WO2006117994A1

WO2006117994A1 - ガストリン放出ペプチド前駆体に対する抗体およびその使用

Info

Publication number: WO2006117994A1
Application number: PCT/JP2006/307808
Authority: WO
Inventors: Katsumi Aoyagi
Original assignee: Advanced Life Science Institute, Inc.
Priority date: 2005-04-13
Filing date: 2006-04-13
Publication date: 2006-11-09
Also published as: CN101160526A; ATE511647T1; KR101282811B1; CA2604608C; US7927814B2; EP1876445A4; US20080182281A1; ES2364185T3; EP1876445B1; JP4950880B2; CN101160526B; EP1876445A1; KR20080003325A; JPWO2006117994A1; CA2604608A1

Abstract

　測定値のばらつきや検体の取り扱いなどの作業上の制約などの問題を持たない、新しいProGRPの測定法を提供する。　詳しくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４０－７５番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドを認識する２種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体もしくはその分解物を測定する方法である。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４０－７９番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドを認識する２種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び／又はその分解物を測定する方法も提供する。　本発明の方法は、従来の測定法と同等の検出感度が得られることに加え、採取後の検体の取扱いが容易となり、再現性の高い測定値が得られるなどの利点を有する。

Description

明細書

ガストリン放出ペプチド前駆体に対する抗体およびその使用

技術分野

[0001] 本発明は、ガストリン放出ペプチド前駆体に対する抗体およびその使用に関するものであり、肺小細胞がんを含む各疾病の早期発見や治療のモニタリング、再発のモニタリング等に広く利用されるものである。

背景技術

[0002] わが国における死因の第 1位は悪性新生物であり、その中でも肺癌の死亡率は、男性では胃癌を抜いて第 1位、女性でも第 3位となっており、年々上昇する傾向にある。肺癌は病理組織学的に以下の主に 4つの組織型に分類されている。すなわち、肺門部に発生する肺扁平上皮癌（squamous-cell carcinoma)と肺小細胞癌（smal卜 ce 11 lung carcinoma : SCLC)、肺野部に発生する肺腺癌（adenocarcinoma)と肺大細胞 (large-cell lung carcinoma;で、ある。

[0003] 特に肺小細胞癌は、増殖が速く早期に遠隔転移を起こすため、初診時ではすでに全身性に転移した進行癌で発見されることが多レ、。この型の癌の治癒率については、病変が一側の肺野に限局している肺小細胞癌の限局型（limited disease : LD)患者の治癒率は約 20%であるが、両肺ゃ他の臓器に転移した進展型（extensive disease ： ED)の患者では、事実上治癒は難しいと言われてレ、る。

[0004] また、肺小細胞癌は抗癌剤に感受性が高いため、化学療法が治療法の第一選択とされるのに対して、肺非小細胞癌（non-smal卜 cell lung carcinoma : non- SCLC)は、化学療法の奏功率が低いために外科療法が治療法の第一選択とされている。

[0005] そのため、肺小細胞癌は肺癌の中でも特に早期発見 ·治療が必要な癌であり、そのためにも肺小細胞癌と肺非小細胞癌を鑑別診断することは、治療方針を決定する上で極めて重要である。

[0006] 肺癌を発見する方法のひとつに喀痰検査がある。しかし、喀痰検査は主に肺扁平上皮癌の検査には好適である力肺小細胞癌に対する陽性率は低いという問題がある。また、 X線撮影法も肺癌の発見に広く用いられている方法であるが、肺門部に生じる肺扁平上皮癌や肺小細胞癌に対しては、肺門部が心臓の影となるので癌組織の陰影が非常に撮影され難いという問題がある。また、肺小細胞癌については、肺野の異常陰影を呈する患者に対して喀痰細胞診、胸部 X線単純撮影、 CTスキャン、気管支内視鏡等を用いても、この型の肺癌の早期発見は容易ではないとされている。

[0007] また、癌を診断するための検查方法の幾つか、例えば放射線照射やバイオプシー、気管支内視鏡などは、患者に対して苦痛を与え、また高価な機器や熟練した技術などを必要とする。

[0008] そのため、より簡便な血液検査によって治癒可能な時期に癌を高率に診断することを可能とする、腫瘍マーカーの研究が行われている。今日では、癌疾患の発見、診断、病状経過のモニタリングの指標、再発診断等に 30以上の腫瘍マーカーが利用されている。

[0009] 肺癌は組織型が多彩であるため、全ての型の肺癌の発見あるいは診断に有効な腫瘍マーカーはいまだ報告されていなレ、。そのため今日では、肺癌の組織型ごとに有効なマーカーが選択され、使用されている。

[0010] 例えば、肺腺癌に対しては癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen : CEA)ゃシァリル Lex-i抗原が、肺扁平上皮癌に対しては扁平上皮癌関連抗原（squamous-cell ca rcinoma related antigen : SCC)が、肺小細胞癌に対しては神経特異エノラーゼ（neur on-specific enolase : NSE)など力主に選択、使用されている。

[0011] し力 NSEは、（1)治癒可能な早期癌に対する陽性率が低いこと、（2)治療による一過性の測定値の上昇が認められること、（3)採血時の溶血により測定値が上昇すること、（4)肺小細胞癌患者と健常人との測定値差が小さいこと、などの欠点があり、肺小細胞癌に対する有効な腫瘍マーカーであるとは必ずしも言えなかった。

[0012] ガストリン放出ペプチド（gastrin- releasing peptide： GRP)は、 McDonaldらが 1978年にブタ胃組織から単離した、ガストリン分泌促進作用を有する 27個のアミノ酸よりなる脳腸ペプチドである。ヒトにおいても GRPの存在は確認されており、ヒト GRPをコードする遺伝子も 1984年にクローユングされている。

[0013] 国立がんセンターの山口らは、神経内分泌細胞に由来すると考えられている肺小細胞癌の生物学的特性の研究過程で、 ACTH (adrenocorticotropic hormone)や力ルシトニンなどを含む 15種類以上の脳腸ホルモンを測定し、 GRPが最も高頻度にかつ高濃度に培養肺小細胞癌株で積極的に分泌されることを明らかにした (非特許文献 1)。さらに、血中 GRPの濃縮法を組み合わせたラジオィムノアッセィ（RIA)を構築し、肺小細胞癌患者は健康な人に較べ高い血中 GRP濃度を呈することを明らかにした。しかし、 GRPは血中で速やかに分解されるため血中濃度が低また上記ァッセィは煩雑な濃縮操作を必要としたため、臨床応用が困難であった。

[0014] その後の研究により、各種の細胞において alternative RNA splicingによって 3種の GRP前駆体 (ProGRP)が産生されることが明らかにされた（非特許文献 2)。これら 3 種の ProGRPは、その 1 98番目においてアミノ酸配列が共通している一方、 99番目以降は alternative RNA splicingによって、互いに異なるアミノ酸配列となっている。この共通する 1〜98番目のアミノ酸配列を配列番号 1に示す。以後、特に断らない限り、本発明における ProGRP、その部分配列、分解物等のアミノ酸残基の番号表示は、配列番号 1のアミノ酸配列のそれをもって表すこととする。

[0015] 3種の ProGRPの 1— 27番目のアミノ酸配列は、ガストリン分泌促進活性をもつ成熟 GRPのそれと同一である。これら 3種の前駆体は、いずれもホルモン前駆体切断酵素によって、 1— 27番目のアミノ酸配列からなる成熟型 GRPと、 31番目以降のァミノ酸配列からなるガストリン分泌促進活性をもたない ProGRPの分解物である C末端側フラグメント（ProGRP-Cfrag)とに分解される。

[0016] Hoistら（非特許文献 3)は、 ProGRPの 42— 53番目のアミノ酸配列からなるペプチド

(以下、 ProGRP (42-53)とする）に対する抗血清を用いたラジオィムノアッセィ (RIA) 法によって、肺小細胞癌患者の血漿中の ProGRPまたは ProGRP-Cfragのレベルが高いことを報告した。しかし、この方法では沈殿抽出操作が必要であり、感度も十分ではな力つた。また、この様な 11アミノ酸残基からなる短鎖のペプチドで免疫した場合には、 ProGRPの立体構造ェピトープを認識する抗体は誘導されないと考えられる

[0017] 三宅らは、 ProGRPが GRPよりも血中で安定性が高いこと、ならびに 3種の ProGRP の共通部分である 31— 98番目のアミノ酸配列が他の蛋白質のアミノ酸配列に対して相同性を示さないことに着目し、同アミノ酸配列からなる組換え体ペプチド（以下、 ProGRP (3ト 98)とする）を抗原として得た高力価の抗血清を用いて、沈殿抽出操作が不要の高感度 RIA法を構築した (非特許文献 1)。この方法により、 ProGRPは GRP と同様に優れた腫瘍マーカーになることが示された。

[0018] しかし、この方法は抽出操作を必要としない点で有利である力測定に 4日間を必要とすることや感度が ΙΟρΜ (77. 3pg抗原/ mL)と十分でないため、健常人血清中の ProGRP値を測定することはできず、臨床応用には至っていない。

[0019] また、前述した Hoistら及び三宅らの RIA法はインヒピション法であるため、 ProGRP の断片の一部でも抗原性を有していれば測定可能であるが、その感度はサンドイツチ法に比べて低ぐ高感度化が必要な ProGRP測定法の臨床応用は困難である。すなわち、 ProGRPの検出を臨床的に行うためには、検出の感度を高めることは必須であり、特にサンドイッチ法で利用可能な抗体が必要となる。

[0020] 山口、青柳らは、 ProGRPの肺小細胞癌用腫瘍マーカーとしての臨床応用を目的として、 enzyme— linked immunosorbent assay (ELISA)を原理とする、サンドイッチ法を用いた簡便で高感度な ProGRP測定試薬を開発した (特許文献 1)。この方法は約 2時間で結果を与え、また高い感度（2pg/mL)を有していることから、現在幅広く臨床応用されており、肺小細胞癌において NSEよりも高い感度、特異性を有していることが明らかとなっている。

[0021] また、この測定法を用いて、肺小細胞癌以外にも、神経内分泌腫瘍（甲状腺髄様癌など）、神経内分泌腫瘍的性格を示す癌 (食道小細胞癌、膝小細胞癌、前立腺小細胞癌など）でも血清 ProGRP値が上昇することが明らかとなり、今後これらの腫瘍の早期発見や治療のモニタリングなどにも応用されてレ、くと思われる。

[0022] しかしながら、 ProGRPの血中での安定性は、 GRPのそれと比較した場合には高い力一般的な他の腫瘍マーカーに比べて、測定値のばらつきが認められる。そのため、 ProGRPを検出対象とした方法では、測定用検体は、採血後すみやかに測定時まで凍結保存されなければならないという制約がある（非特許文献 4)。

[0023] 特許文献 1 :特許第 3210994号公報

特許文献 2：特開平 6-98794号

非特許文献 1： Cancer Research, 1994年、第 54卷、第 2136— 2140頁非特許文献 2 : Eliotら、 Mol. Endo.， 1987年、第 1卷、第 224— 232頁非特許文献 3 : Hoist J. Clin. Oncol.,第 7卷、第 1831— 1838頁、 1989年

非特許文献 4 :臨床検查. 39卷； 981-986， 1995

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0024] 本発明は、 ProGRPを測定対象としながらも、従来法における測定値のばらつきや検体の凍結保存という作業上の制約などの問題を持たなレ、、新しい ProGRPの測定法を提供するものである。

課題を解決するための手段

[0025] 本発明は、 ProGRPの分解物の中に血液検体において安定に保たれているものがあることを見出したことに基づき、力かる安定な分解物に存するェピトープを測定対象とすることで、上記の課題を解決するものである。具体的には、以下の各発明が提供される。

[0026] (1)配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 40— 75番目の部分アミノ酸配列からなるぺプチドを認識する 2種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び/又はその分解物を測定する方法。

[0027] (2)配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 40— 79番目の部分アミノ酸配列からなるぺプチドを認識する 2種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び Z又はその分解物を測定する方法。

[0028] (3)サンドイッチ免疫測定法である、（1)又は（2)に記載の方法。

[0029] (4)配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 40— 60番目の部分アミノ酸配列からなるぺプチドには結合し、かつ配列番号 1に示されるアミノ酸配列上の任意の 8連続アミノ酸配列からなるペプチドには結合しない抗体。

[0030] (5)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 40— 60番目の部分アミノ酸配列からなるぺプチドには結合し、 31—53番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドには結合しなレ、饥体。

[0031] (6)寄託番号 FERM BP— 08669で寄託されたハイブリドーマ 3D6— 2が産生する、（4)または（5)に記載の抗体。 [0032] (7)寄託番号 FERM BP 08669で寄託されたハイブリドーマ 3D6 _ 2。

[0033] (8) 2種以上の異なる抗体の少なくとも一方が（4)〜（6)のレ、ずれかに記載の抗体である、（1)又は（2)に記載の方法。

[0034] (9) 2種以上の異なる抗体の少なくとも一方が（4)〜（6)のレ、ずれかに記載の抗体であり、他方が配列番号 1のアミノ酸配列 71— 75番目の部分アミノ酸配列からなるぺプチドを認識する抗体である、（1)又は（2)に記載の方法。

[0035] (10) (4)〜（6)のいずれかに記載の抗体を含む、ガストリン放出ペプチド前駆体もしくはその分解物を測定するためのキット。

(11)癌の診断を行うためのキットである、 (10)に記載のキット。

発明の効果

[0036] 本発明の方法は、新たに確認された、検体中でも安定に保存されている ProGRPのある種の分解物上のェピトープを測定対象とすることによって、従来の測定法と同等の検出感度が得られることに加え、採取後の検体の取扱い方に影響を受けに《なり、再現性の高い測定値が得られる、などの効果を奏する。

図面の簡単な説明

[0037] [図 1]図 1は、マルチピンペプチドで合成した 8連続アミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体の反応性を示す。横軸は ProGRP(31-98)の 8連続アミノ酸配列を、縦軸は吸光度を示す。（A)は GRP— 3D6— 2、（B)は GRP— 3G2、（C)は GRP 2B 10の反応性を示す。

[図 2]アミノ酸番号 40— 75番目の部分ペプチドに結合する抗体である 3D6— 2と 2B 10を用いた、測定法の標準曲線を示す。横軸は ProGRPの濃度を、縦軸は吸光度を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0038] 本発明は、検体中に存在する、 ProGRPあるいは ProGRP-Cfragよりも血中での保存安定性が高い ProGRPの分解物（ProGRP-Cdel)に残存するェピトープを、免疫学的測定法の対象とするものである。

[0039] この ProGRP-Cdelは、従来法の測定対象である ProGRP-Cfragの C末端側の幾つかのアミノ酸残基が失われた、より鎖長の短いペプチドであり、 ProGRPの 40— 75番目のアミノ酸残基上に残存するェピトープを含むペプチドである。おそらくは、血液中に存在するプロテアーゼによって ProGRP-Cfragの 75〜83番目のアミノ酸残基のいずれかの残基の C末端側が切断されることで、 ProGRP-Cdelが生じるものと推察される

[0040] この ProGRP-Cdelについてその構造を質量分析装置を用いて確認を行ったところ、

79番目の Lysの C末端側で切断されていることが確認された。従って、 ProGRP-Cdel は配列番号 1の 40— 79番目のアミノ酸残基上に残存するェピトープを含むペプチドでもあり、従ってこれらのェピトープを認識する抗体もまた、本発明で利用することができる。

[0041] ProGRP-Cdelと ProGRP-Cfragの間の構造上の相違は、 C末端側の 20前後のァミノ酸残基の有無に過ぎないが、 ProGRPもしくはその分解物を免疫学的に測定するための対象蛋白質としての意義は大きく異なる。従来法の方法では、前記 C末端側の 2 0数残基の部分を認識する抗体が使用されている。そのため、この抗体は、かかる部分を失った ProGRP-Cdelをもはや認識し、捕捉することができない。この C末端側の部分切断の進行は、検体自体あるいは検体採取後の保存状態やその期間によって影響を受け、このこと力従来法における検出シグナルが検体の保存状態やその期間によつて影響を受けることの原因であると推察される。

[0042] 一方、本発明では、 ProGRP-Cdel上に存在するェピトープを認識する抗体を使用するものであり、検体中に ProGRPや ProGRP-Cfragが存在していても、またその部分切断が生じても、安定して ProGRPもしくはその分解物を認識することができるので、検体の保存状態やその期間によって検出シグナルは影響を受けることが少なぐ再現性の高い測定が可能となるのである。

[0043] 本発明は、 ProGRP-Cdel上のェピトープを測定対象とするために、 ProGRPの 40— 75番目のアミノ酸配列からなるペプチド（ProGRP(40-75))上に存在するェピトープを認識することができる抗体から選択された、 ProGRP(40_75)上に存在する 2種以上の異なるェピトープをそれぞれ別個に認識する異なる抗体を使用し、サンドイッチ免疫測定法によって ProGRPもしくはその分解物を検出する方法である。また本発明は、 P roGRPの 40— 79番目のァミノ酸配列からなるぺプチド（？^〇1^(40-79))上に存在するェピトープを認識することができる抗体から選択された、 ProGRP(40-79)上に存在する 2種以上の異なるェピトープをそれぞれ別個に認識する異なる抗体を使用し、サンドイッチ免疫測定法によって ProGRPもしくはその分解物を検出する方法である。

[0044] 特に、本発明では、 ProGRP-Cfragから切断除去される C末端側の部分配列上のェピトープを認識する抗体を含まず、 ProGRP-Cdel上のェピトープを認識する抗体のみを使用したサンドイッチ免疫測定法の利用が好ましレ、。

[0045] サンドイッチ ELISA法の基本操作は、「超高感度免疫測定法」（石川栄治、 1993年、学会出版センター）あるいはその他種々の実験手法の解説書に記載されている方法に準じて行えばよぐ本発明の実施に特有の操作は特に必要とはされないが、次のような工程で行うことができる。

[0046] すなわち、 ProGRPもしくはその分解物は、（l) ProGRP(40_75)及び/又は ProGRP( 40-79)と結合する第一の抗体及び検体中の ProGRPもしくはその分解物とを反応させる工程、（2)該抗体により捕捉された ProGRPもしくはその分解物を、（1)の抗体とは異なるが ProGRP(40-75)及び/又は ProGRP(40-79)と結合する第二の抗体と反応させる工程、及び（3) (2)により生ずる免疫複合体を検出する工程を含む測定法によつて検出すること力 Sできる。

[0047] ProGRPもしくはその分解物と結合する抗体は、 ProGRP(40_75)及び/又は ProGRP (40-79)と結合する抗体のみを選択して使用することが好ましレ、が、再現性の高レ、測定値を再現することができる範囲内で、力かる抗体以外の抗体が測定系に含まれていてもよい。

[0048] 本発明で特に好ましい抗体の組み合わせは、 ProGRPの 40— 60番目のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体 GRP_ 3D6— 2と 71— 75番目のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体 GRP— 2B10の組み合わせである。モノクローナル抗体 G RP— 3D6— 2は、 ProGRPの 40— 60番目のアミノ酸配列を認識する力同時に同ァミノ酸配列中の任意の 8連続アミノ酸配列からなるペプチドは認識しなレ、。このこと力ら、モノクローナル抗体 GRP— 3D6— 2は、 ProGRPの 40— 60番目のアミノ酸配列からなる構造ェピトープを認識するものと考えられる。モノクローナル抗体 GRP— 2B 10 は、 71— 75アミノ酸残基から構成される配列ェピトープを認識していると推察される [0049] 上記の 2種類のモノクローナル抗体を用いた本発明の方法の検出感度は 4. 5pg/ mlである。これは従来のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いた ProGRP(3 1-98)を測定する方法とほぼ同等の感度であり、健常人の血中 ProGRPの測定に十分に使用することのできる感度である。

[0050] 本発明で使用する抗体は、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ニヮトリ、ャギ、ヒッジ、ゥシなどの実験動物を免疫して得ることができる。免疫に用いる抗原は、 ProGRP(40 -75)及び/又は ProGRP(40-79)の利用が好ましいが、 ProGRP(31— 98)のペプチドを用いることもでき、免疫後に ProGRP(40-75)及び/又は ProGRP(40-79)を使って所望の抗体を選択することで得ることができる。

[0051] マウスを例に取って、動物を免疫する方法を説明する。 ProGRP(31-98)などのぺプチドをフロインド完全アジュバント、 TiterMax Gold (CytRx社）等のアジュバンドと 1： 1 に混ぜ、交流ジョイントで結合した二本の注射筒で繰り返しジョイントを通過させる、あるいは超音波処理する等の方法によりェマルジヨンを作製する。作製した抗原含有ェマルジヨンを、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内のいずれか、または複数部位に注入する。一回目の免疫終了の後、 1〜4週間の間隔を開け、二回目の免疫を同様に実施する。以後同様に、血中の ProGRP(31-98)に対する抗体の抗体価が上昇するまで、免疫を続ける。

[0052] 抗体価の測定は以下の様に行うことができる。 ProGRP (31-98)を 1 μ g/mLの濃度に PBSに溶解し、ゥエルあたり 50 μ Lの容量で 96穴マイクロタイタープレートの各ゥエルに添加し、 4。Cでー晚吸着する。 0. 05%Tween20入り PBS (PBS— T)で各ゥエルを洗浄後アツセィに用いる。アツセィの前に、 1。/₀BSA入り PBS等でブロッキングを行っても良い。眼窩静脈叢、尾静脈または尾動脈等力採血し、 PBS—Tで 30倍に希釈した後遠心を行う。得られた上清を PBS—Tで希釈系列を作成し、 ProGRP(31 -98)をコートしマイクロタイタープレートの各ゥエルに 50 μ Lずつ添加する。室温で 30 分反応後、 PBS—Tで洗浄し、 PBS—Tなどで適切に希釈した西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP)標識抗マウス IgG溶液を各ゥエルに 50 μ Lずつ添カ卩する。更に室温で 30分反応後、過酸化水素、オルトフエ二レンジアミン基質液を添加して 30分間反応させ、 2N H SOを 50 μ ΐ添加して反応を停止させ、各ゥエルの吸光度を測定す

2 4

る。

[0053] 免疫したマウスで、十分に ProGRPに対する抗体価が上昇していることを確認した後、脾臓を取り出し、脾臓細胞を単離する。別に培養しておいたマウスミエローマ (例えば SP2/0_Agl4等）と、ポリエチレングリコール等を用いることにより融合する。融合に成功した細胞を HAT (ヒポキサンチン'アミノプテリン'チミジン)培地で選択培養する。 7〜： 14日程度、数日おきに培地を半量交換しながら培養を継続した後、培養上清の抗体価を測定する。ポジティブ'ゥエルの細胞を限界希釈法にてクローユングし、目的の抗体産生ハイプリドーマを得る。上記方法により得られたハイプリドーマクローンとして 3D6— 2 (寄託番号 FERM BP-8669)、 ProGRP_2B10 (寄託番号 FERM BP-4 110)を挙げることができる。

[0054] 上記方法で得られた抗体のェピトープを解析することによって、 ProGRP(40_75)上及び/又は ProGRP(40-79)上に存在するェピトープを認識し結合する抗体を、取得することができる。ェピトープ解析は ProGRP(40-75)及び/又は ProGRP(40-79)に対する抗体の反応を調べることによって可能である。組換え体で発現させた ProGRP(31 -98)や ProGRP(40_75)及び/又は ProGRP(40_79)あるいは Fmoc法や Boc法で化学合成させた ProGRP(40-75)及び/又は ProGRP(40-79)をマイクロタイタープレートにコートし、上述した免疫測定法で各ペプチドに対する反応を調べることにより決定される。また、 ProGRPの連続する 8—12アミノ酸程度の連続するペプチドに存在するェピトープは、マルチピンペプチド法により合成したペプチドを用いて決定することができる。

[0055] 本発明では、使用される抗体を固相化したり、ラベリングしたりすることも可能である。各操作は種々の実験手法の解説書に記載されている方法に準じて行えばよぐ本発明の実施に特有の操作は特に必要とはされない。

[0056] 本発明は、上述の方法に加え、検体中の ProGRPもしくはその分解物を測定するためのキット、特に ProGRPもしくはその分解物を測定することによって肺小細胞癌の診断や化学療法のモニタリングを行うための診断薬キットも提供する。かかるキットは、上述した ProGRP(40-75)上及び/又は ProGRP(40-79)上に存在するェピトープを認識する抗体を少なくとも 2種含み、その他任意に反応緩衝液や 2次抗体の希釈液、 Pr oGRPの標準物質、説明書その他の構成物を含んでいてもよい。キットに含まれる抗体の好ましレ、例としては、 ProGRP(40_75)上及び Z又は ProGRP(40_79)上に存在するェピトープを認識し、同ペプチド上の 8個連続アミノ酸残基からなるペプチドは認識しない抗体あるいは P卬 GRPの 71—75番目のアミノ酸配列を認識する抗体であり、代表例としてはモノクローナル抗体 GRP - 3D6 - 2やモノクローナル抗体 GRP - 2B1 0である。

[0057] 以下、実施例を挙げて本発明をさらに説明する。

実施例 1

[0058] ハイプリドーマの作製

特許第 3210994号の実施例 1に記載した方法により組換え体を作成し、大腸菌で発現させた配列番号 4に示されたペプチドを精製した。特許第 3210994号の実施例 1では、この組換え体は GRP(31_98)と記載されている力正しくは GRP前駆体（Pr oGRP)の（31— 98)部分であるので、 ProGRP(31_98)とここでは記載する。次に、同特許第 3210994号の実施例 6に記載した方法により、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを得た。

[0059] 得られたハイプリドーマ 3D6 _ 2 (FERM BP-8669)は、 2004年 3月 23日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに、 ProGRP-2B10 (FERM BP- 4110)ぉょび？1"。0!^-302 (?61^1 BP- 4109)は 1992年 12月 9日付で工業技術院微生物工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター）に、それぞれ寄託している。

得られたハイプリドーマをプリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水を回収し、プロテイン Aを結合させたセファロースカラムを用いて、各モノクローナル抗体を腹水中から精製した。ハイプリドーマ 3D6— 2 (FERM BP-8669)から得られたモノクローナル抗体を GRP— 3D6 2と命名した。

実施例 2

[0060] モノクローナル抗体のェピトープ解析

(1)ペプチドの合成とェピトープの決定配列番号 3に ProGRP(31_98)の核酸配列とアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配列に従レ、、 ProGRP (31-98)の部分ペプチドを Fmoc法にて合成した。 P印 1は ProGRPの 3 1— 52番目のペプチド、 Pep70ii40 _60#目のペプチド、 Pep3fi54_ 78#目のペプチド、 Epi2は 82— 96番目のペプチド、 P印 5は 82— 96番目のペプチドである。合成したペプチドは逆相クロマトグラフィーあるいは逆相クロマトグラフィーとゲルろ過を組み合わせて精製した。精製純度は 80%以上であった。

[0061] それぞれのペプチドを 1 μ g/mLの濃度に PBSで希釈し、 96穴マイクロタイタープレートの各ゥエルに 100 μ Lずつ添加し、 4°Cでー晚吸着させた。 PBSで各ゥエルを 2回洗浄後、 1%BSAを含む PBSを各ゥエルに添加し、室温で 2時間インキュベーションを行い、吸引除去した。 1 μ g/mLの濃度に希釈したモノクローナル抗体 GRP— 3D6 2を lOO x Lずつ各ゥエルに添カロし、室温で 60分間反応させた後、 0. 05%Tween 20を含む PBS(PBS-T)で 5回洗浄後、西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP)標識抗マウス IgG抗体溶液を 100 / Lずつ各ゥエルに添加し、室温で 30分間反応させた。 P BS— Tで 5回洗浄後、基質溶液（2mg/mLのオルトフヱ二レンジァミン、 30%過酸化水素水 0· 9 μ L/mLを含む 0. 1Mクェン酸リン酸緩衝液、 pH5. 0)を 100 μ Lずつ各ゥエルに添加し、室温で 30分間反応させた後、 2Ν硫酸を 100 /i Lずつ各ゥエルに添加して反応を停止させた。ただちに、 492應における吸光度を測定し、その結果を表 1に示す。

[0062] [表 1]

Peptide a.a. No OD492/630

Pep 1 31 -52 0.003

Pep 70 40-60 0.822

Pep 3 54-78 0.003

Epi 2 70-90 0.004

Pep 5 82-96 0.002

ProGRP 31-98 2.236 モノクローナル抗体 GRP— 3D6— 2は、陽性対照である組換え体 ProGRP (31-98) と ProGRPの 40— 60番目のアミノ酸配列である Pep70に反応した。このことより、 GRP - 3D6— 2は ProGRPの 40 - 60番のアミノ酸配列を認識してレ、ることがわかった。また同様の方法で、 GRP— 2B10は P印 3と Epi2のペプチドに反応し、 GRP— 3G2は E pi2と P印 5のペプチドに反応することがわかった。

[0064] (2)マルチピンペプチドの合成とェピトープの決定

ProGRP(31-98)のアミノ酸配列に基づき、 1アミノ酸ずつオーバーラップさせた連続した 8個のアミノ酸ずつの 61個のペプチドを、マルチピンペプチド法で合成した。各ペプチドは末端にビォチンを結合させたものであり、合成は和光純薬株式会社 (大阪）に依頼した。

[0065] マルチピンペプチド法で合成した各ピオチン化ペプチドをジメチルホルムアミドに溶解し、 1 μ g/mLの濃度に PBSで希釈した。その希釈された各ピオチンィ匕ペプチド溶液を、アビジン固相された 96穴マイクロタイタープレートの各ゥエルに 100 / Lずつ添加し、 4°Cでー晚結合させた。 0. 05%Tween20を含む PBS (PBS-T)で各ゥェルを洗浄後、各モノクローナル抗体 GRP— 3D6— 2、 GRP— 3G2、 GRP— 2B10を 1 μ g/mLに希釈した溶液を、各ゥエルに 100 μ Lずつ添加した。室温で 30分間反応後、 PBS— Τで 5回洗浄し、西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP)標識抗マウス IgG抗体溶液を各ゥエルに 100 / Lずつ添加した。更に室温で 30分間反応後、 PBS— T で 5回洗浄し、基質溶液（2mg/mLのオルトフヱ二レンジァミン、 30%過酸化水素水 0 . 9 μ L/mLを含む 0. 1Mクェン酸リン酸緩衝夜、 ρΗ5. 0)を各ウエノレに 100 μ Lずつ添加し、室温で 30分間反応後、 2Ν硫酸を 100 / Lずつ添加し、ただちに 492nm における吸光度を測定した。各モノクローナル抗体 GRP_ 3D6 _ 2、 GRP_ 3G2、 GRP— 2B10の ProGRP(31-98)内部の各ペプチドに対する反応を図 1 (A)、（B)、 (C )に示す。

[0066] 図 1の（A)に示すように、モノクローナル抗体 GRP— 3D6— 2は ProGRP(31_98)の内部の 8個ずつの連続するペプチドには結合しなかった。これは、 GRP— 3D6— 2 は ProGRPの 8個の連続するペプチドを認識することができず、 8個より長いペプチドで作られる構造ェピトープを認識するためと考えられる。一方、モノクローナル抗体 G RP— 3G2は 81— 88、 82— 89、 83— 90、 84— 91の 4つの 8個の連続するペプチドに結合した。モノクローナル抗体 GRP— 3G2の抗体はこの 4つのペプチドに存在している配列である、 84— 88のペプチドを認識しているものと考えられる（図 1 (B) )。またモノクローナノレ抗体 GRP— 2B10の抗体 ίま 68— 75、 69— 76、 70— 77、 71— 7 8の 4つの 8個の連続するペプチドに結合した。このため、モノクローナル抗体 GRP

— 2B10は、この 4つのペプチドに存在している配列である、 71—75のペプチドを認識してレ、ると考えられる（図 1(C))。

[0067] これらのペプチドを用いたェピトープの決定の結果より、モノクローナル抗体 GRP

— 3G2やモノクローナル抗体 GRP— 2B10に認識されるェピトープは、 5残基のアミノ酸から形成される連続ェピトープである。

[0068] また、モノクローナル抗体 GRP— 3D6— 2は ProGRP(31-98)の少なくとも 40— 60部分のペプチドを認識し、かつ ProGRP(31-98)の内部の 8個の連続するペプチドに反応しない抗体である。言い換えると、 GRP— 3D6— 2に認識されるェピトープは、 Pro GRP(31-98)の少なくとも 40— 60のアミノ酸配列で形成される力 S、 8個ずつの連続するペプチドでは形成できない構造ェピトープであると考えられる。

[0069] 以上のモノクローナル抗体が認識するェピトープの関係をまとめると表 2のようになる。

[0070] [表 2コモノクローナル抗体ェピトープ

(ProGRPのアミノ酸 No. )

GRP- 3 G 2 8 4 - 8 8

GRP- 2 B 1 0 7 1 - 7 5

GRP- 3 D 6 - 2 4 0 - 6 0 実施例 3

モノクローナル抗体の組み合わせによる検体保存安定性の検討

96ウェルマイク口プレートの各ゥエルに、 1種又は 2種のモノクローナル抗体（2種類の場合は等量混合）を 4 μ g/mLの濃度で ΙΟΟ μ L加え、 4°Cでー晚インキュベートし固相化した。 0. 15M NaClを含む lOmMリン酸緩衝液 (pH7. 3)で 2回洗浄後、ブロッキング液 (0. 5%カゼインナトリウムを含む lOmMリン酸緩衝液、 pH7. 1)を 350 x L 加え 2時間静置しブロッキングする。ブロッキング液を除去後、反応液 100 z Lと測定検体 50 を各ゥヱルに加え、 37°Cで 1時間反応させた。洗浄液（0. 05% Twee n20を含む lOmMリン酸緩衝液、 pH7. 3)で 5回洗浄し、 HRP標識をした 1種又は 2 種のモノクローナル抗体（2種類の場合は等量混合)溶液 100 μ Lを添加して室温で 30分間反応させた。洗浄液で 5回洗浄し、基質溶液（2mg/mLのオルトフエ二レンジァミン、 30。/。過酸化水素水 0. 9 z L/mLを含む 0. 1Mクェン酸リン酸緩衝液、 pH5. 0)を 100 x Lをカロえ、 30分間インキュベートし、 2N硫酸を 100 z Lを加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで、 492nm (リファレンス波長 630nm)の吸光度を測定した。

[0072] この測定法を用いて、 3検体を、各々 _ 20°Cで凍結保存しておいたものと、室温で 17時間保存したものに分けて測定した。凍結保存してぉレ、たものの ProGRP値を 100 %として、室温で 17時間保存した場合の測定値をパーセントで表した (表 3)。固相化抗体と標識抗体の組み合わせが、それぞれ GRP— 3G2と GRP— 2B10、 GRP— 3G2と GRP— 3D6— 2、 GRP— 3G2と GRP— 2B10/GRP— 3D6— 2の場合、 17 時間保存検体中の ProGRP免疫活性は、平均 69. 6%、 70. 6%、 69. 2%にそれぞれ低下していた。また、従来法である固相化抗体と標識抗体の組み合わせである、 G RP— 3G2/GRP— 2B10とポリクローナル抗体の場合も 71. 8%に減少していた。一方、固相化抗体に GRP— 3D6— 2、標識抗体に GRP— 2B10を用いた場合は、 1 7時間室温で保存しても測定値は平均で 89. 3%であり、他の抗体の組合せよりも、約 20%の ProGRPの免疫活性が維持されていた（表 3)。なお、ポリクローナル抗体は、特許第 3210994号の実施例 8に記載の方法で取得したものを用いた。

[0073] [表 3]

実施例 4

[0074] ProGRP(40-75)に結合する抗体を用いた測定法

96ウェルマイク口プレートの各ゥエルに、 GRP— 3D6— 2を 4 x g/mLの濃度で 200 μ L加え、 4°Cでー晚インキュベートし固相化した。 0. 15M NaClを含む 10mMリン酸緩衝液 (pH7. 3)で 2回洗浄後、ブロッキング液 (0. 5%カゼインナトリウムを含む 10 mMリン酸緩衝液、 pH7. 1)を 350 z L加え 2時間静置しブロッキングする。ブロッキング液を除去後、反応液 100 μ Lと測定検体 100 μ Lを各ゥエルに加え、 37°Cで 1時間反応させた。洗浄液（0. 05% Tween20を含む 10mMリン酸緩衝液、 pH7. 3)で 5回洗浄し、 HRP標識した GRP— 2B10溶液 200 z Lを添加して室温で 30分間反応させた。洗浄液で 5回洗浄し、基質溶液（2mg/mLのオルトフヱ二レンジァミン、 30 %過酸化水素水 0. 9 x L/mLを含む 0. 1Mクェン酸リン酸緩衝液、 pH5. 0)を 200 Lを加え、 30分間インキュベートし、 5N硫酸を 50 / Lを加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで、 492nm (リファレンス波長 630nm)の吸光度を測定した。その標準曲線を図 2に示した。

[0075] この標準曲線から、約 4. 5pg/mLの ProGRPを検出できると考えられた。この感度は、健常人検体中の ProGRP量を検出するうえで十分な感度である。

[0076] <試験例 1 >

従来法と本発明の実施例 4の測定法を用いて、 5検体を 4°Cで 1、 3、 7日間保存した後、検体中 ProGRP免疫活性を測定し、保存前の測定値と比較した。従来法は次のようにして実施した。 96ウェルマイク口プレートの各ゥエルに、 GRP— 3G2および G RP— 2B10 (等量混合）を 10 i g/mLの濃度で 100 /i L加え、 4°Cでー晚インキュべ一トし固相化した。 0. 15M NaClを含む 10mMリン酸緩衝液 (pH7. 3)で 2回洗浄後、ブロッキング液 (0. 5%カゼインナトリウムを含む 10mMリン酸緩衝液、 pH 7. 1)を 3 50 μ L加え 2時間静置しブロッキングする。ブロッキング液を除去後、反応液 100 μ Lと測定検体 50 x Lを各ゥエルに加え、 37°Cで 1時間反応させた。洗浄液（0. 05 % Tween20を含む 10mMリン酸緩衝液、 pH7. 3)で 5回洗浄し、 HRP標識をしたポリクローナル抗体溶液 100 z Lを添加して室温で 30分間反応させた。洗浄液で 5回洗浄し、基質溶液（2mg/mLのオルトフエ二レンジァミン、 30%過酸化水素水 0. 9 μ L AnLを含む 0. 1Mクェン酸リン酸緩衝液、 pH5. 0)を 100 μ Lをカロえ、 30分間インキュペートし、 2Ν硫酸を 100 z Lを加えて酵素反応を停止させた。マイクロプレートリーダ一で、 492nm (リファレンス波長 630nm)の吸光度を測定した。

[0077] 4°Cで保存する前の ProGRPの値を 100%として、各々の保存期間後の測定値をパ一セントで表した。結果を表 4に示す。

従来法の場合、検体中の ProGRP測定値は、 4°Cで 1日間保存では平均 94. 5%、 3日間保存では平均 85. 8%、 7日間保存では平均 67. 8%であり、 1日間平均で約 4. 93%ずつ低下する傾向であった。一方、本発明の測定法では、検体中の ProGR P測定値は、 4°Cで 1日間保存では平均 96. 9%、 3日間保存では平均 94. 3%、 7日間保存では平均 86. 9%であり、 1日間平均で約 2. 29%ずつ低下する傾向であつた。すなわち、本発明の測定法では、従来法よりも 2. 15倍高い保存安定性を示し、特に 7日間保存では、従来法よりも、約 19%の ProGRPの免疫活性が維持されていた

[0079] [表 4]

[0080] <試験例 2 >

本発明で利用可能なモノクローナル抗体 GRP— 3G2、 GRP- 2B10, GRP— 3D 6 2がそれぞれ認識するェピトープの解析を行った。

ProGRPの 31— 53番目のペプチドを Fmoc法にて合成した。合成したペプチドは逆相クロマトグラフィーあるいは逆相クロマトグラフィーとゲルろ過を組み合わせて精製した。実施例 2で用いたペプチドを含めそれぞれのペプチドを 0. 1%TFAに溶解し、 10 i g/mLの濃度に PBSで希釈した。 96穴マイクロタイタープレートの各ゥエルに 1ゥエルあたり 100 / Lずつの容量で 96穴 ELISAプレートの各ゥエルに添加し、 4 °Cでー晚吸着させた。 PBSで各ゥエルを 2回洗浄後、 1%BSAを含む PBSを各ゥェルに添加し、室温で 2時間インキュベーションを行い、吸引除去した。 5 /i g/mLの濃度に希釈したモノクローナル抗体 GRP_ 3G2、 GRP_ 2B10、 GRP— 3D6— 2を 100 x Lずつ各ゥエルに添加し、室温で 85分間反応させた後、 0. 05%Tween20 を含む PBS (PBS -T)で 5回洗浄した。 PBS—Tで適切に希釈した西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP)標識抗マウス IgG抗体溶液を 100 μ Lずつ各ゥエルに添加し、更に室温で 30分間反応させた。 PBS—Tで 5回洗浄後、基質溶液（2mg/mLのォルトフヱ二レンジァミン、 30%過酸化水素水 0. 9 z L/mLを含む 0. 1Mクェン酸リン酸緩衝液、 pH5. 0)を 100 x Lずつ各ゥエルに添カ卩し、室温で 20分間反応させた後、 2N硫酸を 100 ずつ各ゥエルに添加して反応を停止させ、ただちに 492nmにおける吸光度を測定した。その結果を表 5に示す。

[表 5]

[0082] 表 5より、 GRP— 3G2、 GRP— 2B10、 GRP— 3D6— 2の反応するェピトープは実施例 2で示したものとほぼ同じ結果を示し、 GRP— 3D6— 2は 31— 53に全く反応しないことから、 42— 53のペプチドにも反応しないことが確認された。

[0083] <試験例 3 >

ProGRP-Cdelの同定を質量分析装置（LC-MS/MS)を用いて行った。 ProGRP (31- 98)領域の各種ペプチドに反応性を示したゥサギポリクローナル抗体を PBS (pH7. 3 5)に 12. 7mg/mlになるように溶解し、 3mlの NHS-S印 harose (Amersham社）にュ一ザ一マニュアルに従レ、結合させた。

2例の 1. 5mlのヒト血清検体に、 20 μ gの糸且換え ProGRP (31-98)を添加して室温で 24時間保存した。その後、前述したゥサギポリクローナル抗体結合 S印 haroseを 0. 4 ml添加し、室温で 60分間攪拌した。このゥサギポリクローナル抗体結合 S印 haroseを洗浄液（0. 05%Tween20を含む 10mMリン酸緩衝液 pH7. 3)で洗浄し、 9. 5M 尿素液 0. 5mlを添加し、ゥサギポリクローナル抗体結合 Sepharoseに結合したものを溶出した。溶出液を回収してその一部をとり、 LC-MS/MSを用いてヒト血清検体中で保存後の ProGRP (31-98)領域の保存されたペプチドを検討した。

溶出液 100 μ 1に 250mMの Methv卜 PEO -NHSエステル（Pierce)溶液 ZDMSOを

4

1 μ 1添加し、室温で 1時間インキュベートした。 1M Tris- HC1、 pH8を 5 μ 1添加し、室温で 30分インキュベートして反応を止めた後、 800 μ 1のアセトンを添加してタンパク質を沈澱させた。遠心後、ペレットを乾燥させ、そこに Promega社の modified trypsin溶液（20ng/ μ lZ50mM炭酸水素アンモニゥム）を 15 μ 1添加し、 30°Cでー晚消化した。消化後のサンプルに 0. 1 %ギ酸15 1を添カロし、 15000卬 mで 5分間遠心した上清 5 μ 1について、 LC-MS/MS分析 { (LC部） Agilent 1100 series capillary LC syst em、（カラム） Agilent Zorbax SB- C 18， 5 μ m, 150 x 0.5 mmゝ (MS/MS) BrukerDaltoni cs HCT-plus }を行った。分離は 0. 1 %ギ酸存在下で行い、流量は 15 μ ΐ/分、ァセトニトリル勾配は 0-35% linear/0-120 min、 35-95% linear/120-125 minとした。カラム溶出液は ESI部に導入し、 MS/MSデータを取得し、 DataAnalysisソフトウェアでピークリストを作成し、 Matrix Science社の MASCOT serverで解析を行った。

[0084] Methyl-PEO -NHSは、蛋白質分子内の N末ァミノ基及びリジンの側鎖アミノ基を修

4

飾する性質を有する。従って、見出されたペプチド断片の内で N末が標識されたものがあれば、それは消化前に N末フリーの状態であったものである。また、側鎖アミノ基が修飾されたリジンの部位ではトリプシンによる消化が起こらないので、 C末リジンの側鎖が修飾されていれば、それは消化前に既にこの部分で切断されていたものである。両血清検体で C末リジンが標識された断片としては、 NHQPPQPK (72_79)が見出された。従って、少なくとも Lys-79の C末側で切断された断片が血清処理により生じたものと考えられる。更に、 N末側が標識されていなレ、が、両血清検体で SVSER (37_ 41)という断片が観察され、 Ser-36の C末側で切断される可能性が示唆された。産業上の利用可能性

[0085] 本発明の方法は、新たに確認された、検体中でも安定に保存されている ProGRPのある種の分解物上のェピトープを測定対象とすることによって、従来の測定法と同等の検出感度が得られることに加え、採取後の検体の取扱い方に影響を受けに《なり、再現性の高い測定値が得られるなど、血中 ProGRPの検出に有効である。

Claims

請求の範囲

配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 40— 75番目の部分アミノ酸配列からなるぺプチドを認識する 2種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び /又はその分解物を測定する方法。

配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 40— 79番目の部分アミノ酸配列からなるぺプチドを認識する 2種以上の異なる抗体を用いて、ガストリン放出ペプチド前駆体及び /又はその分解物を測定する方法。

サンドイッチ免疫測定法である、請求項 1又は 2に記載の方法。

配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 40— 60番目の部分アミノ酸配列からなるぺプチドには結合し、かつ配列番号 1に示されるアミノ酸配列上の任意の 8連続アミノ酸配列からなるペプチドには結合しない抗体。

配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 40— 60番目の部分アミノ酸配列からなるぺプチドには結合し、 31—53番目の部分アミノ酸配列からなるペプチドには結合しない抗体。

寄託番号 FERM BP— 08669で寄託されたハイブリドーマ 3D6— 2が産生する、請求項 4又は 5に記載の抗体。

寄託番号 FERM BP— 08669で寄託されたハイブリドーマ 3D6 _ 2。

2種以上の異なる抗体の少なくとも一方が請求項 4〜6のいずれかに記載の抗体である、請求項 1または 2に記載の方法。

2種以上の異なる抗体の少なくとも一方が請求項 4〜6のいずれかに記載の抗体であり、他方が配列番号 1のアミノ酸配列 71— 75番目の部分アミノ酸配列からなるぺプチドを認識する抗体である、請求項 1又は 2に記載の方法。

請求項 4〜6のいずれかに記載の抗体を含む、ガストリン放出ペプチド前駆体もしくはその分解物を測定するためのキット。

癌の診断を行うためのキットである、請求項 10に記載のキット。