JP4532731B2 - 長期に安定で即時使用可能なリストセチン補因子試験試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【技術分野】
本発明は、血液凝固試験に使用するための、長期の安定性を有し、即時に使用可能なリストセチン補因子試験試薬に関する。
【０００２】
【背景技術】
フォンビルブラント−ユルゲンス症候群は最も頻繁に起こる出血性素因である。フォンビルブラント蛋白質（ｖＷＦ）はその母集団の１％に量的に減少するか、またはその機能が障害される。この疾患およびその異なる形態の診断のために、様々な試験が行われている。リストセチン補因子試験（ｖＷＦ：ＲＣｏ）は、最も重要なスクリーニング試験として確立されている（Rodeghiero F.ら, Thromb. Haemost, 1990, 64: 349-352）。Rodeghiero（1990）によって行われた研究によれば、それは50％の感度を有するが、第二の最も重要な試験、すなわちはｖＷＦ抗原（ｖＷＦ：Ａｇ）の定量には３２％の感度を示すにすぎなかった。
【０００３】
リストセチンは抗生物質であるが、その強力な副作用のために、速やかに市場から撤去された。Gangarosaら（Gangarosa EJら, Arch. Intern. Med. 1960, 83-89）は１９６０年にリストセチンがインビトロでウサギの血小板を凝集させることを発見した。富血小板血漿（ＰＲＰ）においては、ヒト血小板もリストセチンの存在下に凝集するが、フォンビルブラント症候群に冒されている患者の場合には凝集は起こらない（Howard & Firkin, Thromb. Diath. Haemorrh, 1971, 26: 362-369）。これらの観察に基づき、Weissら（Weiss HJ ら, J.Clin.Invest. 1973, 52: 2708-2716）は健康なドナーからの洗浄血小板を用いる定量試験を開発した。しかしながら、洗浄血小板は数時間しか使うことができない。比較的長期間それらの活性を維持する利点を有する固定血小板も使用され、新鮮なＰＲＰの処理を苦労して行う必要も軽減されている（Allain JPら, J. Lab. Clin. Med. 1975, 85:318-328）。
【０００４】
リストセチン補因子試験の原理は蛋白質のインビボ機能に類似している。その理由から、この試験は活性試験と呼ばれることが多い。血小板およびフォンビルブラント因子を含む試験混合物に添加した場合には、リストセチンはｖＷＦ分子のＧＰＩｂ／Ｖ／IX受容体への結合を誘導し、その結果、血小板の凝集を生じる。正確な作用様式はまだ不明である。リストセチンは、明らかにｖＷＦに結合し、重要な反応はリストセチンの結合により誘発されるｖＷＦ分子のコンフォーメーションの変化であり、このコンフォーメーションの変化がついでｖＷＦ分子それ自体をＧＰＩｂ／Ｖ／IXに結合可能にするものと考えられる。この過程は内皮細胞下への結合によるコンフォーメーションの変化に匹敵し、ｖＷ因子をインビボで結合可能にする（とくに剪断力において）。
【０００５】
ｖＷＦ：Ｒｃｏ活性に関する固定血小板の液体保存時の安定性について、利用可能な値は１カ月（Allain JPら, J. Lab. Clin. Med. 1975, 85: 318-328）から６カ月まで（Thomasら, Thromb. Res. 1994, 75(4): 401-408）の間で変動する。
しかしながら、少なくとも１０カ月、好ましくは少なくとも１４カ月の安定性が、市販品としての使用のためには必要である。
【０００６】
従来は安定性の実質的な改善は、血小板の凍結乾燥によってのみ可能であった（ＵＳ 4,145,185、ＤＥ 3141894Ａ1）。これに関して、ＵＳ 4,145,185には、蛇毒の添加が記載されている。ＤＥ 3131894には、なめし剤、セリンプロテアーゼインヒビターおよびリストセチンＡの使用が記載されている。
【０００７】
最近市販されているリストセチン補因子試験のための血小板試薬はすべて凍結乾燥されている。このような凍結乾燥試薬を完全自動化または部分自動化された分析装置で使用する場合とくに、製品は開封後そのまま使用することができず、凍結乾燥物をまず再構築しなければならない欠点がある。これに加えて凍結乾燥は高価な操作であり、しかも、凍結乾燥物の製造およびその使用の両者に伴う単なる付加的操作工程のため、血小板の付加的誤差および傷害の危険につながる。凍結乾燥試薬を使用する場合は、結果に製造操作から生じる比較的大きな相違を１回の製造バッチ内のバイアル間にもしばしば観察することができる。
【０００８】
【発明の開示】
本発明の基底にある目的は、したがって、有意に６カ月以上好ましくは少なくとも１０カ月、とくに好ましくは少なくとも１４カ月の保存期間後でも、液体試薬の使用を可能にする血小板試薬の液体処方を用いるリストセチン補因子試験方法を利用可能にすること、すなわち試験のスペックたとえば測定範囲および正確度がこの保存時間後に試薬を試験に用いた場合でも、満足する結果が得られることであった。
【０００９】
このような試薬は処理が容易である（即時使用できる）ことの利点と高い感度および良好な再現性の利点が組合わさっているので、血液凝固実験室にはきわめて有利である。本発明の他の好ましい実施態様はまた特許請求の範囲に記載した通りである。
【００１０】
処理時に、血小板にセリンプロテアーゼインヒビター（好ましくはジイソプロピルフルオロホスフェート）を加え、固定しそしてリストセチンまたは蛇毒を含まない水性の緩衝溶液中に懸濁すると、驚くべきことに、即時使用可能な（約６００,０００個／μｌの血小板）液体プレパレーションに、１２カ月またはそれ以上の安定性が達成できることが見いだされたのである（図２）。
【００１１】
保存安定性は、とくにアルブミンのような中性蛋白質、とくにヒトまたはウシ血清アルブミンを添加することによって改善することができる。アルブミン濃度が適切（０.２％以上、好ましくは２％）であれば、液体プレパレーションにリストセチンを加えることもできる。
【００１２】
保存安定性は、リストセチンが存在しても、液体プレパレーションを、Kathon（登録商標）好ましくは Kathon（登録商標）CG（Rhom & Haas, Philadelphia, USA）もしくは ProClin（登録商標）または他の殺菌もしくは静菌物質で処理またはそれを添加することによって実質的に改善することができる。これらの化合物は試薬中に 0.1〜2％、とくに有利には０.５〜１.４％、きわめて有利には０.８〜１.２％の濃度（容量/容量）で使用される。
【００１３】
熟練者には周知であり、たとえばＤＥ 3141894 に記載されているその他の添加物は、液体保存時の長期安定性にさらに有利な効果がある。
とくに他の指示がなければ、保存等の語は２〜８℃（冷蔵庫）における保存を意味し、安定性等の語は、ｖＷＦ：ＲＣｏ試験（Thomasら, 1994）の測定結果が参照される。
【００１４】
周知の技術水準によれば、試薬を希釈しないでそのまま使用可能な（即時使用可能な）血小板濃度で保存された場合には、試薬が濃縮物として保存された場合より貯蔵寿命が劣ることが期待される。濃縮物は通常１μｌ中に５００〜１５００万個の血小板を含有する。実際、本発明の試薬は、１μｌ中に６０万個の血小板しか含まない場合にも(図２)、１２カ月以上の貯蔵寿命を有する(図１)。
【００１５】
試薬の性質とは独立に試験混合物中におけるリストセチン濃度が１.２５mg／ml以上に上昇すると（試薬または試験混合物中にどの位のアルブミンが存在するかとは無関係に）、長期に保存された血小板試薬の有用性にさらにポジティブな影響を与えることが見いだされた。試験混合物中のリストセチン濃度が１.０mg／mlである場合に、もはや十分に活性である試薬は、たとえばリストセチン濃度１.５mg／ml で使用した場合、適切な活性を示し、その寿命の過程の間にも活性の喪失を示すことはない（図３、４および９）。
【００１６】
試験混合物中におけるリストセチン濃度の上昇のこのポジティブな作用の例は、エルレンマイヤーフラスコ（２５０ml）中における血小板濃縮物（１００ml）の保存に際し、測定時に試薬を採取するために開栓し、再びシールをする場合である。頻繁な開栓は空気との著しい接触および汚染の高いリスクを生じる。試験混合物中に１.０mg／mlの通常のリストセチン濃度を用いた場合、血小板の反応性すなわちリストセチン補因子活性は４.５カ月の保存後には著しく低下した。この場合に開始時の値は測定されなかったが、濃縮物の活性も、きわめて安定であることが知られている凍結乾燥血小板（同一バッチ）の活性に匹敵するものである（図３）。液体保存および凍結乾燥の間で行った比較では、混合物中のリストセチン濃度が１.０mg／mlの場合には４.５カ月の保存後に反応性の著しい低下が見られたのに対し、混合物中のリストセチン濃度が１.７５mg／mlの場合には反応性に有意な差は認められない（図３）。すなわち、エルレンマイヤーフラスコ中における保存の有害な作用（空気との接触、汚染および老化）は、リストセチンの高い濃度によって補償される。この保存効果はまた、図２に示す実験からの結果に比べてこの測定における反応性の比較的鋭い低下を説明するものと考えられる。
【００１７】
試験混合物中のリストセチン濃度の上昇のポジティブな効果の他の例は、試薬が６カ月間は安定である試薬を導くと述べられている Thomasらの方法（１９９４）により調製される場合に見られる。試験混合物中に１.０mg／mlのリストセチンを用いた場合には、１８カ月後、この試薬の活性は期待されたようにきわめて著しい低下を示すことが認められる。しかしながら、試験混合物中に１.５mg／ml のリストセチンを用いた場合には、反応性は同程度までは低下しなかった（図４、固定剤としてパラホルムアルデヒドを使用）。
【００１８】
ホルムアルデヒド溶液で固定し、８カ月間保存した場合の反応性の低下は試験混合物中に１.５mg／mlのリストセチンを使用した場合にはそれ程大きくはない（図４）。
【００１９】
したがって、リストセチンの濃度が高い程、老化過程は補償される。保存が好ましくない場合、これらの老化過程は血小板をＤＦＰで前処理しても（図３）、または現在の技術水準の試薬を用いた場合にも（Thomasら，1994，図４）起こり得る。
【００２０】
試験混合物中の高いリストセチン濃度と本発明の試薬の組み合わせを選択することも可能で、有利である。
試験混合物中におけるリストセチン濃度は好ましくは１〜２.４mg／ml、とくに好ましくは１.２５〜２mg／mlである。
【００２１】
リストセチンの要求の増大の理由は、リストセチンが様々な蛋白質に結合し、増大した蛋白質濃度はさらにリストセチンの添加によって補償できることが知られているので（Stibbe & Kirby, Thromb. Res. 1976, 8: 151-165）、緩衝液中に長時間にわたって蛋白質の濃度の上昇を起こすことができるからである。したがって、４.５カ月保存した血小板を洗浄し、新鮮な緩衝液（この場合もリストセチンを含有する）に取った。洗浄は試験混合物中のリストセチン濃度が１.０mg／mlでも１.７５mg／mlでも活性には全く変化を生じなかった。これから、老化過程は実際、血小板自体に作用すると結論することができる（図３）。老化は明らかにリストセチンの効果に対する血小板の感度を低下させる。これは、現在までリストセチン補因子試験におけるリストセチンの主作用が、蛋白質をＧＰＩｂ受容体に結合できるようにするフォンビルブラント蛋白質の活性化のある種のタイプとして考えられていたことから驚くべきである。しかしながら、老化した血小板が同じ凝集活性を示すためにさらにリストセチンを要求するならば、リストセチンと血小板の間の直接的な相互作用は、従来考えられていたよりも、リストセチン補因子試験に対しさらに重要であることが明らかである。
【００２２】
保存時にリストセチンが既に血小板試薬に添加されているならば、そのときは試薬はリストセチンがない場合より不安定であることになる。しかしながら、中性蛋白質、好ましくはアルブミン、とくに好ましくはヒトまたはウシアルブミンを１％以上の濃度で添加することによって、その安定性を実質的に改善することができる。すなわち、２％アルブミンの存在下におけるその安定性は０.２％のアルブミンの存在下よりも良好である（図５）。
【００２３】
０.２％のアルブミンおよびリストセチンの存在下に保存された血小板を、同じく０.２％のアルブミンおよびリストセチンを含む新鮮な緩衝液で洗浄すると、それらの反応性は再び上昇するが、開始時のレベルには戻らない（図６、左側の図参照）。したがって、これから、血小板自体が老化していたと結論することができる。
【００２４】
リストセチンがフィブリノーゲンおよび他の蛋白質を沈殿させることは、文献から周知である。この反応は既に０.５mg／mlの濃度で認識可能であり、２.０mg／mlの濃度では血漿中のすべてのフィブリノーゲンが沈殿するが、他の血漿蛋白質はまだ影響されない（Howard & Firkin, Thromb. Diath. Haemorrh. 1971, 26: 362-369）。
【００２５】
混合物中のリストセチン濃度、それぞれ１.７５mg／ml（試験混合物１９０μｌ中サンプル４０μｌ）および２.０mg／ml（試験混合物１９０μｌ中サンプル２０μｌ）までおよびそれを含めた本発明の方法では干渉による蛋白質の沈殿は起こらないことが見いだされた（図７）。
【００２６】
サンプルをｖＷＦ：ＲＣｏ試験で測定した場合、２.０mg／mlまでのリストセチン濃度では、結果に有意な差は観察されなかった（図８）。固定血小板を用いたｖＷＦ：ＲＣｏ試験混合物中におけるリストセチンの正常濃度は、１mg／mlである（Thomasら，1994，１.０mg／ml）。
【００２７】
【実施例】
以下の実施例により本発明を明確にする。
実施例１
血小板は、全血から赤血球を遠心除去することによって単離した。単離された血小板をついで、それらをリン酸塩緩衝液Ａ（０.０７モル／Ｌのリン酸塩，８.５ｇ／ＬのＮａＣｌ，１.９ｇ／ＬのＥＤＴＡ）中に取って３回洗浄し、次に、それらを遠心分離し、血小板数を約３００万個／μｌに調整した。
【００２８】
ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ，４.５×１０Ｕ〜４Ｍ）を添加したのち、血小板を、撹拌しながら１時間室温でインキュベートした。血小板を遠心分離することにより２回洗浄したのち、再びリン酸緩衝液Ｂ（０.１５モル／Ｌのリン酸塩，１.０ｇ／ＬのＥＤＴＡ，pH６.５）中に取り、ついでホルムアルデヒドを加えたのち（最終濃度４％）血小板を４℃で４４時間インキュベートした。血小板を遠心分離し、リン酸緩衝液Ｃ（０.０７モル／Ｌのリン酸塩，８.５ｇ／ＬのＮａＣｌ，１.０ｇ／ＬのＥＤＴＡ，１ｇ／Ｌのナトリウムアジド）に取った。
【００２９】
血小板の懸濁液をついで、２０倍容量のリン酸緩衝液Ｃに対して約２４時間透析した。ついで、リン酸緩衝液Ｃを加えて血小板数を調整した。以下の物質、すなわちスクロース（１０ｇ／Ｌ）、グリシン（１０ｇ／Ｌ）、グルタメート（１６.７ｇ／Ｌ）およびヒトアルブミン（２ｇ／Ｌ）も添加した。
血小板試薬はついで、密閉スクリューキャップ付きの 5 ml のバイアルの充填に使用した。
【００３０】
測定（ｍＵでの吸収）に先立ち、０.５mlのリストセチン溶液（２１mg／ml）をバイアルの内容物５mlに添加したので、試薬中のリストセチンの濃度は１.９１mg／mlであった。試験混合物の組成は次の通りであった。
試薬 １５０μｌ
血漿 ２０μｌおよび
等張性ＮａＣｌ溶液(０.９％) ２０μｌ
吸光（Ｖmax）の低下速度を測定した。試験混合物中のリストセチンの濃度は １.５mg／mlであった。
【００３１】
実施例２
この実施例では測定に先立ち血小板試薬中のリストセチンの濃度を１.３mg／mlに調整し、試験混合物中のリストセチンの濃度が１.０mg／mlであったほかは、実施例１と同様に実施した（図１，２および９）。
【００３２】
実施例３
この実施例では測定に先立ち血小板試薬中のリストセチンの濃度を２.２mg／mlに調整し、試験混合物中のリストセチンの濃度が１.７５mg／mlであったほかは、実施例１と同様に実施した（図３）。
【００３３】
実施例４
この実施例では、血小板試薬を密閉スクリューキャップ付きの５mlのバイアルの充填に使用する前に、試薬中の最終濃度が１.９mg／mlになることを保証するのに十分なリストセチンを血小板試薬に加えたほかは、実施例１と同様に実施した。これは、試験混合物中のリストセチンの濃度１.５mg／mlに相当する（図５）。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１のようにＤＦＰを用いてまたはＤＦＰを用いないで Thomasら, 1994,Thromb. Res. 75 (4): 401-408 に従って調製した血小板濃縮試薬の安定性。
【図２】６００,０００個／μｌの血小板を含有する即時使用可能の血小板試薬の安定性。
【図３】試験混合物がそれぞれ１.７５mg／mlおよび１.０mg／mlのリストセチンを含有する場合、４.５カ月保存した血小板試薬の安定性。
【図４】それぞれ１８カ月および８カ月保存したのちの試薬の活性に対する試験混合物中のリストセチン濃度の影響。試薬は Thomasら, 1994, Thromb. Res. 75(4): 401-408 に記載されたようにパラホルムアルデヒドで処理し、一方、実施例１の記載のようにホルムアルデヒドで処理した。与えられたリストセチン濃度は試験混合物に対する意味である。
【図５】さらに０.２％または２％のアルブミンを含むリストセチン含有血小板試薬の安定性。
【図６】リストセチンおよび 0.2％のアルブミンを含む血小板試薬の、２カ月後の各種フォンビルブラント蛋白質濃度における反応性の低下。血小板を保存期間の開始時と同じ組成の新鮮な緩衝液で洗浄したのち、それらの反応性はもう一度、若干上昇する。
【図７】高濃度のリストセチンによるサンプルからの蛋白質の沈殿。
【図８】リストセチン補因子試験を用いるフォンビルブラント蛋白質濃度の測定に対するリストセチンの高濃度の影響。
【図９】試験混合物がそれぞれ０.５mg／mlおよび１.０mg／mlのリストセチンを含有する場合の血小板試薬の反応性の低下。
【技術分野】
本発明は、血液凝固試験に使用するための、長期の安定性を有し、即時に使用可能なリストセチン補因子試験試薬に関する。
【０００２】
【背景技術】
フォンビルブラント−ユルゲンス症候群は最も頻繁に起こる出血性素因である。フォンビルブラント蛋白質（ｖＷＦ）はその母集団の１％に量的に減少するか、またはその機能が障害される。この疾患およびその異なる形態の診断のために、様々な試験が行われている。リストセチン補因子試験（ｖＷＦ：ＲＣｏ）は、最も重要なスクリーニング試験として確立されている（Rodeghiero F.ら, Thromb. Haemost, 1990, 64: 349-352）。Rodeghiero（1990）によって行われた研究によれば、それは50％の感度を有するが、第二の最も重要な試験、すなわちはｖＷＦ抗原（ｖＷＦ：Ａｇ）の定量には３２％の感度を示すにすぎなかった。
【０００３】
リストセチンは抗生物質であるが、その強力な副作用のために、速やかに市場から撤去された。Gangarosaら（Gangarosa EJら, Arch. Intern. Med. 1960, 83-89）は１９６０年にリストセチンがインビトロでウサギの血小板を凝集させることを発見した。富血小板血漿（ＰＲＰ）においては、ヒト血小板もリストセチンの存在下に凝集するが、フォンビルブラント症候群に冒されている患者の場合には凝集は起こらない（Howard & Firkin, Thromb. Diath. Haemorrh, 1971, 26: 362-369）。これらの観察に基づき、Weissら（Weiss HJ ら, J.Clin.Invest. 1973, 52: 2708-2716）は健康なドナーからの洗浄血小板を用いる定量試験を開発した。しかしながら、洗浄血小板は数時間しか使うことができない。比較的長期間それらの活性を維持する利点を有する固定血小板も使用され、新鮮なＰＲＰの処理を苦労して行う必要も軽減されている（Allain JPら, J. Lab. Clin. Med. 1975, 85:318-328）。
【０００４】
リストセチン補因子試験の原理は蛋白質のインビボ機能に類似している。その理由から、この試験は活性試験と呼ばれることが多い。血小板およびフォンビルブラント因子を含む試験混合物に添加した場合には、リストセチンはｖＷＦ分子のＧＰＩｂ／Ｖ／IX受容体への結合を誘導し、その結果、血小板の凝集を生じる。正確な作用様式はまだ不明である。リストセチンは、明らかにｖＷＦに結合し、重要な反応はリストセチンの結合により誘発されるｖＷＦ分子のコンフォーメーションの変化であり、このコンフォーメーションの変化がついでｖＷＦ分子それ自体をＧＰＩｂ／Ｖ／IXに結合可能にするものと考えられる。この過程は内皮細胞下への結合によるコンフォーメーションの変化に匹敵し、ｖＷ因子をインビボで結合可能にする（とくに剪断力において）。
【０００５】
ｖＷＦ：Ｒｃｏ活性に関する固定血小板の液体保存時の安定性について、利用可能な値は１カ月（Allain JPら, J. Lab. Clin. Med. 1975, 85: 318-328）から６カ月まで（Thomasら, Thromb. Res. 1994, 75(4): 401-408）の間で変動する。
しかしながら、少なくとも１０カ月、好ましくは少なくとも１４カ月の安定性が、市販品としての使用のためには必要である。
【０００６】
従来は安定性の実質的な改善は、血小板の凍結乾燥によってのみ可能であった（ＵＳ 4,145,185、ＤＥ 3141894Ａ1）。これに関して、ＵＳ 4,145,185には、蛇毒の添加が記載されている。ＤＥ 3131894には、なめし剤、セリンプロテアーゼインヒビターおよびリストセチンＡの使用が記載されている。
【０００７】
最近市販されているリストセチン補因子試験のための血小板試薬はすべて凍結乾燥されている。このような凍結乾燥試薬を完全自動化または部分自動化された分析装置で使用する場合とくに、製品は開封後そのまま使用することができず、凍結乾燥物をまず再構築しなければならない欠点がある。これに加えて凍結乾燥は高価な操作であり、しかも、凍結乾燥物の製造およびその使用の両者に伴う単なる付加的操作工程のため、血小板の付加的誤差および傷害の危険につながる。凍結乾燥試薬を使用する場合は、結果に製造操作から生じる比較的大きな相違を１回の製造バッチ内のバイアル間にもしばしば観察することができる。
【０００８】
【発明の開示】
本発明の基底にある目的は、したがって、有意に６カ月以上好ましくは少なくとも１０カ月、とくに好ましくは少なくとも１４カ月の保存期間後でも、液体試薬の使用を可能にする血小板試薬の液体処方を用いるリストセチン補因子試験方法を利用可能にすること、すなわち試験のスペックたとえば測定範囲および正確度がこの保存時間後に試薬を試験に用いた場合でも、満足する結果が得られることであった。
【０００９】
このような試薬は処理が容易である（即時使用できる）ことの利点と高い感度および良好な再現性の利点が組合わさっているので、血液凝固実験室にはきわめて有利である。本発明の他の好ましい実施態様はまた特許請求の範囲に記載した通りである。
【００１０】
処理時に、血小板にセリンプロテアーゼインヒビター（好ましくはジイソプロピルフルオロホスフェート）を加え、固定しそしてリストセチンまたは蛇毒を含まない水性の緩衝溶液中に懸濁すると、驚くべきことに、即時使用可能な（約６００,０００個／μｌの血小板）液体プレパレーションに、１２カ月またはそれ以上の安定性が達成できることが見いだされたのである（図２）。
【００１１】
保存安定性は、とくにアルブミンのような中性蛋白質、とくにヒトまたはウシ血清アルブミンを添加することによって改善することができる。アルブミン濃度が適切（０.２％以上、好ましくは２％）であれば、液体プレパレーションにリストセチンを加えることもできる。
【００１２】
保存安定性は、リストセチンが存在しても、液体プレパレーションを、Kathon（登録商標）好ましくは Kathon（登録商標）CG（Rhom & Haas, Philadelphia, USA）もしくは ProClin（登録商標）または他の殺菌もしくは静菌物質で処理またはそれを添加することによって実質的に改善することができる。これらの化合物は試薬中に 0.1〜2％、とくに有利には０.５〜１.４％、きわめて有利には０.８〜１.２％の濃度（容量/容量）で使用される。
【００１３】
熟練者には周知であり、たとえばＤＥ 3141894 に記載されているその他の添加物は、液体保存時の長期安定性にさらに有利な効果がある。
とくに他の指示がなければ、保存等の語は２〜８℃（冷蔵庫）における保存を意味し、安定性等の語は、ｖＷＦ：ＲＣｏ試験（Thomasら, 1994）の測定結果が参照される。
【００１４】
周知の技術水準によれば、試薬を希釈しないでそのまま使用可能な（即時使用可能な）血小板濃度で保存された場合には、試薬が濃縮物として保存された場合より貯蔵寿命が劣ることが期待される。濃縮物は通常１μｌ中に５００〜１５００万個の血小板を含有する。実際、本発明の試薬は、１μｌ中に６０万個の血小板しか含まない場合にも(図２)、１２カ月以上の貯蔵寿命を有する(図１)。
【００１５】
試薬の性質とは独立に試験混合物中におけるリストセチン濃度が１.２５mg／ml以上に上昇すると（試薬または試験混合物中にどの位のアルブミンが存在するかとは無関係に）、長期に保存された血小板試薬の有用性にさらにポジティブな影響を与えることが見いだされた。試験混合物中のリストセチン濃度が１.０mg／mlである場合に、もはや十分に活性である試薬は、たとえばリストセチン濃度１.５mg／ml で使用した場合、適切な活性を示し、その寿命の過程の間にも活性の喪失を示すことはない（図３、４および９）。
【００１６】
試験混合物中におけるリストセチン濃度の上昇のこのポジティブな作用の例は、エルレンマイヤーフラスコ（２５０ml）中における血小板濃縮物（１００ml）の保存に際し、測定時に試薬を採取するために開栓し、再びシールをする場合である。頻繁な開栓は空気との著しい接触および汚染の高いリスクを生じる。試験混合物中に１.０mg／mlの通常のリストセチン濃度を用いた場合、血小板の反応性すなわちリストセチン補因子活性は４.５カ月の保存後には著しく低下した。この場合に開始時の値は測定されなかったが、濃縮物の活性も、きわめて安定であることが知られている凍結乾燥血小板（同一バッチ）の活性に匹敵するものである（図３）。液体保存および凍結乾燥の間で行った比較では、混合物中のリストセチン濃度が１.０mg／mlの場合には４.５カ月の保存後に反応性の著しい低下が見られたのに対し、混合物中のリストセチン濃度が１.７５mg／mlの場合には反応性に有意な差は認められない（図３）。すなわち、エルレンマイヤーフラスコ中における保存の有害な作用（空気との接触、汚染および老化）は、リストセチンの高い濃度によって補償される。この保存効果はまた、図２に示す実験からの結果に比べてこの測定における反応性の比較的鋭い低下を説明するものと考えられる。
【００１７】
試験混合物中のリストセチン濃度の上昇のポジティブな効果の他の例は、試薬が６カ月間は安定である試薬を導くと述べられている Thomasらの方法（１９９４）により調製される場合に見られる。試験混合物中に１.０mg／mlのリストセチンを用いた場合には、１８カ月後、この試薬の活性は期待されたようにきわめて著しい低下を示すことが認められる。しかしながら、試験混合物中に１.５mg／ml のリストセチンを用いた場合には、反応性は同程度までは低下しなかった（図４、固定剤としてパラホルムアルデヒドを使用）。
【００１８】
ホルムアルデヒド溶液で固定し、８カ月間保存した場合の反応性の低下は試験混合物中に１.５mg／mlのリストセチンを使用した場合にはそれ程大きくはない（図４）。
【００１９】
したがって、リストセチンの濃度が高い程、老化過程は補償される。保存が好ましくない場合、これらの老化過程は血小板をＤＦＰで前処理しても（図３）、または現在の技術水準の試薬を用いた場合にも（Thomasら，1994，図４）起こり得る。
【００２０】
試験混合物中の高いリストセチン濃度と本発明の試薬の組み合わせを選択することも可能で、有利である。
試験混合物中におけるリストセチン濃度は好ましくは１〜２.４mg／ml、とくに好ましくは１.２５〜２mg／mlである。
【００２１】
リストセチンの要求の増大の理由は、リストセチンが様々な蛋白質に結合し、増大した蛋白質濃度はさらにリストセチンの添加によって補償できることが知られているので（Stibbe & Kirby, Thromb. Res. 1976, 8: 151-165）、緩衝液中に長時間にわたって蛋白質の濃度の上昇を起こすことができるからである。したがって、４.５カ月保存した血小板を洗浄し、新鮮な緩衝液（この場合もリストセチンを含有する）に取った。洗浄は試験混合物中のリストセチン濃度が１.０mg／mlでも１.７５mg／mlでも活性には全く変化を生じなかった。これから、老化過程は実際、血小板自体に作用すると結論することができる（図３）。老化は明らかにリストセチンの効果に対する血小板の感度を低下させる。これは、現在までリストセチン補因子試験におけるリストセチンの主作用が、蛋白質をＧＰＩｂ受容体に結合できるようにするフォンビルブラント蛋白質の活性化のある種のタイプとして考えられていたことから驚くべきである。しかしながら、老化した血小板が同じ凝集活性を示すためにさらにリストセチンを要求するならば、リストセチンと血小板の間の直接的な相互作用は、従来考えられていたよりも、リストセチン補因子試験に対しさらに重要であることが明らかである。
【００２２】
保存時にリストセチンが既に血小板試薬に添加されているならば、そのときは試薬はリストセチンがない場合より不安定であることになる。しかしながら、中性蛋白質、好ましくはアルブミン、とくに好ましくはヒトまたはウシアルブミンを１％以上の濃度で添加することによって、その安定性を実質的に改善することができる。すなわち、２％アルブミンの存在下におけるその安定性は０.２％のアルブミンの存在下よりも良好である（図５）。
【００２３】
０.２％のアルブミンおよびリストセチンの存在下に保存された血小板を、同じく０.２％のアルブミンおよびリストセチンを含む新鮮な緩衝液で洗浄すると、それらの反応性は再び上昇するが、開始時のレベルには戻らない（図６、左側の図参照）。したがって、これから、血小板自体が老化していたと結論することができる。
【００２４】
リストセチンがフィブリノーゲンおよび他の蛋白質を沈殿させることは、文献から周知である。この反応は既に０.５mg／mlの濃度で認識可能であり、２.０mg／mlの濃度では血漿中のすべてのフィブリノーゲンが沈殿するが、他の血漿蛋白質はまだ影響されない（Howard & Firkin, Thromb. Diath. Haemorrh. 1971, 26: 362-369）。
【００２５】
混合物中のリストセチン濃度、それぞれ１.７５mg／ml（試験混合物１９０μｌ中サンプル４０μｌ）および２.０mg／ml（試験混合物１９０μｌ中サンプル２０μｌ）までおよびそれを含めた本発明の方法では干渉による蛋白質の沈殿は起こらないことが見いだされた（図７）。
【００２６】
サンプルをｖＷＦ：ＲＣｏ試験で測定した場合、２.０mg／mlまでのリストセチン濃度では、結果に有意な差は観察されなかった（図８）。固定血小板を用いたｖＷＦ：ＲＣｏ試験混合物中におけるリストセチンの正常濃度は、１mg／mlである（Thomasら，1994，１.０mg／ml）。
【００２７】
【実施例】
以下の実施例により本発明を明確にする。
実施例１
血小板は、全血から赤血球を遠心除去することによって単離した。単離された血小板をついで、それらをリン酸塩緩衝液Ａ（０.０７モル／Ｌのリン酸塩，８.５ｇ／ＬのＮａＣｌ，１.９ｇ／ＬのＥＤＴＡ）中に取って３回洗浄し、次に、それらを遠心分離し、血小板数を約３００万個／μｌに調整した。
【００２８】
ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ，４.５×１０Ｕ〜４Ｍ）を添加したのち、血小板を、撹拌しながら１時間室温でインキュベートした。血小板を遠心分離することにより２回洗浄したのち、再びリン酸緩衝液Ｂ（０.１５モル／Ｌのリン酸塩，１.０ｇ／ＬのＥＤＴＡ，pH６.５）中に取り、ついでホルムアルデヒドを加えたのち（最終濃度４％）血小板を４℃で４４時間インキュベートした。血小板を遠心分離し、リン酸緩衝液Ｃ（０.０７モル／Ｌのリン酸塩，８.５ｇ／ＬのＮａＣｌ，１.０ｇ／ＬのＥＤＴＡ，１ｇ／Ｌのナトリウムアジド）に取った。
【００２９】
血小板の懸濁液をついで、２０倍容量のリン酸緩衝液Ｃに対して約２４時間透析した。ついで、リン酸緩衝液Ｃを加えて血小板数を調整した。以下の物質、すなわちスクロース（１０ｇ／Ｌ）、グリシン（１０ｇ／Ｌ）、グルタメート（１６.７ｇ／Ｌ）およびヒトアルブミン（２ｇ／Ｌ）も添加した。
血小板試薬はついで、密閉スクリューキャップ付きの 5 ml のバイアルの充填に使用した。
【００３０】
測定（ｍＵでの吸収）に先立ち、０.５mlのリストセチン溶液（２１mg／ml）をバイアルの内容物５mlに添加したので、試薬中のリストセチンの濃度は１.９１mg／mlであった。試験混合物の組成は次の通りであった。
試薬 １５０μｌ
血漿 ２０μｌおよび
等張性ＮａＣｌ溶液(０.９％) ２０μｌ
吸光（Ｖmax）の低下速度を測定した。試験混合物中のリストセチンの濃度は １.５mg／mlであった。
【００３１】
実施例２
この実施例では測定に先立ち血小板試薬中のリストセチンの濃度を１.３mg／mlに調整し、試験混合物中のリストセチンの濃度が１.０mg／mlであったほかは、実施例１と同様に実施した（図１，２および９）。
【００３２】
実施例３
この実施例では測定に先立ち血小板試薬中のリストセチンの濃度を２.２mg／mlに調整し、試験混合物中のリストセチンの濃度が１.７５mg／mlであったほかは、実施例１と同様に実施した（図３）。
【００３３】
実施例４
この実施例では、血小板試薬を密閉スクリューキャップ付きの５mlのバイアルの充填に使用する前に、試薬中の最終濃度が１.９mg／mlになることを保証するのに十分なリストセチンを血小板試薬に加えたほかは、実施例１と同様に実施した。これは、試験混合物中のリストセチンの濃度１.５mg／mlに相当する（図５）。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１のようにＤＦＰを用いてまたはＤＦＰを用いないで Thomasら, 1994,Thromb. Res. 75 (4): 401-408 に従って調製した血小板濃縮試薬の安定性。
【図２】６００,０００個／μｌの血小板を含有する即時使用可能の血小板試薬の安定性。
【図３】試験混合物がそれぞれ１.７５mg／mlおよび１.０mg／mlのリストセチンを含有する場合、４.５カ月保存した血小板試薬の安定性。
【図４】それぞれ１８カ月および８カ月保存したのちの試薬の活性に対する試験混合物中のリストセチン濃度の影響。試薬は Thomasら, 1994, Thromb. Res. 75(4): 401-408 に記載されたようにパラホルムアルデヒドで処理し、一方、実施例１の記載のようにホルムアルデヒドで処理した。与えられたリストセチン濃度は試験混合物に対する意味である。
【図５】さらに０.２％または２％のアルブミンを含むリストセチン含有血小板試薬の安定性。
【図６】リストセチンおよび 0.2％のアルブミンを含む血小板試薬の、２カ月後の各種フォンビルブラント蛋白質濃度における反応性の低下。血小板を保存期間の開始時と同じ組成の新鮮な緩衝液で洗浄したのち、それらの反応性はもう一度、若干上昇する。
【図７】高濃度のリストセチンによるサンプルからの蛋白質の沈殿。
【図８】リストセチン補因子試験を用いるフォンビルブラント蛋白質濃度の測定に対するリストセチンの高濃度の影響。
【図９】試験混合物がそれぞれ０.５mg／mlおよび１.０mg／mlのリストセチンを含有する場合の血小板試薬の反応性の低下。
Claims (9)
- 少なくとも１０カ月間の安定性を有し、血小板の懸濁液からなる固定血小板の液体プレパレーションであって、血小板は操作時に、セリンプロテアーゼインヒビターで処理され、固定され、そしてリストセチンまたは蛇毒を含まない水溶液中に懸濁された血小板の液体プレパレーション。
- 液体状態で少なくとも１２カ月間保存したのちにも、リストセチン補因子試験で測定して初期値の少なくとも８０％の反応性を示す請求項１記載のプレパレーション。
- フォンビルブラント因子の測定および定性のための請求項１記載のプレパレーション。
- ５０,０００〜２,０００,０００個／μｌの血小板を含有する請求項１記載のプレパレーション。
- ２００,０００〜１,０００,０００個／μｌの血小板を含有する請求項４記載のプレパレーション。
- ６００,０００個／μｌの血小板を含有する請求項５記載のプレパレーション。
- 試験混合物中のリストセチン濃度が１〜２.４mg／mlであるリストセチン補因子試験における請求項１〜６のいずれかに記載のプレパレーションの使用。
- リストセチン濃度が１.２５〜２mg／mlである請求項７記載の使用。
- 請求項１〜６のいずれかに記載のプレパレーションを含有するリストセチン補因子試験のための試験キット。
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