CN101160526B - 针对胃泌素释放肽前体的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种不存在测定值分散和样品处理等操作上的制约等问题的新的ProGRP测定方法。具体而言,是一种使用识别序列编号1所示的氨基酸序列的第40-75位的部分氨基酸序列构成的肽的2种以上的不同抗体,测定胃泌素释放肽前体和/或其分解物的方法。此外,还提供一种使用识别序列编号1所示的氨基酸序列的第40-79位的部分氨基酸序列构成的肽的2种以上的不同抗体,测定胃泌素释放肽前体和/或其分解物的方法。本发明的方法除了能获得与现有的测定方法相同的检测灵敏度,还具有采取后的样品容易处理、能获得再现性高的测定值等优点。
Description
技术领域
本发明涉及针对胃泌素释放肽前体的抗体及其应用,所述抗体广泛用于包括小细胞肺癌在内的各种疾病的早期发现和治疗监测、复发监测等。
背景技术
在日本,死因的第1位是恶性肿瘤,其中肺癌死亡率呈逐年上升趋势,在男性中超过胃癌成为死因的第1位,在女性中也占第3位。肺癌在病理组织学上主要分为以下4种组织类型,即:发生于肺门部的肺鳞状上皮癌和小细胞肺癌、发生于肺野部的肺腺癌和大细胞肺癌。
尤其是小细胞肺癌,由于增殖快速,早期即发生远处转移,因此初诊发现时大多已经是转移至全身的进行性癌。关于该类型癌的治愈率,对于病变局限于一侧肺野的小细胞肺癌的局限型患者,其治愈率为约20%,对于已经转移至两肺或其它内脏的扩散型患者,可以说事实上难以治愈。
此外,由于小细胞肺癌对抗癌剂的敏感性高,因此化学疗法是首选的治疗方法,相反,对于非小细胞肺癌,由于化学疗法的疗效差,因此外科疗法是首选的治疗方法。
因此,小细胞肺癌是肺癌中特别需要早期发现、早期治疗的癌症,所以,对小细胞肺癌和非小细胞肺癌的鉴别诊断对于确定治疗方案极其重要。
发现肺癌的方法之一是痰液检查。然而,痰液检查主要适于肺鳞状上皮癌的检查,对小细胞肺癌存在阳性率低的问题。此外,X射线摄影法也是广泛使用的发现肺癌的方法,但对于发生于肺门部的肺鳞状上皮癌和小细胞肺癌,肺门部由于受到心脏的影响,存在癌组织的阴影非常难以拍到的问题。此外,关于小细胞肺癌,对肺野呈现异常阴影的患者,即使使用痰液细胞学诊断、胸部X射线单纯摄影、CT扫描、支气管内窥镜等,也难以早期发现该类肺癌。
此外,用于诊断癌症的一些检查方法,例如放射线照射、活组织检查或支气管内视镜等,会对患者造成痛苦,且需要昂贵的仪器和熟练的技术等。
因此,正在进行通过更简便的血液检查,在能够治愈的时期可高效诊断出癌症肿瘤标志物的研究。目前,在癌症的发现、诊断、病情监测指标、复发诊断等中使用了30种以上的肿瘤标志物。
由于肺癌组织类型多样,所以还没有报道过对所有类型肺癌的发现或诊断都有效的肿瘤标志物。因此,目前根据肺癌的组织类型选择和使用有效的标志物。
例如,对于肺腺癌,主要选择使用癌胚抗原(CEA)或唾液酸化Lex-i抗原;对于肺鳞状上皮癌,主要选择使用鳞状上皮癌相关抗原;对于小细胞肺癌,主要选择使用神经元特异性烯醇化酶(NSE)等。
然而,NSE存在如下缺点:(1)针对可治愈的早期癌的阳性率低,(2)治疗引起测定值出现一过性上升,(3)采血时的溶血引起测定值上升,(4)小细胞肺癌患者与正常健康者的测定差值小等。因此,NSE对于小细胞肺癌来说未必是有效的肿瘤标志物。
胃泌素释放肽(GRP)是McDonald等在1978年从猪的胃组织中分离出的一种具有促胃泌素分泌作用的、由27个氨基酸组成的脑肠肽。已确认人类也存在GRP,并于1984年克隆出编码人类GRP的基因。
国立癌中心的山口等,在认为是来自神经内分泌细胞的小细胞肺癌的生物学特性的研究过程中,测定了包括促肾上腺皮质激素(ACTH)和降钙素等15种以上的脑肠激素,发现在培养的小细胞肺癌株中,GRP以最高频率且高浓度地得到积极分泌(非专利文献1)。并且,建立了配合血中GRP浓缩法的放射免疫测定法(RIA),发现小细胞肺癌患者与健康人相比,呈现出高的血中GRP浓度。然而,由于GRP在血中会快速分解,因此血中浓度低,此外,由于上述测定需要复杂的浓缩操作,因此临床应用困难。
根据此后的研究可知,在各种细胞中,通过选择性RNA剪切,产生3种GRP前体(ProGRP)(非专利文献2)。这3种ProGRP,其第1-98 位氨基酸序列是相同的,而第99位以后,通过选择性RNA剪切,变成互不相同的氨基酸序列。该相同的第1-98位氨基酸序列在序列编号1中示出。下文只要没有特别说明,本发明中的ProGRP、其部分序列、分解物等氨基酸残基的编号均用序列编号1的氨基酸序列的编号表示。
3种ProGRP的第1-27位氨基酸序列,与具有促胃泌素分泌活性的成熟GRP的氨基酸序列相同。这3种前体均通过激素前体切断酶,分解为由第1-27位氨基酸序列构成的成熟型GRP、以及由第31位以后的氨基酸序列构成的不具有促胃泌素分泌活性的作为ProGRP分解物的C末端片段(ProGRP-Cfrag)。
Holst等(非专利文献3)报道:通过对由ProGRP的第42-53位氨基酸序列构成的肽(以下称为ProGRP(42-53))使用抗血清进行放射免疫测定(RIA),发现小细胞肺癌患者血浆中的ProGRP或ProGRP-Cfrag水平高。然而,该方法需要沉淀萃取操作,灵敏度也不足。此外,认为用这种由12个氨基酸残基构成的短链肽进行免疫时,未诱导出识别ProGRP的立体结构抗原表位的抗体。
三宅等着眼于ProGRP与GRP相比在血中的稳定性高、以及作为3种ProGRP共同部分的第31-98位氨基酸序列对其它蛋白质的氨基酸序列没有显示出相同性,使用由该氨基酸序列构成的重组肽(以下称为ProGRP(31-98))作为抗原获得的高效价抗血清,建立了无需沉淀萃取操作的高灵敏度RIA法(非专利文献1)。通过该方法,使ProGRP成为与GRP同样优异的肿瘤标志物。
该方法在无需萃取操作方面是有利的,但是测定需要4天时间,且灵敏度不足,为10pM(77.3pg抗原/mL),因此不能测定健康人血清中的ProGRP值,无法进行临床应用。
此外,上述Holst等和三宅等的RIA法是抑制法,因此只要ProGRP片段的一部分具有抗原性,就能进行测定,但其灵敏度比三明治法低,因此需要高灵敏度的ProGRP测定法的临床应用难以实现。即:为了在临床上进行ProGRP检测,必须提高检测灵敏度,尤其需要能在三明治法中使用的抗体。
山口、青柳等以ProGRP的小细胞肺癌用肿瘤标志物的临床应用为目的,开发了以酶联免疫吸附法(ELISA)为原理、使用三明治法的简便且高灵敏度ProGRP测定试剂(专利文献1)。该方法在约2小时内获得结果,并且具有高灵敏度(2pg/mL),因此目前在临床上广泛应用,发现对于小细胞肺癌,该方法比NSE灵敏度高并具有特异性。
此外,发现使用该测定法,除了小细胞肺癌以外,在神经内分泌肿瘤(甲状腺髓样癌等)、显示神经内分泌肿瘤特征的癌(小细胞食道癌、小细胞胰癌、小细胞前列腺癌等)中,血清ProGRP值也上升,认为今后也可以应用于这些肿瘤的早期发现和治疗监测等中。
然而,虽然在血中ProGRP的稳定性比GRP高,但与其它通常的肿瘤标志物相比,却发现测定值分散。因此,以ProGRP为检测对象的方法,存在下述制约,即测定样品必须在采血后迅速冻干保存直至测定时为止(非专利文献4)。
专利文献1:第3210994号专利公报
专利文献2:特开平6-98794号公报
非专利文献1:Cancer Research,1994年,第54卷,2136-2140页
非专利文献2:Eliot等,Mol.Endo.,1987年,第1卷,224-232页
非专利文献3:Holst,J.Clin.Oncol.,第7卷,1831-1838页,1989年
非专利文献4:临床检查,第39卷,981-986页,1995年
发明内容
本发明提供一种新的ProGRP的测定方法,该测定方法以ProGRP为测定对象,但不存在现有方法中测定值分散和样品冻干保存这种操作上的制约等问题。
本发明在ProGRP的分解物中发现能在血液样品中稳定保存的物质,基于此,通过以该分解物中存在的稳定的抗原表位为测定对象,解决了上述问题。具体地说,提供了以下各发明。
(1)一种使用识别序列编号1所示的氨基酸序列的第40-75位的部分氨基酸序列构成的肽的2种以上的不同抗体,测定胃泌素释放肽前体及/或其分解物的方法。
(2)一种使用识别序列编号1所示的氨基酸序列的第40-79位的部分氨基酸序列构成的肽的2种以上的不同抗体,测定胃泌素释放肽前体及/或其分解物的方法。
(3)如(1)或(2)所述的方法,其中该方法为三明治免疫测定法。
(4)一种与序列编号1所示的氨基酸序列的第40-60位的部分氨基酸序列构成的肽结合、且与序列编号1中所示的氨基酸序列上的任意8个连续氨基酸序列构成的肽不结合的抗体。
(5)一种与序列编号1所示的氨基酸序列的第40-60位的部分氨基酸序列构成的肽结合、与由第31-53位的部分氨基酸序列构成的肽不结合的抗体。
(6)如(4)或(5)所述的抗体,其中该抗体由按照保藏编号FERMBP-08669保藏的杂交细胞瘤3D6-2产生。
(7)按照保藏编号FERM BP-08669保藏的杂交细胞瘤3D6-2。
(8)如(1)或(2)所述的方法,其中所述的2种以上的不同抗体的至少一种是(4)~(6)中任一项所述的抗体。
(9)如(1)或(2)所述的方法,其中所述的2种以上的不同抗体的至少一种是(4)~(6)中任一项所述的抗体,其它抗体为识别序列编号1的氨基酸序列第71-75位的部分氨基酸序列构成的肽的抗体。
(10)一种含有(4)~(6)中任一项所述的抗体并用于测定胃泌素释放肽前体或其分解物的试剂盒。
(11)如(10)所述的试剂盒,其是用于癌诊断的试剂盒。
本发明的方法通过以新确认的、在样品中也能稳定保存的ProGRP的某种分解物上的抗原表位为测定对象,除了能获得与现有的测定方法相同的检测灵敏度,还具有采取后的样品的处理方法不易受到影响、能获得再现性高的测定值等效果。
附图说明
图1表示单克隆抗体对由用多肽合成的8个连续氨基酸序列构成的肽的反应性。横轴表示ProGRP(31-98)的8个连续氨基酸序列,纵轴 表示吸光度。(A)表示GRP-3D6-2的反应性、(B)表示GRP-3G2的反应性、(C)表示GRP-2B10的反应性。
图2表示使用与氨基酸编号第40-75位的部分肽结合的抗体GRP-3D6-2与GRP-2B10的测定法的标准曲线。横轴表示ProGRP的浓度,纵轴表示吸光度。
具体实施方式
本发明以在样品中存在的、与ProGRP或ProGRP-Cfrag相比在血中的保存稳定性高的ProGRP分解物(ProGRP-Cdel)中残存的抗原表位为免疫学测定法的对象。
该ProGRP-Cdel是现有方法的测定对象ProGRP-Cfrag的C末端一些氨基酸残基缺失的、链长更短的肽,是含有ProGRP的第40-75位氨基酸残基上残存的抗原表位的肽。推测可能是通过血液中存在的蛋白酶将ProGRP-Cfrag的第75-83位氨基酸残基的某个残基的C末端切断,从而产生ProGRP-Cdel。
关于该ProGRP-Cdel,使用质量分析装置对其结构进行确认,确认在第79位Lys的C末端处被切断。因此,ProGRP-Cdel是含有序列编号1的第40-79位氨基酸残基上残存的抗原表位的肽,所以,识别这些抗原表位的抗体也可以在本发明中使用。
ProGRP-Cdel与ProGRP-Cfrag之间结构上的差异仅是C末端有无20个左右氨基酸残基,但是作为用于免疫学测定ProGRP或其分解物的对象蛋白质的意义却有很大不同。现有方法中,使用识别上述C末端20几个残基部分的抗体。因此,该抗体已经不能识别、捕捉缺失该部分的ProGRP-Cdel。该C末端部分切断的进行受到样品自身或样品采取后的保存状态及时间的影响,推测这是现有方法中检测信号受到样品的保存状态或时间影响的原因。
另一方面,本发明中,使用识别ProGRP-Cdel上存在的抗原表位的抗体,即使样品中存在ProGRP及ProGRP-Cfrag,或即使产生部分切断,也能稳定地识别ProGRP或其分解物,因此检测信号受到样品的保存状态或时间的影响小,可以进行再现性高的测定。
本发明是一种以ProGRP-Cdel上的抗原表位作为测定对象,使用从可以识别由ProGRP的第40-75位氨基酸序列构成的肽(ProGRP(40-75))上存在的抗原表位的抗体中选择的、能分别识别ProGRP(40-75)上存在的2种以上不同抗原表位的不同抗体,通过三明治免疫测定法检测ProGRP或其分解物的方法。此外,本发明还是一种使用从可以识别由ProGRP的第40-79位氨基酸序列构成的肽(ProGRP(40-79))上存在的抗原表位的抗体中选择的、能分别识别ProGRP(40-79)上存在的2种以上的不同抗原表位的不同抗体,通过三明治免疫测定法检测ProGRP或其分解物的方法。
特别是本发明中,不包含识别从ProGRP-Cfrag切断除去的C末端部分序列上的抗原表位的抗体,优选采用只使用识别ProGRP-Cdel上的抗原表位的抗体的三明治免疫测定法。
三明治ELISA法的基本操作可以根据“超高灵敏度免疫测定法”(石川荣治,1993年,学会出版中心)或其它各种实验方法的说明书中记载的方法进行,本发明的实施中不特别需要特殊的操作,可以按下述工序进行。
即:ProGRP或其分解物可以通过包括如下工序的测定法检测:(1)使与ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)结合的第一抗体与样品中的ProGRP或其分解物反应的工序,(2)由该抗体捕捉的ProGRP或其分解物与和(1)的抗体不同的、与ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)结合的第二抗体反应的工序,以及(3)检测由(2)产生的免疫复合物的工序。
与ProGRP或其分解物结合的抗体,优选使用只选择与ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)结合的抗体,在可以重现再现性高的测定值的范围内,测定体系内也可以含有该抗体以外的抗体。
本发明中特别优选的抗体的组合,是识别ProGRP的第40-60位氨基酸序列的单克隆抗体GRP-3D6-2和识别第71-75位氨基酸序列的单克隆抗体GRP-2B10的组合。单克隆抗体GRP-3D6-2识别ProGRP的第40-60位氨基酸序列,同时不识别由该氨基酸序列中任意的8个连续氨基酸序 列构成的肽。由此认为,单克隆抗体GRP-3D6-2识别由ProGRP的第40-60位氨基酸序列构成的结构抗原表位。推测单克隆抗体GRP-2B10识别由71-75位氨基酸残基构成的序列抗原表位。
使用上述2种单克隆抗体的本发明的方法的检测灵敏度为4.5pg/mL。这与现有的使用单克隆抗体与多克隆抗体测定ProGRP(31-98)的方法具有基本相同的灵敏度,该灵敏度足以用于测定健康人的血中ProGRP。
本发明中使用的抗体可以通过免疫小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、鸡、山羊、绵羊、牛等实验动物获得。免疫中使用的抗原优选使用ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79),也可以使用ProGRP(31-98)的肽,免疫后使用ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)可以选择得到期望的抗体。
以小鼠为例,对免疫动物的方法进行说明。将ProGRP(31-98)等肽与弗氏完全佐剂、TiterMax Gold(CytRx公司)等佐剂以1∶1混合,使用互相流通的接头连接的两个注射器,使其反复通过接头,或通过超声波处理等方法制备乳剂。在皮下、皮内、肌内、腹腔内的任一部位或多个部位注入制备的含有抗原的乳剂。第一次免疫结束后,间隔1~4周,同样进行第二次免疫。以后同样继续免疫,直至抗体对血中的ProGRP(31-98)的抗体效价上升。
抗体效价的测定可以按照以下方式进行:以1μg/mL的浓度在PBS中溶解ProGRP(31-98),以每孔50μL的容量添加到96孔微量滴定板的各孔中,于4℃吸附过夜。用含0.05%Tween20的PBS(PBS-T)将各孔洗涤后,用于测定。测定前,也可以用含1%BSA的PBS等进行封闭。从眼窝静脉丛、尾静脉或尾动脉等处采血,用PBS-T稀释30倍后进行离心。将所得上清液用PBS-T进行系列稀释,涂覆ProGRP(31-98),在微量滴定板的各孔中添加50μL。在室温下反应30分钟后,用PBS-T洗涤,在各孔中添加50μL使用PBS-T等适当稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG溶液。再在室温下反应30分钟后,添加过氧化氢、邻苯二胺底物液,反应30分钟,添加50μL 2N H2SO4,停止反应,测定各孔的吸光度。
在免疫的小鼠中,确认对ProGRP的抗体效价充分上升后,取出脾脏,分离脾脏细胞。使用另外培养的小鼠骨髓瘤(例如SP2/0-Ag14等)和聚乙二醇等进行融合。将融合成功的细胞用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)培养基进行选择培养。7~14天左右,每隔几天半量交换培养基并继续培养后,测定培养上清液的抗体效价。通过有限稀释法克隆阳性孔的细胞,获得产生目标抗体的杂交细胞瘤。通过上述方法获得的杂交细胞瘤克隆体例如有3D6-2(保藏编号FERM BP-8669)、ProGRP-2B10(保藏编号FERM BP-4110)。
通过分析上述方法所得抗体的抗原表位,可以获得识别并结合ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)上存在的抗原表位的抗体。抗原表位分析可以通过研究抗体对ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)的反应来进行。通过在微量滴定板上涂覆重组体中发现的ProGRP(31-98)、ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)、或用Fmoc法或Boc法化学合成的ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79),使用上述免疫测定法研究对各肽的反应来确定。此外,可以通过使用多肽法合成的肽确定在ProGRP的连续8-12个氨基酸左右的连续肽中存在的抗原表位。
本发明中,还可以将使用的抗体固相化或标记。各操作可以根据各种实验方法的说明书中记载的方法进行,本发明的实施中不特别需要特殊的操作。
本发明除了上述方法以外,还提供用于测定样品中的ProGRP或其分解物的试剂盒,尤其是通过测定ProGRP或其分解物进行小细胞肺癌诊断或化学疗法监测的诊断药试剂盒。该试剂盒含有至少2种识别ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)上存在的抗原表位的抗体,其它还可以任意地含有反应缓冲液、二抗稀释液、ProGRP标准物质、说明书等其它组成物。作为试剂盒中含有的抗体的优选例,为识别ProGRP(40-75)和/或ProGRP(40-79)上存在的抗原表位、且不识别由该肽上的8个连续氨基酸残基构成的肽的抗体,或识别ProGRP的第71-75位氨基酸序列的抗体,代表例为单克隆抗体GRP-3D6-2或单克隆抗体GRP-2B10。
以下列举实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
杂交细胞瘤的制备
根据专利第3210994号的实施例1记载的方法制备重组体,精制大肠菌中发现的序列编号4所示的肽。专利第3210994号的实施例1中,该重组体记载为GRP(31-98),正确的是GRP前体(ProGRP)的(31-98)部分,因此本文记载为ProGRP(31-98)。然后,根据专利第3210994号的实施例6中记载的方法,得到产生本发明单克隆抗体的杂交细胞瘤。
得到的杂交细胞瘤3D6-2(FERM BP-8669)于2004年3月23日在日本独立行政法人产业技术综合研究所专利微生物保藏中心保藏,ProGRP-2B10(FERM BP-4110)和ProGRP-3G2(FERM BP-4109)于1992年12月9日在日本工业技术院微生物工业技术研究所(现为日本独立行政法人产业技术综合研究所专利微生物保藏中心)保藏。
将所得杂交细胞瘤移植入使用姥鲛烷等处理的小鼠腹腔中,回收腹水,使用结合蛋白质A的琼脂糖凝胶(Sepharose)柱,从腹水中精制各单克隆抗体。将从杂交细胞瘤3D6-2(FERM BP-8669)获得的单克隆抗体命名为GRP-3D6-2。
实施例2
单克隆抗体的抗原表位分析
(1)肽的合成与抗原表位的确定
序列编号3中表示ProGRP(31-98)的核酸序列和氨基酸序列。根据该氨基酸序列,通过Fmoc法合成ProGRP(31-98)的部分肽。Pep 1是ProGRP的第31-52位肽,Pep70是第40-60位肽,Pep3是第54-78位肽,Epi2是第70-90位肽,Pep5是第82-96位肽。合成的肽通过反相色谱法或反相色谱法和凝胶过滤联用进行精制。精制纯度为80%以上。
将各个肽用PBS稀释成1μg/mL的浓度,在96孔微量滴定板的各孔中添加100μL,于4℃吸附过夜。用PBS将各孔洗涤2次后,在各孔中添加含1%BSA的PBS,室温下培养2小时,吸除。在各孔中添加100μL稀释成1μg/mL浓度的单克隆抗体GRP-3D6-2,室温下反应60分钟后, 用含0.05%Tween20的PBS(PBS-T)洗涤5次后,在各孔中分别添加100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体溶液,室温下反应30分钟。用PBS-T洗涤5次后,在各孔中分别添加100μL底物溶液(2mg/mL邻苯二胺、含0.9μL/mL30%过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH5.0),室温下反应30分钟后,在各孔中分别添加100μL 2N硫酸,停止反应。立即测定492nm处的吸光度,结果如表1所示。
表1
单克隆抗体GRP-3D6-2与作为阳性对照的重组体ProGRP(31-98)和ProGRP的第40-60位氨基酸序列Pep70反应。由此可知,GRP-3D6-2识别ProGRP的第40-60位氨基酸序列。此外,通过同样的方法,发现GRP-2B10与Pep3和Epi2的肽反应,GRP-3G2与Epi2和Pep5的肽反应。
(2)多肽的合成和抗原表位的确定
基于ProGRP(31-98)的氨基酸序列,用多肽法合成每个氨基酸重叠的8个连续氨基酸序列构成的61个肽。各肽末端结合生物素,委托和光纯药株式会社(大阪)合成。
将用多肽法合成的各生物素化肽在二甲基甲酰胺中溶解,用PBS稀释成1μg/mL的浓度。在抗生物素蛋白固相的96孔微量滴定板的各孔中分别添加100μL该稀释的各生物素化肽溶液,于4℃结合过夜。用含0.05%Tween20的PBS(PBS-T)将各孔洗涤后,在各孔中添加100μL将各单克隆抗体GRP-3D6-2、GRP-3G2、GRP-2B10稀释成1μg/mL的溶液。室温下反应30分钟后,用PBS-T洗涤5次,在各孔中分别添加100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体溶液,再在室温下反应30分钟后,用PBS-T洗涤5次,在各孔中分别添加100μL底物溶液(2mg/mL邻苯二胺、含0.9μL/mL 30%过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH5.0),室温下反应30分钟后,分别添加100μL 2N硫酸,立即测定492nm 处的吸光度。各单克隆抗体GRP-3D6-2、GRP-3G2、GRP-2B10对ProGRP(31-98)内部的各肽的反应如图1(A)、(B)、(C)所示。
如图1(A)所示,单克隆抗体GRP-3D6-2与ProGRP(31-98)内部的各8个连续氨基酸序列构成的肽均不结合。认为这是由于GRP-3D6-2不能识别ProGRP(31-98)的8个连续氨基酸序列构成的肽,而能识别比8个连续氨基酸序列长的肽形成的结构抗原表位。另一方面,单克隆抗体GRP-3G2与81-88、82-89、83-90、84-91这4段8个连续氨基酸序列构成的肽结合。认为单克隆抗体GRP-3G2的抗体能识别在该4段肽中存在的序列84-88的肽(图1(B))。此外,单克隆抗体GRP-2B10的抗体与68-75、69-76、70-77、71-78这4段8个连续氨基酸序列构成的肽结合。因此认为单克隆抗体GRP-2B10能识别在该4段肽中存在的序列71-75位的肽(图1(C))。
由使用这些肽的抗原表位的确定结果可知,单克隆抗体GRP-3G2或单克隆抗体GRP-2B10识别的抗原表位是由5个残基的氨基酸形成的连续抗原表位。
此外,单克隆抗体GRP-3D6-2是能识别ProGRP(31-98)的至少40-60部分的肽、且与ProGRP(31-98)内部的8个连续氨基酸序列构成的肽不发生反应的抗体。换句话说,认为被GRP-3D6-2识别的抗原表位由ProGRP(31-98)的至少40-60位氨基酸序列形成,该抗原表位是无法用各8个连续氨基酸序列构成的肽形成的结构抗原表位。
总结以上单克隆抗体识别的抗原表位的关系,如表2所示。
表2
单克隆抗体 | 抗原表位 (ProGRP的氨基酸编号) |
GRP-3G2 GRP-2B10 GRP-3D6-2 | 84-88 71-75 40-60 |
实施例3
通过组合单克隆抗体研究样品的保存稳定性
在96孔微量培养板的各孔中,以4μg/mL的浓度添加100μL 1种或2种单克隆抗体(2种时为等量混合),于4℃培养过夜,进行固相化。用 含0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)洗涤2次后,加入350μL封闭液(含0.5%酪蛋白钠的10mM磷酸缓冲液,pH7.1),静置2小时,进行封闭。除去封闭液后,在各孔中加入100μL反应液和50μL测定样品,在37℃下反应1小时。用洗涤液(含0.05%Tween20的10mM磷酸缓冲液,pH7.3)洗涤5次,添加100μL HRP标记的1种或2种单克隆抗体(2种时为等量混合)溶液,在室温下反应30分钟。用洗涤液洗涤5次,加入100μL底物溶液(2mg/mL邻苯二胺、含0.9μL/mL30%过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH5.0),培养30分钟,添加100μL 2N硫酸,停止酶反应。用酶标仪(Microplate Reader)测定492nm处(参比波长630nm)的吸光度。
使用该测定法,将3个样品分为分别在-20℃下冻干保存的样品和在室温下保存17小时的样品进行测定。将冻干保存的样品的ProGRP值设为100%,室温下保存17小时时的测定值用百分比表示(表3)。固相化抗体与标记抗体的组合分别是GRP-3G2与GRP-2B10、GRP-3G2与GRP-3D6-2、GRP-3G2与GRP-2B10/GRP-3D6-2时,保存17小时的样品的ProGRP免疫活性分别平均降为69.6%、70.6%、69.2%。此外,现有方法的固相化抗体与标记抗体的组合为GRP-3G2/GRP-2B10与多克隆抗体时,也减少至71.8%。另一方面,固相化抗体使用GRP-3D6-2、标记抗体使用GRP-2B10时,即使在室温下保存17小时,测定值也平均为89.3%,与其它抗体的组合相比,约20%的ProGRP的免疫活性得以保持(表3)。另外,多克隆抗体是使用专利第3210994号的实施例8中记载的方法获得的抗体。
表3
实施例4
使用与ProGRP(40-75)结合的抗体的测定法
在96孔微量培养板的各孔中,以4μg/mL的浓度添加200μLGRP-3D6-2,于4℃培养过夜,进行固相化。用含0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)洗涤2次后,加入350μL封闭液(含0.5%酪蛋白钠的10mM磷酸缓冲液,pH7.1),静置2小时,进行封闭。除去封闭液后,在各孔中加入100μL反应液和100μL测定样品,在37℃下反应1小时。用洗涤液(含0.05%Tween20的10mM磷酸缓冲液,pH7.3)洗涤5次,添加200μL HRP标记的GRP-2B10溶液,在室温下反应30分钟。用洗涤液洗涤5次,加入200μL底物溶液(2mg/mL邻苯二胺,含0.9μL/mL30%过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液,pH5.0),培养30分钟,加入50μL 5N硫酸,停止酶反应。用酶标仪测定492nm处(参比波长630nm)的吸光度。其标准曲线如图2所示。
根据该标准曲线,认为可以检测约为4.5pg/mL的ProGRP。该灵敏度在检测健康人样品中的ProGRP量方面具有足够的灵敏度。
试验例1
使用现有方法和本发明实施例4的测定法,将5个样品在4℃下保存1天、3天、7天后,测定样品中ProGRP免疫活性,与保存前的测定值进行比较。现有方法按如下步骤进行:在96孔微量培养板的各孔中,以10μg/mL的浓度添加100μL GRP-3G2和GRP-2B10(等量混合),于4℃培养过夜,进行固相化。用含0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)洗涤2次后,加入350μL封闭液(含0.5%酪蛋白钠的10mM磷酸缓冲液,pH7.1),静置2小时,进行封闭。除去封闭液后,在各孔中加入100μL反应液和50μL测定样品,在37℃下反应1小时。用洗涤液(含0.05%Tween20的10mM磷酸缓冲液,pH7.3)洗涤5次,添加100μL HRP标记的多克隆抗体溶液,在室温下反应30分钟。用洗涤液洗涤5次,加入100μL底物溶液(2mg/mL邻苯二胺、含0.9μL/mL30%过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH5.0),培养30分钟,加入100μL 2N硫酸,停止酶反应。用酶标仪测定492nm处(参比波长630nm)的吸光度。
将在4℃下保存前的ProGRP值设为100%,各保存期后的测定值用百分比表示。结果如表4所示。
使用现有方法时,样品中的ProGRP测定值在4℃下保存1天时平均为94.5%,保存3天时平均为85.8%,保存7天时平均为67.8%,存在1天平均降低约4.93%的倾向。另一方面,本发明的测定方法中,样品中的ProGRP测定值在4℃下保存1天时平均为96.9%,保存3天时平均为94.3%,保存7天时平均为86.9%,存在1天平均降低约2.29%的倾向。即:本发明的测定方法与现有方法相比,显示高2.15倍的保存稳定性,尤其是在保存7天时,与现有方法相比,约19%的ProGRP免疫活性得以保持。
表4
试验例2
对本发明中可使用的单克隆抗体GRP-3G2、GRP-2B10、GRP-3D6-2分别识别的抗原表位进行分析。
通过Fmoc法合成ProGRP的第31-53位肽。合成的肽通过反相色谱法或反相色谱法和凝胶过滤联用进行精制。将包括实施例2中使用的各个肽在0.1%TFA中溶解,用PBS稀释至10μg/mL的浓度。96孔微量滴定板的各孔中以每孔100μL的容量,添加到96孔ELISA板的各孔中,于4℃吸附过夜。用PBS将各孔洗涤2次后,在各孔中添加含1%BSA的PBS,在室温下培养2小时,吸除。在各孔中分别添加100μL稀释成5μg/mL浓度的单克隆抗体GRP-3G2、GRP-2B10、GRP-3D6-2,在室温下反应85分钟后,用含0.05%Tween20的PBS(PBS-T)洗涤5次。在各孔中分别添加100μL用PBS-T适当稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体溶液,再在室温下反应30分钟。用PBS-T洗涤5 次后,在各孔中分别添加100μL底物溶液(2mg/mL邻苯二胺、含0.9μL/mL30%过氧化氢溶液的0.1M柠檬酸磷酸缓冲液、pH5.0),室温下反应20分钟后,在各孔中分别添加100μL 2N硫酸,停止反应。立即测定492nm处的吸光度。结果如表5所示。
表5
由表5可知,GRP-3G2、GRP-2B10、GRP-3D6-2的反应的抗原表位显示与实施例2基本相同的结果,GRP-3D6-2与31-53位的肽完全不反应,因此确认与42-53位的肽也不反应。
试验例3
使用质量分析装置(LC-MS/MS)进行ProGRP-Cdel的鉴定。将对ProGRP(31-98)范围的各种肽显示反应性的兔子多克隆抗体在PBS(pH7.35)中溶解,使达到12.7mg/mL,根据用户手册结合3mL NHS-琼脂糖凝胶(Amersham公司)。
在2例1.5mL人血清样品中,添加20μg重组ProGRP(31-98),在室温下保存24小时。然后,添加0.4mL上述兔子多克隆抗体结合琼脂糖凝胶,在室温下搅拌60分钟。用洗涤液(含0.05%Tween20的10mM磷酸缓冲液pH7.3)洗涤该兔子多克隆抗体结合琼脂糖凝胶,添加0.5mL9.5M尿素溶液,溶出结合在兔子多克隆抗体结合琼脂糖凝胶上的物质。回收溶出液,取其一部分,使用LC-MS/MS研究人血清样品中保存的保存后的ProGRP(31-98)范围的肽。
在100μL溶出液中添加1μL 250mM甲基-PEO4-NHS酯(Pierce)溶液/DMSO,在室温下培养1小时。添加5μL 1M Tris-HCl(pH8),在室温下培养30分钟,停止反应后,添加800μL丙酮,沉淀蛋白质。离心后,干燥沉淀,向其中添加15μL Promega公司的修饰胰蛋白酶溶液 (20ng/μL/50mM碳酸氢铵),在30℃下消化过夜。在消化后的样品中添加15μL 0.1%甲酸,取以15000rpm离心5分钟的上清液5μL,进行LC-MS/MS分析{(LC部分)Agilent 1100系列毛细管LC系统,(柱)Agillent Zorbax SB-C18,5μm,150×0.5mm,(MS/MS)BrukerDaltonicsHCT-plus}。在0.1%甲酸存在下进行分离,流量为15μL/分钟,乙腈梯度为0-35%线性/0-120min、35-95%线性/120-125min。将柱溶出液导入ESI部分,获得MS/MS数据,通过数据分析软件制作峰列表,通过MatrixScience公司的MASCOT server进行分析。
甲基-PEO4-NHS具有修饰蛋白质分子内的N末端氨基和赖氨酸的侧链氨基的性质。因此,在发现的肽片段内只要N末端存在被标记的物质,则其在消化前处于N末端游离的状态。此外,在侧链氨基修饰的赖氨酸部位没有通过胰蛋白酶引起消化,因此只要C末端赖氨酸的侧链被修饰,则其在消化前已经在该部分被切断。在两血清样品中,发现了C末端赖氨酸被标记的片段NHQPPQPK(72-79)。因此认为,至少Lys-79的C末端被切断的片段是通过血清处理产生的。而且,虽然N末端没有被标记,但两血清样品中观察到SVSER(37-41)这样的片段,表明在Ser-36的C末端有被切断的可能性。
工业实用性
本发明的方法通过以新确认的、在样品中也能稳定保存的ProGRP的某种分解物上的抗原表位作为测定对象,除了能获得与现有的测定方法相同的检测灵敏度,而且采取后的样品的处理方法难以受到影响,能获得再现性高的测定值等,对血中ProGRP的检测有效。
Claims (8)
1.一种按照保藏编号FERM BP-08669保藏的杂交细胞瘤3D6-2产生的单克隆抗体,所述单克隆抗体与序列编号1所示的氨基酸序列的第40-60位的部分氨基酸序列构成的肽结合,且与序列编号1所示的氨基酸序列上的任意8个连续氨基酸序列构成的肽不结合。
2.按照保藏编号FERM BP-08669保藏的杂交细胞瘤3D6-2。
3.识别序列编号1所示的氨基酸序列的第40-75位的部分氨基酸序列构成的肽的2种以上的不同抗体在制备用于测定胃泌素释放肽前体和/或其分解物的试剂盒中的用途,其中所述的2种以上的不同抗体中至少一种是权利要求1所述的单克隆抗体,所述胃泌素释放肽前体和/或其分解物含有胃泌素释放肽前体的第40-75位氨基酸残基上残存的抗原表位。
4.如权利要求3所述的用途,其中利用三明治免疫测定法测定所述胃泌素释放肽前体和/或其分解物。
5.如权利要求3或4所述的用途,其中所述的2种以上的不同抗体中还含有按照保藏编号FERM BP-4110保藏的杂交细胞瘤2B10产生的单克隆抗体。
6.一种含有识别序列编号1所示的氨基酸序列的第40-75位的部分氨基酸序列构成的肽的2种以上的不同抗体并用于测定胃泌素释放肽前体或其分解物的试剂盒,其中,所述2种以上的不同抗体中至少一种是权利要求1所述的单克隆抗体,所述胃泌素释放肽前体和/或其分解物含有胃泌素释放肽前体的第40-75位氨基酸残基上残存的抗原表位。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其中还含有按照保藏编号FERMBP-4110保藏的杂交细胞瘤2B10产生的单克隆抗体。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒,其是用于癌诊断的试剂盒。
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