CN106191022A - 一种肿瘤特异抗原及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤特异抗原及其应用，肿瘤特异性抗原TOP-1-40的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。采用蛋白双向电泳方法结合癌症血清学的免疫印迹、抗体捕获酶联免疫测定方法从癌细胞株细胞和癌症组织中分离获得。通过特异性的抗该抗原的多克隆抗体，采用重组蛋白方法、免疫印迹、荧光免疫组化、抗体捕获酶联免疫测定等方法确定该抗原为DNA拓扑异构酶I的一个分子量约为40kd蛋白片段，命名为TOP-1-40。该抗原含量在常见癌症组织普遍增高，而在相应的正常组织则检测不到或含量很低。通过抗体捕获酶联免疫测定方法检测血清中抗该抗原的自身抗体的浓度，可以用于常见癌症的早期筛查。其检测方法有95-100％的特异性，61-66％的敏感性。具有临床应用的良好前景。

Description

一种肿瘤特异抗原及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种肿瘤特异抗原及其应用。
背景技术
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。据国内外调查报告，由癌症导致的死亡病例占因疾病死亡人数的首位。其主要原因是癌症不容易被早期发现，临床上确诊的大多数病例已届疾病的中晚期。现有的临床治疗癌症的方法对中晚期癌症病人疗效有限，而对早期病人则效果显著。因此，治疗癌症最佳途径之一就是要能够早期诊断。
医学影像学如CT，B超，X-光以及病理活检要等到癌细胞发展到一定程度时方能发现。检测血液或其它体液中肿瘤标志物是一种对病人即无损害又能早期发现癌症的癌症诊断手段。过去数十年，已有大量肿瘤标志物用于临床。但是，至今为止，应用的肿瘤标志物特异性不强：不仅在癌症病人增高，而且在良性肿瘤患者或其他非肿瘤疾病亦可能增高；只能作为癌症诊断的辅助手段。因此，要进行癌症早期诊断，其中一个途径就是发现新的肿瘤标志物：不仅能够确定病人患有癌症，而且可能出现在癌症早期。抗肿瘤相关抗原的自身抗体就是这样一类生物标记物，因为在健康人群中少有抗肿瘤相关抗原的自身抗体的存在(Reuschenbach M et al.,Cancer Immunol Immunother 2009；58:1535-1544)。
肿瘤在发生和发展过程中可能产生一些相关的肿瘤抗原，诱发免疫系统产生抗这些抗原的自身抗体。这些免疫反应的启动同自身免疫疾病不同。在正常生理状况下，免疫系统存在自身免疫耐受的机制，能防止免疫系统直接产生抗自身抗原的免疫反应。自身免疫耐受机制受损能够导致自身免疫疾病，主要表现为慢性炎症和组织受损(Mason RJ et al.,Respiration2006；11(Suppl):S12-S15)。而抗肿瘤相关抗原的免疫反应不仅包括免疫耐受机制受损，而且涉及肿瘤抗原本身变异而引致的免疫反应的增强(Dobbs LG et al.,Am J Physiol 1997；273:347-354)。肿瘤抗原本身变异包括基因变异产生带有新的抗原表位的蛋白质(如P53)(DeNiuP et al.,Mol Cell Endocrine 2000；162:131-144)，蛋白表达后的修饰产生抗原性(如低糖基化MUC1)(Varghese R et al.,Endocrinol 1998；139:4714-4725)以及组织表达特异性的变异(如NY-ESO-1)(Chang AC et al.,Mol Cell Endocrinol 1995；112:241-247)等等。
早在上世纪70年代就开始了检测抗肿瘤自身抗体的研究。到上世纪90年代由于分子生物学，多肽合成工艺和测定技术的发展，有了很大的进展。但是，现今发现有临床应用价值的抗肿瘤相关抗原的自身抗体在癌症病人阳性率均相对较低(从2％-50％)。因此，一方面科学家们继续搜寻具有高度敏感性能够用于癌症筛查的抗肿瘤相关抗原的自身抗体，另一方面试图采用抗肿瘤相关抗原的特异自身抗体列阵技术以提高临床筛查或诊断的敏感性和特异性。最近由美国Innovative Diagnostic laboratory公司研发的EarlyCDT@-Lung试剂盒采用了6-7个抗肿瘤相关抗原的特异自身抗体作为列阵用于对肺癌高危人群的早期筛查。结果显示该试剂盒具有93％的特异性和41％的敏感性(Caroline J et al.,Tumor Biol 2012；33:1319-1326)。但其敏感性有待于进一步的改进。
肿瘤相关抗原的筛选的研究和临床应用已有相当长的时间。研究和临床应用过程分为4个阶段。第1阶段主要是用人的癌组织免疫兔子或其他动物；然后用各种吸附技术把动物血清中和正常组织起反应的抗体清除；再用免疫沉淀方法分析癌组织有那些特异性抗原与这些动物血清中的抗体起反应。有两个肿瘤标志物由此检定出来。一是CEA(Abelev GI et al.,Transplantation 1963；1:174-180)，另一个是AFP(Gold P et al.,J Exp Med 1965；122:467-468)。第2阶段则是用鼠的细胞毒自身抗体和单克隆抗体技术发现了不少的淋巴细胞表面抗原，如CD8THY-1和PCA等(Boyse EA and Old LJ.Annu Rev Genet 1969；3:269-290)。第3阶段是用正常细胞吸附癌症病人血清中的自身抗体来鉴定肿瘤特异性抗原。在这个阶段仅有少量的肿瘤细胞表面抗原鉴定出来。主要是由于方法灵敏度差；癌症病人血清中的自身抗体滴度不足以把检测到的肿瘤抗原的纯化和克隆(Old LJ,and Chen YT.J Exp Med 1998；187:1163-7)。第4阶段是发明了称之为SEREX的技术。该技术应用癌症血清学方法结合基因芯片技术筛查肿瘤组织的cDNA文库(Old LJ,and Chen YT.J Exp Med 1998；187:1163-1167)。第4个阶段另一个重要的技术发明是应用癌症血清学方法结合蛋白组学筛查肿瘤组织表达蛋白，然后采用质谱分析方法推断与癌症血清自身抗体特异结合的蛋白(Kobayashi1R.Clinical Cancer Res 2001；7,3325–3327)。
DNA拓扑异构酶是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化DNA链的断裂和结合，参与了DNA超螺旋结构模板的调节，从而控制DNA的拓扑状态。拓扑异构酶分为两类：一类叫拓扑异构酶I，另一类叫拓扑异构酶II。拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链。拓扑异构酶II能同时断裂并连接双股DNA链。
在生物体的整个生命过程中，细胞遗传物质DNA起着十分重要的作用。但是DNA的超长度和双螺旋性质使其在复制和重组期间经常缠绕,阻碍DNA的复制、转录和重组。DNA拓扑异构酶通过在DNA的核糖-磷酸主链上产生移过性的断裂而改变DNA的拓扑结构解开DNA的超长度和双螺旋性质,再通过逆向的转酯反应恢复DNA的完整性。
在肿瘤细胞中拓扑异构酶的活性及含量远远高于正常细胞。抑制拓扑异构酶的活性就有可能抑制肿瘤细胞的快速增值，进而杀死肿瘤细胞。因此，DNA拓扑异构酶已经被公认为抗癌药物的作用靶点。其中，拓扑异构酶I的抑制剂喜树减(CPT)的衍生物：拓扑替康和依立替康已成为在临床上治疗直结肠癌、卵巢癌和肺癌常规治癌的化疗药物(Pommer Y et al.,Chenistry&Biology.2010；17:421-433；Xu Yand Her CT.Biomolecules 2015；5:1652-1670)。但是，尚无研究报道将检测拓扑异构酶表达作为癌症诊断或筛查的肿瘤标志物。
不过，早在上世纪80年代已发现检测血清中一种抗拓扑异构酶I的自身抗体，称为抗SCL-70自身抗体，能够用于自身免疫疾病的系统性硬皮病的诊断(Guldner HH。Et al.,Chromosoma 1986；94:132–138)。抗SCL-70自身抗体对系统性硬皮病的诊断的敏感性为28-70％。，并与疾病的严重性相关(de Rooij DJ et al.,Clin.Rheumatol.1989；8:231–237)。
拓扑异构酶I蛋白分子量为100-105kd。SCL-70是分子量为70kd的拓扑异构酶I片段。如上所述，自身免疫疾病发生主要是由于免疫耐受机制受损。因此，抗SCL-70自身抗体即使与系统性硬皮病同时发生癌症的病人也无显著的相关关系(Joseph CG et al.,Science.2014；343(6167):152–157)。本研究发现的拓扑异构酶I蛋白40kd的片段则是在肿瘤发生和发展过程中出现的肿瘤相关抗原，从而引起癌症病人产生抗该抗原的自身抗体的免疫反应。
发明内容
本发明目的是提供一种肿瘤特异性抗原及其应用，用于肿瘤早期的诊断和筛查。
发明人研究首次发现，在肿瘤发生和发展过程中，出现了一种肿瘤相关抗原，其为拓扑异构酶I蛋白的片段，分子量大约为40Kd，命名为TOP-1-40，该肿瘤相关抗原能引起癌症病人产生抗该抗原的自身抗体的免疫反应，产生的抗体命名为抗TOP-1-40自身抗体，该抗TOP-1-40自身抗体为癌症病人特有的一种产物，因此，通过测定样本中抗TOP-1-40自身抗体的量，就能判断是否有肿瘤的发生。
本发明的技术方案为：
一种肿瘤特异性抗原，命名为TOP-1-40，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该新的肿瘤特异性抗原采用蛋白组学方法结合肿瘤血清学方法，从肿瘤组织中分离获得。
本发明的肿瘤特异性抗原在制备检测肿瘤的诊断试剂或试剂盒中的应用。
一种含有本发明的的肿瘤特异性抗原的酶联免疫诊断试剂或试剂盒。
本发明的肿瘤特异性抗原或含有本发明的肿瘤特异性抗原的酶联免疫诊断试剂或试剂盒在检测抗TOP-1-40自身抗体上的应用。
肿瘤特异性抗原的酶联免疫试剂盒，试剂盒包括TOP-1-40包被的微孔板；浓缩洗涤缓冲液为：200mmol/L的磷酸缓冲液和1.0％的吐温20；浓缩样本稀释液为：1％的小牛白蛋白和100mmol/L的磷酸缓冲液；质控品1为：阳性对照和三羟甲基氨基甲烷缓冲液；指控品2为：阴性对照和三羟甲基氨基甲烷缓冲液，校准品为：抗TOP-1-40自身抗体；酶标液为：辣根过氧化物酶标记的600ng/ml的抗人IgG抗体；底物液为：1.2mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺和2.4mmoL/L过氧化氢；终止液为1mol/L的盐酸。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明涉及一种新的肿瘤特异性抗原，采用蛋白双向电泳方法结合癌症血清学的免疫印迹、抗体捕获酶联免疫测定方法从癌细胞株细胞和癌症组织中分离获得。通过特异性的抗该抗原的多克隆抗体，采用重组蛋白方法、免疫印迹、荧光免疫组化、抗体捕获酶联免疫测定等方法确定该抗原为DNA拓扑异构酶I的一个分子量约为40kd蛋白片段，命名为TOP-1-40。该抗原含量在常见癌症组织普遍增高，而在相应的正常组织则检测不到或含量很低。通过抗体捕获酶联免疫测定方法检测血清中抗该抗原的自身抗体的浓度，可以用于常见癌症的早期筛查。其检测方法有95-100％的特异性，61-66％的敏感性。具有临床应用的良好前景。
附图说明
图1中A为双向电泳分离纯化非小细胞肺癌组织匀浆蛋白，考马斯亮蓝染。
图1中B为以非小细胞肺癌病人的混合血清为抗血清，对肺癌组匀浆蛋白双向电泳进行免疫印迹分析。图1(A)上的箭头指示通过双向电泳图谱和免疫印迹比对证明癌组织存在一种特异抗原能被癌症病人血清中自身抗体识别。
图2中A为比较非小细胞肺癌患者的混合血清与各种自身抗体阳性血清对该肿瘤抗原的免疫活性。比较的自身抗体阳性血清有：抗细胞角蛋白19(CK-19)自身抗体、抗环瓜氨酸肽(CCP)自身抗体、抗胰岛(islet)自身抗体、抗双链DNA(dDNA)自身抗体、抗皮肌炎(DM)自身抗体、抗核糖体(Ribosome)自身抗体、抗组织胺(histamine)自身抗体、抗磷脂(aPL)自身抗体、抗P53自身抗体和抗核抗体(ANA)自身抗体。正常健康人的血清作为对照(con)。结果表示为均数±标准误。*表示与对照相比：P<0.001.
图2中B为比较6种抗核抗体对该肿瘤抗原的免疫活性比较。结果表示为均数±标准误。*表示与对照相比：P<0.001。
图3中A为抗SCL-70抗体和抗该肿瘤抗原抗体(抗体的制备见实施例2)抗体稀释曲线的比较。
图3中B为抗SCL-70抗体和抗该肿瘤抗原抗体的竞争实验，证明这两种抗体对该肿瘤抗原有交叉反应。
图4为免疫印迹分析抗SCL-70抗体和抗肿瘤抗原抗体对人DNA拓扑异构酶I(TOP-1)分段克隆的重组蛋白的免疫反应。1＝TOP-1一个209氨基酸重组蛋白片段，2＝TOP-1一个224氨基酸重组蛋白片段，3＝TOP-1一个149氨基酸重组蛋白片段，4＝TOP-1一个208氨基酸重组蛋白片段。免疫印迹结果显示片段3和4与抗该抗原的特异性抗体有较强的免疫反应，合并分子量约为40kd。因此，该抗肿瘤抗原抗体命名为抗TOP-1-40抗体。
图5-1.为免疫印迹分析抗TOP-1-40抗体的特异性。A为SDS-Page电泳，考马斯亮蓝染。B为用抗体进行免疫印迹分析的结果。M＝蛋白marker，1为MCF乳腺癌细胞株细胞匀浆；2为肺癌组织匀浆。3和4为相应的免疫印迹结果。
图5-2.为免疫荧光染色分析抗TOP-1-40抗体的特异性。A为乳腺癌细胞株MCF-7，B为急性白血病。
图6-1为乳腺癌(A)、正常乳腺组织(B)、卵巢癌(C)、正常卵巢组织(D)、子宫内膜癌(E)和正常子宫内膜组织(F)的免疫组织化学染色对比。
图6-2为食道鳞癌(A)、正常食道组织(B)、直结肠癌(C)、正常直结肠组织(D)、胃癌(E)和正常胃组织(F)的免疫组织化学染色对比。
图6-3为肝癌(A)、正常肝脏组织(B)、非小细胞肺癌(C)、正常肺组织(D)、膀胱癌(E)和正常膀胱组织的免疫组织化学染色对比。
图7中A为免疫印迹分析各种癌症病人的血清与重组TOP-1-40的反应。第1-10行分别为直结肠癌病人(CRC367、CRC369)，胃癌病人(GC010、GC017)，食道癌病人(ESCC408、ESCC439),非小细胞肺癌病人(NSCLC446、NSCLC411)和乳腺癌病人(BC1、BC2)的血清与重组TOP1-F的反应。11和12行为正常健康人的血清与重组TOP-1-40的反应。
图7中B为上述癌症病人血清先与重组TOP-1-40孵化后，再用酶联免疫方法检测这些抗原阻断后的血清与重组TOP-1-40的反应。*表示抗原阻断前后相比：P<0.05。
图8酶联免疫方法检测早期(I-II期)直结肠癌(N＝47)，胃癌(N＝29)，食道鳞癌(N＝55)和非小细胞肺癌(N＝71)患者年龄和性别配对的血清中抗TOP-1-40自身抗体反应，并与结肠良性肿瘤(N＝18)，胃良性肿瘤(N＝12)，食道良性肿瘤(N＝30)和肺良性肿瘤(N＝18)和正常健康人(N＝700)比较。水平线表明阳性判断的临界值(cutoff)。
图9为抗TOP-1-40自身抗体早期诊断直结肠癌，胃癌，食道鳞癌和非小细胞肺癌的ROC曲线图。抗TOP-1-40自身抗体对直结肠癌早期诊断有61％的敏感性和100％特异性(AUC＝0.832)。对胃癌早期诊断有64％的敏感性和95％特异性(AUC＝0.847)。对食道鳞癌早期诊断有66％的敏感性和100％特异性(AUC＝0.875)。对非小细胞肺癌早期诊断有80％的敏感性和100％特异性(AUC＝0.964)。
图10为抗TOP-1-40自身抗体的校准品曲线。
具体实施方式
实施例1肿瘤特异性抗原TOP-1-40的分离纯化和筛选
1.材料和方法
(1)组织匀浆：
将肺癌组织在裂解液中(0.5％NP40,0.15M NaCl，5mM EDTA，50mM Tris，1mM PMSF)用组织匀浆器匀浆。然后4℃，12000rpm离心，合并上清液。
(2)双向电泳分离肿瘤抗原:
实验包括第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳。第一向等电聚焦电泳步骤如下：
●取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(1ml/管)，置室温溶解。在小管中加入0.01g DTT和Bio-Lyte 4-72.5ml，充分混匀。
●再从混匀的水化上样缓冲液取出400ml，加入100ml样品，充分混匀。
●从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm pH 4-7)，室温中放置10分钟。
●沿着聚焦盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。
●将IPG胶条置于聚焦盘中样品溶液上，覆盖2-3ml矿物油。
●对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序进行等电聚焦电泳。
第二向SDS-PAGE电泳步骤如下：
●用含有SDS的缓冲液处理等电聚焦电泳后的IPG胶条30min，使SDS与蛋白质充分结合。
●将处理过的凝胶条放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，然后进行电泳。
●电泳结束后，取出凝胶，进行染色。
(3)肿瘤抗原的筛选：
将第二向SDS-PAGE电泳分离的蛋白转移至PVDF膜上,用肺癌患者的自身血清进行免疫印迹分析。
(4)肿瘤抗原的鉴定：
将用免疫印迹确定的蛋白回收，包被在酶标板上，2μg/ml,每孔50μl，4℃过夜。然后将包被的酶标板作封闭处理。加入1:100各种自身抗体阳性的血清或各种抗核抗体或抗TOP-1-40抗体(该抗体的制备见实施例2)，每孔50μl，在室温下孵化1小时。再次洗板4次，加入TMB显色。
(5)肿瘤抗原的确定：
(5-1)从(4)肿瘤抗原的鉴定的实验结果(见本实施结果)，可以确定该肿瘤抗原是DNA拓扑异构酶I(TOP-1)的一个片段。为确是定哪一个片段，进行如下实验：
(5-2)重组TOP-1不同片段：
(5-2-1)获得目的基因
●从基因库中调取TOP-1基因序列，将CDS区域247-2544bp分成四段，用Primer 5.0软件设计引物。片段1(247-873bp)引物为T1F和TIR；片段2(820-1491bp)引物为T2F和T2R；片段3(1474-1920bp)引物为T3F和T3R；片段4(1903-2544bp)引物为T4F和T4R(见表1：加粗部分为BamHⅠ和HindⅢ酶切位点)。并将设计的引物交生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1:TOP-I扩增引物
Primer名称 序列(5'to3') 碱基数
T1F CCGGATCCATGAGTGGGGACCAC 23
T1R AGGGGTACCCTCTTCTTCCCACCAT 25
T2F ATGGATCCAAAAAGAAGCCGAAG 23
T2R CTCGGTACCGGAAACCAGCCAAGT 24
T3F ATGGATCCGTTACTTGGCTGGTT 23
T3R CTCGGTACCCTTGTTCTCCATAAA 24
T4F ACGGATCCCTATTTATGGAGAACAA 25
T4R CGCGGTACCCTAAAACTCATAGTC 24
●因乳腺癌细胞株MCF-7有较高的TOP-1-40表达(见实施2)，取细胞株匀浆处理后，采用TRNzol方法提取总RNA。
●采用两步法进行RT-PCR将要克隆的目的基因扩增。反转录(RT)反应体系和反应条件如表2；聚合酶链式反应(PCR)反应体系和反应条件如表3。
表2.反转录反应
表3.PCR反应
●将扩增出的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳切胶方法，用天根公司的TIANgel MidiPurification Kit按照操作说明书纯化。
(5-2-2)质粒构建：
●将表达载体(PQE30UA)用BamHⅠ、HindⅢ酶切体系酶切。酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收载体。
●同时PCR产物用BamHⅠ、HindⅢ酶切体系酶切目的基因，纯化后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
(5-2-3)获得含重组表达质粒的表达菌种
●测序验证目的基因阅读框架正确。
●以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
(5-2-4)诱导表达
●挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB中37℃过夜培养。
●将1ml菌加入到含50ml LB培养基的培养瓶中,37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0。
●取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
●分别取菌体1ml,离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1％SDS重悬，混匀,70℃10m。
●离心1min(12000g)，取上清作为样品,做SDS-PAGE分析。
(5-2-5)重组蛋白纯化
●将IPTG诱导表达的菌体用液氮反复融冻破碎菌体。
●然后，5000rpm离心5min，收集上清液进行亲和层析纯化。
●将Ni亲和层析试剂装入10x 1cm层析柱，试剂体积2ml。
●将收集上清液上柱。加入洗脱液分步洗脱。
●每1ml分步收集洗脱液。测定各洗脱液的蛋白浓度。
●将TOP-1各片段重组蛋白作SDS-PAGE，并将电泳分离的蛋白转移至PVDF膜上，用抗TOP-1-40的多克隆抗体和抗SCL-70抗体进行免疫印迹分析。
2.结果
用双向电泳方法分离肺癌组织匀浆上清液，经考马斯亮蓝染色后获得了分辨率较高双向电泳图谱(图1中A)。用患者自身血清进行免疫印迹分析,获得分辨率较高的免疫印迹反应图谱(图1中B)。将双向电泳图谱和免疫印迹反应图谱比对后确定能与患者自身血清中自身抗体特异反应的抗原蛋白(图1中A上的箭头所指)。该抗原等电点为6.1，分子量为43kd。
用抗体捕获酶联免疫方法测定显示该分离纯化的抗原与抗核抗体(ANA)阳性血清和肺癌患者的血清有较强的抗原-抗体反应，而对其他自身抗体的阳性血清或正常健康人血清则没有发现较强的抗原-抗体反应(图2中A)。
因为ANA是一组抗细胞核不同组分多种抗体。又因为在上述试验中发现该抗原与ANA有较强的抗原-抗体反应，我们用不同的抗核抗体进一步进行酶联免疫测定。图2中B显示抗核抗体中的抗SCL抗体对该抗原有较强抗原-抗体反应，而对其他抗核抗体则无反应。
图3中A显示人抗人SCL抗体和我们研发的兔抗人TOP-1-40多克隆抗体滴度比较。两种抗体对该抗原(TOP-1-40)的抗体反应滴度曲线基本上是平行的。图3中B显示当TOP-1-40多克隆抗体保持一个浓度时，逐渐增高的抗人SCL抗体能竞争性地结合抗TOP-1-40多克隆抗体结合位点。
再用纯化的TOP-1不同片段重组蛋白采用抗人SCL抗体和我们研发的兔抗人TOP-1-40多克隆抗体进行免疫印迹分析证明该抗原为TOP-1其中一个片段。氨基酸序列为TOP-1氨基酸序列的410aa-766aa(见SEQ ID NO:1)，分子量约为40kd。与TOP-1的SCL片段氨基酸序列有重叠(图4)。
上述结果证明采用蛋白组学分离纯化癌组织蛋白，然后用癌症病人混合血清，以免疫印迹方法确定有无肿瘤特异性抗原是一种有效的肿瘤特异性抗原筛选有效的方法。进一步采用各种不同自身抗体阳性血清确定这种自身抗体不同于自身免疫疾病的自身抗体，但与抗DNA拓扑异构酶I(SCL-70)有一定的交叉反应，说明该自身抗体可能是一种抗DNA拓扑异构酶I的抗体。最后采用重组蛋白的方法，分别用抗SCL-70抗体和抗该抗原的抗体进行免疫印迹分析比较，确定该抗原是不同于DNA拓扑异构酶I的SCL-70蛋白片段。该蛋白片段含量在各种常见的癌症表达增高，而在相应的正常组织检测不到或很少(见实施例3)，表明该抗原是一种肿瘤相关的特异性抗原。
实施例2兔抗人TOP-1-40多克隆抗体的制备
1.材料和方法
●将从双向电泳分离纯化的目标蛋白作为免疫原。
●将目标蛋白用生理盐水稀释至500μg/ml。首次，与完全弗氏佐剂按1:1比例混合，然后在新西兰白兔皮下注射免疫。之后，用不完全弗氏佐剂与纯化的目标蛋白按1:1比例混合，继续免疫动物，间隔1-2周，连续4次。用抗体捕获酶联免疫方法检测抗该目标蛋白的抗体滴度，滴度达到一定高度后，最后再进行一次加强免疫。
●三天后，从动物的下腔动脉取血，离心3000rpm分离血清。
●采用蛋白G亲和柱(Sigma)按商品说明书进行抗体纯化。纯化的抗体浓缩后储存在-80C备用。
●采用免疫印迹和免疫荧光方法检测抗体的特异性
2.结果
图5中A显示该抗目标蛋白的的多克隆抗体的免疫印迹图谱。在乳腺癌细胞株MCF-7和肺癌组织匀浆具有一条分子量为40Kd的一条免疫印迹带。图5中B为用荧光免疫检测图谱，显示该抗体在MCF-7细胞株和急性白血病患者的血液涂片中的细胞核有较强的免疫反应，在细胞浆或细胞膜则无免疫反应。
上述结果证明由双向电泳分离纯化的目标蛋白作为免疫原得到的多克隆抗体能够特异性地识别该目标蛋白；可以应用于各种免疫检测如免疫组化、免疫印迹和酶联免疫测定。为进一步研究TOP-1-40蛋白片段在肿瘤发生和发展中的作用和机理以及临床应用提供了有用的工具。
实施例3免疫组化检测TOP-1-40在癌症的含量
1.材料和方法
此次研究的癌症组织样品包括直结肠癌(40例)，非小细胞肺癌(20例)，胃癌(20例)，乳腺癌(35例)，子宫内膜癌(20例)，食道癌(15例)，卵巢癌(10例)肝癌(10例)和膀胱癌(10例)，和相应的正常组织。这些样品均经四川省人民医院病理科病理检测确认。
采用抗TOP-1-40多克隆抗体，以常规免疫组化方法检测TOP-1-40在各种不同的癌组织的表达并与相应的正常组织进行比较。抗TOP-1-40多克隆抗体的特异性，已采用免疫印迹法和免疫荧光法得到证明(见实施例2)。
免疫组化方法的操作如下：
●第一步为预处理组织切片；4μm厚的石蜡包埋组织切片贴在多聚左旋赖氨酸处理过的玻片上。组织贴片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精(100％，90％，80％，70％)脱水。然后将组织贴片置于0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中120℃高压5min进行抗原修复。用0.01M磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，PH 7.0)冲洗3次，每次5min。组织贴片中内源性过氧化物酶采用0.03％过氧化氢在室温下封闭30分钟。0.01M PBS冲洗3次，每次5min后，进一步用10％正常羊血清工作液室温下封闭10min。
●第二步滴加用10％BSA溶液稀释的1:100的抗TOP-1-40片段多克隆抗体(一抗)与预处理的组织切片4℃孵化过夜。然后0.01M PBS冲洗3次，每次5min。再滴加用10％BSA溶液稀释的1:200的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(二抗)37℃孵育30min,0.01M PBS冲洗3次，每次5min。加入DAB/H2O2显色液，进行免疫组织化学显色。在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，自来水充分冲洗后，苏木素复染，经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，拍照。
●对阴性对照切片，则不滴加一抗而仅用10％BSA溶液。
2.结果
图6-1、图6-2和图6-3中A，B和C分别显示TOP-1-40在各种常见癌症有不同程度的表达的免疫组化切片；而在相应的正常组织则无或弱表达。
将染色的切片分为4类：无标达(-，无阳性染色)，低标达(+，阳性染色细胞<25％),中度表达(++，阳性染色细胞在25％至50％之间)，强表达(+++，阳性染色细胞>50％)。
根据这种分类的结果见下表4。在相应的正常组织未检测到或仅有低表达。
表4：免疫组化检测抗TOP-1-40在癌症的含量
本研究应用本发明的抗TOP-1-40多克隆抗体世界上首次发现TOP-1-40在各种常见癌症组织含量增高；表明TOP-1-40出现是恶性肿瘤的一个普遍的现象。
实施例4酶联免疫方法检测血清中抗TOP-1-40自身抗体和临床应用
1.材料和方法
(1)检测样品
收集早期(I-II期)直结肠癌(N＝47)，胃癌(N＝29)，食道鳞癌(N＝55)和非小细胞肺癌(N＝71)患者的血清样品这些癌症病人中男性155例，女性55例。年龄从30-74岁，平均57岁。同时收集年龄和性别配对的700健康人血清样品作为该临床研究的正常对照。这些正常人中男性有511例，女性有189例。此外，收集18例患直结肠良性肿瘤，12例患胃良性肿瘤，30例患食道良性肿瘤和18例患肺良性肿瘤患者的血清样品作为检测抗TOP-1-40自身抗体恶性肿瘤特异性的对照。
(2)检测方法：
将纯化的TOP-1-40包被在酶标扳上；4C过夜。洗涤两次后对包被的酶标板作封闭处理。然后加入1:100稀释的血清样品，室温下孵化1小时，让血清中的抗TOP-1-40自身抗体与TOP-1-40结合。洗涤4次后，再加入1:1000的抗人抗体HRP复合物，室温下孵化1小时。结合到抗TOP-1-40自身抗体通过抗人抗体HRP复合物催化酶底物(TMP)显色。显色程度与血清中与TOP-1-40特异性结合的自身抗体相关。其浓度则通过与标准血清比较计算确定。
为检验抗TOP-1-40自身抗体酶联免疫检测的特异性，将1：100的癌症病人的血清在37℃与30μg/ml的重组TOP-1-40孵化1小时。然后用上述酶联免疫方法进行测定。比较用TOP-1-40预吸收的样品与未处理的样品的差别。
第二种方法即采用重组的TOP-1-40进行SDS-PAGE电泳分离，然后转移至PVDF膜上，用1:100的癌症病人及正常人血清进行免疫印迹分析。
(3)统计学分析
用方差分析方法比较各种类型癌症病人的抗TOP-1-40自身抗体浓度与正常健康人及相应良性肿瘤病人进行比较。用ROC曲线分析方法确定测定血清中抗自身抗体浓度对这4种癌症临床诊断的特异性，敏感性和临界值。
2.结果
图7显示无论采用免疫印迹分析或抗原-抗体竞争性自身抗体酶联免疫检测均证明该抗TOP-1-40自身抗体酶联免疫测定的特异性。图8则显示早期直结肠癌、胃癌、食道鳞癌和非小细胞肺癌患者血清中抗TOP-1-40自身抗体均显著地高于正常健康人群和相应的良性肿瘤患者。图9显示采用ROC曲线分析，对早期直结肠癌、胃癌、食道鳞癌和非小细胞肺癌诊断的特异性和敏感性分别为：早期直结肠癌的特异性＝100％，敏感性＝61％；早期胃癌的特异性＝95％，敏感性＝66％；早期食道鳞癌的特异性＝100％，敏感性＝64％；早期非小细胞肺癌的特异性＝100％，敏感性＝66％。
从上述结果证明在早期直结肠癌、胃癌、食道鳞癌和非小细胞肺癌患者血清中存在较高浓度的抗TOP-1-40自身抗体。表明身体免疫系统能够较早地对TOP-1-40抗原性的变异作出反应。而在正常健康人群以及相应良性肿瘤抗TOP-1-40自身抗体很低。因此，检测抗TOP-1-40自身抗体是一个新的肿瘤标志物；有可能用于癌症的早期筛查。
实施例5检测血清中抗TOP-1-40自身抗体酶联免疫试剂盒
表5：试剂盒组成及贮藏条件
编号及名称 主要成分
96孔微孔板 抗原包被的微孔板
浓缩洗涤缓冲液(10×) 磷酸缓冲液(200mmoL/L)、吐温-20(1.3％)。使用前稀释。
浓缩样本稀释液(5×) 小牛白蛋白(1％)、磷酸缓冲液(100mmoL/L)。使用前稀释。
质控品1(1.0ml×1) 阳性对照、三羟甲基氨基甲烷缓冲液
质控品2(1.0ml×1) 阴性对照、三羟甲基氨基甲烷缓冲液
校准品(1.0ml×6) 抗top-1-40自身抗体
酶标液(IgG) 辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体(600ng/ml)。直接使用。
底物液 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(1.2mmoL/L)、过氧化氢(2.4mmoL/L)。直接使用。
终止液 盐酸(1moL/L)。直接使用。
测定原理
用重组蛋白的方法克隆和纯化的TOP-1-40。该抗原与病人血清中的抗TOP-1-40自身抗体特异性结合后加入抗-人抗体-HRP复合物形成抗体-抗原-抗体复合物，加入酶底物显色。显色程度与病人血清中抗TOP-1-40自身抗体的含量相关。
操作步骤
1.样品处理
取病人全血2ml室温(25℃)120xg离心800rpm 20分钟。分离血清，当日稀释测定或-20℃储存备用。
2.ELISA操作步骤
●阳性对照、阴性对照和病人血清用样品稀释液100倍；在96孔包被板中以复管方式分别加入阴性对照稀释样品，阳性对照稀释样品、病人稀释样品和校准品，每孔100μl
●室温25℃震荡器摇震1小时
●用双蒸水稀释20x洗涤液为洗涤工作液稀释20倍，用洗涤工作液洗板4次
●抗人抗体-HRP复合物用样品工作液稀释成1：10000
●向每孔加稀释抗人抗体-HRP符合物100μl
●室温25℃震荡器摇震1小时
●用洗涤工作液洗板4次
●依次加入TMB A液和B液各一滴(50μl)，室温25℃显色10分钟
●每孔加终止液50μl，终止显色反应
●以450nm波长，630nm参考波长在酶标仪上读取ELISA结果
3.质量控制：
●每次测定时应做阴性，阳性对照和校准品测定，以便对所有试剂和操作做出评价
●为了得到有效的测定结果，须满足下列要求：
1)阳性对照的光密度值＞0.2，而阴性对照值＜0.2
2)校准品吸光度值：0＜校准品1＜校准品2＜校准品3＜校准品4＜校准品5。
4.结果计算
先计算各复管测定值的平均光密度，然后使用直线回归拟合进行校准，分别以校准品0～5的浓度和其吸光度值为横、纵坐标绘制标准曲线，根据样品吸光度值计算其在标准曲线上对应的抗体浓度(U/ml)。
5.本方法测定抗TOP-1-40自身抗体参考值
正常人参考值为：0.2–1.40，平均值为：1.13。
6.注意事项：
1)采样应当日分离血清(或血浆)，如不当日测定样品应储存于-20℃
2)准确加入阴阳性对照稀释样品，标准血清和病人稀释样品
3)每次显色时间应严格定为10-15分钟
5.规格
该试剂盒可用于42人份测定。
6.有效期
该试剂盒有效期为至检定之日起6个月。
结果
1.抗TOP-1-40自身抗体的校准品曲线如图10所示。
2.正常健康人、早期(I-II期)和晚期(III-IV期)食道癌、胃癌、结直肠癌和非小细胞肺癌病人血清中抗TOP-1-40自身抗体浓度的比较：
正常健康人抗TOP-1-40自身抗体浓度平均为1.13U+0.05/ml。
表3：病人血清中抗TOP-1-40自身抗体浓度的比较
结论
从上述研究结果可得出如下结论：1)食道癌、胃癌、结直肠癌和非小细胞肺癌病人血清中抗TOP-1-40自身抗体显著高于正常健康人；早期食道癌、胃癌、结直肠癌和非小细胞肺癌病人血清中抗TOP-1-40自身抗体或阳性率明显高于晚期癌症病人，说明身体身体免疫系统对该肿瘤相关抗原的免疫反应发生在疾病的早期。因此，检测血清中抗TOP-1-40自身抗体可用于这些常见癌症的早期筛查。
总结
TOP-1-40是我们在世界上首次发现的一种特异性的肿瘤抗原。该抗原在常见的癌症组织均有出现。癌症病人对该抗原会产生抗该抗原的特异性自身抗体。我们采用检测TOP-1-40特异自身抗体的酶联免疫试剂盒检测了多例各种癌症病人，并与健康人或相应良性肿瘤患者比较。确定血清抗TOP-1-40自身抗体的临界值。早期直结肠癌、胃癌、食道鳞癌和非小细胞肺癌患者抗TOP-1-40自身抗体的阳性率为61.8-67.6％不等。而且抗该抗原的特异性自身抗体产生在癌症早期较癌症晚期较高。用ROC曲线分析发现：诊断早期食道癌，肺癌，胃癌和直结肠癌的敏感性和特异性分别为：61％和100％，66％和95％，64％和100％，66％和100％；远远高于国际上现有检测肿瘤相关抗原自身抗体的试剂盒。因此，仅检测抗TOP-1-40自身抗体就可能作为癌症早期筛查和诊断的新指标。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (5)

1.一种肿瘤特异性抗原，命名为TOP-1-40，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的一种肿瘤特异性抗原在制备检测肿瘤的诊断试剂或试剂盒中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的肿瘤特异性抗原的酶联免疫诊断试剂或试剂盒。
4.根据权利要求1所述的肿瘤特异性抗原或权利要求3所述的酶联免疫诊断试剂或试剂盒在检测抗TOP-1-40自身抗体上的应用。
5.根据权利要求3所述的肿瘤特异性抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于，试剂盒包括TOP-1-40包被的微孔板；浓缩洗涤缓冲液为：200mmol/L的磷酸缓冲液和1.0％的吐温20；浓缩样本稀释液为：1％的小牛白蛋白和100mmol/L的磷酸缓冲液；质控品1为：阳性对照和三羟甲基氨基甲烷缓冲液；指控品2为：阴性对照和三羟甲基氨基甲烷缓冲液，校准品为：抗TOP-1-40自身抗体；酶标液为：辣根过氧化物酶标记的600ng/ml的抗人IgG抗体；底物液为：1.2mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺和2.4mmoL/L过氧化氢；终止液为1mol/L的盐酸。
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