JP5201822B2 - ガストリン放出ペプチド前駆体の免疫学的測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は上記知見に基づき、血液凝固因子が活性化せず、そのためにフィブリン形成が生じず血液凝固が起こらない状態の血液検体を用いることにより、従来の方法より利便性が高くかつより正確な測定が可能となるProGRP測定方法を提供するものである。
本発明により、サンプルを長期間安定に保存することが可能になる。従来、冷蔵保存においては、3−24時間であった保存期間を、1週間程度まで延長することが可能になる。また、室温における保存も可能になる。
1%牛血清アルブミン、2mM塩化カルシウムを含むリン酸緩衝液中にFmoc法によりアミノ酸合成したProGRP 31−98抗原(米国アボットラボラトリーズ社より入手)を添加した。さらにトロンビン(シグマアルドリッチ社製)を添加し、室温保存後、アーキテクトProGRPを用いて、ProGRP濃度を測定した。測定結果を図1に示した。図1より、トロンビン存在下において、ProGRPの分解が観察されることから、血清中でのProGRP分解の主要な一因としてトロンビンが関係していることが示唆される。トロンビンは血液凝固因子IIの活性化体であり、血清において多量に存在する物質である。なおアーキテクト測定方法については実施例3に記す。
血清中にPMSF(シグマアルドリッチ社製)を添加した後に、Fmoc法によりアミノ酸合成したProGRP 31−98抗原を添加し、室温保存後、アーキテクトProGRPを用いて、ProGRP濃度を測定した。測定結果を図2に示した。図2より、PMSF存在下において、ProGRPの活性低下が著しく抑制されることが分かる。PMSFはトロンビンを始めとするセリンプロテアーゼ類の酵素活性を不活性化するために用いられる物質であり、トロンビンを始めとするプロテアーゼの存在が、ProGRPを不活性化させている原因であると考えることができる。
Fmoc法により合成したProGRP 31−98(米国アボットラボラトリーズ社より入手)、を同一供血者より入手した血清およびEDTA血漿中に添加し、測定サンプルとした。測定サンプルを、冷蔵で1日、3日、7日保存後、また1日室温で保存後、ProGRP濃度を測定した。ProGRP濃度の測定にはセラムラボ(登録商標)ProGRP測定キット(富士レビオ社)、および下記するアーキテクトProGRPを用いた。測定結果は図3〜図7に示した。
抗ProGRP 31−98抗体(特許3210994に記載された方法に従って得られた抗体)を、カルボキシル基修飾磁性微粒子(米国アボットラボラトリーズ社より入手)上に、EDC(N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(シグマアルドリッチ社製)を用いる方法により結合させ、抗体固相化微粒子とした。抗体固相化微粒子をツイーン20(関東化学社製)、EDTA(エチレンジアミン4酢酸ナトリウム塩)および塩化ナトリウムを含有するトリス塩酸緩衝液中に添加することにより抗体固相化微粒子溶液を作製した。
同一供血者より得られたEDTA血漿、リチウムヘパリン血漿、クエン酸血漿、ナトリウムヘパリン血漿、血清のマッチ検体に特許3210994に記載された方法に従って得られたリコンビナントProGRP 31−98を添加し、24時間室温に、または7日間冷蔵中に保存を行い、実施例3と同様にProGRP濃度を測定した。24時間室温放置したサンプルの測定値を、時間0の測定値で除した値を、24時間室温保存後のProGRP残存率とし、7日間冷蔵保存したサンプルの測定値を、時間0の測定値で除した値を、7日間冷蔵保存後のProGRP残存率とした。
同一供血者より得られたEDTA血漿・血清マッチ検体中に、Fmoc法によりアミノ酸合成したProGRP 31−98抗原を添加し、室温、冷蔵中に保存後、実施例3に示された方法で、ProGRP濃度を測定した。24時間までの値は、3ドナーの平均値、72時間までの値は2ドナーよりの平均値で示した。図9に冷蔵保存におけるProGRP残存率、図10に室温保存におけるProGRP残存率を示した。図中に示される保存時間は、0、1、3、6、7、9、24時間(ここまで冷蔵保存および室温保存)、72時間(冷蔵保存のみ)である。
山口らは、血清中に安定に存在できる範囲内において、血漿の使用可能であることを示しているが、本発明は、血清中で安定に存在できない保存条件・保存時間であっても、血液サンプル中のProGRPを診断薬用途として用いるに足るだけの十分な保存安定性を確保することができる点で、山口らの発明と異なっており又本発明の有用性を示すことができると考えることができる。
Claims (7)
- a)血液サンプルをガストリン放出ペプチド前駆体(ProGRP)に対する抗体に、抗体/ProGRP複合体の形成に十分な時間および条件において接触させ、ここで前記血液サンプルは1または2以上の活性化していない血液凝固因子を含み、前記血液サンプルは乾燥または事前凍結されておらず、および血液凝固因子の活性化は血清プロテアーゼ阻害剤の添加により妨げられており、ならびに
b)前記抗体/ProGRP複合体の存在を検出し、該複合体の存在は前記血液サンプル中にProGRPが存在することを示す、血液サンプル中のProGRPを検出する方法。 - 前記血液サンプルが活性化していないトロンビンを含む、請求項1に記載のProGRPを検出する方法。
- 前記血液サンプルが血漿からなる、請求項1または2に記載のProGRPを検出する方法。
- ProGRPのアミノ酸31−98を検出する、請求項1〜3の何れか一項に記載のProGRPを検出する方法。
- 前記サンプルが採取後冷蔵保存において6時間を越えて保存される、請求項1、2、3または4に記載のProGRPを検出する方法。
- 前記サンプルが採取後冷蔵保存において24時間を越えて保存される、請求項1、2、3または4に記載のProGRPを検出する方法。
- 前記サンプルが採取後室温において放置または保存される、請求項1、2、3または4に記載のProGRPを検出する方法。
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