KR101525127B1 - 가스트린 방출 펩타이드 전구체에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

서열번호１에　나타나는　아미노산 서열의　４７－６８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　２종 이상의　다른　항체를　이용하여, 가스트린　방출　펩타이드　전구체　및/또는　그의 분해물을　측정하는　방법이 제공된다. 본　발명의　방법은, 종래의　측정법보다　단시간으로, 보다　소량의　검체　시료로부터, 보다　높은　검출　감도를　가지고, 냉장　보존된　검체를　대상으로　하여　ＰｒｏＧＲＰ 또는　그의 분해물을　검출할　수　있다.

Description

가스트린　방출　펩타이드　전구체에　대한　항체　및　그의　용도{ANTIBODY DIRECTED AGAINST PRO-GASTRIN RELEASING PEPTIDE, AND USE THEREOF}

　본　발명은 가스트린　방출　펩타이드　전구체에　대한　항체　및　그　용도에　관한　것으로, 폐소세포　암을　포함한　각종　질병의　조기　발견이나　치료의　모니터링, 재발의　모니터링 등에　넓게　이용되는　것이다.

일본에서의　사인의　제１위는　악성　신생물이며, 그　중에서도　폐암의　사망률은, 남성에서는　위암을　빼놓고　제１위, 여성이라도　제３위가　되고　있어　해마다　상승하는　경향에　있다. 폐암은　병리　조직학적으로　이하의　주로　４개의　조직형으로　분류되고　있다. 즉, 폐문부(肺門部)에　발생하는　폐편평상피암(ｓｑｕａｍｏｕｓ－ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ)과　폐소세포암(ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ： ＳＣＬＣ), 폐주변부(肺野部)에　발생하는　폐선암(ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ)과　폐대세포암(Ｌａｒｇｅ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ)이 있다.

특히　폐소세포암은, 증식이　빠르고　조기에　원격　전이를　일으켜, 초진시에는　벌써　전신에 전이된　진행암으로　발견되는　것이　많다. 이　형태의　암의　치유율에　대해서는, 병변이　한측의　폐부분에　국한하고　있는　폐소세포암의　국한형(Ｌｉｍｉｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ：ＬＤ) 환자의　치유율은　약２０%이지만, 양폐나　다른　장기에　전이한　진전형(ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ：ＥＤ)의　환자에서는, 사실상　치유는　어렵다고　말하고　있다.

또, 폐소세포암은　항암제에　감수성이　높기　때문에, 화학요법이　치료법의 제1　선택으로　여겨지는데　대하여, 비폐소세포암(ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｎｏｎ－ＳＣＬＣ)은, 화학요법의　성공율이　낮기　때문에 외과　요법이　치료법의　제1　선택으로　되어　있다.

때문에, 폐소세포암은　폐암　중에서도　특히　조기　발견·치료가　필요한　암이며, 이를 위해도　폐소세포암과　비폐소세포암을　감별　진단하는　것은, 치료　방침을　결정하는데　있어서　극히　중요하다.

폐암을　발견하는　방법의　하나로　객담　검사가　있다. 그러나, 객담　검사는　주로　폐편평상피암의　검사에는　매우　적합하지만, 폐소세포암에　대한　양성율이　낮다는　문제가　있다. 또, Ｘ선촬영법도　폐암의　발견에　넓게　이용되고　있는　방법이긴 하지만, 폐문부에　생기는　폐편평상피암이나　폐소세포암에　대해서는, 폐문부가　심장의　그림 자가　되므로　암조직의　음영이　매우　촬영되기　어렵다는　문제가　있다. 또, 폐소세포암에　대해서는, 폐주변부의　이상　음영을　나타내는　환자에　대해서　객담세포　진찰, 흉부　Ｘ선단순　촬영, ＣＴ 스캔, 기관지　내시경 등을　이용해도, 이　형태의　폐암의　조기　발견은　용이하지　않다고　여겨지고　있다.

　또, 암을　진단하기　위한　검사　방법의　몇몇은, 예를　들면　방사선　조사나　생검법, 기관지　내시경　등은, 환자에　대해서　고통을　주고,　또　고가의　기기나　숙련　기술 등을　필요로　한다.

때문에, 보다　간편한　혈액검사에　의해서　치유가능한　시기에　암을　고효율로　진단하는　것을　가능하게　하는, 종양마커의　연구가 이루어지고 있다. 오늘날에는, 암질환의　발견, 진단, 병상　경과의　모니터링의　지표, 재발　진단 등에　30개 이상의　종양마커가　이용되고　있다.

폐암은　조직형이　다채롭기　때문에, 모든　형태의　폐암의　발견 또는 진단에　유효한　종양마커는　아직도　보고되어　있지　않다.　때문에 현재로서는, 폐암의　조직형마다　유효한　마커를　선택하여　사용하고　있다.

예를　들면, 폐선암에　대해서는　암태아성　항원(ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ)이나　시아릴　Ｌｅｘ－ｉ항원이, 폐편평상피암에　대해서는　편평상피암관련　항원(ｓｑｕａｍｏｕｓ－ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ：ＳＣＣ)이, 폐소세포암에　대해서는　뉴런-특이성 에놀라아제(ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ：ＮＳＥ)등이 주로　선택, 사용되고　있다.

그러나　ＮＳＥ은, (１) 치유　가능한　조기암에　대한　양성율이　낮은　점, (２) 치료에　의한　일과성의　측정치의　상승이　인정되는　점, (３) 채혈시의　용혈에　의해　측정치가　상승하는　점, (４) 폐소세포암환자와　정상인과의　측정값의 차가　작은　점 등의　결점이　있어, 폐소세포암에　대한　유효한　종양마커라고　반드시　말할　수는　없었다.

가스트린　방출　펩타이드(Ｇａｓｔｒｉｎ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＧＲＰ)는, ＭｃＤｏｎａｌｄ등이　１９７８년에　돼지 위 조직으로부터　단리한, 가스트린　분비　촉진　작용을　가지는　２７개의　아미노산으로 이루어진 뇌장관 펩타이드(brain-gut peptides)이다. 사람에　대해서도　ＧＲＰ의　존재는　확인되고　있고　사람　ＧＲＰ를　코드하는　유전자도　１９８４년에　클로닝되어　있다.

국립　암센터의　야마구치 등은, 신경　내분비　세포에　유래한다고　생각되고　있는　폐소세포암의　생물학적　특성의　연구　과정에서, ＡＣＴＨ(ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ)이나　칼시토닌(calcitonin) 등을　포함한　１５ 종　이상의　뇌장관 호르몬을　측정해, ＧＲＰ이　가장　고빈도에　고농도로　배양 폐소세포암주에서　적극적으로　분비되는　것을　밝혔다(비특허　문헌１). 나아가　혈중　ＧＲＰ의　농축법을　조합한　방사면역측정법(radioimmunoassay,ＲＩＡ)을　구축해, 폐소세포암환자는　건강한　사람에　비해　높은　혈중　ＧＲＰ 농도를　나타내는　것을　밝혔다. 그러나, ＧＲＰ은　혈중에서　신속하게　분해되기　때문에 혈중농도가　낮고, 또　상기　어세이는　번잡한　농축　조작을　필요로　했기　때문에, 임상　응용이　곤란했다.

그　후의　연구에　의해, 각종의　세포에　대해　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ에　의해서　３종의　ＧＲＰ 전구체(ＰｒｏＧＲＰ)가　생산되는　것이　밝혀졌다(비특허　문헌２). 이들 ３종의　ＰｒｏＧＲＰ은, 그　１－９８번째에　대해　아미노산 서열이　공통되고　있는　한편, ９９ 번째　이후는　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ에　의해서, 서로　다른　아미노산 서열이　되고　있다. 이　공통되는　１~９８ 번째의　아미노산 서열을　서열번호１에　나타낸다. 이후, 특별히　나타내지 않는 이상　본　발명에　있어서의　ＰｒｏＧＲＰ, 그　부분　배열, 분해물 등의　아미노산 잔기의　번호　표시는, 서열번호１의　아미노산　서열을　가지고　나타내는　것으로　한다.

３종의　ＰｒｏＧＲＰ의　１－２７번째의　아미노산 서열은, 가스트린　분비　촉진　활성을　가지는　성숙　ＧＲＰ의　그것과　동일하다. 이들３종의　전구체는, 모두　호르몬　전구체　절단　효소에　의해서, １－２７번째의　아미노산　서열로 이루어진　성숙형　ＧＲＰ과　３１번째　이후의　아미노산　서열로 이루어진　가스트린　분비　촉진　활성을　갖지　않는　ＰｒｏＧＲＰ의　분해물인　Ｃ말단측　fragment(ＰｒｏＧＲＰ－Ｃｆｒａｇ)로　분해된다.

Ｈｏｌｓｔ 등(비특허　문헌３)은, ＰｒｏＧＲＰ의　４２－５３번째의　아미노산　서열로 이루어진　펩타이드(이하, ＰｒｏＧＲＰ(４２－５３)으로　한다)에　대한　항혈청을　이용한　방사면역측정법(ＲＩＡ) 법에　의해서, 폐소세포암환자의　혈장중의　ＰｒｏＧＲＰ 또는　ＰｒｏＧＲＰ－Ｃｆｒａｇ의　레벨이　높은　것을　보고했다. 그러나, 이　방법에서는　침전　추출　조작이　필요하고, 감도도　충분하지　않았다.

미야케등은, ＰｒｏＧＲＰ이　ＧＲＰ보다　혈중에서　안정성이　높은　것, 및　３종의　ＰｒｏＧＲＰ의　공통　부분인　３１－９８번째의　아미노산 서열이　다른　단백질의　아미노산 서열에　대해서　상동성을　나타내지　않는　것에　주목해, 상기 아미노산　서열로 이루어진　재조합체　펩타이드(이하, ＰｒｏＧＲＰ (３１－９８)으로　한다)를　항원으로 하여　얻은　고역가의　항혈청을　이용하고, 침전　추출　조작이　불요의　고감도　ＲＩＡ법을　구축했다(비특허　문헌１). 이　방법에　의해, ＰｒｏＧＲＰ은　ＧＲＰ과　같이　뛰어난　종양마커가　되는　것이　나타났다.

　그러나, 이　방법은　추출　조작을　필요로　하지　않는　점에서　유리하긴 하지만, 측정에　４일간을　필요로　하는　것이나　감도가　１０ ｐＭ(７７.３ｐｇ 항원/ｍＬ)으로　충분하지　않기　때문에, 정상인 혈청중의　ＰｒｏＧＲＰ치를　측정하지　못해, 임상　응용에는　이르지　않았다.

또, 전술한　Ｈｏｌｓｔ등　및　미야케등의　ＲＩＡ법은　inhibition법이기　때문에, ＰｒｏＧＲＰ의　단편의　일부에서라도　항원성을　가지고　있으면　측정　가능하지만, 그　감도는　샌드위치법에　비해　낮고, 고감도화가　필요한　ＰｒｏＧＲＰ 측정법의　임상　응용은　곤란하다. 즉, ＰｒｏＧＲＰ의　검출을　임상　응용하기　위해서는, 검출의　감도를　높이는　것은　필수이며, 특히　샌드위치법으로　이용　가능한　항체가　필요하다.

야마구치, 아오야기등은, ＰｒｏＧＲＰ의　폐소세포암용　종양마커로서의　임상　응용을　목적으로　하고, ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ(ＥＬＩＳＡ)를　원리로　하는, 샌드위치법을　이용한　간편하고　고감도인　ＰｒｏＧＲＰ 측정　시약을　개발했다(특허　문헌１). 이　방법은　약２시간에　결과를　주고,　또　높은　감도(２ｐｇ/ｍＬ)를　가지고　있어 현재　폭넓게　임상　응용되고　있으며,　폐소세포암에　대해　ＮＳＥ보다　높은　감도, 특이성을　가지고　있는　것이　분명해지고　있다.

또, 이　측정법을　이용하여, 폐소세포암　이외에도, 신경　내분비　종양(갑상선골수모양암　등), 신경　내분비　종양적　성격을　나타내는　암(식도소세포암, 췌소세포암, 전립선소세포암등)에서도　혈청　ＰｒｏＧＲＰ치가　상승하는　것이　분명해져, 향후　이러한　종양의　조기　발견이나　치료의　모니터링　등에도　응용될 것으로　생각된다.

그렇지만, ＰｒｏＧＲＰ의　혈중에서의　안정성은, ＧＲＰ의　그것과　비교했을　경우에는　높지만, 일반적인　다른　종양마커에　비해, 측정치의　격차가　인정된다. 그　때문에, ＰｒｏＧＲＰ를　검출　대상으로　한　방법에서는, 측정용　검체는 채혈　후　신속하게　측정시까지　동결　보존　되지　않으면　안　된다는　제약이　있다(비특허　문헌４).

아오야기는, ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)의　내부　영역인　ＰｒｏＧＲＰ의　４０－７５ 번째의　아미노산 잔기 또는 ＰｒｏＧＲＰ의　４０－７９번째의　아미노산 잔기를　인식하는　２종류　이상의　항체를　이용한　샌드위치　측정법을　개발했다(특허　문헌３). 이　방법은, ４℃로　보존한　검체의　측정으로　비교적　안정인　결과를　주고,　또　특허　문헌２에　기재되어　있는　방법과　거의　동등한　검출　감도를　나타낸다. 그렇지만, 이　방법은, 특허　문헌３의　실시예４에　나타나는　대로, １００μＬ이라고　하는　일반적인　면역　측정법과　비교해　다소　많은　검체량을　필요로　한다.

특허　제３２１０９９４호공보 특개평６－９８７９４호 국제　특허　공개　ＷＯ２００６/１１７９９４호팜플렛

Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, １９９４년, 제５４권, 제２１３６－２１４０페이지 Ｓｐｉｎｄｅｌ등, Ｍｏｌ.Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ., １９８７년, 제１권, 제２２４－２３２페이지 Ｈｏｌｓｔ등, Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｏｎｃｏｌ., １９８９년, 제７권, 제１８３１－１８３８페이지 임상　검사, １９９５년, 제３９권, 제９８１－９８６페이지

특허　문헌３에　기재된　방법에　대하여, 검출　감도를　유지하면서　필요한　검체량을　한층　더　소량으로　할　수　있으면, 임상　현장에　있어서, 측정에　필요로　하는　코스트의　삭감이나　환자의　부담경감을　달성할　수　있다. 또, 검체의　보존에　의한　측정　감도의　저하가　보다　적은　측정　방법은 검체　취급을　보다　간편하게　할　수　있다. 본　발명은, 검체의　보존에　의해도　검출　감도의　저하가　적고, 보다　소량의　검체량으로　측정이　가능한, 새로운　ＰｒｏＧＲＰ의　측정법을　제공하는　것이다.

본　발명은, ＰｒｏＧＲＰ의　특정의　영역에　대한　항체를　이용한　이뮤노어세이법이　상기의　과제를　해결할　수　있는　것을　찾아내어, 이하의　각　발명을　완성하였다.

(１) 서열번호１에　나타나는　아미노산 서열의　４７－６８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　２종 이상의　다른　항체를　이용하여, 가스트린　방출　펩타이드　전구체　및/또는　그의 분해물을　측정하는　방법.

(２) 샌드위치　면역　측정법인, (１)의　기재의　방법.

(３) 서열번호１에　나타나는　아미노산 서열의　４７－６８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　단일　클론　항체.

(４) 기탁　번호　ＦＥＲＭ Ｐ－２１３０８로　기탁된　하이브리도마　ＧＣＹ９이　생산하는(３)의　기재의　단일　클론　항체.

(５) 기탁　번호　ＦＥＲＭ Ｐ－２１３０９로　기탁된　하이브리도마　ＧＣＹ１７이　생산하는(３)의 기재의　단일　클론　항체.

(６) 기탁　번호　ＦＥＲＭ Ｐ－２１３０８로　기탁된　하이브리도마　ＧＣＹ９.

(７) 기탁　번호　ＦＥＲＭ Ｐ－２１３０９로　기탁된　하이브리도마　ＧＣＹ１７.

(８) ２종 이상의　다른　항체 중　적어도　하나가 (４) 또는 (５)의　어느　하나의　기재의　항체인, (１)의　기재의　방법.

(９) (３) 내지 (５) 중 어느 하나의　항체를　포함하는, 가스트린　방출　펩타이드　전구체 또는 그의 분해물을　측정하기　위한　키트.

(１０) 암의　진단　또는　치료　효과의　모니터링을　수행하기　위한　키트인, (９)의　기재의　키트.

본　발명의　방법은, 검체 중에서도　안정하게　보존되어　있는　ＰｒｏＧＲＰ의　분해물을　측정　대상으로　하는　것에　의해서, 종래의　측정법과　동등한　검출　감도를　얻을　수　있을 뿐만 아니라 채취　후의　검체　취급 방법에 영향을 거의 받지 않아 재현성이　높은　측정치를　얻을　수　있는 등의　효과를　나타낸다. 이것에　의해, 폐소세포암 등의　질병의　진단을　위해서 검체를　채혈하는　임상　현장에　있어서, 채혈　후의　검체　취급이　한층　더　용이해지고, ＰｒｏＧＲＰ의　측정치가　검체　취급에　의해서 고르지 않게 되는 것이 없어져, 보다　안정된　결과를　얻을　수　있으므로　측정치의　신뢰성이　높아진다. 또　임상　소견으로부터　추가　시험의　요청 또는 재검사의　필요성이　생겼을　경우　등에서, 동결　보존　검체가 아닌 냉장　보존　검체를　이용한　측정이　가능해져, 측정에　요구되는　코스트를　삭감할　수　있다. 또, 본　발명의　방법은, 높은　검출　감도를　유지하면서, 측정　검체량의　감소　및　측정　시간의　단축이　가능해져, 임상 현장에　있어서의　코스트를　삭감해, 환자의　부담을　경감할　수　있다.

도 1은 멀티　핀　펩타이드로　합성한　８개의 연속하는 아미노산　서열로 이루어진　각　폴리펩타이드에　대한　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９의　결합능을　나타내는　그래프이다. 횡축은　각　폴리펩타이드와　그의　서열번호１에　있어서의　아미노산 잔기의　번호를, 종축은　흡광도를　나타낸다.
도 2는 멀티　핀　펩타이드로　합성한　８개의 연속하는 아미노산　서열로 이루어진　각　폴리펩타이드에　대한　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７의　결합능을　나타내는　그래프이다. 횡축은　각　폴리펩타이드와　그의　서열번호１에　있어서의　아미노산 잔기의　번호를, 종축은　흡광도를　나타낸다.
도 ３은 멀티　핀　펩타이드로　합성한　８개의 연속하는 아미노산　서열로 이루어진　각　폴리펩타이드에　대한　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ２４의　결합능을　나타내는　그래프이다. 횡축은　각　폴리펩타이드와　그의　서열번호１에　있어서의　아미노산 잔기의　번호를, 종축은　흡광도를　나타낸다.
도 ４는 멀티　핀　펩타이드로　합성한　８개의 연속하는 아미노산　서열로 이루어진　각　폴리펩타이드에　대한　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１２의　결합능을　나타내는　그래프이다. 횡축은　각　폴리펩타이드와　그의　서열번호１에　있어서의　아미노산 잔기의　번호를, 종축은　흡광도를　나타낸다.
도 ５는 멀티　핀　펩타이드로　합성한　８개의 연속하는 아미노산　서열로 이루어진　각　폴리펩타이드에　대한　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ５의　결합능을　나타내는　그래프이다. 횡축은　각　폴리펩타이드와　그의　서열번호１에　있어서의　아미노산 잔기의　번호를, 종축은　흡광도를　나타낸다.
도 ６은 ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)과　각종　단일　클론　항체가　인식하는　에피토프의　위치의　관계를　나타내는　모식도이다.
도 ７은　아미노산　번호　４７－６８번째의　부분　펩타이드에　결합하는　항체인　ＰＧＣＹ９과　ＰＧＣＹ１７을　이용한　측정법의　표준　곡선이다. 횡축은　ＰｒｏＧＲＰ의　농도를, 종축은　흡광도를　나타낸다.
도 ８은 마이크로　플레이트의　고상에　항마우스　ＩｇＧ(Ｆｃ) 항체를　개입시켜　결합시킨　ＰｒｏＧＲＰ에　대한　각　단일　클론　항체와　비오틴화　ＰｒｏＧＲＰ과의　반응성을　나타내는　그래프이다. 횡축은　각　단일　클론　항체를, 종축은　흡광도를　나타내고　있다.

본　발명은, ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식할　수　있는　２이상의 다른 항체를　사용하여, 샌드위치　면역　측정법에　따라　ＰｒｏＧＲＰ 또는　ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산 잔기를　가지는　ＰｒｏＧＲＰ의　분해물을　검출하는　방법이다. 해당　이뮤노어세이법은, 채취된　검체를　냉장　보존했을　경우에서도, 그　검출　감도가　저하하지　않는　특징을　가지고　있다. 이것은, ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산 잔기를　가지는　ＰｒｏＧＲＰ의　분해물이, 검체에　포함되는　프로테아제 또는 그　외의　원인에　의한　검체　보존중의　새로운　분해　반응에　대해서　비교적　안정하다는　것을　의미하는　것이라고　추측된다.

본　발명의　방법에서　이용할　수　있는　항체는, ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식할　수　있는　항체이며, 이것에　의해서　ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８번째의　아미노산 잔기를　가지는　ＰｒｏＧＲＰ의　분해물에　결합할　수　있다. 이러한　항체는　단일　클론　항체인　것이　바람직하다.

본　발명의　방법으로　이용할　수　있는　항체는, 바람직하게는　ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산 서열에　있어서　Ｎ말단　부분에　제시되는　에피토프와　Ｃ말단　부분에　제시되는　에피토프를　인식할　수　있는　２이상의 다른 단일　클론　항체인　것이　바람직하다. 특히, 독립　행정법인　산업기술　종합　연구소　특허　생물　기탁　센터에　수탁　번호　ＦＥＲＭ Ｐ－２１３０８으로서　기탁된　하이브리도마　ＧＣＹ９ 및　수탁　번호　ＦＥＲＭ Ｐ－２１３０９로서　기탁된　하이브리도마　ＧＣＹ１７이　생산하는　단일　클론　항체인　ＰＧＣＹ９와　ＰＧＣＹ１７의　이용이　특히　바람직하다. 이　２종류의　하이브리도마　세포는, 대장균을　이용해　생산한　재조합　ＰｒｏＧＲＰ의　３１－９８번째의　아미노산　서열로 이루어진　폴리펩타이드(이하, ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)로　나타내는　것으로　한다)를　항원으로서　면역시킨　마우스의　항체생산　세포로부터　통상의　방법으로　제작된　하이브리도마　세포이며, ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８) 내부의　펩타이드를　이용한　스크리닝에　의해서　선별된, ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　항체를　생산하는　세포이다.

이와　같이, 본　발명에서　이용할　수　있는　항체는, ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)을　항원으로 하여　마우스, 래트, 모르모트, 토끼, 닭, 염소, 양, 소 등의　실험동물을　면역시켜　회수되는　항체 생산　세포로부터, 통상의　방법으로　단일　클론　항체를　생산하는　하이브리도마　세포를　제작해, ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８번째의　아미노산 잔기로 이루어진　폴리펩타이드(이하, ＰｒｏＧＲＰ(４７－６８)로　나타내는　것으로　한다)를　이용해　원하는　항체를　생산하는　하이브리도마　세포를　스크리닝함으로써　얻을　수　있다. 또, ＰｒｏＧＲＰ(４７－６８)을　항원으로서　이용해도　좋다. 또, 상기　폴리펩타이드는, 사이클로글로불린이나 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole-limpet hemocyanin) 등의　담체에　결합시켜　사용해도　좋다.

마우스를 예로 들어, 동물을　면역하는　방법을　설명한다. ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８) 등의　폴리펩타이드를　Freund　완전　아쥬반트(complete Freund's adjuvant), ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ(ＣｙｔＲｘ사) 등의　아쥬반트와　１：１로　혼합해　교류　조인트로　결합한　2개의　주사통으로　반복해　조인트를　통과시키거나, 또는 초음파　처리하는　등의　방법에　의해　에멀젼을　제작한다. 제작한　항원　함유　에멀젼을, 피하, 피내, 근육내, 복강내 중 어느 하나, 또는　복수　부위에　주입한다. 1회째의　면역　종료의　후, １~４주간의　간격을　두고　2회째의　면역을 동일하게　실시한다. 이후 동일하게　혈중의　ＰｒｏＧＲＰ에　대한　항체의　항체값이　상승할　때까지, 면역을　계속한다.

항체값의　측정은　이하와　같이　실시할　수　있다. ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)을　１μｇ/ｍＬ의　농도로　ＰＢＳ에　용해하여, 웰　당　５０μＬ의　용량으로　９６웰　마이크로타이터플레이트의　각　웰에　가하고, ４℃에서　하룻밤　흡착시킨다. ０.０５%Ｔｗｅｅｎ２０이 들어있는　ＰＢＳ(ＰＢＳ－Ｔ) 로　각　웰을　세정한 후 어세이에　이용한다. 어세이　전에, １%ＢＳＡ가 들어있는이　ＰＢＳ등으로　블로킹을　실시해도　좋다. 안와　정맥총, 꼬리　정맥　또는　꼬리　동맥 등으로부터　채혈해, ＰＢＳ－Ｔ로　３０배　희석한　후　원심분리를　실시한다. 얻어진 상청액에 대해 ＰＢＳ－Ｔ로　단계적 희석액을 제조하여, ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)을　코팅한　마이크로타이터플레이트의　각　웰에　５０μＬ씩　가한다. 실온에서　３０분　반응　후, ＰＢＳ－Ｔ로　세정하고, ＰＢＳ－Ｔ 등으로　적절히　희석한 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제 (ＨＲＰ)로 표지한 항마우스　ＩｇＧ 용액을　각　웰에　５０μＬ씩　첨가한다. 다시　실온에서　３０분간　반응시킨　후, 과산화　수소, 오르토　페닐렌　디아민　기질액을　첨가해　３０ 분간　반응시키고, ２N H₂SO₄ 을　５０μＬ첨가해　반응을　정지시켜, 각　웰의　흡광도를　측정한다.

면역시킨　마우스에서, 충분히　투여한　항원에　대한　항체값이　상승하고　있는　것을　확인한　후, 비장을　꺼내, 비장　세포를　단리한다. 따로　배양해　둔　마우스　골수종(예를　들면　ＳＰ２/０－Ａｇ１４등　)과　폴리에틸렌　글리콜 등을　이용하여　융합한다. 융합에　성공한　세포를　ＨＡＴ(hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 배지에서　선택　배양한다. ７~１４ 일 정도, 수일에 한번씩 배지를　반량　교환하면서　배양을　계속한　후, 배양 상청액의　항체값을　측정한다. 포지티브　웰의　세포를　한계　희석법으로　클로닝　해, 목적하는　항체 생산　하이브리도마를　얻는다.

상기　방법으로　얻어진 항체의　에피토프를　해석함으로써, ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　항체를, 취득할　수　있다. 에피토프　해석은, 멀티　핀　펩타이드법에　의해　합성한　ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)의　연속하는　８－１２ 아미노산　서열로 이루어진　폴리펩타이드, 또는 ＰｒｏＧＲＰ(４７－６８)에　대한　항체의　반응을　조사하는　것에　의해서　실시할　수　있다. 예를　들면, 재조합체로　발현시킨　ＰｒｏＧＲＰ(４７－６８) 또는 Ｆｍｏｃ법이나　Ｂｏｃ법으로　화학　합성시킨　ＰｒｏＧＲＰ(４７－６８)을　마이크로타이터플레이트에　코팅하여, 상술한　면역　측정법으로 항체의　각　펩타이드에　대한　반응성을　조사함으로써 결정할　수　있다.

멀티　핀　펩타이드법에　의해　합성한, ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)의　연속하는　８－１２ 아미노산　서열로 이루어진　폴리펩타이드를　이용한　에피토프　해석의　결과, 본　발명으로　특히　바람직한　항체의　하나인　ＰＧＣＹ９은, ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산에　의해서　제시되는　에피토프　가운데, ５５－６６ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　단일　클론　항체인　것이　확인되었다. 또　본　발명으로　특히　바람직한　또　하나의　항체인　ＰＧＣＹ１７은, 적어도　４５－５７ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　단일　클론　항체인　것이　확인되었다.

본　발명에서　이용되는　항체는, 담체나　마이크로플레이트에　고정하거나　비오틴 등의　적당한　라벨화　시약으로　라벨링　하거나　하는　것도　가능하다. 고정이나　라벨링의　각　조작은, 여러　가지의　실험법의　해설서에　기재되어　있는　방법에　준해　실시하면 되고, 본　발명에서　이용되는　항체에　특유의　조작은　특별히 필요하진 않다.

본　발명의　방법은, 상기의　항체를　이용한　샌드위치이뮤노어세이법, 구체적으로는　샌드위치　ＥＬＩＳＡ법이다. 샌드위치　ＥＬＩＳＡ법의　기본　조작은, 「초고감도　면역　측정법」(이시카와　에이지, １９９３년, 학회　출판　센터) 또는 그　외　여러　가지의　실험법의　해설서에　기재되어　있는　방법으로　준해　실시할　수　있어　본　발명의　실시에　특유의　조작이　특별히　필요하다고는　보지는 않지만, 다음과　같은　공정으로　실시할　수　있다.

즉, ＰｒｏＧＲＰ 및/또는　그의 분해물은, (１) ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　제1의 항체와　검체 중의　ＰｒｏＧＲＰ 및/또는　그의 분해물을　반응시키는　공정, (２) 상기 항체에　의해　포착된　ＰｒｏＧＲＰ 및/또는　그의 분해물을, (１)의　항체와는　다르지만　ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　제2의　항체와　반응시키는　공정, 및 (３) (２)에　의해　발생하는　면역　복합체를　검출하는　공정을　포함한　측정법에　의해서, 검출할　수　있다.

본　발명의　방법의　조작법의　예는, 다음과　같이　나타낼　수　있다. 제1의 항체를　１~１０μｇ/ｍＬ 정도의　농도가　되도록 완충액, 예를　들면　０.１Ｍ 탄산　완충액(ｐＨ９.６)에　용해한　용액을, 마이크로타이터플레이트의　각　웰에　동량으로　두고, ４℃로　하룻밤　인큐베이션한다. ＰＢＳ등의　세정용　완충액으로　각　웰을　세정　후, 제1의 항체가　결합하고　있지　않는　각　웰의　내벽을, 카세인 나트륨 등의　적당한　단백질을　포함한　완충　용액을　이용해　수시간　인큐베이션을　실시해　블로킹　한다. 블로킹액을　제거　후, 각　웰에, Ｔｗｅｅｎ２０등의　계면활성제를　포함한　반응액과　검체를　첨가한다. 검체의　첨가량은, 그　측정법의　감도에　의해서　적당　변경된다. ３７℃ 정도의　온도로　１시간　정도　반응시킨　후, 계면활성제를　포함한　완충액(예를　들면　Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　ＰＢＳ－Ｔ)으로　각　웰을　세정해, 적당한　라벨　시약으로　라벨링된　제2의　항체를　각　웰에　첨가해　수십분　반응　후, 각　웰을　세정해, 라벨　시약에　맞는　방법으로　제2의　항체를　검출한다. 덧붙여　이　상기의　조작법은　어디까지나　예이며, 각　단계의　조작의　상세, 예를　들면　완충액, 라벨　시약, 첨가량 등은 적당히　조절할　수　있다.

단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９과　ＰＧＣＹ１７의　２종류의　단일　클론　항체를　이용한　본　발명의　방법의　검출　감도는　２.５ｐｇ/ｍＬ이며, 검체량은　２５μＬ정도를　이용하면　좋다. 이　검출　감도는, 거의　모든　정상인의　혈중　ＰｒｏＧＲＰ의　측정을　가능하게　하는　것이어서, 임상　현장에　있어　검사　코스트의　삭감, 환자의　부담경감에　기여하는　것이다.

본　발명은, 상술한　방법에　더해,　검체 중의　ＰｒｏＧＲＰ 또는 그의 분해물을　측정하기　위한　키트, 특히　ＰｒｏＧＲＰ 및/또는　그의 분해물을　측정하는　것에　의해서　폐소세포암의　진단이나　화학요법의　모니터링을　수행하기　위한　진단키트도　제공한다. 이러한　키트는, 상술한　ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　항체를　적어도　２종　포함하며, 그　외　임의의　반응　완충액이나　２차　항체의　희석액, ＰｒｏＧＲＰ의　표준　물질, 설명서　그　외의　구성물을　포함하고　있어도　된다. 키트에　포함되는　항체의　바람직한　예로서는, ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　２종 이상의　다른　항체이며, 대표예로서는　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９과　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７이다.

ＰｒｏＧＲＰ 및/또는　그의 분해물과　결합하는　항체는, ＰｒｏＧＲＰ의　４７－６８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　항체만을　선택해　사용하는　것이　바람직하지만, 재현성이　높은　측정치를　얻을　수　있는　범위 내에서, 이러한　항체　이외의　항체가　측정계에　포함되어　있어도　된다.

이하, 실시예를　들어　본　발명을　보다 상세히　설명한다.

[실시예]

실시예 １

특허　제３２１０９９４호의　실시예１에　기재한　방법에　의해　재조합체를　제작해, 대장균에서　발현시킨　서열번호１에　나타난　아미노산　서열로 이루어진　폴리펩타이드를　정제했다. 특허　제３２１０９９４호의　실시예１에서, 이　재조합체는　ＧＲＰ(３１－９８)이라고　기재되어　있지만, 정확하게는　ＧＲＰ 전구체(ＰｒｏＧＲＰ)의(３１－９８) 부분이므로, 여기에서는 ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８) 라고　기재한다.

　ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)：돼지　티로글로블린(thyroglobulin,ＴＧ)을　중량비　1：３으로　결합시킨　항원　단백질(ＰｒｏＧＲＰ－ＴＧ로 나타낸다)을 ０.１５Ｍ의　ＮａＣＬ를　포함한　１００ ｍＭ 인산　완충액(ｐＨ６.０)에　희석하고, 동량의　타이타막스와　혼합하여, ＰｒｏＧＲＰ－ＴＧ 현탁액을 만들었다. ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)의　농도가　０.０５ｍｇ/０.１ｍＬ이　되도록 조제한　상기 현탁액을, ４~６주령의　ＢＡＬＢ/ｃ계　마우스의　복강내에　약２０일의　간격으로　４~６회 투여했다. 다시　약４주일　후, 추가　면역으로서　ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)의　농도가　０.１ｍｇ/０.１ｍＬ이　되도록 조제한　생리　식염수　용액을　２일간　투여했다. 최종　추가　면역　후３일째에, 이　면역　동물으로부터　무균적으로　비장을　적출하고, 가위로　절단한 후, 다시　메쉬를　이용해　비장을　개개의　세포로　풀어, ＲＰＭＩ－１６４０ 배지에서　３회 세정　후, ８－아자구아니딘을　포함한　동배지에서　수일간　배양했다. 복귀　돌연변이체를　완전하게　제외한　대수　증식기의　마우스　골수종　세포주　ＳＰ２/０－Ａｇ１４를　ＲＰＭＩ－１６４０ 배지에서　세정　후, 상기 세포２.４×１０^７개와　전술한　비장　세포　２.０×１０^８개를　원심관에　들어갈　수　있게　혼합했다.혼합한　２종류의　세포를, ２００×ｇ로, ５분간　원심분리를　행해　상청액을　제거한　후, ＨＶＪ Ｅｎｖｅｌｏｐ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ(ＧｅｎｏｍＯＮＥ－ＣＦ, 이시하라산업(주))를　이용해　세포　융합　시켰다. 융합한　세포를, hypoxanthine-aminopterin-thymidine (이하, ３종류의　화합물을　모아　ＨＡＴ로　나타낸다), １０% 우태아　혈청(ＦＣＳ) 및　마우스 인터루킨６(Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ)을　포함한　ＲＰＭＩ－１６４０ 배지에서　희석하고, ９６ 웰　플레이트에　가하여　１~２주간　배양했다. 배양　약１~２주일　후, 항원으로서　ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)을　이용한　ＥＬＩＳＡ법을　실시해서, ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)에　대해서　반응　특이성을　가지는　본　발명의　단일　클론　항체를　생산하는　하이브리도마를　얻었다.

얻어진　하이브리도마에　대해서, 통상적 방법의　한계　희석법에　따라, ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)을　이용해　목적하는　항체의　생산주의　검색　및　단일　클론화를　행해, 최종적으로　５주의　하이브리도마　세포를　얻고, ＧＣＹ９, ＧＣＹ１７, ＧＣＹ１２, ＧＣＹ２４ 및　ＧＣＹ５로　각각　명명하였다. ＧＣＹ９과　ＧＣＹ１７은, 일본　이바라키현　츠쿠바시동１가１번지１중앙　제６에　있는　독립　행정법인　산업기술　종합　연구소　특허　생물　기탁　센터에, 평성　１９년６월　２２ 일자로　기탁　신청을　했다(ＧＣＹ９의　기탁　번호：ＦＥＲＭ Ｐ－２１３０８, ＧＣＹ１７의　기탁　번호：ＦＥＲＭ Ｐ－２１３０９). 또, ＧＣＹ９과　ＧＣＹ１７은, 평성　２０년８월５일자에서　각각　국제　기탁되었다(ＧＣＹ９의　국제　기탁　번호：ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９９１, ＧＣＹ１７의　국제　기탁　번호：ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９９２).

실시예 ２

(１) 실시예１의　기재의　방법에　의해　얻을　수　있던　하이브리도마를, 마우스 인터루킨６을　포함한　무혈청배지(Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ, Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ사)에서　배양하여, 생산되는　단일　클론　항체를 프로테인　Ａ을　결합시킨　세파로스컬럼(아마　샴)을　이용해　정제　회수했다. 각　하이브리도마　ＧＣＹ９, ＧＣＹ１７, ＧＣＹ１２, ＧＣＹ２４ 및　ＧＣＹ５로부터　생산된　단일　클론　항체를, 각각　ＰＧＣＹ９, ＰＧＣＹ１７, ＰＧＣＹ１２, ＰＧＣＹ２４ 및　ＰＧＣＹ５라고　명명했다. ＰＧＣＹ９, ＰＧＣＹ１７, ＰＧＣＹ１２, ＰＧＣＹ２４ 및　ＰＧＣＹ５의　서브타입은, 토끼 항마우스　Ｉｇ 각　서브타입　키트(Ｚｙｍｅｄ사)를　이용한　실험에　의해, ＰＧＣＹ９, ＰＧＣＹ１２, ＰＧＣＹ２４ 및　ＰＧＣＹ５이　ＩｇＧ１, ＰＧＣＹ１７이　ＩｇＧ２ａ인　것이　분명해졌다.

(２) ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)의　아미노산 서열에　근거하여, １ 아미노산씩　늦추어　제조된　연속한　８개의　아미노산으로 이루어진　합계　６１ 종류의　폴리펩타이드를, 멀티　핀　펩타이드법으로　합성했다. 다시　각　펩타이드의　Ｎ말단에　비오틴을　결합시켰다. 비오틴화　폴리펩타이드　각각을　디메틸포름아미드에　용해해, １μｇ/ｍＬ의　농도가　되도록 ＰＢＳ으로　희석하였다. 희석된　각　비오틴화　폴리펩타이드　용액을, 아비딘이　고정된　９６웰의 마이크로타이터플레이트의　각　웰에　１００μＬ씩　첨가해, ４℃로　하룻밤　인큐베이션하였다.０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　ＰＢＳ 완충액(ＰＢＳ－Ｔ)으로　각　웰을　세정　후, 각　단일　클론　항체를　１μｇ/ｍＬ에　희석한　용액을, 각　웰에　１００μＬ씩　첨가하였다. 실온에서　３０분간　반응　후, ＰＢＳ－Ｔ로 각　웰을　５회 세정해, 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제(ＨＲＰ)로 표지한 항마우스　ＩｇＧ 항체　용액을　각　웰에　１００μＬ씩　첨가하였다. 다시　실온에서　３０분간　반응　후, ＰＢＳ－Ｔ로 ５회　각　웰을　세정해, 기질　용액(２ｍｇ/ｍＬ의　오르토　페닐렌　디아민, ３０% 과산화　수소수 ０.９μＬ/ｍＬ를　포함한　０.１Ｍ 구연산　인산　완충액, ｐＨ５.０)을　각　웰에　１００μＬ씩　첨가하여, 실온에서　３０분간　반응시킨　후, ２Ｎ 황산을　１００μＬ씩　첨가해, 즉시　４９２ ｎｍ에서의　흡광도를　측정하였다. 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９, ＰＧＣＹ１７, ＰＧＣＹ２４, ＰＧＣＹ１２ 및　ＰＧＣＹ５의　ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８) 내부의　각　펩타이드에　대한　반응을　도 １ 내지 도 ５에　나타낸다.

도 １에　나타난 바와 같이, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９는, ＰｒｏＧＲＰ(５７－６４)에　대해서　매우　약하게　결합하는　것이　확인되었다. 또　도 ２과　도 ３에　나타난 바와 같이, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７ 및　ＰＧＣＹ２４는, ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)의　아미노산 서열에　있어서의　연속한　８개의　아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드에는　결합하지　않는　것이　확인되었다. 이것으로부터, ＰＧＣＹ１７ 및　ＰＧＣＹ２４은, ８개의 연속하는 아미노산 서열이　아니고, ８개보다　긴　아미노산　서열로 이루어진　폴리펩타이드에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　것이라고　추측된다. 한편, 도 ４에　나타난 바와 같이, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１２는　ＰｒｏＧＲＰ(３４－４１)에　강하게　결합하고, 그　전후의　ＰｒｏＧＲＰ(３３－４０) 및　ＰｒｏＧＲＰ(３５－４２)에는　약하게　결합하는　것이　확인되었다. 따라서, ＰＧＣＹ１２는, ＰｒｏＧＲＰ의　３４－４１번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　것이라고　추측된다. 또, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ５는, ＰｒｏＧＲＰ(６９－７６)와　ＰｒｏＧＲＰ(７０－７７)에　대해서　강하게　결합하고, ＰｒｏＧＲＰ(７１－７８)에　결합하며, 또　ＰｒｏＧＲＰ(６８－７５)에는　매우　약하게　결합하는　것이　확인되었다. 따라서, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ５은, ＰｒｏＧＲＰ의　６９－７６ 번째의　아미노산 서열과　７０－７７ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　공통의　에피토프를　인식하는　것이라고　추측된다.

(３) 표 １에　나타낸　ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)의　부분　아미노산　서열로 이루어진　폴리펩타이드를　Ｆｍｏｃ법으로　합성, 정제하였다. ６Ｍ 요소를　용해시킨　ＰＢＳ에, ＢＳＡ를　２０μｇ/ｍＬ의　농도로　용해하여, ９６웰의 마이크로타이터플레이트(ＮＵＮＣ, Ｍａｘｉｓｏｒｐ)의　각　웰에　１００μＬ씩　가하고　실온에서　３시간　인큐베이션하였다. 각　웰을　５회씩　ＰＢＳ로　세정하고, Ｎ－(３－디메틸아미노프로필)－Ｎ＇－에틸카르보디이미드　염산염(ＥＤＣ)과　Ｎ－하이드록시숙신이미드(ＮＨＳ)를　각각１ｍｇ/ｍＬ이　되도록 ＰＢＳ으로　용해한　용액을　각　웰에　１００μＬ씩　가해　실온에서　２시간　인큐베이션하고, 웰에　고정된　ＢＳＡ의　카르복실기를　활성화시켰다. 각　웰을　３회씩　ＰＢＳ으로　세정하고, 각각의　폴리펩타이드를　５μｇ/ｍＬ의　농도가 되도록　０.１Ｍ 인산　완충액(ｐＨ６.０)으로　희석하여, ９６ 웰의 마이크로타이터플레이트의　각　웰에　１００μＬ씩　첨가하고, ４℃로　하룻밤　인큐베이션하였다. 이것에　의해, 각　폴리펩타이드는　아미노기를 통해　고정화된　ＢＳＡ에　결합하게　된다.

ＰＢＳ로　각　웰을　２회 세정　후, １% ＢＳＡ, ２% 수크로스를　포함한　ＰＢＳ를　각　웰에　３５０μＬ씩　첨가하고, 실온에서　３시간　인큐베이션을　실시하고, 그　후　흡인　제거했다. １μｇ/ｍＬ의　농도로　희석한　각　단일　클론　항체를　１００μＬ씩　각　웰에　첨가하고, 실온에서　６０ 분간　반응시킨　후, ０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　ＰＢＳ(ＰＢＳ－Ｔ) 로　５회 세정　후, 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제(ＨＲＰ)로 표지한 항마우스　ＩｇＧ 항체　용액을　１００μＬ씩　각　웰에　첨가하여, 실온에서　２０ 분간　반응시켰다. ＰＢＳ－Ｔ로 ５회 세정　후, 기질　용액(２ｍｇ/ｍＬ의　오르토　페닐렌　디아민, ３０% 과산화수소수 ０.９μＬ/ｍＬ를　포함한　０.１Ｍ 구연산　인산　완충액, ｐＨ５.０)을　１００μＬ씩　각　웰에　첨가하고, 실온에서　２０ 분간　반응시킨　후, ２Ｎ 황산을　１００μＬ씩　각　웰에　첨가하여　반응을　정지시키고, 즉시　４９２ ｎｍ에서의　흡광도를　측정하였다. 본　발명의　각　단일　클론　항체　외에, 특허　문헌３에　나타난, ＰｒｏＧＲＰ의　４０－６０ 아미노산　서열로 이루어진　폴리펩타이드를　고려하여, 한편　８개의 연속하는 아미노산　서열로 이루어진　폴리펩타이드에는　반응하지　않는　단일　클론　항체인　ＧＲＰ－３Ｄ６－２의　에피토프도, 동시에　검토하였다. 그　결과를　표１에　나타낸다.

[표１]

검토한　４종의　단일　클론　항체는, 표 １에　나타낸 바와 같이, ＰｒｏＧＲＰ의　부분　아미노산　서열로 이루어진　폴리펩타이드를　특이적으로　인식하며, 또　모든　단일　클론　항체가　ＰｒｏＧＲＰ(４２－５３)에　결합하지　않는　것을　확인할　수　있었다.또한　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９는, ＰｒｏＧＲＰ(５５－６６), ＰｒｏＧＲＰ(５７－６８), ＰｒｏＧＲＰ(５４－７８) 및　ＰｒｏＧＲＰ(５４－９０)에　비교적　강하게　결합했다. 또, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７ 및　ＰＧＣＹ２４은, ＰｒｏＧＲＰ(４７－６１), ＰｒｏＧＲＰ(４０－６０) 및　ＰｒｏＧＲＰ(４４－６２)에　비교적　강하게　결합하고, ＰｒｏＧＲＰ(４６－５９)에　매우　약하게　결합하였다. 단일　클론　항체　ＧＲＰ－３Ｄ６－２은, ＰｒｏＧＲＰ(４７－６１), ＰｒｏＧＲＰ(４０－６０) 및　ＰｒｏＧＲＰ(４４－６２)에　비교적　강하게　결합했다.

(４) 실시예１에서 제조한　재조합체　ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)을　１μｇ/ｍＬ의　농도가 되도록　ＰＢＳ로　희석해, ９６ 웰 마이크로타이터플레이트(ＮＵＮＣ, Ｍａｘｉｓｏｒｐ)의　각　웰에　５０μＬ씩　가하여　４℃로　하룻밤　인큐베이션하였다. 각　웰을　２회씩　ＰＢＳ으로　세정하고, ０.５% 카세인 나트륨과　２% 수크로스를　포함한　ＰＢＳ(ｐＨ７.１)를　각　웰에　３５０μＬ씩　가하고, 실온에서　３시간　인큐베이션을　실시하고, 그　후　흡인　제거했다. 반응액(１% ＢＳＡ, ０.０５% 카세인 나트륨, １% 폴리비닐　피롤리돈, １０ ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ, ０.１５Ｍ ＮａＣｌ, ０.０５%Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　０.１Ｍ 인산　나트륨　완충액, ｐＨ７.２)으로, 각　펩타이드를　２μｇ/ｍＬ의　농도로　희석한　용액을, ５０μＬ씩　각　웰에　가하였다. 다음으로, 1 μｇ/ｍＬ의　농도로 희석한　각　단일　클론　항체를　５０μＬ씩　각　웰에　가하고, 실온에서　６０ 분간　인큐베이션을　실시했다. 이　공정으로, 고정화된　ＰｒｏＧＲＰ (３１－９８)과　용액 중의　각　펩타이드가　경합하고, 각　단일　클론　항체와　결합　반응을　한다. 그　후, 각　웰을, ０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　ＰＢＳ(ＰＢＳ－Ｔ)로　５회 세정　후, 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제(ＨＲＰ)로 표지한 항마우스　ＩｇＧ 항체　용액을　１００μＬ씩　각　웰에　첨가하고, 실온에서　２０분간　반응시켰다. ＰＢＳ－Ｔ로 ５회 세정　후, 기질　용액(２ｍｇ/ｍＬ의　오르토　페닐렌　디아민, ３０% 과산화수소수 ０.９μＬ/ｍＬ를　포함한　０.１M구연산　인산　완충액, ｐＨ５.０)을　１００μＬ씩　각　웰에　첨가하고, 실온에서　２０분간　반응시킨　후, ２Ｎ 황산을　１００μＬ씩　각　웰에　첨가하여　반응을　정지시키고, ４９２ ｎｍ에서의　흡광도를　측정하였다. 펩타이드를　첨가하고　있지　않는　웰(컨트롤)을　１００%로 하여　그　저해율(%)을　표２에　나타낸다.

[표 ２]

표 ２에　나타낸 바와 같이, 각　단일　클론　항체의　고정화된　폴리펩타이드에　대한　결합은, 모두　ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)의　존재에서　９０% 이상　저해되고,　또　모두　ＰｒｏＧＲＰ(４２－５３)의　존재에서는　저해되지　않는　것이　확인되었다. 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９에서는, ８０% 이상의　결합　저해가　확인된　폴리펩타이드는, ＰｒｏＧＲＰ(５５－６６), ＰｒｏＧＲＰ(５４－７８) 및　ＰｒｏＧＲＰ(５４－９０)이었다. 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７ 및　ＰＧＣＹ２４에서는, ８０% 이상의　결합　저해가　확인된　폴리펩타이드는, ＰｒｏＧＲＰ(４５－５７), ＰｒｏＧＲＰ(４６－５９), ＰｒｏＧＲＰ(４７－６１), ＰｒｏＧＲＰ(４０－６０) 및　ＰｒｏＧＲＰ(４４－６２)이었다. 덧붙여　단일　클론　항체　ＧＲＰ－３Ｄ６－２로, ８０% 이상의　결합　저해가　확인된　폴리펩타이드는, ＰｒｏＧＲＰ(４６－５９), ＰｒｏＧＲＰ(４７－６１), ＰｒｏＧＲＰ(４０－６０) 및　ＰｒｏＧＲＰ(４４－６２)이며, ＰＧＣＹ１７이나　ＰＧＣＹ２４로　저해　활성이　확인된　ＰｒｏＧＲＰ(４５－５７)에　대한　결합은　약하게　저해되었다.

단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９은, 앞에서(３)　기재한 대로　ＰｒｏＧＲＰ(５５－６６) 및　ＰｒｏＧＲＰ(５７－６８)에　결합하고, 한편　ＰｒｏＧＲＰ(５７－６８)에　ＰｒｏＧＲＰ(５５－６６)보다　강하게　결합하였다. 또 (４)에서는, ＰｒｏＧＲＰ(５５－６６)에서　충분한　저해가　걸리고, ＰｒｏＧＲＰ(５７－６８)에서　약한　저해　반응이　인정되었다. 따라서　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９은, ＰｒｏＧＲＰ의　５５－６８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　것이라고　생각할　수　있다.

또 (３)(４)의　에피토프　해석　결과로부터, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７ 및　ＰＧＣＹ２４는, ＰｒｏＧＲＰ의　４７－５７번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　것이라고　추측된다. 덧붙여　단일　클론　항체　ＧＲＰ－３Ｄ６－２은, ＰＧＣＹ１７이나　ＰＧＣＹ２４보다　Ｃ말단측의　ＰｒｏＧＲＰ의　４７－５９ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프이다고　생각할　수　있다. 또, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ５와　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１２가　인식하는　에피토프는, ８개의 연속하는 아미노산 서열로부터　형성되는　연속　에피토프이다. 나아가　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７ 및　ＰＧＣＹ２４은, ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)의　내부의　８개의 연속하는 아미노산　서열로 이루어진　폴리펩타이드에는　결합하지　않고, ＰｒｏＧＲＰ(４７－５７)의　１１개가　연속하는　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　것이라고　추정되었다. 각　단일　클론　항체가　인식한다고　추정되는　에피토프를, 표３에　나타낸다.

[표 ３]

　

실시예 ３

본　발명의　각　단일　클론　항체와　특허　제３２１０９９４호의　실시예 ６ 및　７에　나타난　단일　클론　항체　ＧＲＰ－３Ｇ２을　이용하여, 혈청 등의　검체　보존 중에서　안정한　ＰｒｏＧＲＰ 부분　펩타이드의　분류를　시도했다. 또한, 단일　클론　항체　ＧＲＰ－３Ｇ２은, 특허　문헌３에　나타나고　있는 바와 같이, ＰｒｏＧＲＰ의　８４－８８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　항체이다.

동결　및　４℃로　각각　１, ４, ７일간　보존한　８ 예의　검체　Ａ~Ｈ에　대해서, 아래와　같은　측정을　실시했다. ９６웰　마이크로　플레이트의　각　웰에, 각　단일　클론　항체(ＰＧＣＹ１７, ＰＧＣＹ９, ＧＲＰ－３Ｇ２)를　４μｇ/ｍＬ의　농도로　１００μＬ 가하고　４℃로　하룻밤　인큐베이션하였다.０.１５Ｍ ＮａＣＬ를　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액(ｐＨ７.３)으로　２회 세정　후, 블로킹액　(０.５% 카세인 나트륨, ２% 수크로스를　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액, ｐＨ７.１)을　３５０μＬ 가해　２시간　정치했다. 블로킹액을　제거　후, 반응액(１%ＢＳＡ, ０.０５% 카세인 나트륨, １% 폴리비닐　피롤리돈, １０ ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ, ０.１５Ｍ ＮａＣｌ, ０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　０.１Ｍ 인산　나트륨　완충액, ｐＨ７.２) １００μＬ와　측정　검체　５０μＬ를　각　웰에　가해　３７℃에서　１시간　반응시켰다. 세정액　(０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액, ｐＨ７.３)으로　５회 세정하고, ＨＲＰ 표지를　한　각　단일　클론　항체(ＰＧＣＹ１２, ＰＧＣＹ１７, ＰＧＣＹ９, ＰＧＣＹ５) 용액　１００μＬ를　첨가해　실온에서　３０분간　반응시켰다. 세정액으로　５회 세정하고, 기질　용액(２ｍｇ/ｍＬ의　오르토　페닐렌　디아민, ３０% 과산화수소수 ０.９μＬ/ｍＬ를　포함한　０.１Ｍ 구연산　인산　완충액, ｐＨ５.０)을　１００μＬ 가하고　３０ 분간　인큐베이션한 후, ２Ｎ 황산을　１００μＬ 가하여　효소　반응을　정지시키고, 마이크로　플레이트　리더로　４９２ ｎｍ(레퍼런스　파장　６２０ ｎｍ)의　흡광도를　측정하였다.

고정화　항체와　표지　항체에　인식　부위가　다른　항체를　조합하는　것으로, 검체 중에　존재하는　ＰｒｏＧＲＰ의　부분　분해물이　가지는　부분　아미노산 서열을　추정할　수　있다. 이번　이용한　항체의　조합을　도 ６에　나타낸다. 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１２과　ＰＧＣＹ１７을　조합하면, 검체 중의　ＰｒｏＧＲＰ 분해물중, ＰｒｏＧＲＰ의　３４－５７ 번째의　아미노산 서열을　가지는　분해물을　측정할　수　있다. 동일하게　ＰＧＣＹ１７과　ＰＧＣＹ９을　조합하면　４７－６８ 번째의　아미노산 서열을　가지는　분해물을, ＰＧＣＹ９과　ＰＧＣＹ５을　조합하면　５５－７６ 번째의　아미노산 서열을　가지는　분해물을, ＰＧＣＹ９과　ＧＲＰ－３Ｇ２을　조합하면　５５－８８ 번째의　아미노산 서열을　가지는　분해물을, ＰＧＣＹ５과　ＧＲＰ－３Ｇ２을　조합하면　７０－８８ 번째의　아미노산 서열을　가지는　분해물을, 각각　측정할　수　있다.

동결보존한　검체에　있어서의　ＰｒｏＧＲＰ 측정치를　１００%로 하여, ４℃에서　１, ４, ７일간　보존한　검체에　있어서의　ＰｒｏＧＲＰ의　측정치를　표 ４에　나타낸다.

[표 ４]

단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９과　ＧＲＰ－３Ｇ２의　조합, 및　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ５과　ＧＲＰ－３Ｇ２의　조합에서는, 대부분의　검체에　대하여, １일　보존에서는　８５%이상의　면역　활성이　보유되고　있지만, ４일　보존에서는　５５~８５%에, 한층　더　７일　보존에서는　모든　검체의　면역　활성이　８０%이하로　저하했다. 이것은, 특허　문헌３에　나타나　있듯이, 보존　기간 동안　혈액 중의　프로테아제 등에　의해, ＰｒｏＧＲＰ이　서열번호１의　Ｌｙｓ－７９의　Ｃ말단 측에서　절단되는　것에　의한　면역　활성의　소실이라고　생각할　수　있다.

단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１２과　ＰＧＣＹ１７의　조합, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７과　ＰＧＣＹ９의　조합, 및　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ５과　ＰＧＣＹ９의　조합에서는, 비교적　안정한　면역　활성이　보유되고　있지만, ＰＧＣＹ１２과　ＰＧＣＹ１７의　조합에서는　８개의 검체　중2개의 검체(Ｂ과　Ｈ)에서　보존에　의해서　면역　활성이　상승해, ７일　보존에서　１１０%를　넘었다.

또, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７과　ＰＧＣＹ９의　조합과　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ５과　ＰＧＣＹ９의　조합을　비교하면, ７일　보존으로, 후자에서　４개의 검체의　면역　활성이　８５%이하로　저하했다. 한편, 전자에서는, ７일　보존에　대해　모두　８０%이상의　면역　활성이　보유되고　있어　８개의 검체 중 ６개의 검체에서　８５%이상의　면역　활성이　보유되고　있었다. 이것은, 특허　문헌３에　기재된　방법에　따라　측정되는　ＰｒｏＧＲＰ의　분해물보다, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７과　ＰＧＣＹ９을　배합하는　것으로　측정되는　분해물이, 검체를　４℃로　보존하는　경우에　대해　열화가　보다　적고, 측정　대상으로　하여　유리한　것을　의미한다.

실시예 ４

특허　문헌３의　실시예４에　기재된　방법에　대하여, 항체를　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ１７과　ＰＧＣＹ９의　조합으로　변경하고, 상기 단일　클론　항체의　조합을　이용한　방법으로　필요하게　되는　측정　시간, 측정　검체량, 측정　감도를　검토했다.

９６ 웰　마이크로　플레이트의　각　웰에, 단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９을　항체　고정액(０.６Ｍ ＮａＣＬ를　포함한　０.１Ｍ 탄산　완충액, ｐＨ９.６)에　５μｇ/ｍＬ이　되도록 용해한　용액을　１２０μＬ 가해　４℃에서　하룻밤　인큐베이션하였다.０.１５Ｍ ＮａＣＬ를　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액(ｐＨ７.３)으로　２회 세정　후, 블로킹액(０.５% 카세인 나트륨, ５% 수크로스를　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액, ｐＨ７.１)를　３５０μＬ 가하고　２시간　정치한 후, 블로킹　했다. 블로킹액을　제거　후, 플레이트를　건조시켰다. 건조　후, 반응액(１% ＢＳＡ, １% 폴리비닐　피롤리돈, ０.０５% 카세인 나트륨, ０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０, ０.１% Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００, ０.１５Ｍ ＮａＣｌ, １０ ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ, ４０μｇ/ｍＬ의　마우스　ＩｇＧ을　포함한　０.１Ｍ 인산　칼륨　완충액, ｐＨ７.０) １００μＬ와　측정　검체　２５μＬ를　각　웰에　가하고　３７℃로　１시간　반응시켰다. 세정액(０.０５%Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액, ｐＨ７.３)으로　５회 세정하고, ＨＲＰ 표지한　ＰＧＣＹ１７의　Ｆａｂ＇을　표지　항체　희석액(２%ＢＳＡ, ０.２５% 폴리비닐　피롤리돈, ０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０, ０.０５% 카세인 나트륨, ０.１５Ｍ ＮａＣｌ, １% 수크로스, ２５μｇ/ｍＬ의　마우스　ＩｇＧ을　포함한　０.１Ｍ 인산　칼륨　완충액, ｐＨ６.５)으로　용해한　액２００μＬ를　첨가하여　실온에서　２０ 분간　반응시켰다. 세정액으로　５회 세정하고, 기질　용액　(２ｍｇ/ｍＬ의　오르토　페닐렌　디아민, ３０% 과산화수소수０.９μＬ/ｍＬ를　포함한　０.１Ｍ 구연산　인산　완충액, ｐＨ５.０)을　１００μＬ 가하고　２０분간　인큐베이션한 후, ２Ｎ 황산　１００μＬ를　가하여　효소　반응을　정지시키고, 마이크로　플레이트　리더로　４９２ ｎｍ(레퍼런스　파장　６２０ ｎｍ)의　흡광도를　측정하였다. 그 표준　곡선을　도 ７에　나타낸다.

그　결과, 본　발명의　방법은, 총 반응　시간이　１００분간으로, 샘플량이　２５μＬ로　소량에도　불구하고, 약２.５ｐｇ/ｍＬ의　ＰｒｏＧＲＰ를　검출할　수　있는　것이　확인되었다. 이　감도는, 정상인　검체 중의　ＰｒｏＧＲＰ 농도를　검출하는데　충분한　감도이다. 또, 특허　문헌３의　실시예４에　기재된　방법과　비교하면, 측정　시간은　１２０분에서　１００분으로　단축되고　측정용　검체량이　1/４로　감소하는 한편　검출　감도는　약 １.７배로　상승한　것이　된다.

실시예 ５

염소항마우스　ＩｇＧ(Ｆｃ)(Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍＭｕｎｏ Ｒｅｓｅａｃｈ) 항체를　０.５Ｍ ＮａＣＬ를　포함한　０.１Ｍ 탄산　완충액(ｐＨ９.６)에　２.５μｇ/ｍＬ의　농도로　용해한　용액　５０μＬ를　９６ 웰　마이크로플레이트의　각　웰에　가하고　４℃로　하룻밤　인큐베이션하였다. ０.１５Ｍ ＮａＣＬ를　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액(ｐＨ７.３)으로　２회 세정　후, 블로킹액(０.５% 카세인 나트륨, ２% 수크로스를　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액, ｐＨ７.１)를　３５０μＬ 가하여　２시간　정치　했다. 블로킹액을　제거　후, 실온에서　건조시켰다. 각　단일　클론　항체를　반응액(１% ＢＳＡ, ０.０５% 카세인 나트륨, １% 폴리비닐　피롤리돈, １０ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ, ０.１５Ｍ ＮａＣｌ, ０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　０.１Ｍ 인산　나트륨　완충액, ｐＨ７.２)에　５μｇ/ｍＬ의　농도로　희석한　액１００μＬ를　각　웰에　가하고　３７℃로　２시간　반응시켰다. 이　반응으로, 고정화된　염소항마우스　ＩｇＧ(Ｆｃ)에, 각　단일　클론　항체의　Ｆｃ 부분이　결합하게　된다.

다음으로, 세정액(０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액, ｐＨ７.３)으로　각　웰을　５회 세정하고, 반응액(１% ＢＳＡ, ０.０５% 카세인 나트륨, １% 폴리비닐피롤리돈, １０ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ, ０.１５Ｍ ＮａＣｌ, ０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　０.１Ｍ 인산　나트륨　완충액, ｐＨ ７.２) １００μＬ와　비오틴화한　재조합체　ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)(０ｐｇ/ｍＬ, ２００ ｐｇ/ｍＬ, １０００ ｐｇ/ｍＬ) 용액　５０μＬ를　각　웰에　가하고, ３７℃에서　１시간　반응시켰다. 이　반응으로, 각　단일　클론　항체가, 비오틴화한　재조합체　ＰｒｏＧＲＰ(３１－９８)와　결합한다.

세정액(０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액, ｐＨ７.３)으로　４회 세정하고, 반응액(１% ＢＳＡ, ０.０５% 카세인 나트륨, １% 폴리비닐피롤리돈, １０ ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ, ０.１５Ｍ ＮａＣｌ, ０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　０.１Ｍ 인산　나트륨　완충액, ｐＨ７.２)으로　희석한　ＨＲＰ 표지를　한　아비딘　Ｄ(Ｖｅｃｔｏｒ) 용액　１００μＬ를　가하고, 실온에서　３０분간　반응시켰다. 세정액으로　４회 세정하고, 기질　용액(２ｍｇ/ｍＬ의　오르토　페닐렌　디아민, ３０% 과산화수소수 ０.９μＬ/ｍＬ를　포함한　０.１Ｍ 구연산　인산　완충액, ｐＨ５.０) １００μＬ를　가하여　３０분간　인큐베이션하고, ２Ｎ 황산　１００μＬ를　가해　효소　반응을　정지시켰다. 마이크로　플레이트　리더로　４９２ ｎｍ(레퍼런스　파장　６３０ ｎｍ)의　흡광도를　측정했다. 그　결과를, 도 ８에　나타낸다.

이러한　단일　클론　항체　중에서, ＰｒｏＧＲＰ(５５－６８)에　결합하는　단일　클론　항체　ＰＧＣＹ９이　가장　높은　반응성을　나타내, 특허　문헌３의　실시예４에서　고정화에　이용한　단일　클론　항체　ＧＲＰ－３Ｄ６－２와　비교해도, 약３.３배　높은 값을　나타냈다. ＰｒｏＧＲＰ(４７－５７)에　결합하는　ＰＧＣＹ１７ 및　ＰＧＣＹ２４은, 거의　같은　반응성을　나타내고, ＰＧＣＹ１７보다　조금　Ｃ말단측인　ＰｒｏＧＲＰ(４７－５９)을　인식하는　ＧＲＰ－３Ｄ６－２은, ＰＧＣＹ１７보다　높은　반응성을　나타냈다. 또, ＰｒｏＧＲＰ(７０－７６) 근방을　인식하는　ＰＧＣＹ５ 및　ＧＲＰ－２Ｂ１０은, 이러한　단일　클론　항체　중에서　낮은　반응성을　나타내고, 그것들보다　더　Ｃ말단측인　ＰｒｏＧＲＰ(８４－８８)을　인식하는　ＧＲＰ－３Ｇ２은, 비교적　높은　반응성을　나타냈다. 이러한　단일　클론　항체의　인식　부위와　반응성으로부터, ５５ 번째로부터　６８ 번째까지의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　단일　클론　항체를　사용하는　것으로써, 고감도로　측정　검체중의　ＰｒｏＧＲＰ 또는　그의 분해물을　포착할　수　있다고　생각할　수　있다. 또, ＰＧＣＹ５ 및　ＧＲＰ－２Ｂ１０의　반응성이　낮은　것으로부터, ７０번　이후의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　단일　클론　항체는　반응성이　낮다고　생각할　수　있어　５５ 번째로부터　６９ 번째까지의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　단일　클론　항체를　사용하는　것에　의해서, 고감도로　ＰｒｏＧＲＰ 또는　그의 분해물을　포착할　수　있다고　생각할　수　있다.

실시예 ６

(１) 각　단일　클론　항체의　비오틴화

각　단일　클론　항체０.５ｍｇ을　１ｍＬ의　０.１Ｍ 인산　나트륨　완충액(ｐＨ８.０)에　첨가하고, 디메틸포름아미드에　용해한　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ(ＰＩＥＲＣＥ)을　몰비　ＩｇＧ：Ｂｉｏｔｉｎ=１：２０이　되도록 첨가하여, 실온에서　６０ 분간　완만하게　교반했다. １.５Ｍ 글리신　용액(ｐＨ８.９)을　１００μＬ첨가하고, 실온에서　１０ 분간　완만하게　교반했다. ＰＢＳ을　이동상으로서　겔　여과를　실시해, 비오틴화　단일　클론　항체를　얻었다.

(２) 각　단일　클론　항체의　조합의　검토

９６웰　마이크로　플레이트의　각　웰에, 각　단일　클론　항체를　５μｇ/ｍＬ의　농도로　항체　고정액(０.５Ｍ ＮａＣＬ를　포함한　０.１Ｍ 탄산　완충액, ｐＨ９.６)에　용해한　용액　１００μＬ를　가하고　４℃에서　하룻밤　인큐베이션하였다. ０.１５Ｍ ＮａＣＬ를　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액(ｐＨ７.３)으로　２회 세정　후, 블로킹액(０.５% 카세인 나트륨, ２% 수크로스를　포함한　１０ ｍＭ 인산　완충액, ｐＨ７.１)를　３５０μＬ 가하고　２시간　정치해　블로킹　했다. 블로킹액을　제거　후, 반응액(１% ＢＳＡ, ０.０５% 카세인 나트륨, １% 폴리비닐피롤리돈, １０ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ, ０.１５Ｍ ＮａＣｌ, ０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　０.１Ｍ 인산　나트륨　완충액, ｐＨ７.２) １００μＬ와　재조합체　ＰｒｏＧＲＰ(０, １００, ５００, ２０００ ｐｇ/ｍＬ)을　５０μＬ씩　각　웰에　가해　３７℃로　１시간　반응시켰다. 세정액(０.０５% Ｔｗｅｅｎ２０을　포함한　１０ｍＭ 인산　완충액, ｐＨ７.３)으로　５회 세정하고, 비오틴화한　각　단일　클론　항체를　１μｇ/ｍＬ의　농도로　반응액에　용해시킨　것을　１００μＬ가해　실온에서　３０ 분간　반응시켰다. 반응액으로　희석한　ＨＲＰ 표지를　한　아비딘　Ｄ(Ｖｅｃｔｏｒ) 용액　１００μＬ를　첨가하고, 실온에서　３０ 분간　반응시켰다. 세정액으로　５회 세정하고, 기질　용액(２ｍｇ/ｍＬ의　오르토　페닐렌　디아민, ３０% 과산화수소수０.９μＬ/ｍＬ를　포함한　０.１Ｍ 구연산　인산　완충액, ｐＨ５.０) １００μＬ를　가하고　２０분간　인큐베이션한 후, ２Ｎ 황산을　１００μＬ 가해　효소　반응을　정지시켰다. 마이크로플레이트　리더로　４９２ｎｍ(레퍼런스　파장　６００ ｎｍ)의　흡광도를　측정했다. 그　반응성을, ５단계(높은　순서로부터,☆；매우　높은　반응성,◎；높은　반응성, 0；중간　정도의　반응,△；약간의 반응성,×；반응하지　않음)로　나누어　표５에　나타냈다.

[표 ５]

표５에　나타낸 바와 같이, 우선, 동일　단일　클론　항체끼리　및　인식하는　에피토프가　같거나　이것을　제시하는　아미노산 서열이　크게　서로　겹치고　있다고　생각되는　항체끼리는, 반응성을　확인할　수　없었다. ＰＧＣＹ９을　고정화했을　경우, 비오틴화　항체로서는, ＰＧＣＹ１７ 및　ＰＧＣＹ２４이　가장　반응성이　높고, 다음으로　ＧＲＰ－３Ｇ２ 및　ＰＧＣＹ５으로, 그　다음으로　ＧＲＰ－２Ｂ１０ 및　ＰＧＣＹ１２이며, ＧＲＰ－３Ｄ６－２에서는　반응성은　확인할　수　없었다.

ＰＧＣＹ１７을　고정화했을　경우, 비오틴화　항체로서는　ＰＧＣＹ９이　가장　반응성이　높고, 다음으로　ＧＲＰ－３Ｇ２, ＰＧＣＹ５, ＧＲＰ－２Ｂ１０ 및　ＰＧＣＹ１２이며, ＰＧＣＹ２４ 및　ＧＲＰ－３Ｄ６－２의　반응성은　확인할　수　없었다.

ＰＧＣＹ２４을　고정화했을　경우, 비오틴화　항체로서는　ＰＧＣＹ９이　중간　정도의　반응성을　나타냈지만, 다른　항체는　거의　반응성을　확인할　수　없었다.

ＧＲＰ－３Ｄ６－２을　고정화했을　경우, 비오틴화　항체로서는　ＧＲＰ－２Ｂ１０보다, ＧＲＰ－３Ｇ２, ＰＧＣＹ５, 및　ＰＧＣＹ１２이　약간　높은　반응성을　나타냈다.

ＰＧＣＹ９을　비오틴화　항체로서　이용했을　경우, 고정화　항체로서　ＰＧＣＹ１７이　가장　높은　반응성을　나타내고, 다음으로　ＧＲＰ－３Ｇ２, 그　다음으로　ＰＧＣＹ２４, ＰＧＣＹ５이　높았다.

따라서, 고정화　항체로　ＰｒｏＧＲＰ(５５－６８)에　결합하는　ＰＧＣＹ９을　이용하고　검출측의　항체인　표지　항체로　ＰｒｏＧＲＰ(４７－５７)에　결합하는　ＰＧＣＹ１７이나　ＰＧＣＹ２４을　이용하거나, 또는 그　반대로, 고정화　항체로　ＰＧＣＹ１７이나　ＰＧＣＹ２４을　이용하고　검출측의　항체인　표지　항체로　ＰＧＣＹ９을　이용하는　것으로, ＰｒｏＧＲＰ 또는　그의 분해물의　고감도인　측정을　실시하는　것이　가능하다.

본　발명의　방법은, 새롭게　확인된, 검체 중에서도　안정하게　보존되고　있는　ＰｒｏＧＲＰ이　있는　종의　분해물 상의　에피토프를　측정　대상으로　하는　것에　의해서, 종래의　측정법과　동등의　검출　감도를　얻을　수　있을뿐만 아니라 채취　후의　검체　취급방법에　영향을　거의 받지 않아 재현성이　높은　측정치를　얻을　수　있는　등, 혈중　ＰｒｏＧＲＰ의　검출에　유효하다.

독립　행정법인　산업기술　종합　연구소　특허　생물　기탁　센터 ＦＥＲＭＢＰ－１０９９１ 20080805 독립　행정법인　산업기술　종합　연구소　특허　생물　기탁　센터 ＦＥＲＭＢＰ－１０９９２ 20080805

<110> Advanced Life Science Institute, Inc. <120> Monoclonal antibody against pro-gastrin rereasing peptide and use thereof <130> XJU9947544WO <150> JP2007-278843 <151> 2007-10-26 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 98 <212> PRT <213> Human <400> 1 Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro 1 5 10 15 Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Gly Lys Lys Ser Thr 20 25 30 Gly Glu Ser Ser Ser Val Ser Glu Arg Gly Ser Leu Lys Gln Gln Leu 35 40 45 Arg Glu Tyr Ile Arg Trp Glu Glu Ala Ala Arg Asn Leu Leu Gly Leu 50 55 60 Ile Glu Ala Lys Glu Asn Arg Asn His Gln Pro Pro Gln Pro Lys Ala 65 70 75 80 Leu Gly Asn Gln Gln Pro Ser Trp Asp Ser Glu Asp Ser Ser Asn Phe 85 90 95 Lys Asp <210> 2 <211> 294 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (1)..(294) <400> 2 gtc ccg ctg cct gcg ggc gga ggg acc gtg ctg acc aag atg tac ccg 48 Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro 1 5 10 15 cgc ggc aac cac tgg gcg gtg ggg cac tta atg ggg aaa aag agc aca 96 Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Gly Lys Lys Ser Thr 20 25 30 ggg gag tct tct tct gtt tct gag aga ggg agc ctg aag cag cag ctg 144 Gly Glu Ser Ser Ser Val Ser Glu Arg Gly Ser Leu Lys Gln Gln Leu 35 40 45 aga gag tac atc agg tgg gaa gaa gct gca agg aat ttg ctg ggt ctc 192 Arg Glu Tyr Ile Arg Trp Glu Glu Ala Ala Arg Asn Leu Leu Gly Leu 50 55 60 ata gaa gca aag gag aac aga aac cac cag cca cct caa ccc aag gcc 240 Ile Glu Ala Lys Glu Asn Arg Asn His Gln Pro Pro Gln Pro Lys Ala 65 70 75 80 ctg ggc aat cag cag cct tcg tgg gat tca gag gat agc agc aac ttc 288 Leu Gly Asn Gln Gln Pro Ser Trp Asp Ser Glu Asp Ser Ser Asn Phe 85 90 95 aaa gat 294 Lys Asp <210> 3 <211> 98 <212> PRT <213> Human <400> 3 Val Pro Leu Pro Ala Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Pro 1 5 10 15 Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Gly Lys Lys Ser Thr 20 25 30 Gly Glu Ser Ser Ser Val Ser Glu Arg Gly Ser Leu Lys Gln Gln Leu 35 40 45 Arg Glu Tyr Ile Arg Trp Glu Glu Ala Ala Arg Asn Leu Leu Gly Leu 50 55 60 Ile Glu Ala Lys Glu Asn Arg Asn His Gln Pro Pro Gln Pro Lys Ala 65 70 75 80 Leu Gly Asn Gln Gln Pro Ser Trp Asp Ser Glu Asp Ser Ser Asn Phe 85 90 95 Lys Asp

Claims (10)

1. 서열번호１에　나타나는　아미노산 서열의　４７－６８ 번째의　아미노산 서열에　의해서　제시되는　에피토프를　인식하는　２종　이상의　다른　항체를　이용하여 가스트린　방출　펩타이드　전구체　및/또는　그의 분해물을　측정하는　방법으로서,
   상기 2종 이상의 다른 항체 중 적어도 하나가 기탁 번호 ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９９１로 기탁된 하이브리도마 ＧＣＹ９가 생산하는 단일 클론 항체 또는 기탁 번호 ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９９２로 기탁된 하이브리도마 ＧＣＹ１７이 생산하는 단일 클론 항체인 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 샌드위치　면역　측정법인 방법.
   
3. 기탁　번호　ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９９１로　기탁된　하이브리도마　ＧＣＹ９가　생산하는 단일　클론　항체.
   
4. 기탁　번호　ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９９２로　기탁된　하이브리도마　ＧＣＹ１７이　생산하는　단일　클론　항체.
   
5. 기탁　번호　ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９９１로　기탁된　하이브리도마　ＧＣＹ９.
   
6. 기탁　번호　ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９９２로　기탁된　하이브리도마　ＧＣＹ１７.
   
7. 제3항 또는 제4항 중 어느 한 항의 단일 클론 항체를 포함하는, 가스트린　방출　펩타이드　전구체 또는 그의 분해물을　측정하기　위한　키트.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 키트는 암의　진단　또는　치료　효과의　모니터링을　수행하기　위한　것인　키트.
9. 삭제
10. 삭제

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