)扩增至少一种识别核酸试剂，产生一种或多种a)的模板颗粒。
在某些实施方案中，所述一种或多种模板颗粒包含两种或多种颗粒，对于所述两种或多种颗粒中的任一种，固定在其上的核酸试剂的核酸序列与固定在至少一种其它颗粒上的核酸试剂的核酸序列不同。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法的某些实施方案中，在b)中，处理模板颗粒包括：b1)处理a)中得到的模板颗粒，以仅去除第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)中包含的核酸试剂的反向链。例如，b1)可以包括用5’至3’核酸外切酶处理a)中得到的模板颗粒，以仅去除第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)中包含的核酸试剂的反向链。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法的某些实施方案中，在b)中，处理模板颗粒进一步包括b2)，处理b1)中得到的颗粒，以除去所述第一双链群中的所述核酸试剂的正向链的实质性部分(例如，提供部分双链的候选核酸试剂)。在某些实施方案中，可以用位点特异性切口酶处理b1)中得到的颗粒，产生所述第一双链群中包含的核酸试剂(例如，双链候选核酸试剂)的有切口的正向链，然后用核酸外切酶进一步处理以去除第一双链群中的核酸试剂的正向链的实质性部分(例如，由此产生部分双链的候选核酸试剂)。在某些实施方案中，可以用位点特异性限制性内切酶处理b1)中得到的颗粒，产生所述第一双链群中包含的核酸试剂(例如，双链候选核酸试剂)的双链断裂，然后用核酸外切酶进一步处理以除去第一双链群中的核酸试剂的正向链的实质性部分(例如，由此产生部分双链的候选核酸试剂)。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法的某些实施方案中，b)进一步包括b3)整合核苷酸以产生与第一双链群的所述核酸试剂的反向链(例如，双链候选核酸试剂的反向链)互补的核酸链。例如，可以用核酸聚合酶整合核苷酸。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法的某些实施方案中，b)进一步包括b4)产生具有多种固定在其上的单链核酸试剂的修饰的颗粒，所述多种单链核酸试剂包含第一单链群(例如，修饰的候选核酸试剂)和第二单链群(例如，识别核酸试剂)；所述至少一种修饰的核酸试剂包含在第一单链群中，并且所述至少一种识别核酸试剂包含在第二单链群中。
在所述方法的某些实施方案中，所述至少一种修饰的核酸试剂(例如，修饰的候选核酸试剂)为适体。
在某些实施方案中，用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法包括：a)获得一种或多种模板颗粒，各自具有多种固定在其上的双链核酸试剂，其中所述多种双链核酸试剂包含第一双链群(例如双链候选核酸试剂)和第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)。第一双链群可以包含多个单一种类的双链候选核酸试剂的相同拷贝；第二双链群可以包含至少一种核酸试剂(例如，双链候选核酸试剂)，并且所述至少一种核酸试剂能够使得包含与第一双链群中包含的核酸试剂相同的核酸序列的核酸试剂扩增；第一双链群中包含的核酸试剂可以与第二双链群中包含的核酸试剂不同；每种双链核酸试剂都可以包含正向链和与该正向链互补的反向链，并且所述正向链可以连接至所述颗粒。在某些实施方案中，第二双链群中包含的至少一种核酸试剂包含第一双链群中的核酸试剂的核酸序列信息。
用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法可以进一步包括b)处理a)中得到的模板颗粒，得到修饰的颗粒，其中每种修饰的颗粒包含至少一种来源于第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)的修饰的核酸试剂(例如，修饰的候选核酸试剂)和至少一种来源于第二双链群(例如，双链候选核酸试剂)的识别核酸试剂；所述至少一种修饰的核酸试剂可以包含至少一种修饰的核苷酸，并且在核酸扩增反应中不能直接起模板作用；及所述至少一种识别核酸试剂使得包含与来源于第一双链群的修饰的核酸试剂相同的核酸序列的核酸试剂能够扩增。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法中，如本发明中描述的，b)可以包括b1)处理a)中得到的颗粒，以仅去除第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)中包含的至少一种核酸试剂的反向链。例如，第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)中包含的核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。在某些实施方案中，第一双链群中的核酸试剂的反向链的5’端被磷硫酰化。第二双链群(例如双链候选核酸试剂)中包含的至少一种核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化敏感。在某些实施方案中，b1)包含用5’至3’核酸外切酶处理a)中得到的颗粒，从而仅去除第二双链群中包含的至少一种核酸试剂的反向链。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法中，如本发明中描述的，b)可以进一步包括b2)处理b1)中得到的颗粒，从而去除第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)中核酸试剂的正向链的实质性部分，并且使第一双链群的核酸试剂的反向链与连接于颗粒上的其部分互补体杂交。在所述方法的b2)中，第二双链群的至少一种核酸试剂的正向链可以保持完整，并且连接至所述颗粒。
在某些实施方案中，b2)包含用位点特异性切口酶处理b1)中得到的颗粒，产生第一双链群中包含的核酸试剂的有切口的正向链。在某些实施方案中，b2)包括用位点特异性限制性内切酶处理b1)中得到的颗粒，产生第一双链群中包含的核酸试剂的双链断裂。b2)可以进一步包括用核酸外切酶除去第一双链群中核酸试剂的正向链的实质性部分。在某些实施方案中，在b2)中，第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)中核酸试剂的正向链的其余部分没有被除去，保持连接于颗粒，充当部分互补体，并且第一双链群中的核酸试剂的反向链仍然与第一双链群中的核酸试剂的正向链的其余部分杂交。
在用于产生修饰的颗粒的方法的某些实施方案中，a)中的模板颗粒进一步包含包含多种连接在其上的单链核酸试剂(例如，单链正向引物)的第三群，所述第三群的多种单链核酸试剂充当b2)中的部分互补体并在除去第一双链群中的核酸试剂的正向群的实质性部分之后，与第一双链群的核酸试剂的反向链杂交。
在用于产生修饰的颗粒的方法中，如本发明中描述的，b)可以进一步包括b3)通过整合核苷酸延伸b2)的颗粒上的部分互补体，产生与第一双链的核酸试剂的反向链互补的核酸链，其中所述整合的核苷酸可以包含至少一种修饰的核苷酸。例如，b3)可以包括用核酸聚合酶整合核苷酸。
在用于产生修饰的颗粒的方法中，如本发明中描述的，b)可以进一步包括b4)除去b3)中得到的连接至颗粒的所有核酸试剂的反向链，从而产生具有多种固定在其上的单链核酸试剂的修饰的颗粒。例如，b4)可以包括通过用碱性溶液(比如，NaOH溶液)培养使所述反向链去杂交。
b4)中产生的多种固定至修饰的颗粒上的单链核酸试剂可以包含第一单链群(例如，修饰的候选核酸试剂)和第二单链群(例如，识别核酸试剂)。所述第一单链群可以包含多种单链核酸试剂(例如，修饰的候选核酸试剂)的相同拷贝，其各自可以与模板颗粒的第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)中的核酸试剂的反向链互补，并且可以包含至少一种修饰的核苷酸。第二单链群可以包含至少一种单链核酸试剂(例如，识别核酸试剂)，其可以与模板颗粒的第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)中包含的至少一种核酸试剂的正向链相同，并且能够使得包含与第一单链群中包含的核酸试剂相同的核酸序列的核酸试剂扩增。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法中，在b1)之后，所述颗粒可以密封在具有进行至少b2)必需的试剂的室中。所述进行至少b2)所必需的试剂可以包括下述一种或多种：切口酶、位点特异性限制性内切酶、核酸外切酶、聚合酶和修饰的dNTP。
在b4)中产生的修饰的颗粒中，第一单链群(例如，修饰的候选核酸试剂)中的核酸试剂能够特异性结合靶标。靶标可以是蛋白质靶标。第二单链群(例如，识别核酸试剂)中包含的至少一种核酸试剂可以包含第一单链群中包含的核酸试剂的核酸序列信息。第一单链群(例如，修饰的候选核酸试剂)的核酸试剂可能在核酸扩增反应中不能直接起模板作用。
第二单链群(例如，识别核酸试剂)中包含的至少一种核酸试剂可以是第一单链群(例如，修饰的候选核酸试剂)中包含的核酸试剂的独特识别符。
所述修饰的候选核酸试剂(例如，第一单链群中包括的核酸试剂)可以是适体。
在某些实施方案中，所述修饰的候选核酸试剂(例如，第一单链群中包括的核酸试剂)基本上由修饰的核苷酸组成。
所述修饰的候选核苷酸可以包含在独立地选自下组一个或多个位点的一种或多种化学修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。例如，所述化学修饰独立地选自下组的修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5’-溴尿嘧啶的取代、5’-溴脱氧尿苷的取代、5’-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。所述5-位修饰的嘧啶可以选自：5-羧基-2’-脱氧尿苷(5-Carboxy-dU)、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷(5-AA-dU)、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷(Tryptamino-dU)、5-羧基-2’-脱氧胞苷(5-Carboxy-dC)、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷(5-AA-dC)、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷(Biotin-16-AA-dC)、5-(N-苄基甲酰胺)-2’脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
所述识别核酸试剂(例如，第二单链群的至少一种单链核酸试剂或第二双链群的至少一种双链核酸试剂)能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法中，第二双链群可以包含多个至少一种核酸试剂的相同拷贝。
第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)中包含的至少一种核酸试剂可以包含与第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)的核酸试剂中包含的核酸序列相同的核酸序列。
所述识别核酸序列(例如，第二单链群的至少一种单链核酸试剂)可以包含与修饰的候选核酸试剂(即，第一单链群的核酸试剂)中包含的核酸序列相同的核酸序列。例如，识别核酸试剂(例如，第二单链群中包含的至少一种核酸试剂)可以与修饰的候选核酸试剂(例如，第一单链群的核酸试剂)相同，不同在于所述识别核酸试剂不包含任何修饰的核苷酸，而所述修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸。
识别核酸序列(例如，第二单链群的至少一种单链核酸试剂)可以基本上由天然核苷酸组成。例如，识别核酸序列(例如，第二单链群的至少一种单链核酸试剂)可以由天然DNA组成。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法中，第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)中包含的核酸试剂与第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)中包含的核酸试剂的比例可以为约1010:1至约1:1。在所述方法中，一种或多种固定至颗粒的双链和/或单链核酸试剂可以包含与其共扼的分子。所述分子可选自小分子、荧光团、肽、治疗活性组分和siRNA。
在所述方法中，所述颗粒可以是无磁性的、磁性的或顺磁性的。在某些实施方案中，所述颗粒具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。
在所述方法中，所述多种固定至颗粒的双链和/或单链核酸试剂可以包含约10至约1010种核酸试剂。
在所述方法中，所述修饰颗粒的修饰的候选核酸试剂(例如，第一单链群中的单链核酸试剂)能够特异性结合靶标，Kd为约1pM至约100μM。
所述方法可以进一步包括在a)之前，将多种双链核酸试剂固定至所述颗粒。所述固定可以包括使用乳液PCR。
所述方法可以进一步包括，在a)之前，用多种固定在其上的相同双链核酸试剂处理一种或多种颗粒，产生包含第一和第二双链群的模板颗粒。
在一个方面，本发明提供本发明的颗粒或本发明的颗粒池/文库在制备用于识别具有期望性质的核酸试剂中的用途。
在一个方面，本发明提供一种产生包含多种修饰的成员(例如，颗粒)的池的方法。所述方法可以包括∶a)提供包含多种核成员(例如，核心颗粒)的池，每种核成员包含多种固定至固体载体的部分双链候选核酸试剂，并且每种部分双链候选核酸试剂包含正向链和比该正向链更长的反向链，其中所述正向链和反向链至少部分地通过碱基配对彼此结合；和b)利用相应的反向链作为模板通过核苷酸聚合延伸所述部分双链候选核酸试剂的所述正向链，并且在所述延伸期间将至少一种修饰的核苷酸整合到所述正向链中，以形成修饰的候选核酸试剂，由此获得包含多种修饰的成员的池，每种修饰的成员都包含多种固定至所述固体载体的所述修饰的候选核酸试剂；其中任何核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列与所述池中至少一种其它核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列不同。
在某些实施方案中，所述池中任何核成员包含的候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有核成员包含的全部候选核酸试剂的序列多样性。
在某些实施方案中，所述池中任一种核成员都包含至少1×102个具有相同核酸序列的候选核酸试剂的拷贝。
在某些实施方案中，所述池中任何核成员包含的候选核酸试剂的序列多样性为1至1000。
在某些实施方案中，所述部分双链候选核酸试剂的正向链的5’端直接地或间接地连接至核成员的固体载体。
在某些实施方案中，修饰的候选核酸试剂不能在核酸扩增反应中直接起模板作用。
在某些实施方案中，对于任何修饰的成员包含的每种修饰的候选核酸试剂而言，相同的修饰的成员包含相应识别核酸试剂，其中所述识别核酸试剂使得其相应修饰的候选核酸试剂能够扩增。例如，对于任何修饰的成员包含的每种独特修饰的候选核酸试剂而言，相同修饰的成员可以包含一种或多种相应识别核酸试剂，其中所述一种或多种识别核酸试剂使得其相应修饰的候选核酸试剂能够扩增。
在某些实施方案中，所述识别核酸序列固定至与其相应修饰的候选核酸试剂相同的固体载体上。
在某些实施方案中，所述识别核酸序列包含其相应修饰的候选核酸试剂的核酸序列信息。例如，识别核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。在某些实施方案中，识别核酸序列包含与其相应修饰的候选核酸试剂相同的核酸序列。例如，识别核酸试剂可以与其相应修饰的候选核酸试剂相同，不同在于所述识别核酸序列不包含任何修饰的核苷酸，而所述修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，所述识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。例如，识别核酸试剂可以由天然DNA组成。
在某些实施方案中，所述识别核酸序列也被用于产生其相应的修饰的候选核酸试剂的核成员所包含。
在某些实施方案中，所述包括在修饰的成员和/或所述核成员中的识别核酸试剂核成员是单链的。
在某些实施方案中，在任何修饰的成员上，修饰的候选核酸试剂的数量与其相应识别核酸试剂的数量的比例为约1010:1至约1:1。
在某些实施方案中，所述修饰的候选核酸试剂能够特异性结合靶标。所述靶标可以是蛋白质靶标。例如，所述修饰的候选核酸试剂可以包括适体。在某些实施方案中，所述修饰的候选核酸试剂能够特异性结合靶标，Kd为约1pM至约100μM。
在某些实施方案中，所述修饰的候选核酸试剂基本上由修饰的核苷酸组成。
在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸包括在独立地选自下组一个或多个位点的化学取代或修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。
在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸包含独立地选自下组的一种或多种修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5’-溴尿嘧啶的取代、5’-溴脱氧尿苷的取代、5’-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。例如，5-位修饰的嘧啶可以独立地选自5-羧基-2’脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷、5-羧基-2’-脱氧胞苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
在某些实施方案中，一种或多种固定至固体载体的核酸试剂(例如，候选核酸试剂和/或识别核酸试剂)包括与其共轭的分子。所述分子可选自小分子、荧光团、肽、治疗活性组分和siRNA。
在某些实施方案中，固体载体为颗粒。例如，固体载体(例如，颗粒)可以是无磁性的、磁性的或顺磁性的。在某些实施方案中，固体载体具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。在某些实施方案中，约102至约1010种核酸试剂固定到任何固体载体。
在所述方法的某些实施方案中，在a)中提供包含多种核成员的池包括：a1)提供包含多种模板成员的池，每种模板成员包含多种固定至固体载体的双链候选核酸试剂，并且每种双链候选核酸试剂包含正向链和互补的反向链；和a2)处理a1)的所述多种模板成员，以除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，使得所述相应的反向链固定至所述固体载体而成为所述核成员的部分双链候选核酸试剂的反向链。
在某些实施方案中，所述池中任一模板成员包含的双链候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有模板成员包含的全部双链候选核酸试剂的序列多样性。
在某些实施方案中，所述池中任一种模板成员都包含至少1×102个具有相同核酸序列的双链候选核酸试剂的拷贝。
在某些实施方案中，所述池中任何模板成员包含的双链候选核酸试剂的序列多样性为1至1000。
在某些实施方案中，双链候选核酸试剂的正向链的5’端直接地或间接地连接于模板成员的固体载体。
在所述方法的某些实施方案中，a1)包括使用乳液PCR产生包含多种双链候选核酸试剂的模板成员。
在某些实施方案中，对于任何模板成员包含的每种双链候选核酸试剂而言，相同的模板成员包含相应的双链识别核酸试剂，所述双链识别核酸试剂包含正向链和互补的反向链，并且其中所述双链识别核酸试剂与其能扩增的相应双链候选核酸试剂不同。例如，对于任何模板成员包含的每种独特的双链候选核酸试剂，相同的模板成员可以包含一种或多种相应双链识别核酸试剂。
在某些实施方案中，所述双链识别核酸试剂包含其相应的双链候选核酸试剂的核酸序列信息。例如，双链识别核酸试剂可以包括与其相应双链候选核酸试剂相同的核酸序列。
在某些实施方案中，在任何模板成员上，双链候选核酸试剂的数量与其相应双链识别核酸试剂数量的比例为约1010:1至约1:1。
在所述方法的某些实施方案中，a2)包括∶a2-1)处理a1)的所述多种模板成员以仅去除所述双链识别核酸试剂的反向链，且所述双链识别核酸试剂的正向链仍然固定至所述固体载体上，而成为所述核成员和/或所述修饰的成员上的识别核酸序列。
在所述方法的某些实施方案中，a2)进一步包括a2-2)处理a2-1)中得到的所述多种模板成员以除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，而所述双链候选核酸试剂的反向链仍固定至所述固体载体上，而成为所述核成员的部分双链候选核酸试剂的所述反向链。
在所述方法的某些实施方案中，在延伸所述部分双链候选核酸试剂的正向链之后，除去反向链，且所述修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂是单链的。例如，在延伸所述部分双链候选核酸试剂的正向链之后，可以通过用碱性溶液培养除去反向链。
在某些实施方案中，所述双链候选核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。例如，双链候选核酸试剂的反向链的5’端可以被磷硫酰化。
在某些实施方案中，所述双链识别核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化敏感。
在某些实施方案中，a2-1)包括用5’至3’核酸外切酶处理a1)的多种模板成员，从而仅去除双链识别核酸试剂的反向链。
在某些实施方案中，a2)包括用核酸外切酶去除双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分。
在某些实施方案中，a2-2)包括用位点特异性切口酶处理多种a2-1)中得到的模板成员，产生双链候选核酸试剂的有切口的正向链。
在某些实施方案中，在a2)中，所述双链候选核酸试剂的正向链的剩余部分没有被去除，仍然固定在固体载体上，充当核成员上所述部分双链候选核酸试剂的正向链，并且所述双链候选核酸试剂的反向链保持与所述正向链的剩余部分相结合，充当核成员上部分双链候选核酸试剂的反向链
在某些实施方案中，a2-2)包括用位点特异性限制性内切酶处理多种a2-1)中得到的多种模板成员，使得双链候选核酸试剂产生双链断裂。
在某些实施方案中，模板成员进一步包含多种固定在固体载体上的单链正向引物，在去除双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分之后，所述单链正向引物能够与所述双链候选核酸试剂的反向链相结合。
在所述方法的某些实施方案中，b)包括用核酸聚合酶延伸所述部分双链候选核酸试剂的正向链。
在某些实施方案中，在a2-1)之后，每种成员(例如，颗粒)都被包封在反应室中。所述反应室可以进一步包括下述的一种或多种∶切口酶、位点特异性限制性内切酶、核酸外切酶、聚合酶和修饰的dNTP。
在另一个方面，本申请提供包含多种核成员的池，每种核成员包含多种固定在固体载体上的部分双链的候选核酸试剂，并且每种部分双链候选核酸试剂包含正向链和比所述正向链更长的反向链，其中所述正向链和反向链至少部分地通过碱基配对彼此结合；其中任何核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列与所述池中至少一个其它核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列不同。在某些实施方案中，池中任何核成员包含的候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有核成员包含的全部候选核酸试剂的序列多样性。
在某些实施方案中，所述池任一种核成员包含至少1×102个具有相同核酸序列的候选核酸试剂的拷贝。
在某些实施方案中，所述池中任何核成员包含的候选核酸试剂的序列多样性为1至1000。
在某些实施方案中，所述部分双链候选核酸试剂的正向链的5’端直接或间接地连接至固体载体。
在某些实施方案中，对于任何核成员包含的每种部分双链候选核酸试剂而言，相同的核成员均包含相应识别核酸试剂，其中所述识别核酸试剂使得其相应的候选核酸试剂能够扩增。所述识别核酸试剂可以固定至与其相应候选核酸试剂相同的固体载体。所述识别核酸试剂可以是单链的。所述识别核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。例如，所述识别核酸试剂可以包含其相应候选核酸试剂的核酸序列信息。在某些实施方案中，所述识别核酸试剂包含与其相应的候选核酸试剂相同的核酸序列。
在某些实施方案中，识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。例如，识别核酸试剂可以由天然DNA组成。
在某些实施方案中，对于任何核成员，所述候选核酸试剂的数量与其相应识别核酸试剂的数量的比例为约1010:1至约1:1。
在某些实施方案中，固体载体为颗粒。所述固体载体可以是非磁性的、磁性的或顺磁性的。在某些实施方案中，所述固体载体具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。在某些实施方案中，约102至约1010种核酸试剂固定至任何固体载体。
在另一个方面，本申请还提供包含多种修饰的成员的池，每种修饰的成员包含多种固定至固体载体的修饰的候选核酸试剂，并且每种修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸；其中任何修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的核酸序列与所述池中至少一种其它修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的核酸序列不同。
在某些实施方案中，所述池中任何修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有修饰的成员包含的全部修饰的候选核酸试剂的序列多样性。
在某些实施方案中，所述池中任一种修饰的成员都包含至少1×102个具有相同核酸序列的修饰的候选核酸试剂的拷贝。
在某些实施方案中，所述池中任何修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的序列多样性为1至1000。
在某些实施方案中，所述修饰的候选核酸试剂为单链的。
在某些实施方案中，单链修饰的候选核酸试剂的5’端直接地或间接地连接至固体载体。
在某些实施方案中，所述修饰的候选核酸试剂不能在核酸扩增反应中直接起模板作用。
在某些实施方案中，对于任何修饰的成员包含的每种修饰的候选核酸试剂而言，相同修饰的成员均包含相应的识别核酸试剂，其中所述识别核酸试剂能够使得其相应修饰的候选核酸试剂扩增。
在某些实施方案中，所述识别核酸序列固定至与其相应修饰的候选核酸试剂相同的固体载体上。
在某些实施方案中，所述识别核酸序列包含其相应的修饰的候选核酸试剂的核酸序列信息。
在某些实施方案中，所述识别核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。
在某些实施方案中，所述识别核酸序列包含与其相应的修饰的候选核酸试剂相同的核酸序列。
在某些实施方案中，所述识别核酸试剂与其相应修饰的候选核酸试剂相同，不同在于所述识别核酸序列不包含任何修饰的核苷酸，而所述修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸。在某些实施方案中，所述识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。例如，所述识别核酸试剂可以由天然DNA组成。在某些实施方案中，识别核酸试剂为单链的。
在某些实施方案中，在任何修饰的成员上，修饰的候选核酸试剂的数量与其相应识别核酸试剂的数量比例为约1010:1至约1:1。
在某些实施方案中，所述修饰的候选核酸试剂能够特异性结合靶标，靶标可以包含蛋白质靶标。例如，修饰的候选核酸试剂可以包括适体。
在某些实施方案中，所述修饰的候选核酸试剂能够特异性结合靶标，Kd为约1pM至约100μM。
在某些实施方案中，所述修饰的候选核酸试剂基本上由修饰的核苷酸组成。
在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸包含在独立地选自下组一个或多个位点的化学取代或修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。
在某些实施方案中，所述修饰的核苷酸包括独立地选自下组的一种或多种修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5’-溴尿嘧啶的取代、5’-溴脱氧尿苷的取代、5’-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。例如，所述5-位修饰的嘧啶可以选自5-羧基-2’-脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷、5-羧基-2’-脱氧胞苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
在某些实施方案中，一种或多种固定至固体载体的修饰的候选核酸试剂和/或识别核酸试剂包括与其共扼的分子。所述分子可选自小分子、荧光团、肽、治疗活性组分和siRNA。
在某些实施方案中，固体载体为颗粒。所述固体载体可以是非磁性的、磁性的或顺磁性的。在某些实施方案中，所述固体载体具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。在某些实施方案中，约102至约1010种核酸试剂固定至任何固体载体。
在另一个方面，本申请提供包括多种模板成员的池，每种模板成员包含多种固定至固体载体的双链候选核酸试剂，并且每种双链候选核酸试剂包含正向链和互补的反向链；其中任何模板成员包含的双链候选核酸试剂的核酸序列与所述池中至少一种其它模板成员包含的双链候选核酸试剂的核酸序列不同。
在某些实施方案中，所述池中任何模板成员包含的双链候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有模板成员包含的全部双链候选核酸试剂的序列多样性。
在某些实施方案中，所述池中任一种模板成员都包含至少1×102个具有相同核酸序列的双链候选核酸试剂的拷贝。
在某些实施方案中，所述池中任何模板成员包含的双链候选核酸试剂的序列多样性为1至1000。
在某些实施方案中，双链候选核酸试剂的正向链的5’端直接地或间接地连接至模板成员的固体载体。
在某些实施方案中，对于任何模板成员包含的每种双链候选核酸试剂而言，相同的所述模板成员均包含相应的双链识别核酸试剂，所述双链识别核酸试剂包含正向链和互补的反向链，并且其中所述双链识别核酸试剂与其能扩增的相应双链候选核酸试剂不同。
在某些实施方案中，所述双链识别核酸试剂固定至与其相应双链候选核酸试剂固定至相同的固体载体上。
在某些实施方案中，所述双链识别核酸序列包含其相应双链候选核酸试剂的核酸序列信息。
在某些实施方案中，所述双链识别核酸试剂包含与其相应双链候选核酸试剂相同的核酸序列。
在某些实施方案中，在任何模板成员上，双链候选核酸试剂的数量与其相应双链识别核酸试剂的数量比例为约1010:1至约1:1。
在某些实施方案中，所述双链候选核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。例如，双链候选核酸试剂的反向链的5’端可以被磷硫酰化。
在某些实施方案中，所述双链识别核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化敏感。
在某些实施方案中，所述双链识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。
在某些实施方案中，所述双链识别核酸试剂由天然DNA组成。
在某些实施方案中，固体载体为颗粒。所述固体载体可以是非磁性的、磁性的或顺磁性的。
在某些实施方案中，固体载体具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。
在某些实施方案中，约102至约1010种双链核酸试剂固定至任何固体载体。
在某些实施方案中，模板成员进一步包含多种固定至固体载体上的单链正向引物，所述单链正向引物能够至少部分地通过碱基配对与所述双链候选核酸试剂的反向链杂交。
根据下述详细说明，本发明的另外的方面和优点将对本领域那些技术人员而言是容易显而易见的，其中仅仅显示和描述了本发明的示例性实施方案。如将认识到的，本发明能够具有其它和不同的实施方案，其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都没有背离本发明。因此，附图和说明将被认为实质上是示例性的，而不是作为限制。
通过援引并入
将本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，引用程度如同每篇单独的出版物、专利或专利申请均明确且单独地被指出通过援引并入本文一样。
附图说明
本发明的新颖特征详细地列在所附权利要求书中。通过参照下述列出的示例性实施方案(其中应用本发明的原理)和附图(本文中也称为“图”)的详细说明将获得本发明的特征和优点的更好理解，其中：
图1a-1f显示根据本发明用于产生包含多种修饰的成员的池的方法的实例。
图2a-2g显示根据本发明用于产生包含多种修饰的成员的池的方法的另一个实例。
图3a-3e显示用于验证在根据本发明获得包含多种修饰的成员的池的过程中产生的中间产品的方案。
图4a-4f显示用各种修饰的核苷酸产生预期核酸试剂的验证结果。
图5a-5c显示使用各种切口酶的切口作用。
图6a-6b显示使用核酸外切酶去除反向链的作用。
图7a-7b显示使用各种聚合酶进行核酸链延伸的结果。
图8a-8c显示当候选核酸试剂的数量与识别核酸试剂的数量具有不同比例时的切口作用。
图9显示当候选核酸试剂的数量与识别核酸试剂的数量具有不同比例时的扩增结果。
图10显示存在和不存在天然DNA的扩增结果。
图11a-11b显示结合修饰的核苷酸的结果。
图12a-12b显示使用修饰的和未修饰的核苷酸试剂的靶向结合的结果。
图13a-13b显示使用未修饰的和修饰的核苷酸试剂的靶向结合的结果。
图14a-14f显示使用根据本发明的方法产生池的结果。
具体实施方式
虽然本文已经显示和描述了本发明的各种实施方案，但是对本领域技术人员而言将显而易见的是，这样的实施方案仅通过举例提供。本领域技术人员在不背离本发明下可以进行大量改变、变化和取代。应当理解，可以使用本文所述本发明实施方案的各种替代。
如本文使用的术语“实质的(substantial)”通常指大于最小量或非显著量；和“实质地(substantially)”通常指大于最低地或非显著地。如本文使用的术语“实质性部分的”通常指对象部分的数量、量、序列、长度浓度等，其为相应对象的整体数量、量、序列、长度、浓度等的至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％。
如本文使用的术语“核酸试剂”通常指包括一种或多种核酸亚基(例如，核苷酸)的分子。核酸试剂可以包括一种或多种选自下述的亚基：腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)、或其类似物和突变体。核苷酸可以包括A、C、G、T或U、或其类似物和变体，包括但不限于肽核酸(PNA)、磷硫酰化的、锁核酸(LNA’s)、2’-O-甲基(2’OMe)修饰的核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰的核苷酸、2’氟修饰的核苷酸和5’反向双脱氧-T。核苷酸可以包括可以结合到增长中的核酸链的任何亚基。这样的亚基可以是A、C、G、T或U，或一种或多种与互补的A、C、G、T或U，或与嘌呤(即，A或G，或其变体)或嘧啶(即，C、T或U，或其变体)互补的特异性的任何其它亚基。亚基可以使各核酸碱基或碱基组(例如，AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA或其尿嘧啶-配对物)拆分。在某些实例中，核酸试剂为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其衍生物。核酸试剂可以是单链的或双链的。核酸试剂可以包括一种或多种修饰，例如其可以包括磷硫酰化(PS)键(例如，在核酸试剂的5’或3’端的最后几(例如，3-5)个核苷酸之间引入)，从而对核酸酶降解(比如，核酸外切酶降解)有抗性。
核酸试剂可以包括一种或多种修饰的核苷酸。所述修饰的核苷酸可以包括位于独立地选自下组的一个或多个的位点的一种或多种化学修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。例如，所述化学修饰独立地选自：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5-溴尿嘧啶的取代、5-溴脱氧尿苷的取代、5-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。所述5-位修饰的嘧啶可以选自：5-羧基-2’-脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷、5-羧基-2’-脱氧胞苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N)、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷(5-AA-dC)、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷(生物素-16-AA-dC)、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
仅仅当：1)它们具有相同的核酸序列；和2)一种核酸试剂中的每种核苷酸与其它核酸试剂中的相应核苷酸相同时，本文使用的两种或多种“核酸试剂”是相同的。在这方面上，核苷酸及其修饰的形式、类似物或其它变体被认为是不同的核苷酸。因此，如果两种核酸试剂包含相同的核酸序列，同时一种核酸试剂仅仅包含未修饰的A、C、G、T或U，且另一种包括修饰的A、C、G、T或U时，它们被认为是不同的核酸试剂。
如本文使用的术语“聚合酶”通常指能够催化聚合反应的任何酶。聚合酶的实例包括，而不限于核酸聚合酶、转录酶或连接酶。聚合酶(polymerase)可以是聚合化酶(polymerization enzyme)或聚合酶(polymerizing enzyme)。
如本文使用的术语“适体”或“适体序列”通常指对于靶标例如靶分子具有特异性结合亲和性的核酸，其中这样的靶标不同于经由主要取决于Watson/Crick碱基配对的机制结合所述核酸的多核苷酸。
术语“肽"、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用，通常指任何长度的氨基酸的多聚形式，其可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和天然前导序列的融合蛋白，其具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基；免疫标记的蛋白；具有可检测的融合配偶体的融合蛋白，例如具有融合配偶体荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、荧光素酶的融合蛋白等。
例如在核酸序列(例如，适体序列)或氨基酸序列中使用的术语“序列”通常指一级结构，例如单体亚基(例如，核苷酸或氨基酸)的顺序。如本文使用的具有实质上相同的单体亚基(例如核苷酸)顺序的序列(例如，核酸序列)被认为是相同序列(核酸序列)。
例如，就核酸试剂而言，如果在它们的一级序列中A(或其类似物、变体、衍生物)、C(或其类似物、变体、衍生物)、T(或其类似物、变体、衍生物)、G(或其类似物、变体、衍生物)和U(或其类似物、变体、衍生物)的顺序相同，则这些核酸试剂被认为具有相同的核酸序列。
在某些情况下，两个分子(例如，核酸试剂)可以具有相同的单体亚基顺序(例如，A(或其类似物、变体、衍生物)、C(或其类似物、变体、衍生物)、T(或其类似物、变体、衍生物)、G(或其类似物、变体、衍生物)和U(或其类似物、变体、衍生物)的顺序)，同时一个分子包括未修饰的亚基且另一个分子包括相应修饰的亚基，则在该情况下，这两个分子被认为是具有相同序列(例如，核酸序列)的不同分子(例如，核酸试剂)。例如，修饰的A为核苷酸A的相应修饰的核苷酸，修饰的C为核苷酸C的相应修饰的核苷酸，修饰的T为核苷酸T的相应修饰的核苷酸，修饰的G为核苷酸G的相应修饰的核苷酸，和修饰的U为核苷酸U的相应修饰的核苷酸。
术语“标记”和“可检测的标记”在本文中可互换地使用，通常指能够被检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、生色团、染料、金属离子、金溶胶、配体(例如，生物素、抗生物素蛋白、链亲和素或半抗原)等。
如本文使用的术语“荧光剂”通常指能够显示出可检测范围的荧光的物质或其部分。适合用作可检测标记的示例性可检测部分可以包括例如亲和标记物和荧光蛋白。
如本文使用的术语“亲和标记物”通常指可以连接至靶标的肽段，所述靶标可以为使用结合亲和标记物且提供可检测信号(例如，荧光化合物或蛋白)的分子检测的靶标。原则上，可以使用抗体或其它特异结合试剂的任何肽或蛋白作为亲和标记物。
如本文使用的术语“扩增”通常指核酸的拷贝数增加，其包括由RNA产生DNA。扩增可以通过任何已知的方法进行。扩增方法可需要热循环，或者可以在等温条件下进行。例如，扩增可以包括聚合酶链反应(PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、或其组合。扩增方法也可包括RNA扩增方法，例如逆转录(RT)或RT-PCR。另外，扩增可以是DNA扩增或RNA扩增。核酸扩增可以是，例如，实时核酸扩增。
本文使用的术语“PCR”通常指通过使用聚合酶特异性结合靶核酸的引物对，扩增靶核酸的方法。例如，PCR扩增核酸重复实施变性、退火和延伸的循环。
本文使用的术语“退火”可以与术语“杂交”可互换地使用，并且指结合两个互补DNA链，以便产生杂化的核酸分子。
本文使用的术语“识别符”通常指能够区别一种对象与另一种对象的信号、消息或信息，或者指包含这样的信号、消息或信息的对象。如本文使用的术语“独特识别符”通常指其为在用于特定目的的给定类型对象所使用的所有标识符中独特的任何标识符。通常，独特标识符和其识别的对象之间存在独特明确的关系。标识符可以是识别核酸试剂。识别核酸试剂可以是双链或单链的。在本申请中，识别核酸试剂能够发现相应候选核酸试剂(其可以是双链的或单链的)的同一性(identity)。识别核酸试剂能够使得其相应候选核酸试剂(比如，修饰的核酸试剂)扩增。例如，识别核酸试剂可以包含其相应候选核酸试剂的核酸序列信息。在某些情况下，识别核酸序列可以包含与其相应修饰的候选核酸试剂相同的核酸序列。当候选核酸试剂为修饰的核酸试剂时，其相应识别核酸试剂可以与所述修饰的候选核酸试剂相同，不同在于所述识别核酸序列不包含任何修饰的核苷酸，而所述修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸。所述识别核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或测序。例如，可以经由对其相应识别核酸试剂测序，发现修饰的候选核酸试剂的同一性(identity)。在本申请中，识别核酸试剂(单链或双链)可以基本上由天然核苷酸组成。例如，识别核酸试剂可以由天然DNA组成。
如本文使用的术语“靶标”通常指要检测的对象。例如，靶标可以是蛋白(例如，抗体)、多核苷酸、多肽、病毒、微生物、小分子、全细胞、细胞组分、脂质体或其组合。在某些实施方案中，合适的靶标可以包括例如小分子(例如，有机染料)、氨基酸、碳水化合物、脂质、氨基糖苷、抗生素、肽、蛋白、翻译后修饰、核酸、病毒、全细胞和/或细胞组分。感兴趣的小分子靶标通常可以具有约800道尔顿或更小的分子量。感兴趣的蛋白靶标可以包括例如细胞表面受体、信号转导因子和激素。感兴趣的细胞靶标可以包括，例如哺乳动物细胞，特别是人类细胞、干细胞、肿瘤细胞和细菌细胞。在某些实施方案中，可以同时根据候选核酸试剂或候选适体序列的单个文库对两种或多种靶标(比如，具有不同氨基酸序列的蛋白靶标)进行试验。在某些实施方案中，可以以标记地形式检测靶标或例如经由结合相互作用与靶标结合的分子。
术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“对于...有特异性”在本文中可互换地使用，通常指将试剂(例如，核酸试剂，比如适体)结合至靶分子(例如，蛋白或其部分)，并且所述结合可测量地或具有统计学意义地不同于非特异性相互作用(例如，非特异性相互作用可以结合参照分子或随机分子)。可以例如通过与靶标类似的对照分子(例如，过量的非标记的靶标)的竞争，测量特异性结合，在该情况下，如果标记的靶标结合候选试剂受到过量未标记的靶标竞争性抑制，则指示为特异性结合。特异性结合可以由，例如，对于靶标具有以下Kd的分子显示：至少约100μM、至少约90μM、至少约80μM、至少约70μM、至少约60μM、至少约50μM、至少约40μM、至少约30μM、至少约20μM、至少约10μM、至少约1μM、至少约500nM、至少约400nM、至少约300nM、至少约200nM、至少约150nM、至少约100nM、至少约60nM、至少约50nM、至少约40nM、至少约30nM、至少约20nM、至少约10nM、至少约8nM、至少约6nM、至少约4nM、至少约2nM、至少约1nM、至少约900pM、至少约800pM、至少约700pM、至少约600pM、至少约500pM、至少约400pM、至少约300pM、至少约200pM、至少约100pM、至少约90pM、至少约80pM、至少约70pM、至少约60pM、至少约50pM、至少约40pM、至少约30pM、至少约20pM、至少约10pM、至少约5pM、至少约1pM或更大。
本文使用的术语“亲和性”通常指分子(例如，适体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，蛋白)之间的全部非共价相互作用总和的强度。
本文使用的术语“Kd”或“Kd值”通常指解离常数，通过适于适体和靶标对的技术进行测定，例如通过使用放射性或荧光测量的配体结合分析，表面等离子共振(SurfacePlasmon Resonance，SPR)、生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI，例如Systems)、SRU biosystems />等温滴定量热法(Isothermal TitrationCalorimetry，ITC)或微量热泳动(Microscale Thermophoresis，MST)。在某些实施方案中，使用标准基于荧光的配体结合试验和饱和分析确定Kd值。在一个实例中，在室温下，在轻轻旋转下，用本发明的颗粒培养各种浓度的荧光标记的靶分子至少3小时。然后，洗涤每个样品，并且通过使用流式细胞仪测量每个颗粒的荧光，定量剩余的结合靶标。然后，将减去背景的荧光值拟合饱和结合曲线，例如通过使用均衡结合模型(例如，根据质量作用定理)。
术语“共轭”、“共轭的”和“共轭结合”可互换地使用，通常指任何和所有形式的共价或非共价键，包括而不限于直接基因或化学融合，经由连接基或交联剂偶联，和非共价结合。
本文使用的术语“模板”通常指要扩增的分子(例如，核酸试剂)。
本文使用的术语“测序”通常指用于测定分子(例如，核酸试剂)的序列(例如，单体亚基的顺序，比如核苷酸顺序)的过程或反应。
本文使用的术语“固定的”通常指分子或试剂连接至或固定至底物或载体(例如，颗粒)。
本文使用的术语“治疗活性组分”通常指具有治疗效果，例如用于治疗或控制疾病进程的分子或试剂。
本文使用的术语“富集”通常指在一个群体内一种或多种具体对象的数量、量或百分比升高。
本文使用的术语“靶结合活性”通常指结合特异性靶标的能力。例如，“靶结合活性”可以是亲和性、特异性或双特异性。
本文使用的术语“靶标结合诱导活性”通常指通过将分子或试剂结合到预期靶标诱导或产生的能力。“靶结合诱导活性”可以包括催化活性、抑制活性、活化活性、结构转换活性和/或协作活性。
本文使用的术语“同一性(identity)”通常指独特地区别分子或试剂与其它分子或试剂的信息。例如，可以通过核酸试剂的核酸序列和/或其包括的核苷酸测定或表示核酸试剂的同一性(identity)。
本文使用的术语“正向链”和“反向链”通常指特定构型的双链DNA的两个互相互补的链。例如，当两个链彼此垂直叠加时，上层链通常被认为是正向链或书写为在左侧具有其5’端和在右侧具有其3’端。同时，除非另有说明，否则下层链典型地被认为是反向链或书写为在左侧具有其3’端且在右侧具有5’端。本文使用的“反向链”的意义是相对于“正向链”而言的，反之亦然。这些术语用于清楚方便地描述本发明及其优选的实施方案。
本文使用的术语“互补的”通常指包括任何核酸序列的多核苷酸(或在一种或多种多核苷酸之内的序列)，所述核酸序列可以在两个或多个独立的相应位点以反向平行的方向进行累积碱基配对，如在杂交的双链中一样。
本文使用的术语“部分互补体”通常指包括的核酸序列中有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％、但小于100％的残基与另一个核酸序列的残基互补的核酸分子。
本文使用的术语“位点特异性的”通常指在分子(例如，核酸试剂)的特定位点出现作用或反应。
本文使用的术语“密封”通常指将部分材料包含在独立的(self-contained)空间中。
本文使用的术语“区室”通常指在混合物或液体体系比如液滴之内的独立的空间。
本文使用的术语“基本上由...组成”通常指实质性部分由所指示的组分或成分组成。本文使用的术语“天然核酸”通常指天然出现的核酸。本文使用的术语“天然DNA”通常指天然出现的DNA核酸。在某些实施方案中，“天然核酸”也包括不妨碍扩增和/或测序的合成的或修饰的核苷酸。
当在数值的上下文中使用时，术语“约”通常指高于或低于指示值小于1％至15％(例如，小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于6％、小于7％、小于8％、小于9％、小于10％、小于11％、小于12％、小于13％、小于14％或小于15％)的值。
本文使用的术语“颗粒”通常指固体载体，在其表面上可以固定多种核酸试剂。适合的颗粒可以具有任何合适的形状。
本文使用的术语“成员”通常指在池或文库中的单个单元。例如，池或文库中的成员可以是颗粒或任何其它固体载体，在其表面上可以固定多种核酸试剂。
本文使用的术语“修饰的成员”通常指包括多种固定在其上的修饰的候选核酸试剂的成员(例如，颗粒或任何其它固体载体)。
本文使用的术语“核成员”通常指包括多种固定在其上的部分双链核酸试剂的成员(例如，颗粒或任何其它固体载体)。核成员可以来源于模板成员，并且可以用于制备修饰的成员。例如，可以处理模板成员，以提供核成员，其可以接着被处理以提供修饰的成员。
本文使用的术语“候选核酸试剂”通常指要筛选或试验的一种或多种核酸试剂。候选核酸试剂可以固定在固体载体上(例如，固体载体表面上)。候选核酸试剂可以是双链的或单链的。在某些实施方案中，候选核酸试剂可以包括一种或多种修饰的核苷酸，以提供修饰的候选核酸试剂。
本文使用的术语“双链候选核酸试剂”通常指要筛选或试验的一种或多种双链核酸试剂。模板成员(例如模板颗粒)可以包含多种固定在固体载体上的双链候选核酸试剂。双链候选核酸试剂可以包含正向链和互补的反向链，所述正向链和所述反向链彼此结合(例如，通过碱基配对)，产生其整体长度基本为双链的结构。
本文使用的术语“部分双链候选核酸试剂”通常指要筛选或试验的一种或多种部分双链核酸试剂。部分双链候选核酸试剂可以包含第一链(例如，正向链)和第二链(例如，反向链)，其中仅第一链的一部分可以与第二链的一部分结合形成部分双链结构。
双链候选核酸试剂可以被处理变成部分双链候选核酸试剂，然后，其可以被进一步处理以提供修饰的候选核酸试剂。修饰的候选核酸试剂的核酸序列可以与产生修饰的候选核酸试剂的部分双链或双链候选核酸试剂的核酸序列相同。
可以通过在随后的核酸聚合反应中充当模板的链的核酸序列来测定部分双链候选核酸试剂(例如，任何核成员包含的)的核酸序列。例如，部分双链候选核酸试剂可以包含正向链和比所述正向链更长的反向链，并且所述部分双链候选核酸试剂的核酸序列与所述反向链的互补链的核酸序列相同。
本文使用的术语“序列多样性”通常指包括各种核酸试剂的群、池或文库中存在的不同核酸序列的数量。例如，“n”(例如，1、2、3或更多)个序列多样性指群/池/文库中的核酸试剂具有“n”(例如，1、2、3或更多)个不同的核酸序列。
当提供一个范围的数值(例如，数值范围)时，应当理解在该范围的上限与下限之间的每个中间值，除非上下文另有明确的规定，精确至下限的单位的十分之一，以及所述范围内的任何其它所述值或中间值都涵盖在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围内，并且也涵盖在本发明之内，但服从于所述范围内的任何具体排除的限值。在所述范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语具有与如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本文中描述的任意方法和物质的类似物或等效物也可以用于实施或试验本发明，但是优选的方法和物质为目前描述的。将本文提及的所有出版物都通过引用并入本文以公开和描述与引用所述出版物相关的方法和/或材料。
如本文使用的单数形式"一个/一种"、“和”和"所述"包括复数指示。因此，例如，提及“颗粒”包括多个这样的颗粒，并且提及“序列”包括提及本领域技术人员已知的所述序列和其等同物，诸如此类。
本领域技术人员在阅读本公开时将显而易见的是，本文所述和说明的单个实施方案中的每个都具有离散的组分和特征，其可以容易地与其它几个实施方案中的任一个的特征在不脱离本发明的范围或精神的情况下分离或组合。任何所述的方法都可以按照所述的事件的顺序或按照在逻辑上可能的任何其它顺序来进行。这预期支持所有这样的组合。
在一个方面，本发明提供包含多种固定在其上的核酸试剂的颗粒。所述多种核酸试剂可以包含第一群(例如，候选核酸试剂)和第二群(例如，识别核酸试剂)。第一群中的核酸试剂可以与第二群中的核酸试剂不同。第一群可以包含多个单一种类核酸试剂的相同拷贝。第二群可以包含至少一种核酸试剂，并且所述至少一种核酸试剂能够使得包含与第一群中包含的核酸试剂相同核酸序列的核酸试剂扩增。
在本发明公开的颗粒中，第二群中包含的至少一种核酸试剂可以包含第一群中核酸试剂的核酸序列信息。例如，在扩增第二群中包含的核酸试剂之后，得到的扩增产物可以具有与第一群中的核酸试剂相同或基本上相同的核酸序列。在某些实施方案中，第二群中包含的至少一种核酸试剂包含或具有与第一群中的核酸试剂相同的核酸序列。例如，第二群中包含的至少一种核酸试剂可以与第一群中的核酸试剂相同，不同在于第一群的核酸试剂包含至少一种修饰(例如，一种或多种修饰的核苷酸或修饰的结合键，或核酸试剂的其它修饰)，而第二群中的至少一种核酸试剂不包含任何修饰。
在某些实施方案中，第二群中的至少一种核酸试剂是第一群中包含的核酸试剂的独特标识符。例如，第二群中包含的至少一种核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或测序。在某些实施方案中，可以通过扩增第二群的核酸试剂和/或对其测序确定第一群中的核酸试剂的同一性(例如，核酸序列或包含的核苷酸)。在某些实施方案中，第二群中包含的至少一种核酸试剂包含至少一种识别核酸试剂。例如，第二群中包含的核酸试剂可以是识别核酸试剂。
在另一个方面，本发明提供本发明的颗粒的文库。所述文库可以包含约10至约1015个不同的本发明的颗粒。例如，所述文库可以包含至少102个不同的颗粒、至少103个不同的颗粒、至少104个不同的颗粒、至少105个不同的颗粒、至少106个不同的颗粒、至少107不同的颗粒、至少108不同的颗粒、至少109不同的颗粒、至少1010不同的颗粒、至少1011不同的颗粒、至少1012不同的颗粒、至少1013不同的颗粒、至少1014不同的颗粒、至少1015不同的颗粒、至少1016不同的颗粒、至少1017不同的颗粒或更多颗粒。
在某些实施方案中，文库为富集的颗粒池。例如，可以选择具有期望性质的颗粒，并富集在池中。
在某些实施方案中，对于颗粒文库中包含的任何颗粒，固定在其上的核酸试剂的核酸序列与固定在至少一种其它颗粒上的核酸试剂的核酸序列不同。例如，颗粒文库可以包含多种颗粒，并且固定在一种颗粒上的核酸试剂可以与固定在另一种颗粒上的核酸试剂不同。作为另一个实例，颗粒文库可以包含多种颗粒，并且固定在一种颗粒上的核酸试剂的核酸序列可以与固定在另一种颗粒上的核酸试剂的核酸序列不同。
在另一个方面，本申请提供包含多种核成员的池。每种核成员可以包含多种固定至固体载体的部分双链的候选核酸试剂。每种部分双链候选核酸试剂可以包含正向链和比所述正向链更长的反向链。所述正向链和反向链可以至少部分通过碱基配对彼此结合。任何核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列可以与所述池中至少一种其它核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列不同。在某些情况下，核成员可以是核心颗粒，其为具有多种固定在其上的部分双链候选核酸试剂的颗粒。所述部分双链候选核酸试剂的正向链的5’端可以直接地或间接地连接至核成员(例如核心颗粒)包含的固体载体。
在另一个方面，本申请提供包含多种修饰的成员的池。每种修饰的成员可以包含固定至固体载体的多种修饰的候选核酸试剂。每种修饰的候选核酸试剂可以包含至少一种修饰的核苷酸。任何修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的核酸序列可以与所述池中至少一种其它修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的核酸序列不同。修饰的候选核酸试剂可以是单链的。单链修饰的候选核酸试剂的5’端可以直接地或间接地连接至固体载体。另外，所述修饰的候选核酸试剂可能在核酸扩增反应中不能直接地起模板作用。在某些情况下，所述修饰的候选核酸试剂可基本上(或者甚至完全)由修饰的核苷酸组成。
在进一步的方面，本申请提供包含多种模板成员的池。每种模板成员可以包含多种固定至固体载体的双链候选核酸试剂。每种双链候选核酸试剂可以包含正向链和互补的反向链。任何模板成员包含的双链候选核酸试剂的核酸序列可以与所述池中至少一个其它模板成员包含的双链候选核酸试剂的核酸序列不同。所述双链候选核酸试剂的正向链的5’端可以直接地或间接地连接至模板成员的固体载体。所述双链候选核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。例如，所述双链候选核酸试剂的反向链的5’端可以包括修饰的核苷酸，例如磷硫酰化核苷酸、锁核酸(LNA’s)、2’-O-甲基(2’OMe)修饰的核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰的核苷酸、2’氟修饰的核苷酸和5’反向双脱氧-T-磷硫酰化核苷酸。
池中的成员(例如，核成员、修饰的成员和/或模板成员)可以包含固体载体，在其表面上，可以固定多种核酸试剂(单链的、双链的和/或部分双链的)。所述固体载体可以是能够固定核酸试剂的任何合适的固体材料。其可以具有任何形状或尺寸。例如，合适的固体载体可以包括颗粒(例如，珠粒)、载玻片、孔、板内区域、芯片、阵列点等。同一池中的一个成员和任何其它成员之间可以存在清晰的边界。在某些实施方案中，在同一池中不同成员之间不存在任何防止流体连通的固体边界。
在某些情况下，固体载体可以是本申请的颗粒。固体载体可以是无磁性的、磁性的或顺磁性的。例如，固体载体可以具有至少一个约50nm至约100μm(例如，约50nm至约1pm、约50nm至约500nm、约50nm至约100nm、约500nm至约100μm、约1μm至约100μm、或约50μm至约100μm)的尺寸。
本发明的池中的任何成员(例如，模板成员、核成员和/或修饰的成员)包含的候选核酸试剂(例如，双链候选核酸试剂、部分双链候选核酸试剂和/或修饰的候选核酸试剂)的序列多样性可以小于所述池中所有成员(例如，模板成员、核成员和/或修饰的成员)包含的全部候选核酸试剂(例如，双链候选核酸试剂、部分双链候选核酸试剂和/或修饰候选核酸试剂)的序列多样性。
根据本发明的池中的任何成员(例如，模板成员、核成员和/或修饰的成员)包含的候选核酸试剂(例如，双链候选核酸试剂、部分双链候选核酸试剂和/或修饰候选核酸试剂)的序列多样性可以为1至1000(例如，小于900、小于800、小于700、小于600、小于500、小于400、小于300、小于200、小于100、小于50、小于40、小于30、小于20、小于15、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3或小于2)。
根据本发明的池中的任一种成员(例如，模板成员、核成员和/或修饰的成员)可以包含至少1×102(例如，至少1×103、至少1×104、至少1×105、至少1×106、至少1×107、至少1×108、至少1×109、至少1×1010、至少1×1011、至少1×1011或更多)个具有相同核酸序列的候选核酸试剂(例如，双链候选核酸试剂、部分双链候选核酸试剂和/或修饰的候选核酸试剂，相应地)的拷贝。在某些情况下，对于任何成员(例如，模板成员、核成员和/或修饰的成员，相应地)包含的每种候选核酸试剂(例如，双链候选核酸试剂、部分双链候选核酸试剂和/或修饰的候选核酸试剂)，相同的成员可以包含相应的识别核酸试剂(双链的或单链的)。所述识别核酸试剂能够使得其相应候选核酸试剂扩增。模板成员包含的识别核酸试剂可以是双链的，同时，核成员或修饰的成员包含的识别核酸试剂可以是单链的。
在池的任何成员(例如，模板成员、核成员和/或修饰的成员)上，候选核酸试剂与其相应识别核酸试剂的数量比可以为约1010:1至约1:1(例如，约109:1至约1:1、约108:1至约1:1、约107:1至约1:1、约106:1至约1:1、约105:1至约1:1、约104:1至约1:1、约103:1至约1:1、约100:1至约1:1、约90:1至约1:1、约80:1至约1:1、约70:1至约1:1、约60:1至约1:1、约50:1至约1:1、约40:1至约1:1、约30:1至约1:1、约20:1至约1:1、约15:1至约1:1、约10:1至约1:1、约9:1至约1:1、约8:1至约1:1、约7:1至约1:1、约6:1至约1:1、约5:1至约1:1、约4:1至约1:1、约3:1至约1:1或约2:1至约1:1)。在某些实施方案中，在池的任何成员上，候选核酸试剂的数量与其相应识别核酸试剂的数量比例可以为不超过1:10、不超过约1:100、不超过约1:1000、或不超过约1:10000)。
存在约102至约1010种(例如，至少约102种核酸试剂、至少约103种核酸试剂、至少约104种核酸试剂、至少约105种核酸试剂、至少约106种核酸试剂、至少约107种核酸试剂、至少约108种核酸试剂、至少约109种核酸试剂)核酸试剂(候选核酸试剂和/或识别核酸试剂)，其固定至根据本申请的池的成员包含的任何固体载体。
所述识别核酸试剂可以固定至与其相应候选核酸试剂相同的固体载体。另外，识别核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。识别核酸试剂可以包含其相应候选核酸试剂的核酸序列信息。例如，识别核酸试剂可以包含与其相应候选核酸试剂相同的核酸序列。识别核酸试剂可以基本上由天然核苷酸组成。例如，识别核酸试剂可以由天然DNA组成。
对于修饰的成员，识别核酸试剂可以与其相应修饰的候选核酸试剂相同，不同在于所述识别核酸试剂不包含任何修饰的核苷酸，而所述修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸。
对于模板成员，双链识别核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化敏感。例如，双链识别核酸试剂的反向链可不包含导致其对5’至3’核酸外切酶消化有抗性的任何修饰。在某些情况下，模板成员可以进一步包含多种固定至固体载体的单链正向引物，所述单链正向引物可以至少部分地通过碱基配对与所述双链候选核酸试剂的反向链杂交。例如，单链正向引物可以与双链候选核酸试剂的反向链结合，形成核成员的部分双链候选核酸试剂。
在本发明的颗粒中，第一群中(例如，候选核酸试剂)包含的单一种类的核酸试剂能够特异性结合靶标。本申请的修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂也能够特异性结合靶标。
所述靶标可以是多核苷酸、多肽、核酸分子、蛋白靶标、小分子靶标、全细胞、细胞组分、脂质体或其组合。合适的靶标可以包括例如小分子(例如，有机染料)、氨基酸、碳水化合物、脂质、氨基糖苷、抗生素、肽、蛋白、翻译后修饰、核酸、病毒、全细胞和细胞组分。感兴趣的小分子靶标通常具有约800道尔顿或更小的分子量。感兴趣的蛋白靶标可以包括例如细胞表面受体、信号转导因子和激素。感兴趣的细胞靶标可以包括例如哺乳动物细胞，特别是人类细胞；干细胞；肿瘤细胞和细菌细胞。在某些实施方案中，可以根据候选试剂或候选适体序列的单一文库同时对两种或多种类型的靶标(比如，具有不同氨基酸序列的蛋白靶标)进行试验。在某些实施方案中，可以以标记地形式检测靶标分子或经由例如结合相互作用与靶标结合的分子。合适的标记可包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素、抗生物素蛋白、链亲和素或半抗原)、亲和标记物等。
适于使用的示例性的亲和标记物包括但不限于：用于靶分子的单克隆抗体、用于靶分子的多克隆抗体、荧光抗体、生物素化抗体、单核适体蛋白(MONA)结合肽、T7结合肽、链亲和素结合肽、多组氨酸束(polyhistidine tract)、蛋白A(Nilsson et al.,EMBO J.4:1075(1985)；Nilsson et al.,Methods Enzymol.198:3(1991))、谷胱甘肽S转移酶(Smithand Johnson,Gene 67:31(1988))、Glu-Glu亲和标记物(Grussenmeyer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.EISA 82:7952(1985))、物质P、FLAG肽(Hopp et al.,Biotechnology6:1204(1988))或其它抗原表位(antigenic epitope)或结合结构域。通常参见Ford etal.,Protein Expression and Purification 2:95(1991)。DNA分子编码亲和标记物是从商业供应商(例如Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J.)可获得的。
任何荧光多肽(本文中也称为荧光标记)都可以适于用作可检测的标记。合适的荧光多肽将是容易提供可检测信号的多肽，所述信号可以定性地(阳性/阴性)和定量地(比较荧光程度)来评价。示例性的荧光多肽包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、GFP、mRFP、RFP(tdimer2)、HCRED等，或其任何突变体(例如，修饰以提供荧光增强或发射光谱迁移的荧光蛋白)、类似物或衍生物。进一步合适的荧光多肽以及本文列出的那些多肽的具体实例为本领域提供的且是熟知的。
也可以使用基于生物素的标记物。为了进行蛋白质、核酸、碳水化合物、羧酸的生物素化，可以使用生物素化试剂，包括胺反应性试剂以及硫醇反应性试剂；参见，例如，Molecular Probes Catalog,，第4章，Haugland，第6版，1996，通过引用并入本文中。可以通过结合可检测地标记的生物素结合配偶体比如抗生物素蛋白或链亲和素，检测生物素化的底物。类似地，大量半抗原化(haptenylation)试剂也是已知的。
在某些实施方案中，第一群中包括的单一种类的核酸试剂为适体或包括适体。在某些实施方案中，修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂为适体或包括适体。
所述颗粒的第一群中包括的核酸试剂或所述修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂可以能够特异性结合靶标，Kd为约1pM至约100μM、至少约90μM、至少约80μM、至少约70μM、至少约60μM、至少约50μM、至少约40μM、至少约30μM、至少约20μM、至少约10μM、至少约1μM、至少约500nM、至少约400nM、至少约300nM、至少约200nM或至少约100nM。例如，第一群中包括的核酸试剂可以能够特异性结合靶标，Kd为至少约90nM、至少约80nM、至少约70nM、至少约60nM、至少约50nM、至少约40nM、至少约30nM、至少约20nM、至少约10nM、至少约8nM、至少约6nM、至少约4nM、至少约2nM、至少约1nM、至少约900pM、至少约800pM、至少约700pM、至少约600pM、至少约500pM、至少约400pM、至少约300pM、至少约200pM、至少约100pM、至少约90pM、至少约80pM、至少约70pM、至少约60pM、至少约50pM、至少约40pM、至少约30pM、至少约20pM、至少约10pM、至少约5pM、至少约1pM或更大。
所述颗粒的第一群中包含的每种核酸试剂或所述修饰的载体包含的每种修饰的候选核酸试剂都可以包含至少一种修饰。在某些实施方案中，至少一种修饰包含一种或多种修饰的核苷酸，在那种情况下，第一群中包含的核酸试剂是修饰的核酸试剂。
在某些实施方案中，第一群中包含的核酸试剂中没有一种(例如，修饰的候选核酸试剂中没有一种)能够在核酸扩增反应中直接起模板作用。例如，第一群中包含的每种核酸试剂中(例如，每种修饰的候选核酸试剂)能够包含至少一种修饰的核苷酸，并且可能不能在核酸扩增反应中直接起模板作用。
在某些实施方案中，第一群中包含的每种核酸试剂或每种修饰的候选核酸试剂基本上由修饰的核苷酸组成。在某些实施方案中，第一群中包含的每种核酸试剂或每种修饰的候选核酸试剂完全由修饰的核苷酸组成。
所述修饰的核苷酸可以包括位于独立地选自下组的一个或多个位点的一个或多个化学修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。例如，所述化学修饰独立地选自：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5-溴尿嘧啶的取代、5-溴脱氧尿苷的取代、5-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。5-位修饰的嘧啶可以独立地选自5-羧基-2’脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷、5-羧基-2’-脱氧胞苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷(5-AA-dC)、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷(生物素-16-AA-dC)、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
在本发明的颗粒中，第二群可以包含核酸试剂的多个相同的拷贝。对于根据本发明的池的任何成员，识别核酸试剂(双链的或单链的)可以包括核酸试剂的多个相同的拷贝。
在某些实施方案中，第二群中包含的至少一种核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。例如，第二群中包含的至少一种核酸试剂可以由天然DNA组成。
在本发明的颗粒中，第一群中包含的核酸试剂和第二群中包含的核酸试剂比例可以为约1010:1至约1:1。例如，比例为约109:1至约1:1、约108:1至约1:1、约107:1至约1:1、约106:1至约1:1、约105:1至约1:1、约104:1至约1:1、约103:1至约1:1、约100:1至约1:1、约90:1至约1:1、约80:1至约1:1、约70:1至约1:1、约60:1至约1:1、约50:1至约1:1、约40:1至约1:1、约30:1至约1:1、约20:1至约1:1、约15:1至约1:1、约10:1至约1:1、约9:1至约1:1、约8:1至约1:1、约7:1至约1:1、约6:1至约1:1、约5:1至约1:1、约4:1至约1:1、约3:1至约1:1或约2:1至约1:1。在某些实施方案中，第一群中包含的核酸试剂和第二群中包含的核酸试剂的比例可以为不超过1:10、不超过约1:100、不超过约1:1000、或不超过约1:10000。
在另一个方面，本发明提供一种从候选核酸试剂的混合物中识别具有期望性质的核酸试剂的方法。所述方法可以包括：a)获得一种或多种本发明的颗粒(或颗粒的文库/池)；b)将所述颗粒(或颗粒的文库或池)暴露于靶标，从而确定存在或不存在期望的性质；c)分离一种或多种具有固定在其上的具有期望性质的候选核酸试剂的颗粒；和d)从分离的颗粒中识别具有期望性质的候选核酸试剂。
靶标可以是多核苷酸、多肽、核酸分子、蛋白靶标、小分子靶标、全细胞、细胞组分、脂质体或其组合。靶标可以是如在本发明的其它部分中描述的。在某些实施方案中，靶标选自蛋白靶标、小分子靶标、全细胞、细胞组分或脂质体。在本发明中，期望的性质可以是靶结合活性或靶结合诱导活性。靶结合活性可以是亲和性、特异性或双特异性。所述靶结合诱导活性可以是催化活性、抑制活性、活化活性、抑制活性或活化活性的修饰、结构转换活性和/或协作活性(cooperative activity)。期望的性质可以是第一群中的核酸试剂的性质。例如，第一群中的核酸试剂也能够特异性结合靶标(例如，蛋白靶标)。可以由第二群中包含的核酸试剂(例如，识别核酸试剂，比如由天然核苷酸组成的相应DNA分子)确定具有期望性质的核酸试剂(例如，修饰的核酸试剂，比如包含一种或多种修饰的核苷酸的适体)的同一性。例如，可以通过对第二群中的核酸试剂扩增和/或测序来确定具有期望性质的核酸试剂的核酸序列。
根据本发明的识别具有期望性质的核酸试剂的方法可以包括定量来自可检测标记(例如，连接至核酸试剂或靶标的标记)的信号。在某些实施方案中，所述方法包括基于定量信号分离和/或富集包括多种颗粒的群。在某些实施方案中，所述方法包括将一种或多种突变引入到一种或多种核酸试剂中，或引入到一种或多种具有期望性质的核酸试剂中。在某些实施方案中，所述方法包括反复重复一个或多个所述步骤。
在某些实施方案中，来自可检测的标记的信号强度指示固定至本发明的颗粒的核酸试剂和一种或多种可检测的标记靶标之间的结合相互作用。信号可以随核酸试剂和可检测的标记靶标之间的结合亲和性增加而增加。
当考虑到要扩增的核酸试剂序列或适体序列需要时，可以用如上所述的扩增方法(例如，PCR、逆转录酶PCR或引物延伸)扩增具有期望性质的核酸试剂。
可以使用本领域技术人员已知的多种方法和/或装置，比如流式细胞仪(例如，荧光激活细胞分选法(FACS)或拉曼(Ramen)流式细胞仪)、荧光显微镜术、光镊、微移液管(micro-pipettes)和微流体磁分离装置和方法，进行分离和/或分选。在某些实施方案中，当可检测的标记靶标为荧光标记靶标时，可采用荧光激活细胞分选法(FACS)基于一种或多种荧光信号，定量分选颗粒固定的核酸试剂或适体。可以使用一种或多种分选门(sortgates)或阈值水平结合一种或多种可检测的标记来提供对大量核酸试剂-靶标相互作用或适体序列-靶标相互作用的定量分选。另外，可以通过调节靶标浓度和定位分选门位点来定量控制筛选严格性。
当例如荧光信号与核酸试剂(例如，适体)对靶标的结合亲和性相关时，可以调节分选门和/或严格条件以选择对于靶标具有期望亲和性或期望亲和性范围的核酸试剂(例如，适体)。在某些情况下，可能期望从核酸试剂或适体序列的特定文库分离最高亲和性核酸试剂或适体。然而，在其它情况下，可以分离落入特定结合亲和性范围中的核酸试剂或适体。
在一个方面，本发明提供一种产生根据本发明的成员的颗粒、颗粒文库或池的方法。
在一个方面，本发明提供产生一种或多种具有固定在其上的核酸试剂的修饰的颗粒(比如本发明的颗粒或颗粒文库)的方法。所述方法可以包括∶a)获得一种或多种模板颗粒，各自具有多种固定在其上的双链核酸试剂，每种双链核酸试剂可以包含正向链和反向链。所述反向链可以与所述正向链互补。所述正向链可以连接至颗粒(例如，经由正向引物)。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括在a)之前，将多种双链核酸试剂固定至颗粒。例如，多种特别设计的正向引物可以固定至所述颗粒，然后，可以进行核酸扩增(例如，PCR反应，比如乳液PCR)以将所述多种双链核酸试剂固定至所述颗粒。
对于每种模板颗粒，所述多种双链核酸试剂可以包含第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)和第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)，第一双链群中包含的核酸试剂可以与第二双链群中包含的核酸试剂不同。
可以在固定化工艺(例如经由核酸扩增(例如，PCR反应，比如乳液PCR)，例如对于乳液PCR使用不同的反向引物)期间，直接产生第一和第二双链群。例如，在乳液PCR中，可以使用具有(保护的)核酸酶-抗性磷硫酰化(PS)主链的反向引物产生第一双链群，同时，在乳液PCR中，可以使用不具有(未保护的)核酸酶-抗性磷硫酰化(PS)主链的反向引物产生第二双链群。在某些实施方案中，预先确定PCR反应混合物中保护的和未保护的反向引物的比例以控制第一和第二双链群包含的核酸试剂的比例。
在某些实施方案中，在固定化工艺之后，例如在核酸扩增(例如，PCR反应，比如乳液PCR)之后，仅仅一种双链核酸试剂的群可以存在于所述颗粒上。然后，可以进一步处理(例如，部分消化)这些包含仅仅一种双链核酸试剂群的颗粒，产生第一双链核酸群和第二双链群。因此，在某些实施方案中，所述方法进一步包括，在a)之前，处理一个或多个具有多个固定在其上的相同的双链核酸试剂的颗粒(例如，进行部分消化)，产生包含第一和第二双链群的模板颗粒。
在某些实施方案中，第一双链群包含单一种类的核酸试剂的多个相同的拷贝；第二双链群包含至少一种核酸试剂，并且第二双链群的至少一种核酸试剂能够使得包含与第一双链群中包含的核酸试剂相同核酸序列的核酸试剂扩增。
在某些实施方案中，第二双链群中包含的至少一种核酸试剂包含第一双链群中的核酸试剂的核酸序列信息。第二双链群中包含的至少一种核酸试剂可以包含与第一双链群的核酸试剂中包含的核酸试剂相同的核酸序列。
第二双链群可以包含所述至少一种核酸试剂的多个相同的拷贝。
所述方法可以进一步包括b)处理a)中得到的模板颗粒，得到修饰的颗粒，其中每种修饰的颗粒可以包含至少一种来源于第一双链群的修饰的核酸试剂和至少一种来源于第二双链群的识别核酸试剂；所述至少一种修饰的核酸试剂可以包含至少一种修饰的核苷酸，并且在核酸扩增反应中不能直接起模板作用；且所述至少一种识别核酸试剂可以能够使得包含与来源于第一双链群的修饰的核酸试剂相同的核酸序列的核酸试剂扩增。
在所述方法中，b)可以包括∶b1)处理a)中得到的模板颗粒，以仅除去第二双链群中包含的核酸试剂的反向链。例如，b1)可以包括用5’至3’核酸外切酶处理a)中得到的模板颗粒，以仅仅去除第二双链群中包含的核酸试剂的反向链。
例如，第一双链群中包含的核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。例如，第一双链群中的核酸试剂的反向链的5’端可以包含修饰的核苷酸，比如磷硫酰化、锁核酸(LNA’s)、2’-O-甲基(2’OMe)修饰的核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸或5’反向双脱氧-T。第二双链群中包含的至少一种核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化敏感。例如，第二双链群中包含的至少一种核酸试剂的反向链可不包含导致其对5’至3’核酸外切酶消化有抗性的任何修饰。
例如，第一双链群中包含的核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。在某些实施方案中，第一双链群中的核酸试剂的反向链的5’端被磷硫酰化，并且第二双链群中包含的至少一种核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化敏感。因此，通过用5’至3’核酸外切酶处理a)中得到的模板颗粒，可以仅仅去除第二双链群中包含的核酸试剂的反向链。
在用于产生本发明的颗粒的方法中，仅除去第二双链群中的至少一种核酸试剂的反向链可以包含用5’至3’核酸外切酶(比如T5核酸外切酶、核酸外切酶VIII、截短的核酸外切酶或T7核酸外切酶)处理所述颗粒。例如，因为第一双链群中的核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化有抗性，而第二双链群中的核酸试剂的反向链可能对于5’至3’核酸外切酶消化敏感，因此用5’至3’核酸外切酶处理颗粒可以仅消化和去除第二双链群中的核酸试剂的反向链。核酸外切酶消化可以在如下温度下进行：至少约15℃、至少约20℃、至少约25℃、至少约30℃、至少约31℃、至少约32℃、至少约33℃、至少约34℃、至少约35℃、至少约36℃、至少约37℃、至少约38℃、至少约39℃、至少约40℃、至少约41℃、至少约42℃、至少约43℃、至少约44℃、至少约45℃、至少约46℃、至少约47℃、至少约48℃、至少约49℃或至少约50℃。
在所述方法中，b)可以进一步包括b2)处理b1)中得到的颗粒，以除去第一双链群中的核酸试剂的正向链的实质性部分。在某些情况下，第一双链群的核酸试剂的反向链可以与连接于所述颗粒的其部分互补体杂交。在b2)步骤中，第二双链群的至少一种核酸试剂的正向链可以保持完整，并且连接至所述颗粒。
在某些实施方案中，在b2)步骤期间，可以用位点特异性切口酶处理b1)中得到的颗粒，产生所述第一双链群中包含的核酸试剂的有切口的正向链，然后用核酸外切酶进一步处理以除去第一双链群中的核酸试剂的正向链的实质性部分。
可以使用适用于位点特异性产生有切口的正向链的任何酶，例如切口酶可选自：Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BssSI、Nb.BtsI，或其组合。例如，在切口之后，可以产生有切口的正向链，导致其对核酸外切酶消化敏感。切口反应可以在下述温度下进行：至少约30℃、至少约35℃、至少约40℃、至少约45℃、至少约46℃、至少约47℃、至少约48℃、至少约49℃、至少约50℃、至少约51℃、至少约52℃、至少约53℃、至少约54℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约57℃、至少约58℃、至少约59℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约70℃。
例如，切口酶可以识别第一双链群中的双链核酸试剂中的特异性位点，并且仅水解其两个链之一(例如，水解第一双链群中的核酸试剂的正向链)，产生“有切口的”链。因为在b1)步骤中已经去除了第二双链群中的核酸试剂的反向链，因此切口酶不能识别和水解(例如，切开))第二双链群中的核酸试剂的正向链(因为其现在是单链的，其不能被切口酶识别)。因此，可以产生第一双链群中包括的核酸试剂的有切口的正向链，然后其可以被核酸外切酶消化，以除去其实质性部分，而第二双链群的至少一种核酸试剂的正向链可以保持完整且连接至颗粒。在某些实施方案中，在b2)步骤期间，可以用位点特异性限制性内切酶处理b1)中得到的颗粒，使得所述第一双链群中包括的核酸试剂产生双链断裂，然后用核酸外切酶进一步处理以去除第一双链群中的核酸试剂的正向链的实质性部分。
可以使用适用于位点特异性产生核酸试剂的双链断裂的任何酶，例如位点特异性限制性内切酶可选自NdeI、EcoRI、XhoI、HindIII、Ncos、AgeI、BamHI、KpnI、MfeI、SalI、或其组合。例如，在用位点特异性限制性内切酶处理颗粒之后，可能产生双链断裂，导致第一双链群的核酸试剂的正向链对5’至3’核酸外切酶消化敏感。位点特异性的限制性内切酶消化可以在下述温度下进行：至少约25℃、至少约30℃、至少约31℃、至少约32℃、至少约33℃、至少约34℃、至少约35℃、至少约36℃、至少约37℃、至少约38℃、至少约39℃、至少约40℃、至少约41℃、至少约42℃、至少约43℃、至少约44℃、至少约45℃、至少约46℃、至少约47℃、至少约48℃、至少约49℃、至少约50℃或至少约55℃。
例如，位点特异性的限制性内切酶可以识别第一双链群的双链核酸试剂的特异性位点，并且在产生双链断裂之后，暴露第一双链群中核酸试剂的正向链的5’端。因为在b1)步骤中已经去除了第二双链群中核酸试剂的反向链，则位点特异性的限制性内切酶不能识别和消化(例如，切开)第二双链群中核酸试剂的正向链(因为其现在是单链的，其不能被限制性内切酶识别)。因此，第一双链群中包括的核酸试剂的正向链可以被切开，暴露其5’端，然后其被核酸外切酶消化以去除其实质性部分，同时第二双链群的至少一种核酸试剂的正向链可以保持完整且连接至颗粒。
为了除去第一双链群的核酸试剂的正向链的实质性部分，所述颗粒可以进一步用核酸外切酶处理。例如，在用位点特异性切口酶或位点特异性限制性内切酶处理颗粒之后，可以将核酸外切酶(例如，5’至3’核酸外切酶)加入到反应体系或所得到的颗粒中。在某些实施方案中，在用切口酶或位点特异性限制性内切酶处理颗粒之后，第一双链群的核酸试剂的正向链5’端的切口酶或限制性内切酶识别位点被暴露，变得对5’至3’核酸外切酶消化敏感，然后，这些正向链可以被消化且从切口位点或限制性内切酶识别位点开始被去除。核酸外切酶消化可以在下述温度下进行：至少约15℃、至少约20℃、至少约25℃、至少约30℃、至少约31℃、至少约32℃、至少约33℃、至少约34℃、至少约35℃、至少约36℃、至少约37℃、至少约38℃、至少约39℃、至少约40℃、至少约41℃、至少约42℃、至少约43℃、至少约44℃、至少约45℃、至少约46℃、至少约47℃、至少约48℃、至少约49℃或至少约50℃。
在某些实施方案中，在b2)中，第一双链群中核酸试剂的正向链的其余部分没有被去除，保持连接至颗粒，充当部分互补体，并且第一双链群中的核酸试剂的反向链仍然与第一双链群中的核酸试剂的正向链的其余部分杂交。
在用于产生修饰的颗粒的方法的某些实施方案中，a)中的模板颗粒进一步包括包含多种连接在其上的单链核酸试剂(例如，与第一双链群的核酸试剂的反向链互补的固定的正向引物)的第三群，该第三群的多种单链核酸试剂充当b2)中的部分互补体并在去除第一双链群中的核酸试剂的正向链的实质性部分之后，与第一双链群的核酸试剂的反向链杂交。
例如，第三群的单链核酸试剂可以包含与第一双链群的核酸试剂的正向链的5’端的一段序列同源或相同的序列，从而能够与位于第一双链群的核酸试剂的反向链的3’端或与3’端邻近的一段互补序列杂交。在步骤a)中固定至模板颗粒的第一群和第二群的双链核酸试剂的组合数量与在步骤a)中固定至模板颗粒的第三群的单链核酸试剂的数量之间的比例为约10:1至约1:10。例如，a)中固定至模板颗粒的第一和第二双链群的双链核酸试剂的数量与a)中固定至模板颗粒的第三群的单链核酸试剂的数量之间的比例可以为约2:1至约1∶2，例如可以为约1:1。杂交可以在下述温度下进行：至少约45℃、至少约50℃、至少约51℃、至少约52℃、至少约53℃、至少约54℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约57℃、至少约58℃、至少约59℃、至少约60℃、至少约61℃、至少约62℃、至少约63℃、至少约64℃、至少约65℃、至少约66℃、至少约67℃、至少约68℃、至少约69℃、至少约70℃或至少约75℃。
在某些实施方案中，第一双链群的核酸试剂的反向链可以与颗粒分离，并且通过退火再连接至连接颗粒的其部分互补体。退火可以在下述温度下发生；至少约45℃、至少约50℃、至少约51℃、至少约52℃、至少约53℃、至少约54℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约57℃、至少约58℃、至少约59℃、至少约60℃、至少约61℃、至少约62℃、至少约63℃、至少约64℃、至少约65℃、至少约66℃、至少约67℃、至少约68℃、至少约69℃、至少约70℃或至少约75℃。
在所述方法中，b)可以进一步包括b3)整合核苷酸，产生与第一双链群的核酸试剂的反向链互补的核酸链。在某些情况下，b2)的颗粒上的部分互补体可以整合核苷酸来延伸，产生与第一双链群的核酸试剂的反向链互补的核酸链。例如，核苷酸可以通过核酸聚合酶整合。所述整合的核苷酸可以包含至少一种修饰的核苷酸。
可以使用任何合适的聚合酶，例如聚合酶可选自：Bst 3.0 DNA Polymerase、Bst2.0 DNA Polymerase、TherminatorTM DNA Polymerase、Deep VentRTM DNA Polymerase、Deep VentRTM(exo-)DNA Polymerase、Hot Start DNA Polymerase、SulfolobusDNA Polymerase IV、phi29DNA Polymerase、Klenow Fragment(3’→5’exo-)、DNAPolymerase I、Large(Klenow)Fragment、KOD Hot Start DNA Polymerase、KODXtremeTMHot Start DNA Polymerase或其组合。核酸链合成(即，通过整合核苷酸延伸链)可以在下述温度下进行：至少约45℃、至少约50℃、至少约51℃、至少约52℃、至少约53℃、至少约54℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约57℃、至少约58℃、至少约59℃、至少约60℃、至少约61℃、至少约62℃、至少约63℃、至少约64℃、至少约65℃、至少约66℃、至少约67℃、至少约68℃、至少约69℃、至少约70℃或至少约75℃。
在所述方法中，b)可以进一步包括b4)产生具有多种固定在其上的单链核酸试剂的修饰的颗粒，所述多种单链核酸试剂包含第一单链群和第二单链群；第一单链群中包含至少一种修饰的核酸试剂，且第二单链群中包含至少一种识别核酸试剂。
例如，b4)可以包括去除b3)中得到的连接至颗粒的所有核酸试剂的反向链，从而产生具有多种固定在其上的单链核酸试剂的修饰的颗粒。为了去除b4)中连接至颗粒的所有核酸试剂的反向链，可以用碱性溶液培养颗粒，由此使得反向链从正向链上去杂交。例如，所述碱性溶液可以包括NaOH、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、NaCl、Tris、EDTA和/或吐温20。可选地，或者另外，可以用加热或酶(例如，解螺旋酶或核酸外切酶)处理所述颗粒，使反向链从正向链上去杂交。
在某些实施方案中，b4)包括通过用碱性溶液(比如，NaOH溶液)培养使所述反向链去杂交。
第一单链群可以包含单链核酸试剂(例如，修饰的候选核酸试剂)的多个相同的拷贝，其各自可以与模板颗粒的第一双链群中的核酸试剂的反向链互补，并且可以包含至少一种修饰的核苷酸。第二单链群可以包含至少一种单链核酸试剂(例如，识别核酸试剂)，其可以与模板颗粒的第二双链群中包含的至少一种核酸试剂的正向链相同，并且能够使得包含与第一单链群中包含的核酸试剂相同的核酸序列的核酸试剂扩增。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒的方法中，在b1)之后，所述颗粒可以密封在具有进行至少b2)必需的试剂的区室中。进行至少b2)所必需的试剂可以包括下述的一种或多种：切口酶、位点特异性限制性内切酶、核酸外切酶、聚合酶和修饰的dNTP。例如，在仅仅去除第二双链群中包含的至少一种核酸试剂的反向链之后，所述颗粒可以与用于下述的试剂一起密封在区室(例如，液滴)中：除去第一双链群中的核酸试剂的正向链的实质性部分，产生与第一双链群中的核酸试剂的反向链互补的核酸链，和/或去除连接至b4)的颗粒的所有核酸试剂的反向链。例如，所述试剂可以包括一种或多种下述物质：切口酶、位点特异性限制性内切酶、核酸外切酶、聚合酶、修饰的dNTP、天然dNTP、合适的缓冲剂、一种或多种盐和洗涤剂。所述颗粒可以包含在溶液中，并且溶液可以制备成使得每个区室(例如，液滴)可以仅仅包含一种或一些具有固定在其上的核酸试剂的颗粒。
所述方法可以进一步包括c)扩增至少一种识别核酸序列，产生一种或多种a)的模板颗粒。
在某些实施方案中，一种或多种模板颗粒包含两种或多种颗粒，对于所述两种或多种颗粒中的任一种，固定在其上的核酸试剂的核酸序列与固定在至少一种其它颗粒上的核酸试剂的核酸序列不同。例如，两种或多种颗粒可以包含多种颗粒，并且固定在一种颗粒上的核酸试剂可以与固定在另一种颗粒上的核酸试剂不同。作为另一个实例，两种或多种颗粒可以包含多种颗粒，并且固定在一种颗粒上的核酸试剂的核酸序列可以与固定在另一种颗粒上的核酸试剂的核酸序列不同。
在另一个方面，本发明提供一种用于产生包含多种修饰的成员的池的方法。所述多种修饰的成员可以是多种独立的固体载体，各自固定多种修饰的候选核酸试剂。所述方法可以包括a)提供包含多种核成员的池，每种核成员包含多种固定至固体载体的部分双链候选核酸试剂。每种部分双链候选核酸试剂可以包含正向链和比该正向链更长的反向链。所述正向链和反向链可以至少部分地通过碱基配对彼此结合。例如，正向链可以在其整个长度中杂交反向链，形成部分双链结构，而反向链的其余部分仍然是单链的。
所述方法可以进一步包括b)利用相应的反向链作为模板通过核苷酸聚合来延伸所述部分双链候选核酸试剂的正向链，并且在所述延伸期间将至少一种修饰的核苷酸整合到所述正向链中，以形成修饰的候选核酸试剂，由此获得包含多种修饰的成员的池。每种修饰的成员都可以包含多种固定至固体载体的所述修饰的候选核酸试剂。修饰的成员包含的固体载体可以与核成员包含的那些固体载体相同。
任何核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列可以与所述池中至少一种其它核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列不同。例如，相同池中的至少两个核成员包含具有不同核酸序列的核酸试剂。
池中任何核成员包含的候选核酸试剂的序列多样性可以小于所述池中所有核成员包含的全部候选核酸试剂的序列多样性。所述池中任何核成员包含的候选核酸试剂的序列多样性可以为1至1000(例如，小于900、小于800、小于700、小于600、小于500、小于400、小于300、小于200、小于100、小于50、小于40、小于30、小于20、小于15、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3或小于2)。在某些实施方案中，任何单个核成员仅仅包含具有相同核酸序列的核酸试剂。
所述池中的任一种核成员都可以包含至少1×102(例如，至少1×103、至少1×104,atleast1×105、至少1×106、至少1×107、至少1×108、至少1×109、至少1×1010、至少1×1011、至少1×1011或更多)个具有相同核酸序列的候选核酸试剂的拷贝。
部分双链候选核酸试剂的正向链的5’端可以直接地或间接地连接至固体载体。
在某些情况下，候选核酸试剂(双链的、单链的或部分单链的)可以经由连接子连接至固体载体。连接子可以是可裂解的或不可裂解的。在某些实施方案中，连接子可以是氨基-修饰的核酸引物。
在所述方法中，对于任何修饰的成员包含的每种修饰的候选核酸试剂而言，相同的修饰的成员可以包含相应的识别核酸试剂。所述识别核酸试剂能够使得其相应修饰的候选核酸试剂扩增。所述识别核酸试剂可以固定至与其相应修饰的候选核酸试剂相同的固体载体。
在某些实施方案中，核成员和修饰的成员都包含识别核酸试剂。例如，修饰的成员包含的识别核酸试剂也被用于产生其相应的修饰的候选核酸试剂的核成员所包含。在某些实施方案中，修饰的成员和/或所述核成员包含的识别核酸试剂是单链的。
为了提供包含多种核成员的池，所述方法可以包括a1)提供包含多种模板成员的池，每种模板成员都包含多种固定至固体载体的双链候选核酸试剂。每种双链候选核酸试剂可以包含正向链和互补的反向链。双链候选核酸试剂的正向链的5’端可以直接地或间接地连接至模板成员的固体载体(比如，经由可裂解的或不可裂解的连接基，例如可裂解氨基-修饰的核酸引物)。
为了提供包含多种核成员的池，所述方法可以进一步包括：在a1)之后，a2)处理a1)的多种模板成员，以除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，使得所述相应的反向链固定至所述固定载体，而成为所述核成员的所述部分双链候选核酸试剂的所述反向链。
所述池中任一模板成员包含的所述双链候选核酸试剂的序列多样性可以小于所述池中包含的所有模板成员的全部双链候选核酸试剂的序列多样性。所述池中任何模板成员包含的双链候选核酸试剂的序列多样性可以为1至1000(例如，小于900、小于800、小于700、小于600、小于500、小于400、小于300、小于200、小于100、小于50、小于40、小于30、小于20、小于15、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3或小于2)。在某些实施方案中，任何单个模板成员仅仅包含具有相同核酸序列的核酸试剂。
所述池中的任一模板成员可以包括至少1×102(例如，至少1×103、至少1×104、至少1×105、至少1×106、至少1×107、至少1×108、至少1x109、至少1×1010、至少1×1011、至少1×1011或更多)个具有相同核酸序列的双链候选核酸试剂的拷贝。
在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括通过将双链候选核酸试剂固定至固体载体，产生包含多种双链候选核酸试剂的模板成员。例如，多种特别设计的正向引物可以固定至固体载体，然后，可以进行核酸扩增(例如，PCR反应，比如乳液PCR)以将所述多种双链候选核酸试剂固定至所述固体载体。
对于任何模板成员包含的每种双链候选核酸试剂而言，相同的模板成员可以包含相应双链识别核酸试剂。双链识别核酸试剂可以包含正向链和互补的反向链，并且其中所述双链识别核酸试剂与其相应的双链候选核酸试剂不同但却能使得所述相应的双链候选核酸试剂扩增。
双链候选核酸试剂和双链识别核酸试剂都可以在固定化工艺(例如经由核酸扩增(例如,PCR反应，比如乳液PCR)，例如对于乳液PCR使用不同的反向引物)期间直接产生。例如，在乳液PCR中，可以使用具有(保护的)核酸酶-抗性磷硫酰化(PS)主链的反向引物产生双链候选核酸试剂，同时，在乳液PCR中，可以使用不具有(未保护的)核酸酶-抗性磷硫酰化(PS)主链的反向引物产生双链识别核酸试剂。在某些实施方案中，预先确定PCR反应混合物中保护的和未保护的反向引物的比例以控制双链候选核酸试剂和双链识别核酸试剂包含的核酸试剂之间的比例。
在某些实施方案中，在固定化工艺之后(例如在核酸扩增(例如，PCR反应，比如乳液PCR)之后)，仅仅一个双链核酸试剂的群可以存在于固体载体上。然后，可以进一步处理(例如，部分消化)这些包含仅仅一个双链核酸试剂群的模板成员，产生双链候选核酸试剂和双链识别核酸试剂。
在某些实施方案中，处理多种a1)的模板成员，以去除双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，包括：a2-1)处理a1)的多种模板成员，以仅除去所述双链识别核酸试剂的反向链，所述双链识别核酸试剂的正向链仍保持完整且固定至所述固体载体上，而成为所述核成员和/或所述修饰的成员上的识别核酸试剂。例如，a2-1)可以包括用5’至3’核酸外切酶处理a1)中得到的模板成员，以仅除去所述双链识别核酸试剂的反向链。
例如，双链候选核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。例如，双链候选核酸试剂的反向链的5’端可以包含修饰的核苷酸，比如磷硫酰化的、锁核酸(LNA’s)、2’-O-甲基(2’OMe)修饰的核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰的核苷酸、2’氟修饰的核苷酸和5’反向双脱氧-T。双链识别核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化敏感。例如，双链识别核酸试剂的反向链可能不包含导致其对5’至3’核酸外切酶消化有抗性的任何修饰。
例如，双链候选核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。在某些实施方案中，双链候选核酸试剂的反向链的5’端被磷硫酰化，并且双链识别核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化敏感。因此，通过用5’至3’核酸外切酶处理a1)中得到的模板成员，可以仅去除双链识别核酸试剂的反向链。
在用于产生修饰的成员的池的方法中，仅仅去除双链识别核酸试剂的反向链可以包括用5’至3’核酸外切酶(T5核酸外切酶、核酸外切酶VIII、截短的核酸外切酶、或T7核酸外切酶)处理模板成员。例如，双链候选核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化有抗性，而双链识别核酸试剂的反向链可能对5’至3’核酸外切酶消化敏感，用5’至3’核酸外切酶的模板成员可以仅消化和去除所述双链识别核酸试剂的反向链。核酸外切酶消化可以在下述温度下进行：至少约15℃、至少约20℃、至少约25℃、至少约30℃、至少约31℃、至少约32℃、至少约33℃、至少约34℃、至少约35℃、至少约36℃、至少约37℃、至少约38℃、至少约39℃、至少约40℃、至少约41℃、至少约42℃、至少约43℃、至少约44℃、至少约45℃、至少约46℃、至少约47℃、至少约48℃、至少约49℃或至少约50℃。
在某些实施方案中，处理多种a1)的模板成员以除去双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，进一步包括：a2-2)处理a2-1)中得到的多种模板成员以除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，所述双链候选核酸试剂的反向链固定至固体载体上，成为所述核成员的部分双链候选核酸试剂的反向链。例如，可以用核酸外切酶除去双链候选核酸试剂的正向链的实性质部分。
在某些情况下，双链候选核酸试剂的反向链可以杂交其连接至固体载体的部分互补体。
在某些实施方案中，a2-2)包括用位点特异性切口酶处理多种a2-1)中得到的模板成员，产生双链候选核酸试剂的有切口的正向链，其可以进一步用核酸外切酶处理，以除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分。
可以使用适于位点特异性产生有切口的正向链的任何酶，例如，切口酶可选自Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BssSI、Nb.BtsI，或其组合。例如，在切口之后，可以产生有切口的正向链，使其对核酸外切酶消化敏感。所述切口反应可以在下述温度下进行：至少约30℃、至少约35℃、至少约40℃、至少约45℃、至少约46℃、至少约47℃、至少约48℃、至少约49℃,至少约50℃、至少约51℃、至少约52℃、至少约53℃、至少约54℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约57℃、至少约58℃、至少约59℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约70℃。
例如，切口酶可以识别双链候选核酸试剂的特异性位点，并且仅水解其两个链中的仅仅一个链(例如，水解双链候选核酸试剂的正向链)，产生“有切口的”链。因为在a1)的过程中已经去除了双链识别核酸试剂的反向链，切口酶不能识别和水解(例如，切开)所述双链识别核酸试剂的正向链(因为其现在是单链的，不能被切口酶识别)。因此，可以产生双链候选核酸试剂的有切口的正向链，然后其可以被核酸外切酶消化，以去除其实质性部分，而双链识别核酸试剂的正向链可以保持完整，并且连接至固体载体。
在某些实施方案中，a2-2)包括用位点特异性限制性内切酶处理多种a2-1)中得到的模板成员，产生双链候选核酸试剂的双链断裂，其可以进一步用核酸外切酶处理以去除所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分。
可以使用适于位点特异性产生核酸试剂的双链断裂的任何酶，例如位点特异性限制性内切酶可选自NdeI、EcoRI、XhoI、HindIII、Ncos、AgeI、BamHI、KpnI、MfeI、SalI或其组合。例如，在用位点特异性限制性内切酶处理模板成员之后，可以产生双链断裂，使所述双链候选核酸试剂的正向链对5’至3’核酸外切酶消化敏感。位点特异性的限制性内切酶消化可以在下述温度下进行：至少约25℃、至少约30℃、至少约31℃、至少约32℃、至少约33℃、至少约34℃、至少约35℃、至少约36℃、至少约37℃、至少约38℃、至少约39℃、至少约40℃、至少约41℃、至少约42℃、至少约43℃、至少约44℃、至少约45℃、至少约46℃、至少约47℃、至少约48℃、至少约49℃、至少约50℃或至少约55℃。
例如，位点特异性限制性内切酶可以识别双链候选核酸试剂的特异性位点，并在产生双链断裂之后暴露双链候选核酸试剂的正向链的5’端。因为在a1)的过程中已经去除了双链识别核酸试剂的反向链，因此位点特异性限制性内切酶不能识别和消化(例如，切开)所述双链识别核酸试剂的正向链(因为其现在是单链的，不能被切口酶识别)。因此，双链候选核酸试剂的正向链可以被切开,暴露5’端，然后其可以被核酸外切酶消化，以除去其实质性部分，而双链识别核酸试剂的正向链可以保持完整，并且连接至固体载体。
为了除去双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，可以进一步用核酸外切酶处理模板成员。例如，在用位点特异性切口酶或位点特异性限制性内切酶处理模板成员之后，可以将核酸外切酶(例如，5’至3’核酸外切酶)加入到反应体系中或者获得模板成员。在某些实施方案中，在用切口酶或位点特异性限制性内切酶处理模板成员之后，双链候选核酸试剂的正向链的切口或限制性内切酶识别位点5’端暴露，并且变得对5’至3’核酸外切酶消化敏感，这些正向链可被消化且从切口位点或限制性内切酶识别位点开始被去除。核酸外切酶消化可以在下述温度下进行：至少约15℃、至少约20℃、至少约25℃、至少约30℃、至少约31℃、至少约32℃、至少约33℃、至少约34℃、至少约35℃、至少约36℃、至少约37℃、至少约38℃、至少约39℃、至少约40℃、至少约41℃、至少约42℃、至少约43℃、至少约44℃、至少约45℃、至少约46℃、至少约47℃、至少约48℃、至少约49℃或至少约50℃。
在某些实施方案中，在a2)中，所述双链候选核酸试剂的剩余部分没有被去除，仍然固定在固体载体上，充当核成员上所述部分双链候选核酸试剂的正向链，并且所述双链候选核酸试剂的反向链保持与所述正向链的剩余部分结合，充当核成员上部分双链候选核酸试剂的反向链。
在某些实施方案中，所述模板成员进一步包含多种固定在固体载体上的单链正向引物(例如，固定的正向引物与双链候选核酸试剂的反向链互补)。在去除双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分之后，单链正向引物能够与所述双链候选核酸试剂的反向链结合。
例如，所述单链正向引物可以包含与双链候选核酸试剂的正向链的5’端的一段序列同源或相同的序列，从而能够杂交位于双链识别核酸试剂的反向链的3’端或与3’端邻近的一段互补序列。固定在模板成员的固体载体的双链候选核酸试剂和双链识别核酸试剂的组合数量与固定在的相同模板成员的固体载体地单链正向引物的数量之间的比例为约10:1至约1∶10。例如，这样的比例可以为约2:1至约1:2，可以为约1:1。杂交可以在下述温度下进行：至少约45℃、至少约50℃、至少约51℃、至少约52℃、至少约53℃、至少约54℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约57℃、至少约58℃、至少约59℃、至少约60℃、至少约61℃、至少约62℃、至少约63℃、至少约64℃、至少约65℃、至少约66℃、至少约67℃、至少约68℃、至少约69℃、至少约70℃或至少约75℃。
在某些实施方案中，双链候选核酸试剂的反向链从固体载体分离，并通过退火再次连接至连接于固体载体的其部分互补体(例如，单链正向引物)。退火可以在下述温度下发生；至少约45℃、至少约50℃、至少约51℃、至少约52℃、至少约53℃、至少约54℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约57℃、至少约58℃、至少约59℃、至少约60℃、至少约61℃、至少约62℃、至少约63℃、至少约64℃、至少约65℃、至少约66℃、至少约67℃、至少约68℃、至少约69℃、至少约70℃或至少约75℃。
在所述方法中，部分双链候选核酸试剂的正向链可以用核酸聚合酶延伸。可以使用任何合适的聚合酶，例如聚合酶可选自：Bst 3.0DNA Polymerase、Bst 2.0DNAPolymerase、TherminatorTM DNA Polymerase、Deep VentRTM DNA Polymerase、DeepVentRTM(exo-)DNA Polymerase、Hot Start DNA Polymerase、Sulfolobus DNAPolymerase IV、phi29 DNA Polymerase、Klenow Fragment(3’→5’exo-)、DNA PolymeraseI、Large(Klenow)Fragment、KOD Hot Start DNA Polymerase、KOD XtremeTM Hot StartDNA Polymerase或其组合。核酸链合成(即，整合核苷酸，对链进行延伸)可以在下述温度下进行：至少约45℃、至少约50℃、至少约51℃、至少约52℃、至少约53℃、至少约54℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约57℃、至少约58℃、至少约59℃、至少约60℃、至少约61℃、至少约62℃、至少约63℃、至少约64℃、至少约65℃、至少约66℃、至少约67℃、至少约68℃、至少约69℃、至少约70℃或至少约75℃。
在延伸部分双链候选核酸试剂的正向链之后，可以除去反向链，此时修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂是单链的。为了除去连接至固体载体的所有核酸试剂的反向链，可以用碱性溶液培养所述成员，由此使反向链从正向链上去杂交。例如，所述碱性溶液可以包括NaOH、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、NaCl、Tris、EDTA和/或吐温20。可选地，或者另外，可以用加热或酶(例如，解螺旋酶或核酸外切酶)处理所述成员，使反向链从正向链上去杂交。在某些实施方案中，用碱性溶液(比如，NaOH溶液)培养使所述反向链去杂交。
在用于产生修饰的成员池的方法中，在a2-1)之后，所述成员可以密封在区室中。所述区室可以进一步包括下述一种或多种：切口酶、位点特异性限制性内切酶、核酸外切酶、聚合酶和修饰的dNTP。例如，在仅仅除去双链识别核酸试剂的反向链之后，可以将所述成员与用于除去双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分、用于产生与双链候选核酸试剂的反向链互补的核酸链和/或用于在链延伸之后除去连接至固体载体的所有核酸试剂的反向链所必需的试剂一起密封在区室(例如，液滴)中。例如，所述试剂可以包括一种或多种下述物质：切口酶、位点特异性限制性内切酶、核酸外切酶、聚合酶、修饰的dNTP、天然dNTP、合适的缓冲剂、一种或多种盐和洗涤剂。所述成员可以包含在溶液中，并且溶液可以制备成使得每个区室(例如，液滴)可以仅仅包含一种或一些具有固定在其上的核酸试剂的成员。
第二单链群中包含的至少一种核酸试剂(例如，核成员或修饰的成员包含的识别核酸试剂)可以是第一单链群中包含的核酸试剂(例如，修饰的候选核酸试剂，比如修饰的成员包含的那些)的独特标识符。第二单链群(例如，识别核酸试剂)中包含的至少一种核酸试剂可以包含第一单链群(例如，候选核酸试剂)中包含的核酸试剂的核酸序列信息。第一单链群(例如，修饰的候选核酸试剂，比如修饰的成员包含的那些)的核酸试剂可能在核酸扩增反应中不能直接起模板作用。
所述识别核酸试剂(例如，双链的或单链的，比如第二单链群的至少一种单链核酸试剂，或者来自根据本申请的池的成员包含的那些)能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。
所述识别核酸序列(例如，第二单链群的至少一种单链核酸试剂)可以包含与修饰的候选核酸试剂(例如，第一单链群的核酸试剂，比如修饰的成员包含的那些核酸试剂)中包含的相同的核酸序列。例如，识别核酸试剂(例如，第二单链群中包含的至少一种核酸试剂)可以与修饰的候选核酸试剂(例如，第一单链群的核酸试剂)相同，不同在于所述识别核酸试剂不包含任何修饰的核苷酸，而所述修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸。
识别核酸试剂(双链的或单链的，比如第二单链群的至少一种单链核酸试剂)可以基本上由天然核苷酸组成。例如，识别核酸序列(例如，第二单链群的至少一种单链核酸试剂)可以由天然DNA组成。
在产生的修饰的颗粒或修饰的成员中，第一单链群中的核酸试剂或修饰的候选核酸试剂能够特异性结合靶标。靶标可以是蛋白质靶标。第一单链群中包含的修饰的候选核酸试剂或核酸试剂可以是适体。
靶标可以是多核苷酸、多肽、核酸分子、蛋白靶标、小分子靶标、全细胞、细胞组分、脂质体或其组合。合适的靶标可以包括例如小分子(例如，有机染料)、氨基酸、碳水化合物、脂质、氨基糖苷类、抗生素、肽、蛋白质、翻译后修饰、核酸、病毒、全细胞和细胞组分。感兴趣的小分子靶标通常具有约800道尔顿或更小的分子量。感兴趣的蛋白靶标可以包括例如细胞表面受体、信号转导因子和激素。感兴趣的细胞靶标可以包括例如哺乳动物细胞，特别是人类细胞；干细胞；肿瘤细胞和细菌细胞。在某些实施方案中，可以根据单个候选核酸试剂或候选适体序列的库同时对两种或多种靶标(比如，具有不同氨基酸序列的蛋白靶标)进行试验。在某些实施方案中，可以以标记地方式检测靶分子或例如通过结合相互作用与靶分子结合的分子。
合适的标记可以包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素、抗生物素蛋白、链亲和素或半抗原)、亲和标记物等。
适于使用的示例性的亲和性标记物可以包括，但不限于用于靶分子的单克隆抗体、用于靶分子的多克隆抗体、荧光抗体、生物素化的抗体、单核细胞接合蛋白(MONA)结合肽、T7结合肽、链亲和素结合肽、多组氨酸束(polyhistidine tract)、蛋白A(Nilsson etal.,EMBO J.4:1075(1985)；Nilsson et al.,Methods Enzymol.198:3(1991))、谷胱甘肽S转移酶(Smith and Johnson,Gene 67:31(1988))、Glu-Glu亲和性标记物(Grussenmeyeret al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:7952(1985))、P物质、FLAG肽(Hopp et al.,Biotechnology 6:1204(1988))或其它抗原表位或结合域。一般而言，参见Ford et al.,Protein Expression and Purification 2:95(1991)。DNA分子编码亲和标记物是从商业供应商(例如Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J.)可获得的。
任何荧光多肽(本文中也称为荧光标记)可以适于用作可检测的标记。合适的荧光多肽容易提供可以定性地(阳性/阴性)和定量地(比较荧光程度)评价的可检测信号。示例性的荧光多肽包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、GFP、mRFP、RFP(tdimer2)、HCRED等，或其任何突变体(例如，修饰以提供荧光增强或发射光谱迁移的荧光蛋白)、类似物或衍生物。进一步合适的荧光多肽以及本文列出的那些多肽的具体实例为本领域提供的且是熟知的。可以使用基于生物素的标记。可以使用的生物素化试剂包括，例如用于蛋白、核酸、碳水化合物、羧酸的生物素化的胺反应性试剂以及硫醇反应性试剂；参见，例如，Molecular Probes Catalog，第4章，Haugland，第6版，1996年，通过引用并入本文中。可以通过结合可检测的标记的生物素结合配偶体比如抗生物素蛋白或链亲和素检测生物素化的底物。类似地，大量半抗原化(haptenylation)试剂也是已知的。
在本发明的任何方面中，第一单链群中的单链核酸试剂或修饰的候选核酸试剂能够特异性结合靶标，Kd为约1pM至约100μM、至少约90μM、至少约80μM、至少约70μM、至少约60μM、至少约50μM、至少约40μM、至少约30μM、至少约20μM、至少约10μM、至少约1μM、至少约500nM、至少约400nM、至少约300nM、至少约200nM、或至少约100nM，比如约1pM至约10nM。例如，第一单链群中的单链核酸试剂或修饰的候选核酸试剂能够特异性结合靶标，Kd为至少约90nM、至少约80nM、至少约70nM、至少约60nM、至少约50nM、至少约40nM、至少约30nM、至少约20nM、至少约10nM、至少约8nM、至少约6nM、至少约4nM、至少约2nM、至少约1nM、至少约900pM、至少约800pM、至少约700pM、至少约600pM、至少约500pM、至少约400pM、至少约300pM、至少约200pM、至少约100pM、至少约90pM、至少约80pM、至少约70pM、至少约60pM、至少约50pM、至少约40pM、至少约30pM、至少约20pM、至少约10pM、至少约5pM、至少约1pM或更大。
在某些实施方案中，修饰的候选核酸试剂或第一单链群中包含的核酸试剂基本上由修饰的核苷酸组成。
修饰的核苷酸可以包括在独立地选自下组的一个或多个位点的一种或多种化学修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。例如，化学修饰独立地选自下述的修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5-溴尿嘧啶的取代、5-溴脱氧尿苷的取代、5-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。
5-位修饰的嘧啶可以选自：5-羧基-2’-脱氧尿苷(5-Carboxy-dU)、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷(5-AA-dU)、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷(Tryptamino-dU)、5-羧基-2’-脱氧胞苷(5-Carboxy-dC)、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷(5-AA-dC)、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷(Biotin-16-AA-dC)、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
在用于产生一种或多种修饰的颗粒或用于产生修饰的成员池的方法中，第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)中包含的核酸试剂与第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)中包含的核酸试剂的比例可以为约1010:1至约1:1。例如，比例为约109:1至约1:1、约108:1至约1:1、约107:1至约1:1、约106:1至约1:1、约105:1至约1:1、约104:1至约1:1、约103:1至约1:1、约100:1至约1:1、约90:1至约1:1、约80:1至约1:1、约70:1至约1:1、约60:1至约1:1、约50:1至约1:1、约40:1至约1:1、约30:1至约1:1、约20:1至约1:1、约15:1至约1:1、约10:1至约1:1、约9:1至约1:1、约8:1至约1:1、约7:1至约1:1、约6:1至约1:1、约5:1至约1:1、约4:1至约1:1、约3:1至约1:1或约2:1至约1:1。在某些实施方案中，第一双链群(例如，双链候选核酸试剂)中包含的核酸试剂与第二双链群(例如，双链识别核酸试剂)中包含的核酸试剂的比例可以不超过1:10、不超过约1:100、不超过约1:1000或不超过约1:10000。
在某些实施方案中，第一单链群中的核酸试剂或修饰的候选核酸试剂可以显示出期望的性质，并且这样的具有期望性质的核酸试剂的同一性可以由第二单链群的至少一种单链核酸试剂或识别核酸试剂决定。例如，具有期望性质的核酸试剂(例如，修饰的候选核酸试剂)的同一性可以经由对第二单链群的至少一种单链核酸试剂或识别核酸试剂进行测序确定。
在另一个方面，本发明提供根据本发明的颗粒(颗粒文库，或成员池)在制备用于识别具有期望性质的核酸试剂的试剂中的用途。
在本发明中，本发明的固定至颗粒或固体载体的一种或多种核酸试剂可以包括与其共轭的分子。例如，所述共轭的分子可以选自蛋白质(比如抗体)、小分子、荧光团、肽、治疗活性组分(例如，药物)、聚合物(例如，聚乙二醇，聚(乳酸-共-乙醇酸)或水凝胶)和siRNA。
在本发明中，颗粒或固体载体可以是非磁性的、磁性的或顺磁性的。例如，所述颗粒或固体载体可以是珠粒。可以使用多种合适的颗粒或固体载体用于产生本发明的颗粒或成员。这样的颗粒或固体载体可以调整大小至具有至少一种尺寸，例如直径约50nm至约100μm。例如，在某些实施方案中，合适的颗粒或固体载体具有至少一种尺寸：约50nm至约1μm，例如约50nm至约500nm，或约50nm至约100nm。在其它实施方案中，合适的颗粒或固体载体具有至少一种尺寸：约500nm至约100μm，例如约1μm至约100μm，或约50μm至约100μm。合适的颗粒或固体载体通常可以是球形的或者可以具有任何其它合适的形状。在某些情况下，固体载体可以是平坦表面、板内区域(area in a plate)或阵列中的点。
根据本发明的颗粒或固体载体可以由多种合适的材料制备。例如，磁性颗粒或固体载体可以用于本发明的组合物和/或方法中。合适的磁性颗粒或固体载体可以包括例如磁性珠粒或由磁性材料比如铁磁性材料、顺磁性材料或超顺磁性材料制备的其它小物体。磁性颗粒可以包括例如氧化铁(Fe2O3和/或Fe3O4)。另外的感兴趣的颗粒或固体载体可以包括基于聚合物的材料，例如基于聚合物的固体载体或颗粒。例如，可以使用聚苯乙烯颗粒。另外，可以使用陶瓷颗粒。
根据本发明的颗粒或固体载体可以包括或涂布促进所述颗粒或固体载体偶联核酸试剂(例如适体序列)的材料。涂层的实例可以包括聚合物壳、玻璃、陶瓷、凝胶等。在某些实施方案中，涂层包括或自身涂布促进所述颗粒或固体载体偶联或物理结合核酸试剂(例如，适体)的材料。例如，可以使用具有暴露的羧酸基的颗粒或固体载体连接至氨基修饰的核苷酸试剂，比如适体。在某些实施方案中，可以使用链亲和素涂布的颗粒或固体载体连接至5’生物素化的核酸试剂，比如适体。
在本发明中，颗粒或固体载体可以包含约10到约1010种双链和/或单链的核酸试剂，例如至少约102种核酸试剂，至少约103种核酸试剂、至少约104种核酸试剂、至少约105种核酸试剂、至少约106种核酸试剂、至少约107种核酸试剂、至少约108种核酸试剂、至少约109种核酸试剂。
固定至颗粒或固体载体的核酸试剂可以包含单链核酸试剂、双链核酸试剂或其组合。在某些实施方案中，颗粒或池成员可以包括3、4、5、6、7、8或更多种不同的核酸试剂群。例如，池中颗粒或成员可以包括偶数个固定在其上的群，并且这些群匹配且分成多个对。对于每个对而言，第一群可以包含单一种类的核酸试剂(例如，候选核酸试剂)的多个相同的拷贝，并且另一个群可以包含至少一种能够使得所述第一群(例如，相应识别核酸试剂)中的核酸扩增的核酸试剂。
本发明还涉及下述实施方案。
1.一种包含多种固定在其上的核酸试剂的颗粒，其中：所述多种核酸试剂包含第一群和第二群；所述第一群中的核酸试剂与所述第二群中的核酸试剂不同；所述第一群包含单一种类的核酸试剂的多个相同的拷贝；所述第二群包含至少一种核酸试剂，并且所述至少一种核酸试剂能够使得包含与所述第一群中包含的核酸试剂相同的核酸序列的核酸试剂扩增。
2.根据实施方案1的颗粒，其中所述第二群中包含的所述至少一种核酸试剂包含所述第一群中的核酸试剂的核酸序列信息。
3.根据实施方案1或2的颗粒，其中所述第二群中包含的所述至少一种核酸试剂为所述第一群中包含的所述核酸试剂的独特标识符。
4.根据实施方案1-3中任一项的颗粒，其中所述第一群中包含的所述单一种类的核酸试剂能够特异性结合靶标。
5.根据实施方案4的颗粒，其中所述靶标为蛋白靶标。
6.根据实施方案1-5中任一项的颗粒，其中所述第一群中包含的所述单一种类的核酸试剂为适体。
7.根据实施方案1-6中任一项的颗粒，其中所述第一群中包含的每种所述核酸试剂都包含至少一种修饰的核苷酸。
8.根据实施方案7的颗粒，其中所述第一群中包含的每种所述核酸试剂都基本上由修饰的核苷酸组成。
9.根据实施方案7-8中任一项的颗粒，其中所述第一群中包含的所述核酸试剂中没有一种能够在核酸扩增反应中直接地起模板作用。
10.根据实施方案7-9中任一项的颗粒，其中所述修饰的核苷酸包括位于独立地选自下组的一个或多个位点的化学取代或修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。
11.根据实施方案7-10中任一项的颗粒，其中所述修饰的核苷酸包括独立地选自下组的一种或多种修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5’-溴尿嘧啶的取代、5’-溴脱氧尿苷的取代、5’-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。
12.根据实施方案11的颗粒，其中所述5-位修饰的嘧啶选自5-羧基-2’脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷、5-羧基-2’-脱氧胞苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
13.根据实施方案1-12中任一项的颗粒，其中所述第二群包含所述至少一种核酸试剂的多个相同的拷贝。
14.根据实施方案1-13中任一项的颗粒，其中所述第二群中包含的所述至少一种核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。
15.根据实施方案1-14中任一项的颗粒，其中所述第二群中包含的所述至少一种核酸试剂包含与所述第一群中的核酸试剂相同的核酸序列。
16.根据实施方案15的颗粒，其中所述第二群中包含的所述至少一种核酸试剂与所述第一群中的核酸试剂相同，不同在于所述第二群中包含的所述至少一种核酸试剂不包含任何修饰的核苷酸，而所述第一群中的核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸。
17.根据实施方案1-16中任一项的颗粒，其中所述第二群中包含的所述至少一种核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。
18.根据实施方案17的颗粒，其中所述第二群中包含的所述至少一种核酸试剂由天然DNA组成。
19.根据实施方案1-18中任一项的颗粒，其中所述第一群中包含的核酸试剂与所述第二群中包含的核酸试剂的比例为约1010:1至约1:1。
20.根据实施方案1-19中任一项的颗粒，其中一种或多种固定至所述颗粒的核酸试剂包括与其共轭的分子。
21.根据实施方案20的颗粒，其中所述分子选自小分子、荧光团、肽、治疗活性组分和siRNA。
22.根据实施方案1-21中任一项的颗粒，其中所述颗粒是非磁性的、磁性的或顺磁性的。
23.根据实施方案1-22中任一项的颗粒，其中所述颗粒具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。
24.根据实施方案1-23中任一项的颗粒，其中所述多种固定在其上的核酸试剂包含约10至约1010种核酸试剂。
25.根据实施方案4-24中任一项的颗粒，其中所述第一群中包含的所述核酸试剂能够特异性结合靶标，Kd为约1pM至约100μM。
26.根据实施方案1-25中任一项的颗粒，其中所述固定在其上的核酸试剂包括单链核酸试剂、双链核酸试剂或其组合。
27.一种颗粒文库，其中所述文库包含约10至约1015种如实施方案1-26中任一项所定义的不同颗粒。
28.根据实施方案27的文库，其中所述文库为富集的颗粒池。
29.根据实施方案27-28中任一项的文库，其中对于所述文库中包含的任何颗粒，固定在其上的核酸试剂的核酸序列与固定至至少一种其它颗粒的核酸试剂的核酸序列不同。
30.一种从候选核酸试剂的混合物识别具有期望性质的核酸试剂的方法，所述方法包括：a)获得一种或多种如实施方案1-26中任一项所定义的颗粒，或如实施方案27-29中任一项所定义的颗粒文库；b)将所述颗粒暴露于靶标，由此确定存在或不存在所述期望的性质；c)分离一种或多种具有固定在其上的具有期望性质的核酸试剂的颗粒；和d)从分离的颗粒识别所述具有期望性质的核酸试剂。
31.实施方案30的方法，其中所述靶标为蛋白靶标、小分子靶标、全细胞、细胞组分或脂质体。
32.根据实施方案30-31中任一项的方法，其中所述期望的性质为靶结合活性或靶结合诱导活性。
33.实施方案32的方法，其中所述靶结合活性是亲和性、特异性或双特异性。
34.实施方案32的方法，其中所述靶结合诱导活性是催化活性、抑制活性、活化活性、结构转换活性和/或协作活性(cooperative activity)。
35.根据实施方案30-34中任一项的方法，其中所述期望的性质为第一群的核酸试剂的性质。
36.根据实施方案30-35中任一项的方法，其中所述具有期望性质的核酸试剂的同一性由所述第二群中包含的所述至少一种核酸试剂决定。
37.根据实施方案36的方法，其中所述具有期望性质的核酸试剂的同一性经由对所述第二群中包含的至少一种核酸试剂测序决定。
38.一种用于产生一种如实施方案1-26中任一项所定义的颗粒或如实施方案27-29中任一项所定义的颗粒文库的方法。
39.一种用于产生一种或多种具有固定在其上的核酸试剂的修饰的颗粒的方法，所述方法包括：a)获得一种或多种模板颗粒，各自具有多种固定在其上的双链核酸试剂，每种所述双链核酸试剂包含正向链和反向链，其中对于每种颗粒：所述多种双链核酸试剂包含第一双链群和第二双链群，所述第一双链群中包含的核酸试剂与所述第二双链群中的核酸试剂不同；b)处理a)中获得的模板颗粒，以便对于每种颗粒：至少一种修饰的核酸试剂来源于所述第一双链群，所述至少一种修饰的核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸，并且不能在核酸扩增反应中直接起模板作用；并且至少一种识别核酸试剂来源于所述第二双链群，所述至少一种识别核酸试剂能够使得包含与来源于所述第一双链群的所述修饰的核酸试剂相同核酸序列的核酸试剂扩增。
40.根据实施方案39的方法，其中所述第一双链群包含单一种类的核酸试剂的多个相同的拷贝。41.根据实施方案39-40中任一项的方法，其中对于每种所述多种双链核酸试剂，所述反向链与所述正向链互补，并且所述正向链连接至所述颗粒。
42.根据实施方案39-41中任一项的方法，进一步包括c)扩增所述至少一种识别核酸试剂，产生一种或多种a)的所述模板颗粒。
43.根据实施方案39-42中任一项的方法，其中所述一种或多种模板颗粒包含两种或多种颗粒，并且对于两种或多种颗粒中的任一种，固定在其上的核酸试剂的核酸序列与固定至至少一种其它颗粒的核酸试剂的核酸序列不同。
44.根据实施方案39-43中任一项的方法，其中b)包括：b1)处理a)中得到的模板颗粒，以仅除去第二双链群中包含的至少一种核酸试剂的反向链。
45.根据实施方案44的方法，其中b)进一步包括b2)处理b1)中得到的颗粒，以除去所述第一双链群中的所述核酸试剂的正向链的实质性部分。
46.根据实施方案45的方法，其中在b2)中，所述第一双链群的所述核酸试剂的反向链与连接于所述颗粒的其部分互补体杂交。
47.根据实施方案45-46中任一项的方法，其中b)进一步包括b3)整合核苷酸，产生与所述第一双链群的所述核酸试剂的反向链互补的核酸链。
48.根据实施方案47的方法，其中b3)包括通过整合核苷酸延伸b2)的颗粒上的所述部分互补体，产生与所述第一双链群的核酸试剂的所述反向链互补的核酸链。
49.根据实施方案47-48中任一项的方法，其中所述整合的核苷酸包含至少一种修饰的核苷酸。
50.根据实施方案47-49中任一项的方法，其中b)进一步包括b4)产生具有多种固定在其上的单链核酸试剂的修饰的颗粒，所述多种单链核酸试剂包含第一单链群和第二单链群；所述至少一种修饰的核酸试剂包含在所述第一单链群中，并且所述至少一种识别核酸试剂包含在所述第二单链群中。
51.根据实施方案50的方法，其中b4)包括除去b3)中得到的连接至颗粒的所有核酸试剂的反向链，从而产生具有多种固定在其上的单链核酸试剂的修饰的颗粒。
52.根据实施方案39-51中任一项的方法，其中所述修饰的核酸试剂包含单链核酸的多个相同的拷贝，所述单链核酸各自与所述第一双链群中的所述核酸试剂的反向链互补，并且包含至少一种修饰的核苷酸。
53.根据实施方案39-52中任一项的方法，其中所述识别核酸试剂包含至少一种单链核酸试剂，其与所述第二双链群中包含的所述至少一种核酸试剂的正向链相同，并且使得包含与修饰的核酸试剂的核酸序列相同的核酸试剂能够扩增。
54.根据实施方案45-53中任一项的方法，其中在b2)中，所述第二双链群的所述至少一种核酸试剂的正向链保持完整，并且连接至所述颗粒。
55.根据实施方案39-54中任一项的方法，其中所述第一双链群中包含的所述核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。56.根据实施方案39-55中任一项的方法，其中所述第一双链群中包含的所述核酸试剂的反向链的5’端被磷硫酰化。
57.根据实施方案39-56中任一项的方法，其中所述第二双链群中包含的所述至少一种核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化敏感。
58.根据实施方案44-57中任一项的方法，其中b1)包括用5’至3’核酸外切酶处理a)中得到的颗粒，从而仅除去所述第二双链群中包含的所述至少一种核酸试剂的反向链。
59.根据实施方案45-58中任一项的方法，其中b2)包括用位点特异性切口酶处理b1)中得到的颗粒，产生所述第一双链群中包含的核酸试剂的有切口的正向链。
60.根据实施方案45-58中任一项的方法，其中b2)包括用位点特异性限制性内切酶处理b1)中得到的颗粒，使得所述第一双链群中包含的核酸试剂产生双链断裂。
61.根据实施方案45-60中任一项的方法，其中b2)包括用核酸外切酶除去所述第一双链群中的所述核酸试剂的正向链的实质性部分。
62.根据实施方案45-59或实施方案61中任一项的方法，其中在b2)中，所述第一双链群中核酸试剂的正向链的其余部分没有被除去，保持连接至颗粒，充当所述部分互补体，并且第一双链群中的核酸试剂的反向链仍然与第一双链群中的核酸试剂的所述正向链的所述其余部分杂交。
63.根据实施方案45-62中任一项的方法，其中a)中的所述模板颗粒进一步包含包含多种连接在其上的单链核酸试剂的第三群，所述第三群的多种单链核酸试剂充当b2)中的所述部分互补体并在除去第一双链群中的核酸试剂的正向群的实质性部分之后，与第一双链群的所述核酸试剂的所述反向链杂交。
64.根据实施方案47-63中任一项的方法，其中b3)包括用核酸聚合酶整合核苷酸。
65.根据实施方案50-64中任一项的方法，其中b4)包括通过用碱性溶液培养使所述反向链去杂交。
66.根据实施方案45-65中任一项的方法，其中在b1)之后，所述颗粒密封在具有进行至少b2)必需的试剂的区室中。
67.根据实施方案66的方法，其中进行至少b2)所必需的所述试剂可以包括下述的一种或多种：切口酶、位点特异性限制性内切酶、核酸外切酶、聚合酶和修饰的dNTP。
68.根据实施方案39-67中任一项的方法，其中所述修饰的核酸试剂能够特异性结合靶标。
69.根据实施方案68的方法，其中所述靶标为蛋白靶标。
70.根据实施方案39-69中任一项的方法，其中所述至少一种识别核酸试剂包含所述修饰的核酸试剂的核酸序列信息。
71.根据实施方案39-70中任一项的方法，其中所述至少一种识别核酸试剂为所述修饰的核酸试剂的独特标识符。
72.根据实施方案39-71中任一项的方法，其中所述修饰的核酸试剂为适体。
73.根据实施方案39-72中任一项的方法，其中所述修饰的核酸试剂基本上由修饰的核苷酸组成。
74.根据实施方案39-73中任一项的方法，其中所述修饰的核苷酸包括位于独立地选自下组的一个或多个位点的化学取代或修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。
75.根据实施方案39-74中任一项的方法，其中所述修饰的核苷酸包括独立地选自下组的一种或多种修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5’-溴尿嘧啶的取代、5’-溴脱氧尿苷的取代、5’-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。
76.根据实施方案75的颗粒，其中所述5-位修饰的嘧啶选自5-羧基-2’脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷、5-羧基-2’-脱氧胞苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
77.根据实施方案39-76中任一项的方法，其中所述第二双链群包含所述至少一种核酸试剂的多个相同拷贝。
78.根据实施方案39-77中任一项的方法，其中所述识别核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。
79.根据实施方案39-78中任一项的方法，其中所述第二双链群中包含的所述至少一种核酸试剂包含与所述第一双链群的所述核酸试剂中包含的核酸序列相同的核酸序列。
80.根据实施方案39-79中任一项的方法，其中所述识别核酸试剂包含与所述修饰的核酸试剂中包含的核酸序列相同的核酸序列。
81.根据实施方案80的方法，其中所述至少一种识别核酸试剂包含与所述修饰的核酸试剂中包含的核酸序列相同的核酸序列，不同在于所述至少一种识别核酸试剂不包含任何修饰的核苷酸，而所述至少一种修饰的核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸。
82.根据实施方案39-81中任一项的方法，其中所述至少一种识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。
83.根据实施方案82的方法，其中所述至少一种识别核酸试剂由天然DNA组成。
84.根据实施方案39-83中任一项的方法，其中所述第一双链群中包含的核酸试剂与所述第二双链群中包含的核酸试剂的比例为约1010:1。至约1:1。
85.根据实施方案39-84中任一项的方法，其中一种或多种固定至所述颗粒的核酸试剂包括与其共轭的分子。
86.根据实施方案85的方法，其中所述分子选自小分子、荧光团、肽、治疗活性组分和siRNA。
87.根据实施方案39-86中任一项的方法，其中所述颗粒是非磁性的、磁性的或顺磁性的。
88.根据实施方案39-87中任一项的方法，其中所述颗粒具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。
89.根据实施方案39-88中任一项的方法，其中所述多种固定至所述颗粒的核酸试剂包含约10至约1010种核酸试剂。
90.根据实施方案39-89中任一项的方法，其中所述修饰的核酸试剂能够特异性识别靶标，Kd为约1pM至约100μM。
91.根据实施方案39-90中任一项的方法，进一步包括在a)之前，将多种双链核酸试剂固定至所述颗粒，产生所述模板颗粒。
92.根据实施方案91的方法，其中所述固定包括使用乳液PCR。
93.根据实施方案39-92中任一项的方法，其中所述第二双链群中包含的所述至少一种核酸试剂包含与所述第一双链群中核酸试剂的核酸序列信息。
94.根据实施方案1-26中任一项的颗粒或根据实施方案27-29中任一项的颗粒文库在制备用于识别具有期望性质的核酸试剂的试剂中的用途。
95.一种用于产生包含多种修饰的成员的池的方法，所述方法包括：a)提供包含多种核成员的池，每种核成员包含多种固定至固体载体的部分双链候选核酸试剂，并且每种所述部分双链候选核酸试剂包含正向链和比所述正向链更长的反向链，其中所述正向链和反向链至少部分地通过碱基配对彼此结合；和b)利用相应的反向链作为模板通过核苷酸聚合延伸所述部分双链候选核酸试剂的所述正向链，并且在所述延伸期间将至少一种修饰的核苷酸整合到所述正向链中，以形成修饰的候选核酸试剂，由此获得包含多种修饰的成员的池，每种修饰的成员包含多种固定于至所述固体载体的所述修饰的候选核酸试剂；
其中任何核心核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列与所述池中至少一种其它核心核成员所包含的候选核酸试剂的核酸序列不同。。
96.根据实施方案95的方法，其中所述池中任何核成员包含的候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有核成员包含的全部候选核酸试剂的序列多样性。
97.根据实施方案95-96中任一项的方法，其中所述池中的任一种核成员都包括至少1×102个具有相同核酸序列的候选核酸试剂的拷贝。
98.根据实施方案95-97中任一项的方法，其中所述池中任何核成员包含的候选核酸试剂的序列多样性为1至1000。
99.根据实施方案95-98中任一项的方法，其中所述部分双链候选核酸试剂的所述正向链的5’端直接地或间接地连接至固体载体。
100.根据实施方案95-99中任一项的方法，其中所述修饰的候选核酸试剂不能在核酸扩增反应中直接地起模板作用。
101.根据实施方案95-100中任一项的方法，其中对于任何修饰的成员包含的每种修饰的候选核酸试剂而言，相同修饰的成员包含相应识别核酸试剂，其中所述识别核酸试剂使得其相应修饰的候选核酸试剂能够扩增。
102.根据实施方案101的方法，其中所述识别核酸试剂固定至与其相应修饰的候选核酸试剂相同的固体载体。
103.根据实施方案101-102中任一项的方法，其中所述识别核酸试剂包含其相应修饰的候选核酸试剂的核酸序列信息。
104.根据实施方案101-103中任一项的方法，其中所述识别核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。
105.根据实施方案101-104中任一项的方法，其中所述识别核酸试剂包含与其相应修饰的候选核酸试剂的核酸序列相同的核酸序列。
106.根据实施方案101-105中任一项的方法，其中所述识别核酸试剂与其相应修饰的候选核酸试剂相同，不同在于所述识别核酸试剂不包含任何修饰的核苷酸，而所述修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸。
107.根据实施方案101-106中任一项的方法，其中所述识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。
108.根据实施方案101-107中任一项的方法，其中所述识别核酸试剂由天然DNA组成。
109.根据实施方案101-108中任一项的方法，其中所述识别核酸序列也被用于产生其相应的修饰的候选核酸试剂的核成员所包含。
110.根据101-109中任一项的方法，其中所述修饰的成员和/或核成员包含的所述识别核酸试剂是单链的。
111.根据实施方案101-110中任一项的方法，其中对于任何修饰的成员，修饰的候选核酸试剂的数量与其相应识别核酸试剂的数量的比例为约1010∶1至约1:1。
112.根据实施方案95-111中任一项的方法，其中所述修饰的候选核酸试剂能够特异性结合靶标。
113.根据实施方案112的方法，其中所述靶标为蛋白靶标。
114.根据实施方案112-113中任一项的方法，其中所述修饰的候选核酸试剂包括适体。
115.根据实施方案95-114中任一项的方法，其中所述修饰的候选核酸试剂能够特异性结合靶标，Kd为约1pM至约100μM。
116.根据实施方案95-115中任一项的方法，其中所述修饰的候选核酸试剂基本上由修饰的核苷酸组成。
117.根据实施方案95-116中任一项的方法，其中所述修饰的核苷酸包含在独立地选自下组的一个或多个位点的化学取代或修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。
118.根据实施方案95-117中任一项的方法，其中所述修饰的核苷酸包含独立地选自下组的一种或多种修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5’-溴尿嘧啶的取代、5’-溴脱氧尿苷的取代、5’-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。
119.根据实施方案118的方法，其中所述5-位修饰的嘧啶选自5-羧基-2’脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷、5-羧基-2’-脱氧胞苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
120.根据实施方案95-119中任一项的方法，其中一种或多种固定至所述固体载体的核酸试剂包括与其共轭的分子。
121.根据实施方案120的方法，其中所述分子选自小分子、荧光团、肽、治疗活性组分和siRNA。
122.根据实施方案95-121中任一项的方法，其中所述固体载体为颗粒。
123.根据实施方案95-122中任一项的方法，其中所述固体载体是非磁性的、磁性的或顺磁性的。
124.根据实施方案95-123中任一项的方法，其中所述固体载体具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。
125.根据实施方案95-124中任一项的方法，其中约102至约1010种核酸试剂固定至任何固体载体。
126.根据实施方案95-125中任一项的方法，其中所述a)中提供的包含多种核成员的池包括：a1)提供包含多种模板成员的池，每种模板成员包含多种固定至所述固体载体的双链候选核酸试剂，并且每种双链候选核酸试剂包含正向链和互补的反向链；a2)处理a1)的所述多种模板成员，以除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，使得所述相应的反向链固定至所述固体载体，而成为所述核成员的所述部分双链候选核酸试剂的所述反向链。
127.根据实施方案126的方法，其中所述池中任何一个模板成员包含的双链候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有模板成员包含的全部双链候选核酸试剂的序列多样性。
128.根据实施方案126-127中任一项的方法，其中所述池中的任一种模板成员都包括至少1×102个具有相同核酸序列的双链候选核酸试剂的拷贝。
129.根据实施方案126-128中任一项的方法，其中所述池中任何模板成员包含的双链候选核酸试剂的序列多样性为1至1000。
130.根据实施方案126-129中任一项的方法，其中所述双链候选核酸试剂的所述正向链的5’端直接地或间接地连接至模板成员的固体载体。
131.根据实施方案126-130中任一项的方法，其中a1)包括使用乳液PCR产生所述包含多种双链候选核酸试剂的模板成员。
132.根据实施方案126-131中任一项的方法，其中对于任何模板成员包含的每种双链候选核酸试剂而言，相同的模板成员均包含相应的双链识别核酸试剂，所述双链识别核酸试剂包含正向链和互补的反向链，并且其中所述双链识别核酸试剂与其相应的双链候选核酸试剂不同但却能够使得所述相应的双链候选核酸试剂扩增。
133.根据实施方案132的方法，其中所述双链识别核酸试剂包含其相应双链候选核酸试剂的核酸序列信息。
134.根据实施方案132-133中任一项的方法，其中所述双链识别核酸试剂包括与其相应候选核酸试剂相同的核酸序列。
135.根据实施方案132-134中任一项的方法，其中对于任何修饰的成员，双链候选核酸试剂的数量与其相应双链识别核酸试剂的数量的比例为约1010∶1至约1:1。
136.根据实施方案132-135中任一项的方法，其中a2)包括：a2-1)处理a1)的多种模板成员，以仅除去所述双链识别核酸试剂的反向链，所述双链识别核酸试剂的正向链仍然固定至固体载体上，在核成员和/或修饰的成员上形成识别核酸试剂。
137.根据实施方案136的方法，其中a2)进一步包括a2-2)处理a2-1)中得到的所述多种模板成员，以除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，使得所述双链候选核酸试剂的反向链固定至所述固定载体而成为所述核成员的所述部分双链候选核酸试剂的所述反向链。
138.根据实施方案95-137中任一项的方法，其中在b)中，在延伸所述部分双链候选核酸试剂的所述正向链之后，除去反向链，并且所述修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂是单链的。
139.根据实施方案138的方法，其中在延伸所述部分双链候选核酸试剂的所述正向链之后，通过用碱性溶液培养除去反向链。
140.根据实施方案126-139中任一项的方法，其中所述双链候选核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。
141.根据实施方案126-140中任一项的方法，其中所述双链候选核酸试剂的反向链的5’端被磷硫酰化。
142.根据实施方案132-141中任一项的方法，其中所述双链识别核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化敏感。
143.根据实施方案136-142中任一项的方法，其中a2-1)包括用5’至3’核酸外切酶处理a1)的多种模板成员，从而仅除去双链识别核酸试剂的反向链。
144.根据实施方案126-143中任一项的方法，其中a2)包括用核酸外切酶除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分。
145.根据实施方案137-144中任一项的方法，其中a2-2)包括用位点特异性切口酶处理a2-1)中得到的多种模板成员，产生双链候选核酸试剂的有切口的正向链。
146.根据实施方案126-145中任一项的方法，其中在a2)中，所述双链候选核酸试剂的正向链的其余部分没有被除去，保持固定在固体载体上，充当核成员上部分双链候选核酸试剂的正向链，并且所述双链候选核酸试剂的反向链保持结合所述正向链的所述其余部分，充当核成员上部分双链候选核酸试剂的反向链。
147.根据实施方案137-144中任一项的方法，其中a2-2)包括用位点特异性限制性内切酶处理a2-1)中得到的多种模板成员，产生双链候选核酸试剂的双链断裂。
148.根据实施方案126-147中任一项的方法，其中所述模板成员进一步包括固定至固体载体上的多种单链正向引物，在除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分之后，所述单链正向引物能够结合所述双链候选核酸试剂的所述反向链。
149.根据实施方案95-148中任一项的方法，其中b)包括用核酸聚合酶延伸所述部分双链候选核酸试剂的所述正向链。
150.根据实施方案136-149中任一项的方法，其中在a2-1)之后，所述成员被密封在反应室中。
151.根据实施方案150的方法，其中所述反应室进一步包括下述的一种或多种：切口酶、位点特异性限制性内切酶、核酸外切酶、聚合酶和修饰的dNTP。
152.提供包含多种核成员的池，每种核成员包含多种固定至固体载体的部分双链候选核酸试剂，并且每种所述部分双链候选核酸试剂包含正向链和比所述正向链更长的反向链，其中所述正向链和反向链至少部分地通过碱基配对彼此结合；其中任何核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列与所述池中至少一种其它核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列不同。
153.根据实施方案152的池，其中所述池中任何核成员包含的候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有核成员包含的全部候选核酸试剂的序列多样性。
154.根据实施方案152-153中任一项的池，其中所述池中的任一种核成员都包括至少1×102个具有相同核酸序列的候选核酸试剂的拷贝。
155.根据实施方案152-154中任一项的池，其中所述池中任何核成员包含的候选核酸试剂的序列多样性为1至1000。
156.根据实施方案152-155中任一项的池，其中所述部分双链候选核酸试剂的所述正向链的5’端直接地或间接地连接至固体载体。
157.根据实施方案152-156中任一项的池，其中对于任何核成员包含的每种部分双链候选核酸试剂而言，相同的核成员包含相应的识别核酸试剂，其中所述识别核酸试剂能够使得其相应的候选核酸试剂扩增。
158.根据实施方案157的池，其中所述识别核酸试剂固定至与其相应候选核酸试剂相同的固体载体。
159.根据实施方案157-158中任一项的池，其中所述识别核酸试剂为单链的。
160.根据实施方案157-159中任一项的池，其中所述识别核酸试剂包含其相应候选核酸试剂的核酸序列信息。
161.根据实施方案157-160中任一项的池，其中所述识别核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。
162.根据实施方案157-161中任一项的池，其中所述识别核酸试剂包括与其相应候选核酸试剂相同的核酸序列。
163.根据实施方案157-162中任一项的池，其中所述识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。
164.根据实施方案157-163中任一项的池，其中所述识别核酸试剂由天然DNA组成。
165.根据实施方案157-164中任一项的池，其中对于任何核成员，候选核酸试剂的数量与其相应识别核酸试剂的数量的比例为约1010∶1至约1:1。
166.根据实施方案152-165中任一项的池，其中所述固体载体为颗粒。
167.根据实施方案152-166中任一项的池，其中所述固体载体是非磁性的、磁性的或顺磁性的。
168.根据实施方案152-167中任一项的池，其中所述固体载体具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。
169.根据实施方案152-168中任一项的池，其中约102至约1010种核酸试剂固定至任何固体载体。
170.包含多种修饰的成员的池，每种修饰的成员包含多种固定至固体载体的修饰的候选核酸试剂，并且每种修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸；
其中任何修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的核酸序列与所述池中至少一种其它修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的核酸序列不同。
171.根据实施方案170的方法，其中所述池中任何修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有修饰的成员包含的全部修饰的候选核酸试剂的序列多样性。
172.根据实施方案170-171中任一项的池，其中所述池中的任一种修饰的成员都包括至少1×102个具有相同核酸序列的修饰的候选核酸试剂的拷贝。
173.根据实施方案170-172中任一项的方法，其中所述池中任何修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的序列多样性为1至1000。
174.根据实施方案170-173中任一项的池，其中所述修饰的候选核酸试剂为单链的。
175.根据实施方案174的池，其中所述单链修饰的候选核酸试剂的5’端直接地或间接地连接至固体载体。
176.根据实施方案170-175中任一项的池，其中所述修饰的候选核酸试剂不能在核酸扩增反应中直接地起模板作用。
177.根据实施方案170-176中任一项的池，其中对于任何修饰的成员包含的每种修饰的候选核酸试剂而言，相同的修饰的成员均包含相应的识别核酸试剂，其中所述识别核酸试剂使得其相应的修饰的候选核酸试剂能够扩增。
178.根据实施方案177的池，其中所述识别核酸试剂固定至与其相应候选核酸试剂相同的固体载体。
179.根据实施方案177-178中任一项的池，其中所述识别核酸试剂包含其相应修饰的候选核酸试剂的核酸序列信息。
180.根据实施方案177-179中任一项的池，其中所述识别核酸试剂能够在核酸扩增反应中扩增和/或被测序。
181.根据实施方案177-180中任一项的池，其中所述识别核酸试剂包含与其相应修饰的候选核酸试剂的核酸序列相同的核酸序列。
182.根据实施方案177-181中任一项的池，其中所述识别核酸试剂与其相应修饰的候选核酸试剂相同，不同在于所述识别核酸试剂不包含任何修饰的核苷酸，而所述修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸。
183.根据实施方案177-182中任一项的池，其中所述识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。
184.根据实施方案177-183中任一项的池，其中所述识别核酸试剂由天然DNA组成。
185.根据实施方案177-184中任一项的池，其中所述识别核酸试剂为单链的。
186.根据实施方案177-185中任一项的池，其中对于任何修饰的成员，修饰的候选核酸试剂的数量与其相应识别核酸试剂的数量的比例为约1010∶1至约1:1。
187.根据实施方案170-186中任一项的池，其中所述修饰的候选核酸试剂能够特异性结合靶标。
188.根据实施方案187的池，其中所述靶标是蛋白靶标。
189.根据实施方案187-188中任一项的池，其中所述修饰的候选核酸试剂包括适体。
190.根据实施方案170-189中任一项的池，其中所述修饰的候选试剂能够特异性结合靶标，Kd为约1pM至约100μM。
191.根据实施方案170-190中任一项的池，其中所述修饰的候选核酸试剂基本上由修饰的核苷酸组成。
192.根据实施方案170-191中任一项的池，其中所述修饰的核苷酸包含位于独立地选自下组的一个或多个位点的化学取代或修饰：核糖位点、脱氧核糖位点、磷酸盐位点和碱基位点。
193.根据实施方案170-192中任一项的池，其中所述修饰的核苷酸包含独立地选自下组的一种或多种修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5’-溴尿嘧啶的取代、5’-溴脱氧尿苷的取代、5’-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。
194.根据实施方案193的方法，其中所述5-位修饰的嘧啶选自5-羧基-2’脱氧尿苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧尿苷、5-[(3-吲哚基)丙酰胺-N-烯丙基]-2’-脱氧尿苷、5-羧基-2’-脱氧胞苷、5-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、生物素-16-氨基烯丙基-2’-脱氧胞苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷和5-(N-色胺基甲酰胺)-2’-脱氧尿苷。
195.根据实施方案170-194中任一项的池，其中一种或多种固定至所述固体载体的修饰的候选核酸试剂包括与其共轭的分子。
196.根据实施方案195的池，其中所述分子选自小分子、荧光团、肽、治疗活性组分和siRNA。
197.根据实施方案170-196中任一项的池，其中所述固体载体为颗粒。
198.根据实施方案170-197中任一项的池，其中所述固体载体是非磁性的、磁性的或顺磁性的。
199.根据实施方案170-198中任一项的池，其中所述固体载体具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。
200.根据实施方案170-199中任一项的池，其中约102至约1010种核酸试剂固定至任何固体载体。
201.包含多种模板成员的池，每种模板成员包含多种固定至固体载体的双链候选核酸试剂，并且每种双链修饰的候选核酸试剂包含正向链和互补的反向链；
其中任何模板成员包含的双链候选核酸试剂的核酸序列与所述池中至少一种其它模板成员包含的双链候选核酸试剂的核酸序列不同。
202.根据实施方案201的池，其中所述池中任何模板成员包含的双链候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有模板成员包含的全部双链候选核酸试剂的序列多样性。
203.根据实施方案201-202中任一项的方法，其中所述池中的任一种模板成员都包括至少1×102个具有相同核酸序列的双链候选核酸试剂的拷贝。
204.根据实施方案201-203中任一项的方法，其中所述池中任何模板成员包含的双链候选核酸试剂的序列多样性为1至1000。
205.根据实施方案201-204中任一项的池，其中所述双链候选核酸试剂的所述正向链的5’端直接地或间接地连接至模板成员的固体载体。
206.根据实施方案201-205中任一项的池，其中对于任何模板成员包含的每种双链候选核酸试剂而言，相同的模板成员均包含相应双链识别核酸试剂，所述双链识别核酸试剂包含正向链和互补的反向链，并且其中所述双链识别核酸试剂与其相应的双链候选核酸试剂不同但却能够使得所述相应的双链候选核酸试剂扩增。
207.根据实施方案206的池，其中所述双链识别核酸试剂固定至与其相应双链候选核酸试剂相同的固体载体。
208.根据实施方案206-207中任一项的池，其中所述双链识别核酸试剂包含与其相应候选核酸试剂相同的核酸序列信息。
209.根据实施方案206-208中任一项的池，其中所述双链识别核酸试剂包含与其相应候选核酸试剂相同的核酸序列。
210.根据实施方案206-209中任一项的池，其中对于任何模板成员，双链候选核酸试剂的数量与其相应双链识别核酸试剂的数量的比例为约1010∶1至约1:1。
211.根据实施方案201-210中任一项的池，其中所述双链候选核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。
212.根据实施方案201-211中任一项的池，其中所述双链候选核酸试剂的反向链的5’端被磷硫酰化。
213.根据实施方案206-212中任一项的池，其中所述双链识别核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化敏感。
214.根据实施方案206-213中任一项的池，其中所述双链识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。
215.根据实施方案206-214中任一项的池，其中所述双链识别核酸试剂基本上由天然DNA组成。
216.根据实施方案201-215中任一项的池，其中所述固体载体为颗粒。
217.根据实施方案201-216中任一项的池，其中所述固体载体是非磁性的、磁性的或顺磁性的。
218.根据实施方案201-217中任一项的池，其中所述固体载体具有至少一个约50nm至约100μm的尺寸。
219.根据实施方案201-218中任一项的池，其中约102至约1010种双链核酸试剂固定至任何固体载体。
220.根据实施方案201-219中任一项的池，其中所述模板成员进一步包含固定至固体载体上的多种单链正向引物，所述单链正向引物至少部分地通过碱性配对能够杂交所述双链候选核酸试剂的所述反向链。
实施例
提出下述实施例以便给本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整内容和说明，而不意欲限制本发明人认为其发明的范围，也不意欲表示下述试验是进行的全部和唯一的试验。已经进行了努力以确保所用数值(例如数量、温度等)的准确性，但是应当考虑到某些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏温度，压力为常压或接近常压。可以使用标准缩写词，例如bp，碱基对；kb，千碱基对；pl,微微升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下等。
实施例1.颗粒产生和确认
一个根据本发明产生修饰的成员(也称为MAP)的池的实施例显示在图1a-1f中。首先，经由体外区室化(compartmentalizaiton)和乳液PCR(ePCR)方法，用显示正向引物(FP)的颗粒，将3×108个随机DNA分子的文库转变成单克隆模板颗粒的文库(图1a)。单链DNA(ssDNA)文库和引物购自Integrated DNA Technologies(IDT)。所述文库是使用人工混合方法和PAGE-纯化合成的。每种81-核苷酸(nt)文库成员表征为侧接23-nt正向PCR引物和18-nt反向PCR引物的40-nt随机化序列(5’-ATCCAGAGTGACGCTCTTCAGCA-[40N]-TGCACACCGTCGCTTAGT-3’)(SEQ ID NO:1)。特别地设计该ePCR中使用的正向引物和反向引物。正向引物包含接近其3’端GCTCTTC的切口核酸内切酶剪切位点，其可以被切口核酸内切酶Nt.BspQI特异性识别。反向引物为合成的引物的9:1混合物，所述引物分别含有(保护的)和不含有(未保护的)核酸酶-抗性磷硫酰化(PS)主链。
在可以在颗粒上显示DNA文库之前，首先需要将正向引物(FP)偶联至所述颗粒。为此，用500μL的0.01N NaOH洗涤500μL的1-μm MyOne羧酸磁性颗粒(107/μL，Life
Technologies)一次，然后用1mL的无核酸酶水洗涤三次。在最后一次洗涤之后，将颗粒重悬在150μL包含200mM NaCl、0.2mM 5’-氨基-修饰的FP(5’-氨基-PEG18-ATCCAGAGTGACGCTCTTCAGCA-3’)(SEQ ID NO：2)、1mM咪唑氯化物、50％v/v二甲亚砜(DMSO)和250mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(PierceBiotechnology)的反应混合物中。氨基修饰能够共价偶联、使FP在热循环期间与所述颗粒保持连接，同时PEG18在5’端充当展示适体和颗粒之间的间隔基。
将颗粒与试剂混合好，涡旋，超声处理，并置于旋转器上在室温下培养过夜。为了减少颗粒和靶分子之间的非特异性相互作用，在室温下，在含250mM EDC和100mM N-琥珀酰亚胺(NHS)的2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(100mM,PH 4.7)(Pierce Biotechnology)中，将所述颗粒上的剩余羧基转变为氨基-反应性NHS酯，30分钟后，接着在MES缓冲液中与20mM氨基-PEG12(Pierce Biotechnology)共轭1小时。然后，将所述颗粒用500μL的TET缓冲液(10mM Tris,pH 8.0,0.1mM EDTA,0.1％吐温-20)洗涤四次，最后悬浮在500μL的TE缓冲液中，并贮存在4℃。为了测试共轭效率，在59℃下，在100μL的STE缓冲液(10mM Tris pH8.0,50mM NaCl,1mM EDTA)中，用0.2μL的FP颗粒培养1μM的AlexaFluor 647-修饰的FP互补序列(FPC)10分钟，然后在冰上骤冷2分钟。将所述颗粒用100μL的STE缓冲液洗涤两次，并用Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)分析。可以将制备的500μLFP颗粒贮存在4℃下，可稳定6-12个月。
接着，经由乳液PCR产生单克隆模板颗粒。如之前描述的进行乳液PCR(ePCR)(参见，例如Dressman et al.(2003)Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 100:8817-22；Diehl,F.etal.(2006)Nature methods3:551-9)。简而言之，油相由在矿物油中的4.5％司盘80、0.40％吐温80和0.05％Triton X-100组成，全部购自Sigma-Aldrich。制备大量油相，并贮存在4℃下2个月。用于ePCR的水相具有100μL的总体积，由1×GoTaq PCR Master Mix(Promega)、10mM MgCl2、0.8mM的每种dNTP(Promega)、40nM FP、2.7μM具有核酸酶-抗性PS主链的受保护的RP、0.3μM不具有核酸酶-抗性PS主链的未受保护的RP、0.1U/μL的GoTaq Hot Start Polymerase(Promega)、3×108模板DNA和108FP-涂层颗粒组成。通过如下制备油包水型乳液：将100μL的水相加入到在1.5mL管中的500μL的油相中，并使用IKA Vortex 4 digital(IKA,4050100)以3000rpm混合所述1.5mL管10分钟。将该乳液以100μL等分试样分配到6个PCR管中。然后，在下述循环条件下进行25个PCR循环：95℃下3分钟，接着25个95℃下15秒、60℃下15秒和72℃下45秒的循环。
在ePCR之后，产生具有多种固定在其上的双链核酸试剂的颗粒。所述多种双链核酸试剂包含第一双链群和第二双链群，所述第一双链群包含包含保护的反向引物的核酸试剂，并且所述第二双链群包含包含未保护的反向引物的核酸试剂。因为在ePCR期间要控制未保护的和保护的反向引物的比例在约1至9，因此颗粒上展示的约10％的PCR产物存在未保护的反向链(即，第二双链群的核酸试剂)(图1b)。因此，获得展示约90％的第一双链群和约10％的第二双链群的模板颗粒。
接着，模板颗粒/成员被翻译成修饰的颗粒/成员(例如，修饰的适体颗粒或MAP)。在PCR之后，将来自PCR管的乳液收集到1.5mL的管中。将600μL的2-丁醇加入到所述乳液中，通过涡旋混合好进行破乳。在涡旋30秒之后，将颗粒以13,000×g离心2分钟。在小心地除去油相之后，将颗粒再悬浮在500μL的破乳(EB)缓冲液(100mM NaCl，1％Triton X-100,10mMTris-HCl,pH 7.5和1mM EDTA)中，并将其再转移到新的1.5mL管中。在涡旋30秒且以13,000×g离心90秒之后，除去上清液。然后，将管放置在磁力分离器(DynaMag-2Magnet,LifeTechnologies)上，并移除剩余上清液。将颗粒使用磁性分离用TET缓冲液洗涤三次，然后再悬浮在100μL的TE缓冲液中。用CFX96TouchTM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)进行定量PCR，以评价每种单克隆模板颗粒的扩增的模板拷贝数。通过将106、107、108、109或1010个模板加入到20μL反应液中制备校准样品，所述反应液包含各250nM的FP和RP、1,000FP-涂层颗粒、10μL的GoTaq PCRMaster Mix(Promega)和0.5xSYBR绿染料(LifeTechnologies)。同样制备试验样品，但是采用1,000个单克隆模板颗粒。从阈值循环，定量在1,000个颗粒上的约4.8×107个序列。由于仅仅20％的模板颗粒显示模板序列，每个载有模板的颗粒上序列的平均拷贝数为约2.4×105。
然后，将50个单位的T7 5’至3’核酸外切酶(New England Biolabs,M0263)与显示双链DNA(dsDNA)模板的单克隆模板颗粒在100μL的缓冲液(New EnglandBiolabs,B7204)中混合，并在25℃下培养15分钟。T7核酸外切酶仅仅消化5’端未保护的反向链(约10％)(即，第二双链群中的核酸试剂的反向链)，且保持PS主链保护的反向链(即，第一双链群中的核酸试剂的反向链)(90％)完整(图1c)。
使用荧光标记的探针确认在用于获得修饰的适体颗粒(MAP，或根据本发明的修饰的成员)的每个方法步骤之后产生的中间产物。对于图3a-3e中描述的所有试验，使用荧光标记的(即，Alexa Fluor 488-修饰的)反向引物(RP)或RP互补序列(RPC)探针定量颗粒上显示的模板的正向链或反向链。在所述方法期间的每个步骤之后，采样0.2μL的颗粒，用100μL的TET缓冲液洗涤一次，并且在50℃下，用在100μL的STE缓冲液(10mM Tris pH 8.0,50mMNaCl,1mM EDTA)中的1μM的合适荧光探针(Alexa Fluor 488-修饰的RP或RPC)培养所述颗粒10分钟，然后在冰上骤冷2分钟。接着，将所述颗粒用100μL的STE缓冲液洗涤两次，并通过Accuri C6Flow Cytometer(BD Biosciences)分析，以定量其荧光强度。如图3a中所示，当通过用100mM的NaOH洗涤两次将固定至颗粒的全部核酸试剂的反向链与正向链分离时，荧光标记的探针(Alexa Fluor 488 RP)杂交正向链，因此，检测荧光信号，其表示两种双链群。当T7核酸外切酶除去第二双链群中核酸试剂(例如，双链识别核酸试剂)的反向链时，在第一次T7核酸外切酶消化(图1c)之后，进行图3b中的试验。在没有使用NaOH去杂交反向链，而仅仅杂交第二双链群中的核酸试剂(识别核酸试剂，现在在T7消化之后是单链的)的正向链下，加入荧光标记的探针(Alexa Fluor 488 RP)，并且检测到非常弱的荧光信号。
而且，如6a-6b中所示，当使用T7核酸外切酶(NEB,M0263)时，除去第二双链群(双链识别核酸试剂，5’端未保护)中核酸的反向链，用与第二双链群的正向链的3’端互补的荧光探针(即，Alexa Fluor 488 RP)验证(图6b)。
接着，将20个单位的Nt.BspQI切口核酸内切酶(New England Biolabs,R0644)加入到在100μL的NEBuffer 3.1(New England Biolabs,B7203)中的模板颗粒中，并在50℃下培养30分钟，以便仅仅裂解位于双链候选核酸试剂上Nt.BspQI识别位点(在核苷酸20之后，即在GCTCTTCA之后)的DNA的一个链(即，第一双链群中核酸试剂的正向链)，产生“有切口的”候选核酸试剂(图1d)。在该步骤中，由于前述T7消化，约10％的固定的核酸试剂是单链的(即，识别核酸试剂，包含第二双链群中核酸试剂的正向链)，并且不能被切口酶裂解(图1d)。
如图3c所反映的，在切口之后，第一双链群(双链候选核酸试剂)中的核酸试剂的正向链有缺口(图1d)。在用100mM的NaOH洗涤两次以使反向链去杂交之后，仅仅第二双链群(识别核酸试剂)中核酸试剂的正向链保持完整且连接至颗粒，其与荧光标记的探针(AlexaFluor 488 RP)杂交，并且检测的信号与图3b中的类似。因此，证实了切口的效果。
另外，当使用多种不同的切口酶时，也验证了切口酶的作用。例如，如图5a-5c所示，当分别使用切口酶Nt.BspQI(NEB,R0644)(FIG.5a)和Nt.BbvCI(NEB,N0632)(FIG.5b)时，成功地产生了第一双链群(双链候选核酸试剂)的核酸试剂的有切口的正向链，用与第二双链群中的核酸试剂的正向链的3’端互补的荧光探针(即，Alexa Fluor 488 RP)得到验证(图5c)。切口反应缓冲液、温度和时间与上述实施例1中描述的相同。
另外，如图8a-8c中所示，对于包含不同比例的第一双链群(双链候选核酸试剂)中的核酸试剂和第二双链群(双链识别核酸试剂)中的核酸试剂的颗粒，在切口之前(图8a)和在切口(图8b)之后检测的荧光信号相应地变化，用与第二双链群中的核酸试剂(双链识别核酸试剂)的正向链的3’端互补的荧光探针得到验证(图8c)。
然后，将“有切口的”颗粒暴露于第二次T7核酸外切酶(New England Biolabs,M0263)消化(与第一次消化相同的条件)，以仅仅在“切口”之后暴露的5’端除去正向链(即，第一双链群中的核酸试剂或双链候选核酸试剂的正向链)(图le)。在该步骤之后，每个单克隆的颗粒显示10％的天然正向链识别核酸试剂(即，第二双链群中的核酸试剂的正向链)和90％的反向链(即，第一双链群中的核酸试剂或双链候选核酸试剂的反向链)在颗粒上退火成正向引物(即，第一双链群中的核酸试剂的反向链的部分互补体，或双链候选核酸试剂的正向链的其余部分)(图1e)。
如图3d所示，当第二双链群中的核酸试剂的反向链被除去且第一双链群的核酸试剂的正向链被部分除去时(图1e)，荧光标记的探针(Alexa Fluor 488 RPC)仅仅杂交第一双链群中的核酸试剂的反向链。
接着，用TET缓冲液洗涤所述颗粒两次，准备用于延伸长。使用KOD XtremeTM HotStart DNA Polymerase(EMD Millipore,71975)整合反向模板链(即，第一双链群中的核酸试剂或双链候选核酸试剂的反向链)编码的天然和修饰的dNTP(图1f)。对于每108个颗粒，制备100μL的延长反应液，其包括100mM KHPO4(pH 7.4)、10mM MgCl2、1mM DTT、40个单位的KOD XtremeTM Hot Start DNA Polymerase、dATP、dGTP、dCTP或修饰的dCTP衍生物之一、和dTTP或修饰的dUTP衍生物之一(对于每种天然dNTP，最终浓度为50μM，且对于每种修饰的dNTP衍生物，最终浓度为100μM)。在70℃下，进行延伸反应30分钟。
当使用多种不同的聚合酶时，也验证聚合酶的作用。例如，如图7a-7b中所示，当使用聚合酶Therminator 9N(NEB,M0261)、Klenow(NEB,M0210)、BST2.0(NEB,M0537)和BST3.0(NEB,M0374)时，成功地完成了预期的核酸试剂(例如，第一单链群中的核酸试剂)延伸，用与全合成的核酸的3’端互补的荧光探针(即，Alexa Fluor 488RP)得到验证(图7b)。
使用各种修饰的核苷酸产生根据本发明的颗粒。如可以从图4a-4f中可以看到的，当使用修饰的dUTP(FIG.4a)、修饰的dCTP(FIG.4b)、修饰的dUTP和dCTP(图4c和图4d)和100％修饰的核苷酸(图4e)时，成功地获得了预期的核酸试剂(例如，第一单链群中的核酸试剂)延伸，用与全合成的核酸试剂的3’端互补的荧光探针(即，Alexa Fluor 488RP)得到验证(图4f)。在图4中描述的所有试验中，天然dNTP、侧链-修饰的dNTP衍生物(图4a-d)和主链-修饰的dNTP(图4e-f)的最终浓度分别保持为50μM、100μM和1mM。
如图11a-11b中所示，当使用修饰的核苷酸延伸与第一双链群(例如，用于产生修饰的候选核酸试剂)中的核酸试剂的反向链互补的核酸链时，在修饰的核苷酸的存在下产生预期的核酸试剂(图11b，其中将dATP、dGTP、dCTP和修饰的dUTP加入聚合反应中)，与对照进行比较(图11a，其中仅仅将dATP、dGTP和dCTP加入聚合反应中)，表明成功地整合了修饰的核苷酸。
在延伸之后，进行破乳，反向链去杂交，在颗粒上留下单链修饰的适体(即，第一单链群的核酸试剂或修饰的候选核酸试剂)(～90％)和天然DNA模板序列(即，第二单链群中的核酸试剂或识别核酸试剂)(～10％)，完成了修饰的颗粒(例如，MAP)的形成，准备用于筛选。简而言之，通过离心将颗粒收集在管中，然后再悬浮在200μM的0.1M NaOH中，并培养2分钟。将所述管置于磁力分离器中1分钟，小心地除去上清液。在重复该步骤两次之后，将颗粒再悬浮在300μL的TE缓冲液中。
与模板颗粒一样，修饰的颗粒/成员(例如，MAP)是单克隆的，其中每个颗粒显示约2×105个单个修饰的适体序列(即，第一单链群的核酸试剂，在本发明中也称为修饰的候选核酸试剂)的拷贝，和约2×104个扩增的天然DNA序列(即，第二单链群的核酸试剂，在本发明中也称为识别核酸试剂)的拷贝。
如图3e所示，在链延伸(图1f)和用100mM NaOH洗涤两次除去固定至颗粒的全部种群核酸试剂的反向链之后，所述颗粒包含多种单链核酸试剂，所述多种单链核酸试剂包含第一单链群(例如，包含修饰的核酸试剂)和第二单链群(例如，包含识别核酸试剂)，其中第一单链群中的每种核酸试剂都与第一双链群中的核酸试剂的反向链互补，并且第二单链群中的核酸试剂与第二双链群中的核酸试剂的正向链相同，荧光标记的探针(Alexa Fluor488 RP)同时杂交第一和第二单链群中的核酸试剂。
对于根据本发明的方法产生的颗粒，当使用具有各种不同比例的第一单链群和第二单链群中的核酸试剂时，成功地产生了扩增产物，如图9中所示。泳道1是梯形条带(ladder)标记物；在泳道2和泳道6中，第一单链群中的核酸试剂和第二单链群中的核酸试剂的比例为1:1；在泳道3和泳道7中，第一单链群中的核酸试剂和第二单链群中的核酸试剂的比例为9:1；在泳道4和泳道8中，第一单链群中的核酸试剂和第二单链群中的核酸试剂的比例为49:1；泳道5和泳道9说明了来自使用参考DNA适体的阳性对照的结果。
进一步，如图10所示，对于根据本发明的方法产生的颗粒，只有当存在第二单链群的核酸试剂(例如，识别核酸试剂)时才可以产生扩增产物。泳道1为DNA梯形条带标记物，泳道2显示包括来自第一和第二单链群的核酸试剂的颗粒的扩增结果，和泳道3显示仅仅包括第一单链群(例如，修饰的候选核酸试剂)的核酸试剂的颗粒的扩增结果。
另外，如图12a-12b所示，对于根据本发明的方法产生的颗粒，使用蛋白靶标嗜中性粒细胞明胶酶-结合的脂质运载蛋白(lipocalin)(NGAL)测试第一单链群(例如，修饰的候选核酸试剂)的核酸试剂的靶结合能力。特别地，在100μL具有0nM、5nM或25nM NGAL的PBSMCT(含有2.5mM MgCl2、1mM CaCl2、0.01％TWEEN-20的DPBS)中培养约106个修饰的适体颗粒(MAP或修饰的成员)，并向反应中加入Histag.0.1mg/mL鲑鱼精子DNA(LifeTechnologies)以阻断随机DNA和NGAL之间的非特异性相互作用。也加入10μM的His-Tag肽(GenScript)以消除与连接至NGAL蛋白的His-Tag的结合。在用NGAL培养1小时之后，用PBSMCT洗涤MAP两次，并用5nM荧光标记的单克隆抗体(iFluor 488His-Tag抗体)标记俘获MAP的NGAL蛋白20分钟。然后，用PBSMCT洗涤MAP两次，并用FACS测量Alexa 488信号。对于不同浓度(5nM和25nM)的靶标，仅仅含有修饰的核苷酸的核酸试剂(图12a)可以产生结合信号，而相同核酸序列的天然DNA核酸试剂不会结合所述靶标(图12b)，表明了来自第一单链群的核酸试剂(例如，修饰的候选核酸试剂)的结合活性结果。
而且，如图13a-13b所示，也使用蛋白靶标NGAL测试颗粒文库中的核酸试剂的靶结合能力。所述文库包含具有修饰的核酸试剂(例如，核酸试剂包含修饰的核苷酸，图13a)的颗粒或具有相同核酸序列的天然DNA(例如，核酸试剂仅仅包含天然核苷酸，图13b)的颗粒。对于浓度为100nM的靶标，仅仅包含具有修饰的核酸试剂的颗粒的文库(图13a)显示强结合信号，而包含具有仅仅天然DNA核酸试剂的颗粒的文库没有显示强结合信号(图13b)，表明可以使用修饰的核酸试剂产生具有更高结合活性的试剂。
实施例2.颗粒产生
图2a-2g显示根据本发明用于产生颗粒的另一个实施例。首先，经由体外区室化和乳液PCR(ePCR)，用显示正向引物的颗粒，如实施例1中描述的类似地进行，将3×108个随机DNA的文库转化成单克隆模板颗粒文库(图2a)。控制每个乳液室中PCR循环数量和试剂量(即，引物和聚合酶)，以便使用颗粒上显示约50％的正向引物来合成PCR产物(图2a)。如此，在第二阶段区室化中，将有等量的DNA模板链(即，第一和第二双链群的双链核酸试剂)(50％)和可用正向引物(即，第三群中的单链核酸试剂)(约50％)进行延伸反应。
为了精确控制ePCR循环数以获得模板颗粒上约50％的最大覆盖，进行一系列使用不同PCR循环数量的ePCR。在ePCR之后，乳液破裂，使用NaOH使固定至所述颗粒的全部核酸试剂的反向链去杂交。然后，在使AF-488标记的与充分延伸的核酸正向链的3’端互补的反向引物退火至产生的颗粒之后，使用FACS定量充分延伸的核酸试剂的覆盖度。分析在不同ePCR循环之后阳性群的中位荧光强度(如图14a所示)，并且选择20个ePCR-循环以产生DNA模板颗粒，使得约50％的可用正向引物没有被PCR产物(即，双链候选和识别核酸试剂)所占据。在该ePCR之后，每个DNA模板颗粒的约50％正向引物未被占据，这通过简单地使与所述正向引物互补的AF-488标记的链退火验证。这在ePCR之前和之后进行，并使用FACS测量它们的荧光强度，证实了约50％比例(13342/29365)(图14b)。
单链DNA(ssDNA)文库和引物购自Integrated DNA Technologies(IDT)。所述文库是使用人工混合方法和PAGE-纯化合成的。每个81-核苷酸(nt)文库成员表征为侧接26-nt正向PCR引物和20-nt反向PCR引物的40-nt随机化序列(5’-CATATGAGCAGCACAGAGGTCAGATG-[40N]-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’)(SEQ ID NO:3。特别地设计该ePCR中使用的正向引物和反向引物。正向引物包含接近其5’端GCTCTTC的核酸内切酶剪切位点，其可以被核酸内切酶NdeI(New England Biolabs,R0111)特异性识别且在CA|TATG处裂解。反向引物为合成的引物的9:1混合物，所述引物分别含有(保护的)和不含有(未保护的)核酸酶-抗性磷硫酰化(PS)主链。对于ePCR，要控制未保护的和保护的反向引物的比例在约1至9，使得约10％的PCR产物(即，第二双链群的核酸试剂)显示颗粒上存在未保护的反向链(图2b)。
在使乳液破乳和除去未反应的PCR试剂(如实施例1中描述的相同方法)之后，单克隆的模板颗粒显示dsDNA模板(即，第一和第二双链群的核酸试剂)位于一半引物位点上。因此，获得了显示约45％的第一双链群(双链候选核酸试剂)、约5％的第二双链群(双链识别核酸试剂)和约50％的第三单链群(单链正向引物)的模板颗粒。
接着，所述模板颗粒被翻译成修饰的颗粒，例如MAP(或未修饰的成员)。
然后，将得到的单克隆模板颗粒与50个单位的T7 5’至3’核酸外切酶(NewEngland Biolabs,M0263)混合在100μL的缓冲液(New England Biolabs,B7204)中，并在25℃下培养15分钟。T7核酸外切酶仅仅消化5’端未保护的反向链(即，第二双链群中的核酸试剂的反向链，约5％))，且保持PS主链保护的反向链(即，第一双链群中的核酸试剂的反向链，约45％)完整(图2c)。然后，将108个模板颗粒在冰上混入100μL的反应混合物中，所述反应混合物由/>Buffer(New England Biolabs,B7204)、dATP、dGTP、dCTP或修饰的dCTP衍生物之一、和dTTP或修饰的dUTP衍生物之一(对于每种天然dNTP，最终浓度为50μM，对于每种修饰的dNTP衍生物，最终浓度为100μM)、以及三种不同的酶(即，80个单位的NdeI限制性内切酶(New England Biolabs,R0111)、10个单位的T7 5’至3’核酸外切酶(New England Biolabs,M0263)和40个单位的KOD XtremeTM Hot Start DNAPolymerase(EMD Millipore,71975))。然后，在体外区室化的第二阶段中，将该反应混合物分隔到乳液区室中(图2d)，其中每个区室包含不超过一个DNA模板颗粒(与如实施例1中描述的相同的体外区室化方法)。
接着，将该乳液区室在热循环仪中在37℃下培养60分钟(图2e)。此时，限制性内切酶释放来自颗粒的DNA模板(即，第一双链群的核酸试剂)，T7核酸外切酶仅仅消化在从所述颗粒释放之后暴露的5’端的正向链(即，第一双链群中的核酸试剂的正向链)(图2e)。用PS主链保护所述反向链(即，第一双链群中的核酸试剂的反向链)免于T7核酸外切酶破坏。在该步骤中，由于前述T7消化，约5％的模板DNA是单链的(即，第二双链群的核酸试剂的正向链)，并且不会被限制性内切酶切开(图2e)。如此，在每个修饰的颗粒(例如，MAP)上将保持约5％的天然DNA模板链(即，第二双链群的核酸试剂的正向链)，其可以使用PCR直接扩增。然后，将温度升高至约90℃10分钟，以灭活NdeI限制性内切酶和活化KOD XtremeTM HotStart DNA Polymerase。接着，将温度降低至60℃30秒，以在颗粒上使反向链(即，第一双链群中的核酸试剂的反向链或双链候选核酸试剂)退火至可用未占据的单链正向引物(即，部分互补体，其为第三群的单链核酸试剂)(图2f)。接着，将温度升高至70℃30分钟，以促进延伸。KOD XtremeTM Hot Start DNA Polymerase整合模板链(即，第一双链群的核酸试剂的反向链)编码的天然和修饰的dNTP(图2g)。然后，乳液破裂，使反向链去杂交，仅仅在颗粒上留下单链修饰的适体(即，第一单链群的核酸试剂)，完成修饰的颗粒(例如，MAP)的形成，接着准备用于筛选。与模板颗粒一样，修饰的颗粒/成员(例如，MAP)是单克隆的，其中每个颗粒显示约105个单个修饰的适体(即，第一单链群的核酸试剂)序列的拷贝，和约104个扩增的天然DNA(即，第二单链群的核酸试剂)序列的拷贝。
还小心地监测和优化第二次区室化反应中的每个步骤的条件。为了测试NdeI限制性内切酶剪切步骤，使用AF-488标记的反向引物进行ePCR，在模板颗粒上得到荧光双链DNA(图14c)。NdeI活性在低温下受到抑制，低温是防止双链DNA在准备用于第二次区室化反应时释放所必需的(图14c)。然后，确认了在37℃下使用NdeI剪切60分钟能够从颗粒释放全部双链DNA模板(图14c)。接着，测试T7核酸外切酶活性，确认了PS-保护的反向链(即，双链群中核酸试剂的反向链)和模板颗粒上未占据的正向引物之间的成功杂交。这是通过破乳和使具有AF-488标记的反向引物补体的颗粒退火，并在FACS中测量荧光强度(图14d)。它们的高荧光证实T7完全消化了正向链，并且反向链被颗粒上的可用正向引物成功地俘获。接着，BST3.0聚合酶将天然和修饰的dNTP整合反应中，成功地获得了修饰的全延长的核酸试剂(例如，适体)，断定模板DNA颗粒翻译成了修饰的颗粒(例如，MAP)。然后，进行破乳，并使用NaOH除去反向链。使用FACS，通过使具有荧光标记的反向引物的颗粒退火测试修饰的颗粒(例如，MAP)的性质，因此仅仅正确延长的适体将得到信号(图14e)。基于泊松分布(Poissondistribution)，当<30％的颗粒显示修饰的配体，而其余是未占据的正向引物颗粒时，修饰的颗粒(例如，MAP)是高度单克隆的。然后，能够持续地控制进料比，得到约20％阳性修饰的颗粒(例如，MAP或修饰的成员)的排出，如通过FACS确认的(图14f)。
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选的实施方案，但是对本领域技术人员而言将显而易见的是，这样的实施方案仅通过举例提供。不受通过在说明书中提供的具体实施例的限制。虽然本文已经参照前述说明书描述了本发明，但本文实施方案的说明和示例不是意味着以限定的含义解释。对本领域技术人员而言，在没有背离本发明下，现在将进行大量的变化、改变和取代。进一步，应当理解本发明的所有方面都不限于本文列出的具体描述、构型或相对比例，其取决于多种条件和变量。应当理解在实施本发明中，可以使用本文描述的本发明实施方案的各种替代。因此，本发明预期还将涵盖任何这样的替代、修饰、变化或等同物。预期下述权利要求书定义了本发明的范围，但是所述方法和结构都在这些权利要求书及其涵盖的等同物的范围之内。
序列表
<110> 爱普济德生物技术有限公司
<120> 用于识别候选核酸试剂的组合物、方法和系统
<130> 0014-PA-006CN
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 40-nt randomized sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(63)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
atccagagtg acgctcttca gcannnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnntgcacac cgtcgcttag t 81
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> modified FP
<400> 2
atccagagtg acgctcttca gca 23
<210> 3
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 40-nt randomized sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(66)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
catatgagca gcacagaggt cagatgnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnccta tgcgtgctac cgtgaa 86

Claims (31)

1.一种用于产生包含多种修饰的成员的池的方法，所述方法包括：
a)提供包含多种核成员的池，每种核成员包含多种固定至固体载体的部分双链候选核酸试剂，并且每种所述部分双链候选核酸试剂包含正向链和比所述正向链更长的反向链，其中所述正向链和反向链至少部分地通过碱基配对彼此结合；
b)利用相应的反向链作为模板通过核苷酸聚合延伸所述部分双链候选核酸试剂的所述正向链，并且在所述延伸期间将至少一种修饰的核苷酸整合到所述正向链中，以形成修饰的候选核酸试剂，由此获得包含多种修饰的成员的池，每种修饰的成员包含多种固定至所述固体载体的所述修饰的候选核酸试剂；其中对于任何修饰的成员包含的每种修饰的候选核酸试剂而言，相同的所述修饰的成员均包含相应的识别核酸试剂，其中所述识别核酸试剂使得其相应的修饰的候选核酸试剂能够扩增；
其中任何核成员包含的候选核酸试剂的核酸序列与所述池中至少一种其它核成员所包含的候选核酸试剂的核酸序列不同。
2.根据权利要求1的方法，其中所述池中任何核成员包含的所述候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有核成员包含的所述全部候选核酸试剂的序列多样性。
3.根据权利要求1的方法，其中所述池中任何核成员包含的所述候选核酸试剂的所述序列多样性为1至1000。
4.根据权利要求1的方法，其中所述识别核酸试剂包含与其相应的修饰的候选核酸试剂相同的核酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。
6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述识别核酸序列也被用于产生其相应的修饰的候选核酸试剂的核成员所包含。
7.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述修饰的候选核酸试剂能够特异性地结合蛋白靶标。
8.根据权利要求7的方法，其中所述修饰的候选核酸试剂包括适体。
9.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述修饰的候选核酸试剂基本上由修饰的核苷酸组成。
10.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述修饰的核苷酸包含独立地选自下组的一种或多种修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5’-溴尿嘧啶的取代、5’-溴脱氧尿苷的取代、5’-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。
11.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述a)中提供包含多种核成员的池包括：
a1)提供包含多种模板成员的池，每种模板成员包含多种固定至所述固体载体的双链候选核酸试剂，并且每种双链候选核酸试剂包含正向链和互补的反向链；a2)处理a1)的所述多种模板成员，以除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，使得所述相应的反向链固定至所述固体载体而成为所述核成员的所述部分双链候选核酸试剂的所述反向链。
12.根据权利要求11的方法，其中所述池中任一模板成员包含的双链候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有模板成员包含的全部双链候选核酸试剂的序列多样性。
13.根据权利要求11的方法，其中对于任何模板成员包含的每种双链候选核酸试剂而言，相同的模板成员均包含相应的双链识别核酸试剂，所述双链识别核酸试剂包含正向链和互补的反向链，并且其中所述双链识别核酸试剂与其相应的双链候选核酸试剂不同但却能够使得所述相应的双链候选核酸试剂扩增。
14.根据权利要求13的方法，其中所述双链识别核酸试剂包含与其相应的双链候选核酸试剂相同的核酸序列。
15.根据权利要求11的方法，其中a2)包括：a2-l)处理a1)的所述多种模板成员，以仅除去所述双链识别核酸试剂的反向链，所述双链识别核酸试剂的正向链仍然固定至所述固体载体上，而成为核成员和/或修饰的成员上的识别核酸试剂。
16.根据权利要求15的方法，其中a2)进一步包括a2-2)处理a2-1)中得到的所述多种模板成员，以除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分，而所述双链候选核酸试剂的反向链固定至所述固体载体成为核成员的所述部分双链候选核酸试剂的所述反向链。
17.根据权利要求11的方法，其中所述双链候选核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化有抗性。
18.根据权利要求13的方法，其中所述双链识别核酸试剂的反向链对5’至3’核酸外切酶消化敏感。
19.根据权利要求16的方法，其中a2-2)包括用位点特异性切口酶处理a2-1)中得到的多种模板成员，以产生双链候选核酸试剂的有切口的正向链。
20.根据权利要求16的方法，其中a2-2)包括用位点特异性限制性内切酶处理a2-1)中得到的多种模板成员，以使得所述双链候选核酸试剂产生双链断裂。
21.根据权利要求11的方法，其中所述模板成员还包含固定至所述固体载体上的多种单链正向引物，在除去所述双链候选核酸试剂的正向链的实质性部分之后，所述单链正向引物能够结合所述双链候选核酸试剂的所述反向链。
22.包括多种修饰的成员的池，每种修饰的成员包含多种固定至固体载体的修饰的候选核酸试剂，并且每种修饰的候选核酸试剂包含至少一种修饰的核苷酸；其中对于任何修饰的成员包含的每种修饰的候选核酸试剂而言，相同修饰的成员均包含相应的识别核酸试剂，其中所述识别核酸试剂使得其相应的修饰的候选核酸试剂能够扩增；其中任何修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的核酸序列不同于所述池中至少一种其它修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的核酸序列。
23.根据权利要求22的池，其中所述池中任何修饰的成员包含的修饰的候选核酸试剂的序列多样性小于所述池中所有修饰的成员包含的全部修饰的候选核酸试剂的序列多样性。
24.根据权利要求22-23中任一项的池，其中所述修饰的候选核酸试剂为单链的。
25.根据权利要求22-23中任一项的池，其中所述识别核酸试剂包含与其相应修饰的候选核酸试剂相同的核酸序列。
26.根据权利要求22-23中任一项的池，其中所述识别核酸试剂基本上由天然核苷酸组成。
27.根据权利要求22-23中任一项的池，其中所述识别核酸试剂为单链的。
28.根据权利要求22-23中任一项的池，其中所述修饰的候选核酸试剂能够特异性结合蛋白靶标。
29.根据权利要求28的池，其中所述修饰的候选核酸试剂包括适体。
30.根据权利要求22-23中任一项的池，其中所述修饰的候选核酸试剂基本上由修饰的核苷酸组成。
31.根据权利要求22-23中任一项的池，其中所述修饰的核苷酸包含独立地选自下组的一种或多种修饰：2’-位糖修饰、2’-氨基(2’-NH2)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-MOE)修饰、5-位修饰的嘧啶、位于胞嘧啶环外胺的修饰、5’-溴尿嘧啶的取代、5’-溴脱氧尿苷的取代、5’-溴脱氧胞苷的取代、主链修饰、甲基化、3’帽和5’帽。
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