CN102084249A - 针对胃泌素释放肽前体的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种不存在测定值分散和样品处理等操作上的制约等问题的、高灵敏度的新的ProGRP测定方法。特别是，本发明提供一种使用2种以上的不同抗体测定胃泌素释放肽前体和/或其降解物的方法，所述的抗体识别序列编号1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位。本发明的方法与现有的测定方法相比，能够以冷藏保存的样品为对象，在短时间内从更少量的样品试样中以更高的检测灵敏度检测ProGRP或其降解物。

Description

针对胃泌素释放肽前体的抗体及其应用 
技术领域
本发明涉及一种针对胃泌素释放肽前体的抗体及其应用，所述抗体广泛用于包括小细胞肺癌在内的各种疾病的早期发现和治疗监测、复发监测等。 
背景技术
在日本，死因的第1位是恶性肿瘤，其中肺癌死亡率呈逐年上升趋势，在男性中超过胃癌成为死因的第1位，在女性中也占第3位。肺癌在病理组织学上主要分为以下4种组织类型，即：发生于肺门部的肺鳞状上皮细胞癌(squamous-cell carcinoma)和小细胞肺癌(small-cell lungcarcinoma：SCLC)、发生于肺野部的肺腺癌(adenocarcinoma)和大细胞肺癌(Large-cell lung carcinoma)。 
尤其是小细胞肺癌，由于增殖快速，早期即发生远处转移，因此初诊时发现大多已是全身性转移的进行性癌。关于该类型癌的治愈率，对于病变局限于一侧肺野的小细胞肺癌的局限型(Limited disease：LD)患者，其治愈率为约20％；对于已经转移至两肺和其他脏器的扩散型(extensive disease：ED)患者，可以说事实上难以治愈。 
此外，由于小细胞肺癌对抗癌剂的敏感性高，因此，化学疗法是首选的治疗方法，相反，对于非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma：non-SCLC)，由于化学疗法的疗效差，因此外科疗法是首选的治疗方法。 
因此，小细胞肺癌是肺癌中特别需要早期发现、早期治疗的癌症，所以，将小细胞肺癌和非小细胞肺癌进行鉴别诊断，对于确定治疗方案极其重要。 
发现肺癌的方法之一是痰液检查。然而，痰液检查主要适于肺鳞状上皮细胞癌的检查，对小细胞肺癌而言，存在阳性率低的问题。此外，X射线摄影法也是广泛使用的发现肺癌的方法，但是对于发生于肺门部的肺鳞状上皮细胞癌和小细胞肺癌，肺门部由于受到心脏的影响，存在癌组织的阴影非常难以拍到的问题。此外，关于小细胞肺癌，对肺野呈现 异常阴影的患者，即使使用痰液细胞学诊断、胸部X射线普通摄影、CT扫描、支气管内窥镜等，也难以早期发现该类肺癌。 
此外，用于诊断癌症的一些检查方法，例如放射线照射、活组织检查或支气管内窥镜等，会对患者造成痛苦，且需要昂贵的仪器和熟练的技术等。 
因此，正在进行肿瘤标志物的研究，以便通过更简便的血液检查，在能够治愈的时期可高效诊断出癌症。目前，在癌症的发现、诊断、病情监测指标、复发诊断等中使用了30种以上的肿瘤标志物。 
由于肺癌组织类型多样，所以还没有报道过对所有类型肺癌的发现或诊断均有效的肿瘤标志物。因此，目前根据肺癌的组织类型来选择和使用有效的标志物。 
例如，对于肺腺癌，主要选择使用癌胚抗原(carcinoembryonicantigen：CEA)或唾液酸化Lex-i抗原；对于肺鳞状上皮细胞癌，主要选择使用鳞状上皮细胞癌相关抗原(squamous-cell carcinoma relatedantigen：SCC)；对于小细胞肺癌，主要选择使用神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase：NSE)等。 
然而，NSE存在如下缺点：(1)针对可治愈的早期癌的阳性率低；(2)治疗引起测定值出现暂时性上升；(3)采血时的溶血引起测定值上升；(4)小细胞肺癌患者与正常健康者的测定差值小等。因此，对于小细胞肺癌来说，NSE未必是有效的肿瘤标志物。 
胃泌素释放肽(Gastrin-Releasing Peptide：GRP)是McDonald等在1978年从猪的胃组织中分离出的一种具有促进胃泌素分泌作用的、由27个氨基酸组成的脑肠肽(brain-gut peptide)。已证实人类也存在GRP，并于1984年克隆出编码人类GRP的基因。 
日本国立癌中心的山口等，在认为是来自神经内分泌细胞的小细胞肺癌的生物学特性的研究过程中，测定了包括促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone：ACTH)和降钙素等15种以上的脑肠激素，发现在培养的小细胞肺癌株中，GRP以最高频率且高浓度地得到积极分泌(非专利文献1)。并且，建立了组合有血中GRP浓缩法的放射免 疫测定法(RIA)，发现小细胞肺癌患者与健康人相比，呈现出高的血中GRP浓度。然而，由于GRP在血中会快速降解，因此血中浓度低，此外，由于上述测定需要复杂的浓缩操作，因此临床应用困难。 
根据此后的研究可知，在各种细胞中，通过选择性RNA剪接(alternative RNA splicing)，产生3种GRP前体(ProGRP)(非专利文献2)。这3种ProGRP，其第1-98位氨基酸序列是相同的，而第99位以后，通过选择性RNA剪接，变成互不相同的氨基酸序列。该相同的第1-98位氨基酸序列在序列编号1中示出。下文只要没有特别说明，本发明中的ProGRP、其部分序列、降解物等氨基酸残基的编号均用序列编号1的氨基酸序列的编号表示。 
3种ProGRP的第1-27位氨基酸序列，与具有促胃泌素分泌活性的成熟GRP的该部分氨基酸序列相同。这3种前体均通过激素前体切断酶，降解为由第1-27位氨基酸序列构成的成熟型GRP；以及由第31位以后的氨基酸序列构成的、不具有促胃泌素分泌活性的、作为ProGRP降解物的C末端片段(ProGRP-Cfrag)。 
Holst等(非专利文献3)报道：通过对由ProGRP的第42-53位氨基酸序列构成的肽(以下称为ProGRP(42-53))使用抗血清进行放射免疫测定(RIA)，发现小细胞肺癌患者血浆中的ProGRP或ProGRP-Cfrag水平高。然而，该方法需要沉淀萃取操作，灵敏度也不足。 
三宅等着眼于ProGRP与GRP相比在血中的稳定性高、以及作为3种ProGRP共同部分的第31-98位氨基酸序列对其他蛋白质的氨基酸序列没有显示出相同性，使用由该氨基酸序列构成的重组肽(以下称为ProGRP(31-98))作为抗原得到的高效价抗血清，建立了无需沉淀萃取操作的高灵敏度RIA法(非专利文献1)。通过该方法，使ProGRP成为与GRP同样优异的肿瘤标志物。 
该方法在无需萃取操作方面是有利的，但是测定需要4天时间，且灵敏度不足，为10pM(77.3pg抗原/mL)，因此不能测定健康人血清中的ProGRP值，尚未得到临床应用。 
此外，上述Holst等和三宅等的RIA法是抑制法，因此，虽然只要 ProGRP片段的一部分具有抗原性就能进行测定，但是其灵敏度比夹心(sandwich)法低，因此难以实现需要高灵敏度的ProGRP测定法的临床应用。即：为了在临床上进行ProGRP检测，必须提高检测灵敏度，尤其需要能在夹心法中使用的抗体。 
山口、青柳等以ProGRP的小细胞肺癌用肿瘤标志物的临床应用为目的，开发了以酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay：ELISA)为原理、使用夹心法的简便且高灵敏度的ProGRP测定试剂(专利文献1)。该方法在约2小时内获得结果，并且具有高灵敏度(2pg/mL)，因此目前在临床上得到广泛应用，发现与NSE相比，该方法对于小细胞肺癌的灵敏度高并具有特异性。 
此外，发现使用该测定法，除了小细胞肺癌以外，在神经内分泌肿瘤(甲状腺髓样癌等)、显示神经内分泌肿瘤特征的癌(小细胞食道癌、小细胞胰腺癌、小细胞前列腺癌等)中，血清ProGRP值也上升，认为今后也可以应用于这些肿瘤的早期发现和治疗监测等中。 
然而，虽然ProGRP比GRP在血中的稳定性高，但是与其他通常的肿瘤标志物相比，却发现测定值分散。因此，以ProGRP为检测对象的方法，存在下述制约，即测定用样品必须在采血后迅速冷冻保存直至测定时为止(非专利文献4)。 
青柳开发了使用识别作为ProGRP(31-98)内部区域的ProGRP的第40-75位的氨基酸残基或ProGRP的第40-79位的氨基酸残基的2种以上的抗体的夹心测定法(专利文献3)。该方法在测定于4℃保存的样品时获得比较稳定的结果，并且显示与专利文献2记载的方法大致相同的检测灵敏度。然而，该方法如专利文献3的实施例4所示的那样，需要100μL样品量，该量比通常的免疫测定法多。 
专利文献1：专利第3210994号公报 
专利文献2：特开平6-98794号 
专利文献3：国际专利公开WO2006/117994号小册子 
非专利文献1：Cancer Research，1994年，第54卷，第2136-2140页 
非专利文献2：Spindel等，Mol.Endocrinol.，1987年，第1卷，第224-232页 
非专利文献3：Holst等，J.Clin.Oncol.，1989年，第7卷，第1831-1838页 
非专利文献4：临床检查(日文原文：臨床検査)，1995年，第39卷，第981-986页 
发明内容
在专利文献3记载的方法中，如果在维持检测灵敏度的同时，能够进一步减少所需要的样品量，则在临床上能够削减测定所需的成本，减轻患者的负担。此外，由样品保存引起的测定灵敏度下降更小的测定方法，能够更加简便地进行样品的处理。本发明提供一种新的ProGRP的测定方法，该测定方法中，由样品保存引起的检测灵敏度下降小，能够用更少量的样品量进行测定。 
本发明发现，使用针对ProGRP的特定区域的抗体的免疫测定法能够解决上述课题，从而完成了以下各发明。 
(1)一种测定胃泌素释放肽前体和/或其降解物的方法，所述方法使用2种以上的不同抗体，所述的抗体识别序列编号1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位。 
(2)如(1)所述的方法，其中，该方法为夹心免疫测定法。 
(3)一种识别序列编号1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的单克隆抗体。 
(4)如(3)所述的单克隆抗体，其中，该抗体由按照保藏编号FERMP-21308保藏的杂交瘤(hybridoma)GCY9产生。 
(5)如(3)所述的单克隆抗体，其中，该抗体由按照保藏编号FERMP-21309保藏的杂交瘤GCY17产生。 
(6)按照保藏编号FERM P-21308保藏的杂交瘤GCY9。 
(7)按照保藏编号FERM P-21309保藏的杂交瘤GCY17。 
(8)如(1)所述的方法，其中，所述的2种以上的不同抗体的至 少一种是(4)或(5)中任一项所述的抗体。 
(9)一种用于测定胃泌素释放肽前体或其降解物的试剂盒，所述试剂盒含有(3)～(5)中任一项所述的抗体。 
(10)如(9)所述的试剂盒，所述试剂盒是用于癌诊断或用于治疗效果监测的试剂盒。 
本发明的方法以在样品中也能稳定保存的ProGRP的降解物为测定对象，除了能获得与现有的测定方法相同的检测灵敏度，还具有采取后的样品的处理方法不易受到影响、能够获得再现性高的测定值等效果。据此，为了诊断小细胞肺癌等疾病，在采血样品的临床现场，采血后的样品的处理变得更加容易，ProGRP的测定值没有因样品的处理而分散，能够获得更稳定的结果，测定值的可靠性提高。此外，根据临床表现，在要求追加试验或需要再检查等时，可以使用冷藏保存的样品而不是冷冻保存的样品进行测定，从而可削减测定所需的成本。而且，本发明的方法在维持高检测灵敏度的同时，能够减少测定样品量及缩短测定时间，在临床上能够削减成本，减轻患者的负担。 
附图说明
图1是表示单克隆抗体PGCY9对由用多中心肽合成法(multipinpeptide)合成的8个连续氨基酸序列构成的各多肽的结合性的图。横轴表示各多肽及其序列编号1中的氨基酸残基的编号，纵轴表示吸光度。 
图2是表示单克隆抗体PGCY17对由用多中心肽合成法合成的8个连续氨基酸序列构成的各多肽的结合性的图。横轴表示各多肽及其序列编号1中的氨基酸残基的编号，纵轴表示吸光度。 
图3是表示单克隆抗体PGCY24对由用多中心肽合成法合成的8个连续氨基酸序列构成的各多肽的结合性的图。横轴表示各多肽及其序列编号1中的氨基酸残基的编号，纵轴表示吸光度。 
图4是表示单克隆抗体PGCY12对由用多中心肽合成法合成的8个连续氨基酸序列构成的各多肽的结合性的图。横轴表示各多肽及其序列编号1中的氨基酸残基的编号，纵轴表示吸光度。 
图5是表示单克隆抗体PGCY5对由用多中心肽合成法合成的8个连续氨基酸序列构成的各多肽的结合性的图。横轴表示各多肽及其序列编号1中的氨基酸残基的编号，纵轴表示吸光度。 
图6是表示ProGRP(31-98)与各种单克隆抗体所识别的抗原表位的位置关系的模式图。 
图7是表示使用与氨基酸编号第47-68位的部分肽结合的抗体PGCY9与PGCY17的测定法的标准曲线图。横轴表示ProGRP的浓度，纵轴表示吸光度。 
图8是表示针对在微量板(microplate)的固相上通过抗小鼠IgG(Fc)抗体结合的ProGRP的各单克隆抗体与生物素化ProGRP的反应性的图。横轴表示各单克隆抗体，纵轴表示吸光度。 
具体实施方式
本发明是一种使用能够识别ProGRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的2种以上的不同抗体，通过夹心免疫测定法检测ProGRP或ProGRP的降解物的方法，所述ProGRP的降解物具有ProGRP的第47-68位的氨基酸残基。该免疫测定法具有如下特征：即使在将采取的样品进行冷藏保存的情况下，其检测灵敏度也不下降。由此推测：这意味着具有ProGRP的第47-68位的氨基酸残基的ProGRP的降解物对样品中含有的蛋白酶或其他原因引起的样品保存中的进一步降解反应比较稳定。 
本发明的方法中可以使用的抗体为能够识别ProGRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的抗体，据此能够与具有ProGRP的第47-68位的氨基酸残基的ProGRP的降解物结合。这种抗体优选为单克隆抗体。 
本发明的方法中可以使用的抗体，优选为能够识别ProGRP的第47-68位的氨基酸序列中的N末端部分所呈示的抗原表位和C末端部分所呈示的抗原表位的2种以上的不同单克隆抗体。特别优选使用单克隆抗体PGCY9和PGCY17，所述的单克隆抗体分别由杂交瘤GCY9和杂交瘤GCY17产生，所述杂交瘤GCY9和杂交瘤GCY17分别以保藏编号 FERM P-21308和FERM P-21309保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。这2种杂交瘤细胞是以利用大肠杆菌生产的重组ProGRP的第31-98位的氨基酸序列构成的多肽(以下表示为ProGRP(31-98))作为抗原，由免疫小鼠的抗体产生细胞(antibody-producingcell)按通常的方法制备的杂交瘤细胞。这2种杂交瘤细胞是通过使用ProGRP(31-98)内部的肽的筛选而进行挑选的、产生识别ProGRP的第47-68位的氨基酸所呈示的抗原表位的抗体的细胞。 
这样，本发明中可以使用的抗体可以通过下述方法得到：以ProGRP(31-98)作为抗原，由将小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、鸡、山羊、绵羊、牛等实验动物免疫后回收的抗体产生细胞，按通常的方法制备产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，使用ProGRP的第47-68位的氨基酸残基构成的多肽(以下表示为ProGRP(47-68))可以筛选产生所需抗体的杂交瘤细胞。此外，也可以将ProGRP(47-68)作为抗原使用。另外，上述多肽也可以与甲状腺球蛋白或匙孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)等载体结合后使用。 
以小鼠为例来说明对动物进行免疫的方法。将ProGRP(31-98)等多肽与弗氏完全佐剂、TiterMax Gold(CytRx公司)等佐剂以1∶1混合，使用互相流通的接头连接的两个注射器，使其反复通过接头，或通过超声波处理等方法制备乳剂。在皮下、皮内、肌肉内、腹腔内的任一部位或多个部位注入制备的含有抗原的乳剂。第一次免疫结束后，间隔1～4周，以同样的方式进行第二次免疫。然后，同样继续免疫，直至抗体对血中的ProGRP的抗体效价上升。 
抗体效价的测定可以按照以下方式进行。以1μg/mL的浓度在PBS中溶解ProGRP(31-98)，以每孔50μL的容量添加到96孔微量滴定板(micro-titer plate)的各孔中，于4℃下吸附过夜。用含0.05％吐温20的PBS(PBS-T)将各孔洗涤后，用于测定。测定前，也可以用含1％BSA的PBS等进行封闭。从眼窝静脉丛、尾静脉或尾动脉等处采血，用PBS-T稀释到30倍后进行离心。将所得上清液用PBS-T进行系列稀释，涂覆ProGRP(31-98)，在微量滴定板的各孔中分别添加50μL。在室温下反应30分钟后，用PBS-T洗涤，在各孔中分别添加50μL辣根过氧化物酶 (HRP)标记的抗小鼠IgG溶液，该溶液使用PBS-T等进行过适当稀释。再在室温下反应30分钟后，添加过氧化氢、邻苯二胺底物溶液进行反应30分钟，添加50μL 2N H2SO4，使反应停止，测定各孔的吸光度。 
在免疫过的小鼠中，证实对所给予的抗原的抗体效价充分上升后，取出脾脏，分离脾脏细胞。使用另外培养的小鼠骨髓瘤(例如SP2/0-Ag14等)和聚乙二醇等进行融合。将融合成功的细胞用HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培养基进行选择培养。7～14天左右，每隔几天半量交换培养基并继续培养后，测定培养上清液的抗体效价。通过有限稀释法克隆阳性孔的细胞，得到产生目标抗体的杂交瘤。 
通过分析上述方法所得抗体的抗原表位，可以获得识别ProGRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的抗体。抗原表位分析可以通过研究抗体对使用多中心肽合成法合成的ProGRP(31-98)的连续8-12个氨基酸序列构成的多肽或ProGRP(47-68)的反应来进行。例如，可以通过在微量滴定板上涂覆用重组体表达的ProGRP(47-68)、或用Fmoc法或Boc法进行化学合成的ProGRP(47-68)，使用上述免疫测定法研究抗体对各肽的反应性来确定。 
根据使用多中心肽合成法合成的ProGRP(31-98)的连续8-12个氨基酸序列构成的多肽的抗原表位的分析结果，证实本发明特别优选的抗体之一PGCY9为识别ProGRP的第47-68位的氨基酸所呈示的抗原表位中第55-66位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的单克隆抗体。此外，证实本发明特别优选的另一抗体PGCY17为至少识别第45-57位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的单克隆抗体。 
本发明中使用的抗体还可以在载体或微量板(microplate)上固相化、或用生物素等适当的标记试剂进行标记。可以根据各实验方法的说明书中记载的方法进行固相化或标记的各种操作，本发明中使用的抗体并不特别需要特殊的操作。 
本发明的方法为使用上述抗体的夹心免疫测定法，具体地说，是夹心ELISA法。夹心ELISA法的基本操作可以根据《超高灵敏度免疫测定法》(日文原文：超高感度免疫测定法)(石川栄治，1993年，学会出版 センタ一)或其它各种实验方法的说明书中记载的方法进行，本发明的实施中并不特别需要特殊的操作，可以按下述工序进行。 
即，ProGRP和/或其降解物可以通过包括如下工序的测定法检测：(1)使识别ProGRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的第一抗体与样品中的ProGRP和/或其降解物反应的工序；(2)由该抗体捕捉的ProGRP和/或其降解物与不同于(1)的抗体的、识别ProGRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的第二抗体反应的工序；以及(3)检测由(2)产生的免疫复合物的工序。 
本发明方法的操作法的例子可以表示如下。将以1～10μg/mL的浓度溶解于缓冲液(例如，0.1M碳酸缓冲液(pH 9.6))中的第一抗体的溶液等量添加到微量滴定板的各孔中，于4℃下培养过夜。用PBS等洗涤用缓冲液将各孔洗涤后，将没有结合第一抗体的各孔的内壁用含有酪蛋白酸钠等适当的蛋白质的缓冲溶液培养数小时后进行封闭。除去封闭液后，在各孔中添加含有吐温20等表面活性剂的反应液和样品。样品的添加量根据其测定法的灵敏度进行适当变更。在37℃左右的温度下反应约1小时后，用含有表面活性剂的缓冲液(例如，含吐温20的PBS-T)将各孔洗涤，在各孔中添加使用适当的标记试剂标记的第二抗体，反应几十分钟后，将各孔洗涤，使用与标记试剂相适应的方法检测第二抗体。另外，上述操作法只不过是个例子，各步骤的具体操作，例如缓冲液、标记试剂、添加量等可以适当调节。 
本发明使用单克隆抗体PGCY9和PGCY17这2种单克隆抗体的方法的检测灵敏度为2.5pg/mL，样品量可以使用25μL左右。该检测灵敏度几乎能够测定所有健康人血中的ProGRP，这在临床上有助于削减检查成本，减轻患者的负担。 
本发明除了上述方法以外，还提供用于测定样品中的ProGRP或其降解物的试剂盒，尤其是通过测定ProGRP和/或其降解物进行小细胞肺癌诊断或化学疗法监测的诊断药试剂盒。该试剂盒含有至少2种识别上述ProGRP的第47-68位的氨基酸所呈示的抗原表位的抗体，其他还可以任意地含有反应缓冲液、二抗稀释液、ProGRP标准物质、说明书及其他组成物。作为试剂盒中含有的抗体的优选例，为识别ProGRP的第47-68 位的氨基酸所呈示的抗原表位的2种以上的不同抗体，代表例为单克隆抗体PGCY9和单克隆抗体PGCY17。 
与ProGRP和/或其降解物结合的抗体，虽然优选使用只选择识别ProGRP的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的抗体，但是，在可以得到再现性高的测定值的范围内，测定体系内也可以含有这些抗体以外的抗体。 
实施例 
以下列举实施例对本发明作进一步的说明。 
实施例1
根据专利第3210994号的实施例1记载的方法制备重组体，提纯由大肠杆菌表达的序列编号1所示的氨基酸序列构成的多肽。专利第3210994号的实施例1中，该重组体记载为GRP(31-98)，正确的是GRP前体(ProGRP)的(31-98)部分，因此本文记载为ProGRP(31-98)。 
将ProGRP(31-98)：猪甲状腺球蛋白(TG)以重量比为1∶3结合的抗原蛋白质(表示为ProGRP-TG)使用含0.15M NaCl的100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)稀释，与等量的TiterMax混合，制成ProGRP-TG悬浮液。将配制的ProGRP(31-98)浓度达0.05mg/0.1mL的该悬浮液按约20天的间隔、在4～6周龄的BALB/c系小鼠的腹腔内给药4～6次。再于约4周后，作为加强免疫，用配制的ProGRP(31-98)的浓度达0.1mg/0.1mL的生理盐水给药2天。最终加强免疫后第3天，从该免疫动物中无菌性摘除脾脏，用手术剪剪成切片，再用筛孔将脾脏弄成一个个细胞，用RPMI-1640培养基洗涤3次后，用含8-氮鸟嘌呤的相同培养基培养数天。将完全去除回复突变体的对数增殖期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0-Ag14用RPMI-1640培养基洗涤后，将该细胞2.4×107个和上述脾脏细胞2.0×108个加入离心管中混合。将混合的2种细胞以200×g离心分离5分钟，除去上清液后，采用HVJ Envelope Cell Fusion Kit(GenomONE-CF，石原产业株式会社)进行细胞融合。将融合的细胞用含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷(以下将3种化合物合起来表示为HAT)、10％胎牛血清(FCS)及小鼠白介素-6(R&D Systems)的RPMI-1640培养基稀释，添加到96孔培养板上培养1～2周。在培养约1～2周后，进行使用ProGRP(31-98) 作为抗原的ELISA法，得到杂交瘤，该杂交瘤产生对ProGRP(31-98)具有反应特异性的本发明的单克隆抗体。 
关于得到的杂交瘤，通过常用的有限稀释法，使用ProGRP(31-98)进行目标抗体的产生株的检索和单一克隆化，最终得到5株杂交瘤细胞，分别命名为GCY9、GCY17、GCY12、GCY24及GCY5。GCY9和GCY17于2007年6月22日在位于日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏(GCY9的保藏编号：FERM P-21308；GCY17的保藏编号：FERM P-21309)。另外，GCY9和GCY17于2008年8月5日分别获得国际保藏(GCY9的国际保藏编号：FERM BP-10991、GCY17的国际保藏编号：FERMBP-10992)。 
实施例2
(1)将通过实施例1记载的方法得到的杂交瘤在含有小鼠白介素-6的无血清培养基(Hybridoma-SFM，Invitrogen公司)中培养，将产生的单克隆抗体用结合了蛋白质A的琼脂糖凝胶柱(Amersham)提纯回收。将由各杂交瘤GCY9、GCY17、GCY12、GCY24及GCY5产生的单克隆抗体分别命名为PGCY9、PGCY17、PGCY12、PGCY24及PGCY5。对于PGCY9、PGCY17、PGCY12、PGCY24及PGCY5的亚型(subtype)，根据使用兔抗小鼠Ig各亚型试剂盒(Zymed公司)的实验，表明PGCY9、PGCY12、PGCY24和PGCY5为IgG1，PGCY17为IgG2a。 
(2)基于ProGRP(31-98)的氨基酸序列，用多中心肽合成法合成每个氨基酸进行错位制备的连续8个氨基酸构成的共61种多肽。再在各肽的N末端结合生物素。将各生物素化多肽溶解于二甲基甲酰胺中，并用PBS稀释成1μg/mL的浓度。在抗生物素蛋白(avidin)固相化的96孔微量滴定板的各孔中分别添加100μL稀释过的各生物素化多肽溶液，于4℃培养过夜。用含0.05％吐温20的PBS缓冲液(PBS-T)将各孔洗涤后，在各孔中分别添加100μL将各单克隆抗体稀释成1μg/mL的溶液。在室温下反应30分钟后，用PBS-T将各孔洗涤5次，在各孔中分别添加100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体溶液。再在室温下反应30分钟后，用PBS-T将各孔洗涤5次，在各孔中分别添加100μL 底物溶液(含2mg/mL邻苯二胺、0.9μL/mL 30％过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH 5.0)，在室温下反应30分钟后，分别添加100μL 2N硫酸，立即测定492nm处的吸光度。单克隆抗体PGCY9、PGCY17、PGCY24、PGCY12及PGCY5对ProGRP(31-98)内部各肽的反应如图1～图5所示。 
如图1所示，证实单克隆抗体PGCY9与ProGRP(57-64)的结合非常弱。此外，如图2和图3所示，证实单克隆抗体PGCY17及PGCY24与ProGRP(31-98)的氨基酸序列中的8个连续氨基酸构成的多肽不结合。由此推测，PGCY17及PGCY24不能识别8个连续氨基酸序列，而能识别比8个长的氨基酸序列构成的多肽所呈示的抗原表位。另一方面，如图4所示，证实单克隆抗体PGCY12与ProGRP(34-41)结合强，与其前后的ProGRP(33-40)及ProGRP(35-42)结合弱。因此推测，PGCY12能识别ProGRP的第34-41位的氨基酸序列所呈示的抗原表位。此外，证实单克隆抗体PGCY5与ProGRP(69-76)和ProGRP(70-77)结合强，与ProGRP(71-78)结合，与ProGRP(68-75)结合非常弱。因此推测，单克隆抗体PGCY5能识别ProGRP的第69-76位的氨基酸序列和第70-77位的氨基酸序列所呈示的共同的抗原表位。 
(3)通过Fmoc法合成表1所示的ProGRP(31-98)的部分氨基酸序列构成的多肽，进行提纯。在溶解6M尿素的PBS中，以20μg/mL的浓度溶解BSA，在96孔微量滴定板(NUNC、Maxisorp)的各孔中分别添加100μL，在室温下培养3小时。用PBS将各孔分别洗涤5次，在各孔中分别添加100μL用PBS将N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)分别以1mg/mL溶解后的溶液，在室温下培养2小时，将在孔中固定的BSA的羧基活化。用PBS将各孔洗涤3次，将各多肽用0.1M磷酸缓冲液(pH 6.0)稀释成5μg/mL的浓度，在96孔微量滴定板的各孔中分别添加100μL，于4℃培养过夜。据此，各多肽通过氨基与固定化的BSA结合。 
用PBS将各孔洗涤2次后，在各孔中分别添加350μL含1％BSA、2％蔗糖的PBS，在室温下培养3小时，然后吸除。在各孔中分别添加100μL稀释成1μg/mL浓度的各单克隆抗体，在室温下反应60分钟后，用含 0.05％吐温20的PBS(PBS-T)洗涤5次后，在各孔中分别添加100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体溶液，在室温下反应20分钟。用PBS-T洗涤5次后，在各孔中分别添加100μL底物溶液(含2mg/mL邻苯二胺、0.9μL/mL30％过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH 5.0)，在室温下反应20分钟后，在各孔中分别添加100μL 2N硫酸，使反应停止，立即测定492nm处的吸光度。除了本发明的各单克隆抗体外，同时还研究了专利文献3中所示的、识别ProGRP的40-60位的氨基酸序列构成的多肽、且与8个连续氨基酸序列构成的多肽不发生反应的单克隆抗体GRP-3D6-2的抗原表位。其结果如表1所示。 
表1 
Figure GPA00001099225300141
aa No.：氨基酸编号 
如表1所示，可以证实研究的4种单克隆抗体特异性识别ProGRP的部分氨基酸序列构成的多肽，且所有单克隆抗体与ProGRP(42-53)不结合。而且，单克隆抗体GCY9与ProGRP(55-66)、ProGRP(57-68)、ProGRP(54-78)及ProGRP(54-90)结合较强。此外，单克隆抗体GCY17及GCY24与ProGRP(47-61)、ProGRP(40-60)及ProGRP(44-62)结合较强，与ProGRP(46-59)结合非常弱。单克隆抗体GRP-3D6-2与ProGRP(47-61)、ProGRP(40-60)及ProGRP(44-62)结合较强。 
(4)将实施例1制备的重组ProGRP(31-98)用PBS稀释成1μg/mL 的浓度，在96孔微量滴定板(NUNC、Maxisorp)的各孔中分别添加50μL，于4℃培养过夜。用PBS将各孔洗涤2次，在各孔中分别添加350μL含0.5％酪蛋白酸钠和2％蔗糖的PBS(pH 7.1)，在室温下培养3小时，然后吸除。在各孔中分别添加50μL利用反应液将各肽稀释成2μg/mL浓度的溶液，所述的反应液为含1％BSA、0.05％酪蛋白酸钠、1％聚乙烯吡咯烷酮、10mM EDTA-2Na、0.15M NaCl、0.05％吐温20的0.1M磷酸钠缓冲液、pH 7.2。然后，在各孔中分别添加50μL稀释成1μg/mL浓度的各单克隆抗体，在室温下培养60分钟。该工序中，固相化的ProGRP(31-98)与溶液中的各肽发生竞争，与各单克隆抗体进行结合反应。然后，用含0.05％吐温20的PBS(PBS-T)将各孔洗涤5次后，在各孔中分别添加100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体溶液，在室温下反应20分钟。用PBS-T洗涤5次后，在各孔中分别添加100μL底物溶液(含2mg/mL邻苯二胺、0.9μL/mL30％过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH 5.0)，在室温下反应20分钟后，在各孔中分别添加100μL2N硫酸，使反应停止，测定492nm处的吸光度。将不添加肽的孔(对照)设为100％，其阻断率(％)如表2所示。 
表2 
Figure GPA00001099225300151
aa No.：氨基酸编号 
如表2所示，证实各单克隆抗体与固相多肽的结合，在ProGRP (31-98)存在下全部被阻断90％以上，而在ProGRP(42-53)存在下全部不被阻断。单克隆抗体PGCY9中，证实结合被阻断80％以上的多肽为ProGRP(55-66)、ProGRP(54-78)及ProGRP(54-90)。单克隆抗体PGCY17及PGCY24中，证实结合被阻断80％以上的多肽为ProGRP(45-57)、ProGRP(46-59)、ProGRP(47-61)、ProGRP(40-60)及ProGRP(44-62)。另外，单克隆抗体GRP-3D6-2中，证实结合被阻断80％以上的多肽为ProGRP(46-59)、ProGRP(47-61)、ProGRP(40-60)及ProGRP(44-62)；单克隆抗体GRP-3D6-2对ProGRP(45-57)结合被弱阻断，而PGCY17和PGCY24对ProGRP(45-57)阻断活性已得到证实。 
如上述(3)所述，单克隆抗体PGCY9与ProGRP(55-66)及ProGRP(57-68)结合，且与ProGRP(57-68)结合比与ProGRP(55-66)强。此外在(4)中，发现ProGRP(55-66)被充分阻断，ProGRP(57-68)显示弱的阻断反应。因此，认为单克隆抗体PGCY9识别ProGRP的第55-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位。 
此外，根据(3)、(4)的抗原表位分析结果，推测单克隆抗体PGCY17及PGCY24识别ProGRP的第47-57位的氨基酸序列所呈示的抗原表位。另外，认为单克隆抗体GRP-3D6-2与PGCY17及PGCY24相比，识别的是C末端的ProGRP的第47-59位的氨基酸序列所呈示的抗原表位。此外，单克隆抗体PGCY5与单克隆抗体PGCY12识别的抗原表位为由8个连续氨基酸序列构成的连续抗原表位。进一步推断，单克隆抗体PGCY17及PGCY24与ProGRP(31-98)内部的8个连续氨基酸序列构成的多肽不结合，识别ProGRP(47-57)的11个连续氨基酸序列所呈示的抗原表位。推断各单克隆抗体识别的抗原表位如表3所示。 
表3 
  单克隆抗体   抗原表位(氨基酸编号)
  PGCY9  PGCY17  PGCY24  PGCY12  PGCY5  GRP-3D6-2   55-68  47-57  47-57  34-41  70-76  47-59
实施例3
使用本发明的各单克隆抗体与专利第3210994号的实施例6及7所示的单克隆抗体GRP-3G2，尝试对在血清等样品保存中稳定的ProGRP部分肽进行鉴定。另外，如专利文献3所示，单克隆抗体GRP-3G2为识别ProGRP的第84-88位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的抗体。 
将冷冻及在4℃下分别保存1、4、7天的8个样品A～H进行下述测定。在96孔微量板的各孔中，以4μg/mL的浓度添加100μL各单克隆抗体(PGCY17、PGCY9、GRP-3G2)，于4℃培养过夜。用含0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH 7.3)洗涤2次后，加入350μL封闭液(含0.5％酪蛋白酸钠和2％蔗糖的10mM磷酸缓冲液、pH 7.1)，静置2小时。除去封闭液后，在各孔中加入100μL反应液(含1％BSA、0.05％酪蛋白酸钠、1％聚乙烯吡咯烷酮、10mM EDTA-2Na、0.15M NaCl、0.05％吐温20的0.1M磷酸钠缓冲液、pH 7.2)和50μL测定样品，在37℃下反应1小时。用洗涤液(含0.05％吐温20的10mM磷酸钠缓冲液、pH 7.3)洗涤5次，添加100μL HRP标记的各单克隆抗体(PGCY12、PGCY17、PGCY9、PGCY5)溶液，在室温下反应30分钟。用洗涤液洗涤5次，加入100μL底物溶液(含2mg/mL邻苯二胺、0.9μL/mL30％过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH 5.0)，培养30分钟，添加100μL 2N硫酸，使酶反应停止，用微量板阅读仪(Microplate Reader)测定492nm处(参比波长620nm)的吸光度。 
通过使固相化抗体与标记抗体组合识别部位不同的抗体，可以推断样品中存在的ProGRP的部分降解物所具有的部分氨基酸序列。这次使用的抗体的组合如图6所示。如果单克隆抗体PGCY12与PGCY17组合，可以测定样品中的ProGRP的降解物中具有ProGRP的第34-57位的氨基酸序列的降解物。同样，如果PGCY17与PGCY9组合，可以测定具有第47-68位的氨基酸序列的降解物；如果PGCY9与PGCY5组合，可以测定具有第55-76位的氨基酸序列的降解物；如果PGCY9与GRP-3G2组合，可以测定具有第55-88位的氨基酸序列的降解物；如果PGCY5与GRP-3G2组合，可以测定具有第70-88位的氨基酸序列的降解物。 
将冷冻保存的样品的ProGRP测定值设为100％，在4℃下保存1、4、7天的样品的ProGRP测定值如表4所示。 
表4 
Figure GPA00001099225300181
单克隆抗体PGCY9与GRP-3G2的组合、以及单克隆抗体PGCY5与GRP-3G2的组合中，大部分样品保存1天时85％以上的免疫活性得以保持，保存4天时降为55～85％，保存7天时所有样品的免疫活性降为80％以下。这如专利文献3所示的那样，认为可能是保存期间血液中的蛋白酶等将ProGRP在序列编号1的Lys-79的C末端切断，从而引起免疫活性消失。 
单克隆抗体PGCY12与PGCY17的组合、单克隆抗体PGCY17与PGCY9的组合以及单克隆抗体PGCY5与PGCY9的组合中保持比较稳定的免疫活性，在PGCY12与PGCY17的组合中，8个样品中有2个样品(B和H)通过保存而免疫活性上升，保存7天时超过110％。 
此外，单克隆抗体PGCY17与PGCY9的组合与单克隆抗体PGCY5与PGCY9的组合相比，保存7天时，后者4个样品的免疫活性降为85％以下。而前者保存7天时，全部保持80％以上的免疫活性，8个样品中有6个样品保持85％以上的免疫活性。这表明与通过专利文献3记载的方法测定的ProGRP的降解物相比，通过将单克隆抗体PGCY17和PGCY9进行组合测定的降解物在将样品在4℃下保存时劣化更少，作为测定对象有利。 
实施例4
专利文献3的实施例4记载的方法中，将抗体变更为单克隆抗体PGCY17与PGCY9的组合，研究了采用使用该单克隆抗体的组合的方法所需要的测定时间、测定样品量及测定灵敏度。 
在96孔微量板的各孔中，添加120μL将单克隆抗体PGCY9以5μg/mL的浓度溶解于抗体固定液(含0.6M NaCl的0.1M碳酸缓冲液、pH9.6)中的溶液，于4℃培养过夜。用含0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH 7.3)洗涤2次后，加入350μL封闭液(含0.5％酪蛋白酸钠和5％蔗糖的10mM磷酸缓冲液、pH 7.1)，静置2小时，进行封闭。除去封闭液后，将微量板干燥。干燥后，在各孔中加入100μLL反应液(含1％BSA、1％聚乙烯吡咯烷酮、0.05％酪蛋白酸钠、0.05％吐温20、0.1％TritonX100、0.15M NaCl、10mM EDTA-2Na、40μg/mL小鼠IgG的0.1M磷酸钾缓冲液、pH 7.0)和25μL测定样品，在37℃下反应1小时。用洗涤液(含0.05％吐温20的10mM磷酸缓冲液、pH 7.3)洗涤5次，添加200μL用标识抗体稀释液(含2％BSA、0.25％聚乙烯吡咯烷酮、0.05％吐温20、0.05％酪蛋白酸钠、0.15M NaCl、1％蔗糖、25μg/mL小鼠IgG的0.1M磷酸钾缓冲液、pH 6.5)溶解HRP标记的PGCY17的Fab′的溶液，在室温下反应20分钟。用洗涤液洗涤5次，加入100μL底物溶液(含2mg/mL邻苯二胺、0.9μL/mL30％过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH 5.0)，培养20分钟，加入100μL 2N硫酸，使酶反应停止，用微量板阅读仪测定492nm处(参比波长620nm)的吸光度。其标准曲线如图7所示。 
其结果是，本发明的方法总反应时间为100分钟，样品量为25μL，虽然样品量为少量，但是证实可以检测约2.5pg/mL的ProGRP。该灵敏度是在检测健康人样品中的ProGRP浓度方面需要的足够的灵敏度。此外，与专利文献3的实施例4记载的方法相比，测定时间由120分钟缩短为100分钟，测定用样品量减少到1/4，且检测灵敏度上升为约1.7倍。 
实施例5
在96孔微量板的各孔中，加入50μL将山羊抗小鼠IgG(Fc)(JacksonImMuno Research)抗体以2.5μg/mL的浓度溶解于含0.5M NaCl的0.1M碳酸缓冲液(pH 9.6)中的溶液，于4℃培养过夜。用含0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH 7.3)洗涤2次后，加入350μL封闭液(含0.5％酪蛋白酸钠和2％蔗糖的10mM磷酸缓冲液、pH 7.1)，静置2小时。除去封闭液后，在室温下干燥。在各孔中加入100μL将各单克隆抗体以5μg/mL的浓度稀释于反应液(含1％BSA、0.05％酪蛋白酸钠、1％聚乙烯吡咯烷酮、10mM EDTA-2Na、0.15M NaCl、0.05％吐温20的0.1M磷酸钠缓冲液、pH 7.2)中的溶液，在37℃下反应2小时。该反应中，各单克隆抗体的Fc部分与固相的山羊抗小鼠IgG(Fc)结合。 
然后，用洗涤液(含0.05％吐温20的10mM磷酸缓冲液、pH 7.3)将各孔洗涤5次，在各孔中添加100μL反应液(含1％BSA、0.05％酪蛋白酸钠、1％聚乙烯吡咯烷酮、10mM EDTA-2Na、0.15M NaCl、0.05％吐温20的0.1M磷酸钠缓冲液、pH 7.2)和50μL生物素化重组ProGRP(31-98)(0pg/mL、200pg/mL、1000pg/mL)溶液，在37℃下反应1小时。该反应中，各单克隆抗体与生物素化重组ProGRP(31-98)结合。 
用洗涤液(含0.05％吐温20的10mM磷酸缓冲液、pH 7.3)洗涤4次，添加100μL利用反应液(含1％BSA、0.05％酪蛋白酸钠、1％聚乙烯吡咯烷酮、10mM EDTA-2Na、0.15M NaCl、0.05％吐温20的0.1M磷酸钠缓冲液、pH 7.2)稀释的HRP标记的抗生物素蛋白D(Vector)溶液，在室温下反应30分钟。用洗涤液洗涤4次，加入100μL底物溶液(含 2mg/mL邻苯二胺、0.9μL/mL30％过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH 5.0)，培养30分钟，加入100μL 2N硫酸，使酶反应停止。用微量板阅读仪测定492nm处(参比波长630nm)的吸光度。其结果如图8所示。 
这些单克隆抗体中，与ProGRP(55-68)结合的单克隆抗体PGCY9显示最高反应性，与专利文献3的实施例4中固相使用的单克隆抗体GRP-3D6-2相比，也显示高约3.3倍的值。与ProGRP(47-57)结合的PGCY17及PGCY24显示大致相同的反应性，与PGCY17相比，识别略靠近C末端的ProGRP(47-59)的GRP-3D6-2比PGCY17显示高反应性。此外，识别ProGRP(70-76)附近的PGCY5及GRP-2B10在这些单克隆抗体中显示低反应性，识别比它们更靠近C末端的ProGRP(84-88)的GRP-3G2显示较高反应性。根据这些单克隆抗体的识别部位和反应性，通过使用识别第55位至第68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的单克隆抗体，认为能够以高灵敏度捕捉测定样品中的ProGRP或其降解物。此外，由于PGCY5及GRP-2B10的反应性低，因此认为识别70位以后的氨基酸序列所呈示的抗原表位的单克隆抗体的反应性低，通过使用识别第55位至第69位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的单克隆抗体，认为也能够以高灵敏度捕捉ProGRP或其降解物。 
实施例6
(1)各单克隆抗体的生物素化 
在1mL 0.1M磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中添加各单克隆抗体0.5mg，添加已溶解于二甲基甲酰胺中的Sulfo-NHS-Biotin(PIERCE)以使得IgG∶生物素(Biotin)的摩尔比＝1∶20，在室温下缓慢搅拌60分钟。添加100μL1.5M甘氨酸溶液(pH 8.9)，在室温下缓慢搅拌10分钟。以PBS作为流动相进行凝胶过滤，得到生物素化单克隆抗体。 
(2)各单克隆抗体的组合的研究 
在96孔微量板的各孔中，加入100μL将各单克隆抗体以5μg/mL的浓度溶解于抗体固定液(含0.5M NaCl的0.1M碳酸缓冲液、pH 9.6)中的溶液，于4℃培养过夜。用含0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH 7.3)洗涤2次后，加入350μL封闭液(含0.5％酪蛋白酸钠和2％蔗糖的10mM 磷酸缓冲液、pH 7.1)，静置2小时，进行封闭。除去封闭液后，在各孔中分别加入100μL反应液(含1％BSA、0.05％酪蛋白酸钠、1％聚乙烯吡咯烷酮、10mM EDTA-2Na、0.15M NaCl、0.05％吐温20的0.1M磷酸钠缓冲液、pH 7.2)和50μL重组ProGRP(0、100、500、2000pg/mL)，在37℃下反应1小时。用洗涤液(含0.05％吐温20的10mM磷酸缓冲液、pH 7.3)洗涤5次，添加100μL将生物素化的各单克隆抗体以1μg/mL的浓度溶解于反应液中的溶液，在室温下反应30分钟。添加100μL用反应液稀释的HRP标记的抗生物素蛋白D(Vector)溶液，在室温下反应30分钟。用洗涤液洗涤5次，加入100μL底物溶液(含2mg/mL邻苯二胺、0.9μL/mL30％过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH 5.0)，培养20分钟，加入100μL 2N硫酸，使酶反应停止。用微量板阅读仪测定492nm处(参比波长600nm)的吸光度。将其反应性分为5个等级(按从高到低的顺序，☆：非常高的反应性、◎：高反应性、○：中度反应性、△：略微的反应性、×：不反应)，如表5所示。 
表5 
Figure GPA00001099225300221
☆：非常高的反应性 
◎：高反应性 
○：中度反应性 
△：略微的反应性 
×：不反应 
如表5所示，首先，不能证实相同单克隆抗体之间、以及认为识别的抗原表位相同或呈示该抗原表位的氨基酸序列重叠大的抗体之间的反应性。将PGCY9固相化时，作为生物素化抗体，PGCY17及PGCY24反应性最高，其次为GRP-3G2及PGCY5，再其次为GRP-2B10及PGCY12；不能证实GRP-3D6-2的反应性。 
将PGCY17固相化时，作为生物素化抗体，PGCY9反应性最高，其次为GRP-3G2、PGCY5、GRP-2B10及PGCY12，不能证实PGCY24及GRP-3D6-2的反应性。 
将PGCY24固相化时，作为生物素化抗体，PGCY9显示中度反应性，几乎不能证实其他抗体的反应性。 
将GRP-3D6-2固相化时，作为生物素化抗体，与GRP-2B10相比，GRP-3G2、PGCY5及PGCY12显示稍高的反应性。 
将PGCY9作为生物素化抗体使用时，作为固相抗体，PGCY17显示最高反应性，其次为GRP-3G2，再其次为PGCY24及PGCY5。 
因此，固相抗体使用与ProGRP(55-68)结合的PGCY9、作为检测方抗体的标记抗体使用与ProGRP(47-57)结合的PGCY17和PGCY24，或者相反，固相抗体使用PGCY17和PGCY24、作为检测方抗体的标记抗体使用PGCY9，由此可以高灵敏度测定ProGRP或其降解物。 
工业实用性 
本发明的方法，通过以新证实的、在样品中也能稳定保存的ProGRP的某种降解物上的抗原表位作为测定对象，除了能获得与现有的测定方法相同的检测灵敏度，而且采取后的样品的处理方法不易受到影响，能获得再现性高的测定值等，对血中ProGRP的检测有效。 
SEQUENCE LISTING序列表
<110>Advanced Life Science Institute，Inc.株式会社先端生命科学研究所
 
<120>Monoclonal antibody against pro-gastrin rereasing peptide and use thereof
     针对胃泌素释放肽前体的抗体及其应用
 
<130>XJU9947544WO
 
<150>JP2007-278843
<151>2007-10-26
 
<160>2
 
<170>PatentIn version 3.1
 
<210>1
<211>98
<212>PRT
<213>Human人类
 
<400>1
 
Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro
1               5                   10                  15
Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Gly Lys Lys Ser Thr
            20                  25                  30
Gly Glu Ser Ser Ser Val Ser Glu Arg Gly Ser Leu Lys Gln Gln Leu
        35                  40                  45
Arg Glu Tyr Ile Arg Trp Glu Glu Ala Ala Arg Asn Leu Leu Gly Leu
    50                  55                  60
Ile Glu Ala Lys Glu Asn Arg Asn His Gln Pro Pro Gln Pro Lys Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gly Asn Gln Gln Pro Ser Trp Asp Ser Glu Asp Ser Ser Asn Phe
                85                  90                  95
Lys Asp
 
<210>2
<211>294
<212>DNA
<213>Human人类
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(294)
<223>
 
<400>2
gtc ccg ctg cct gcg ggc gga ggg acc gtg ctg acc aag atg tac ccg    48
Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro
1               5                   10                  15
cgc ggc aac cac tgg gcg gtg ggg cac tta atg ggg aaa aag agc aca     96
Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Gly Lys Lys Ser Thr
            20                  25                  30
ggg gag tct tct tct gtt tct gag aga ggg agc ctg aag cag cag ctg    144
Gly Glu Ser Ser Ser Val Ser Glu Arg Gly Ser Leu Lys Gln Gln Leu
        35                  40                  45
aga gag tac atc agg tgg gaa gaa gct gca agg aat ttg ctg ggt ctc    192
Arg Glu Tyr Ile Arg Trp Glu Glu Ala Ala Arg Asn Leu Leu Gly Leu
    50                  55                  60
ata gaa gca aag gag aac aga aac cac cag cca cct caa ccc aag gcc    240
Ile Glu Ala Lys Glu Asn Arg Asn His Gln Pro Pro Gln Pro Lys Ala
65                  70                  75                  80
ctg ggc aat cag cag cct tcg tgg gat tca gag gat agc agc aac ttc    288
Leu Gly Asn Gln Gln Pro Ser Trp Asp Ser Glu Asp Ser Ser Asn Phe
                85                  90                  95
aaa gat                                                            294
Lys Asp
PCT/RO/134表
Figure QSB00000249362500011

Claims (10)

1.一种测定胃泌素释放肽前体和/或其降解物的方法，所述方法使用2种以上的不同抗体，所述的抗体识别序列编号1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法为夹心免疫测定法。
3.一种识别序列编号1所示的氨基酸序列的第47-68位的氨基酸序列所呈示的抗原表位的单克隆抗体。
4.如权利要求2所述的单克隆抗体，其中，所述抗体由按照保藏编号FERM P-21308保藏的杂交瘤GCY9产生。
5.如权利要求2所述的单克隆抗体，其中，所述抗体由按照保藏编号FERM P-21309保藏的杂交瘤GCY17产生。
6.按照保藏编号FERM P-21308保藏的杂交瘤GCY9。
7.按照保藏编号FERM P-21309保藏的杂交瘤GCY17。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述的2种以上的不同抗体的至少一种是权利要求4或5中任一项所述的抗体。
9.一种含有权利要求3～5中任一项所述的抗体、并用于测定胃泌素释放肽前体或其降解物的试剂盒。
10.如权利要求9所述的试剂盒，所述试剂盒是用于癌诊断或用于治疗效果监测的试剂盒。
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