ES2257258T3 - Reactivo de prueba de cofactor de ristocetina listo para utilizar, estable a largo plazo. - Google Patents
Reactivo de prueba de cofactor de ristocetina listo para utilizar, estable a largo plazo.Info
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Abstract
Preparación líquida de trombocitos fijados con una estabilidad de al menos 10 meses, preferiblemente de 12 meses, consistente en una suspensión de trombocitos, tratándose los trombocitos en la elaboración final con una sustancia inhibidora serina-proteasa, se los fija y se los suspende en una solución acuosa, preferentemente tamponada, que no contiene ristocetina ni veneno de serpiente.
Description
Reactivo de prueba de cofactor de ristocetina
listo para utilizar, estable a largo plazo.
La presente invención se refiere a un reactivo de
prueba cofactor ristocetina listo para utilizar, estable a largo
plazo, para utilizar en pruebas de coagulación.
El síndrome de von
Willebrand-Jurgens es la tendencia a sangrar
(diátesis hemorrágica o hemofilia de tipo A) de presentación más
frecuente. En el 1% de la población, la proteína de von Willebrand
(vWF) está cuantitativamente disminuida, o su función está
perturbada. Para el diagnóstico de la enfermedad y de sus diversas
formas, se llevan a cabo distintas pruebas. Como prueba de
detección mas importante se ha establecido la prueba del cofactor
ristocetina (vWF: RCo) (Rodeghiero F. et al.: Thromb. Haemost
(1990) 64, Págs. 349 - 352). Según investigaciones de Rodeghiero
(1990), presenta una sensibilidad del 50%, mientras que la prueba
segunda en importancia, la determinación del antígeno de vWF,
(vWF:-Ag), presenta sólo aproximadamente 32%.
La ristocetina es un antibiótico que fue retirado
rápidamente del mercado debido a sus fuertes efectos secundarios.
Ya en el año 1960 Gangarosa et al. (Gangarosa EJ et
al., Arch. Intern. Med. (1960), Páginas 83-89)
descubrieron que la ristocetina in vitro causa la agregación
de trombocitos de conejo. También las plaquetas humanas en plasma
rico en plaquetas (PRP) se agregan en presencia de ristocetina, pero
no lo hacen en el caso de pacientes con síndrome de von Willebrand
(Howard and Firkin, Thromb. Diath. Haemorrh. (1971), 26, Páginas
362-369). Basándose en ello, Weiss et al.
(Weiss HJ et al., J. Clin. Invest. (1973) 52, Páginas 2708 -
2716) desarrollaron una prueba cuantitativa con trombrocitos
adultos de donantes normales. No obstante, los trombocitos adultos
sólo pueden utilizarse durante unas pocas horas. También se han
empleado plaquetas fijadas, que tienen la ventaja de conservar su
actividad durante un intervalo de tiempo más prolongado, por lo que
se suprime la laboriosa preparación final de PRP fresco (Allain JP
et al, J. Lab. Clin. Med. (1975), 85, Páginas 318 - 328).
El principio de la prueba del cofactor
ristocetina se asemeja a la función in vivo de la proteína,
por lo que la prueba se designa frecuentemente prueba de actividad.
Mediante la adición de ristocetina a un preparado de prueba con
trombocitos y factor de von Willebrand se desencadena la unión de la
molécula de vWF al receptor GPIb/V/IX y con ello la aglutinación de
trombocitos. El modo de acción no se conoce todavía. La ristocetina
se une aparentemente al vWF, y se supone que una reacción decisiva
es la modificación, ocasionada por la unión de la ristocetina, de
la conformación de la molécula de vWF, de modo tal que ésta pueda
unirse a su vez a GPIb/V/IX. Este proceso sería comparable con la
variación de la conformación debida a la unión al subendotelio, que
hace que el factor vW sea capaz de unirse (en especial en el caso de
elevadas fuerzas de cizallamiento).
Acerca de la estabilidad de trombocitos fijos en
relación con la actividad de vWF:Rco en caso de almacenamiento
líquido, hay datos que oscilan entre 1 mes (Allain et al., J.
Lab. Clin. Med. 1975, 85, Páginas 318 - 328) y hasta 6 meses
(Thomas et al. (1994), Thromb. Res. 75, 4, Páginas
410-408).
Sin embargo, para el empleo comercial se necesita
una estabilidad de al menos 10, mejor aún, de al menos 14 meses.
Hasta ahora una mejora esencial de la estabilidad
solamente podía lograrse mediante una liofilización de los
trombocitos (documentos US 4.145.185; DE 3141894A1, WO 99/55346) o
mediante crioconservación (documentos 5.378.601; US 5.919.614), En
este caso, en la Patente de los EE.UU. N° 4.145.185 Se describe la
adición de un veneno de serpiente. En el documento DE 314894 se
describe la utilización de un tanino, de un inhibidor
serina-proteinasa y de ristocetina A. En la
Solicitud Internacional WO 99/55346 se describe un método en el que
los trombocitos se estabilizan mediante diafiltración y fijación.
En la Patente de los EE.UU. N° 5.378.601 se describe un método en
el que los trombocitos se estabilizan mediante adición de apirasa y
de un antioxidante. En la Patente de los EE.UU. N° 5.919.614 se
describe un método, en el que los trombocitos se conservan hasta su
utilización en una solución que contiene una serie de diversos
inhibidores de la función de las plaquetas. Todos los reactivos de
trombocitos actualmente obtenibles en el comercio para la prueba del
cofactor ristocetina están liofilizados. En especial en el caso de
la utilización de un reactivo de este tipo, liofilizado, en un
aparato de análisis total o parcialmente automatizado, es
desventajoso que el producto no pueda emplearse directamente después
de la abertura, ya que es necesario reconstituir primero el
liofilizado. Además de ello, la liofilización es un procedimiento
costoso, que además, debido ya sólo a los pasos de procedimiento
adicionales, tanto en la producción como en la utilización, alberga
en si el riesgo de errores adicionales y de dañar los trombocitos.
Condicionado por el procedimiento de producción, existe en los
reactivos liofilizados frecuentemente una desviación relativamente
grande de los resultados dentro de una tanda de producción, de un
frasquito a otro.
Por ello, la misión sobre la que se basa la
presente invención consiste en poner a disposición un procedimiento
para la prueba del cofactor ristocetina bajo utilización de una
formulación líquida de un reactivo de trombocitos, que posibilite
una utilización del reactivo líquido también después de un tiempo de
almacenamiento claramente superior a 6 meses, preferentemente de al
menos 10 meses, de manera especialmente preferida de al menos 14
meses, es decir, que en el empleo del reactivo en una prueba también
después de este tiempo de almacenamiento se cumplan las
especificaciones de la prueba tales, como por ejemplo, el intervalo
de medición y la precisión.
\newpage
Un reactivo de este tipo es extraordinariamente
ventajoso para el laboratorio de coagulación, ya que combina las
ventajas de una fácil manipulabilidad (aptitud para el uso) con las
ventajas de la elevada sensibilidad y buena reproducibilidad. De las
reivindicaciones cabe deducir también otras formas de realización
preferidas de la invención.
Se ha descubierto ahora sorpresivamente que en
una preparado líquido
listo-para-utilizarse (de
aproximadamente 600.000 trombocitos/\mul) es posible lograr una
estabilidad de 12 meses y más, si en la preparación final los
trombocitos se tratan con una sustancia inhibidora serina proteasa
(preferentemente fosfato de diisopropilfluor), se fijan y se
suspenden en una solución acuosa tamponada que no contiene
ristocetina ni veneno de serpiente (Figura 2).
Es posible mejorar la estabilidad de
almacenamiento entre otros mediante la adición de proteínas neutras,
tales como albúminas, en especial albúmina de suero humano o
bovino. En el caso de una concentración suficiente de albúmina
(mayor de 0,2%, preferentemente de 2%) es también posible agregar
ristocetina en la preparación líquida. Es posible mejorar
esencialmente la estabilidad de almacenamiento, también en presencia
de ristocetina, mediante el tratamiento con o la adición de una
isotiazolona, tal como por ejemplo Kathon®, preferentemente Kathon®
CG (Rohm & Haas, Philadelphia, EE.UU.) o de Proclin®, o de algún
otro material bactericida o bacteriostático. Estos compuestos se
emplean ventajosamente en una concentración (vol/vol) de 0,1 a 2%,
de manera especialmente ventajosa 0,5 a 1,4%, de manera muy
especialmente ventajosa 0,8 a 1,2% en el reactivo.
Otros aditivos, en sí conocidos por la persona
experta, tal como se describen por ejemplo en el documento DE
3141894, tienen adicionalmente un efecto ventajoso sobre la
estabilidad a largo plazo en caso de almacenamiento líquido.
A menos que se indique otra cosa, la expresión
almacenamiento se refiere entre otros al almacenamiento a 2 - 8°C
(refrigerador), y la expresión estabilidad se refiere entre otros a
la determinación de la prueba vWF:RCo (Thomas et al.
(1994)).
El almacenamiento del reactivo con una
concentración de trombocitos que hacen que el reactivo pueda
emplearse sin dilución, directamente para la prueba
(listo-para-usar) hace que según el
estado conocido de la técnica deba esperarse una durabilidad peor
que en el caso del almacenamiento en forma de concentrado. Un
concentrado contiene típicamente 5 a 15 millones de
trombocitos/\mul. De hecho, el reactivo conforme a la invención
muestra, también en el caso
de un reactivo con 600.000 trombocitos/\mul, una durabilidad del reactivo de más de 12 meses (Figura 1 y Figura 2).
de un reactivo con 600.000 trombocitos/\mul, una durabilidad del reactivo de más de 12 meses (Figura 1 y Figura 2).
Además de ello, independientemente del tipo de
reactivo se ha descubierto que la elevación de la concentración de
ristocetina, independientemente de cuánta albúmina se encuentre
presente en el reactivo o en el preparado de prueba, a un valor
superior a 1,25 mg/ml en el preparado de prueba, puede tener una
influencia positiva sobre la posibilidad de utilización de reactivo
trombocitos que ha estado almacenado durante mucho tiempo. Un
reactivo, que a razón de 1,0 mg/ml de ristocetina en el preparado de
prueba ya no es suficientemente activo, puede, en el caso de una
utilización de por ejemplo 1,5 mg/ml, presentar una actividad
suficiente y no mostrar tampoco ninguna pérdida de actividad en el
transcurso del plazo de vigencia del reactivo.
Un ejemplo de este efecto positivo de la mayor
concentración de ristocetina en el preparado de prueba es el
almacenamiento de un concentrado de trombocitos (100 ml) en un
matraz de Erlenmeyer (250 ml), que fue abierto y nuevamente cerrado
para la extracción de reactivo en el momento de medición. La
frecuente abertura determina un fuerte contacto con el aire y un
elevado peligro de contaminación. En el caso de la utilización de la
concentración usual de ristocetina de 1,0 mg/ml en el preparado de
prueba, después de 4,5 meses la reactividad de los trombocitos, es
decir la actividad del cofactor ristocetina, ha caído
considerablemente. En este casi no se determinó un valor de
partida, pero la actividad del concentrado también puede compararse
con la actividad de trombocitos liofilizados (la misma tanda), de
los cuales es sabido que son muy estables (Figura 3). En el caso de
una comparación de almacenamiento en estado líquido y secado por
congelación, resultó después de 4 ½ meses de almacenamiento una
fuerte pérdida de reactividad, cuando la concentración de
ristocetina es de 1,0 mg/ml en el preparado, y no resultó en cambio
ninguna diferencia esencial de reactividad, cuando la concentración
de ristocetina en el preparado es de 1,75 mg/ml (Figura 3). Por lo
tanto, la influencia perjudicial del almacenamiento en el matraz de
Erlenmeyer (contacto con el aire, contaminación, envejecimiento) se
compensó por la mayor concentración de ristocetina. Este efecto de
almacenamiento es presumiblemente también la explicación de la
caída de reactividad, relativamente fuerte, de esta medición en
comparación con los resultados del en sayo representado en la Figura
2.
Otro ejemplo del efecto positivo de la mayor
concentración de ristocetina en el preparado de prueba es la
producción del reactivo según Thomas et al. (1994), que
debería conducir a un reactivo estable durante 6 meses. Después de
18 meses la actividad ha decaído de manera muy considerable, lo que
cabía esperar, cuando en el preparado de prueba se emplea 1,0 mg de
ristocetina. En el caso de 1,5 mg de ristocetina en el preparado de
prueba, la reactividad está muy lejos de haber caído tanto (Figura
4, paraformaldehido como agente de fijación). También en el caso de
la fijación cor formalina y 8 meses de duración de almacenamiento,
la caída de la reactividad en el caso de 1,5 mg de ristocetina en el
preparado de prueba no es tan fuerte (Figura 4).
Por lo tanto, la mayor concentración de
ristocetina determina una compensación de procesos de
envejecimiento. Estos procesos de envejecimiento pueden presentarse
en el caso de almacenamiento desventajoso también en el caso de
tratamiento previo con DFF (Figura 3) o en el caso de un reactivo
según el estado de la técnica (Thomas et al., 1994)
(Figura 4).
Es posible elegir de manera ventajosa una mayor
concentración de ristocetina en el preparado de prueba también en
unión con el reactivo conforme a la invención.
Es preferible que la concentración de ristocetina
en el preparado de prueba sea de 1 a 2,4 mg/ml, de manera
especialmente preferida, de 1,25 a 2 mg/ml.
La causa de la mayor necesidad de ristocetina
podría ser también la concentración de proteína en el tampón que
aumenta en el transcurso del tiempo, ya que es sabido que la
ristocetina se une a diversas proteínas y que es posible compensar
una mayor concentración de proteínas mediante una mayor cantidad de
ristocetina (Stibbe y Kirby, Thromb. Res. (1976), 8, Páginas 151 -
165). Por ello se lavaban trombocitos que habían estado almacenados
durante 4 ½ meses, y se los incorporaba en tampón fresco (que
nuevamente, contiene ristocetina). La actividad no se modificaba
mediante lavado ni con 1,0 mg/ml ni con 1,75 mg/ml de ristocetina en
el preparado de prueba. De ello cabe llegar a la conclusión que el
proceso de envejecimiento actúa de hecho sobre los trombocitos
propiamente dichos (Figura 3). El envejecimiento ocasiona
visiblemente una sensibilidad disminuida frente a la acción de
ristocetina. Esto es sorprendente en el sentido de que hasta ahora
la acción principal de la ristocetina en la prueba del cofactor
ristocetina se consideraba como una especie de activación de la
proteína de von Willebrand, que hace que la proteína sea capaz de
unirse al receptor GPIb. Sin embargo, cuando para la igual actividad
de aglutinación las proteínas envejecidas necesitan más ristocetina,
la interacción directa entre la ristocetina y los trombocitos es
evidentemente más importante para la prueba del cofactor ristocetina
de lo que se había supuesto hasta ahora.
Si se agrega ristocetina al reactivo trombocitos
ya durante el almacenamiento, en este caso el reactivo es menos
estable que sin ristocetina. No obstante, es posible mejorar
esencialmente la estabilidad mediante la adición de una proteína
neutra en una concentración de más de 1%, preferentemente albúmina,
de manera especialmente preferida albúmina humana o bovina. Así, la
estabilidad con 2% de albúmina es mejor que con 0,2% de albúmina
(Figura 5).
Si se lavan trombocitos que se habían almacenado
con 0,2% de albúmina y ristocetina, con tampón fresco que también
contiene 0,2% de albúmina y ristocetina, la reactividad se hace
nuevamente más fuerte, pero no vuelve al nivel de partida (Figura 6,
diagrama a la izquierda). De esto puede llegarse a la conclusión que
los trombocitos se han envejecido de esta manera por si solos.
De la bibliografía es sabido que la ristocetina
precipita fibrinógeno y otras proteínas. Esta reacción puede
reconocerse ya a 0,5 mg/ml, y a 2,0 mg/ml todo el fibrinógeno se ha
precipitado en el plasma, mientras que las otras proteínas del
plasma todavía no han sido afectadas (Howard and Firkin, Thromb.
Diath. Haemorrh. (1971), 16, Páginas 362 - 369).
Se ha mostrado que en el procedimiento conforme a
la invención, con una concentración de ristocetina de hasta 1,75
mg/ml en el preparado (40 \mul de muestra en 190 \mul de
preparado de prueba), o de hasta 2,0 mg/ml (20 \mul de muestra en
190 \mul) no se presenta ninguna precipitación perturbadora de
proteína (Figura 7).
En la medición de muestras en la prueba de
vWF:RCo no se mostraron diferencias de resultado significativas
para concentraciones de ristocetina de hasta 2,0 mg/ml (Figura 8).
La concentración usual de ristocetina en el preparado de prueba
vWF:RCo con trombocitos fijos es de 1 mg/ml (Thomas et al.
1994: 1,0 mg/ml).
Estabilidad del reactivo concentrado de
trombocitos, que se produjo sea con DFP como en el Ejemplo 1 sea sin
DFP como en el caso de Thomas et al. (1994), Thromb. Res. 75,
4, Páginas 401-408).
Estabilidad de un reactivo trombocitos "listo
para utilizar" con 6000.000 trombocitos/\mul.
Actividad del reactivo concentrado de trombocitos
después de 4,5 meses de almacenamiento con 1,75 y 1,0 mg/ml de
ristocetina en el preparado de ensayo.
Acción de la concentración de ristocetina en el
preparado de prueba sobre la actividad del reactivo después de 18 ó
8 meses de almacenamiento. La elaboración final con paraformaldehido
tuvo lugar según Thomas et al. (1994), Thromb. Res. 75, 4,
Paginas 401 - 408), la elaboración final con formaldehído se realizó
como en el Ejemplo 1. La concentración de ristocetina se refiere al
preparado de prueba.
Estabilidad de un reactivo trombocitos que
contiene ristocetina con 0,2% y 2% de albúmina.
Caída de la reactividad para diversas
concentraciones de von Willebrand de un reactivo de trombocitos que
contiene ristocetina con 0,2% de albúmina, después de 2 meses.
Después del lavado de los trombocitos con tampón fresco de la misma
composición que al inicio del almacenamiento, la reactividad vuelva
a crecer un tanto.
Precipitación de proteínas de la muestra por
elevadas concentraciones de ristocetina.
Influencia de elevadas concentraciones de
ristocetina sobre la determinación de la concentración de von
Willebrand con ayuda de la prueba del cofactor ristocetina.
Caída de la reactividad de un reactivo de
trombocitos con 0,5 y 1,0 mg/ml de ristocetina en el preparado de
prueba.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Se aislaron trombocitos a partir de sangre
completa mediante separación de los eritrocitos por centrifugación.
El lavado triple de los trombocitos aislados tuvo lugar mediante
incorporación en tampón fosfato A (0,07 mol de fosfato/l, 8,5 g de
NaCl/L, 1,9 g de EDTA/l) y separación por centrifugación; ajuste del
número de eritrocitos a aproximadamente 3 millones/\mul.
Después de adición de diisopropilfluorfosfato
(DFP, 4,5 x 10E-4 M) se incubó durante 1 hora a
temperatura ambiente bajo agitación. Después de lavado doble
mediante separación por centrifugación y reincorporación en tampón
fosfato B (0,15 mol de fosfato/l, 1,0 g de EDTA, pH 6,5), y después
de la adición de formaldehído (concentración final: 4%) se acopló
una incubación de 44 h a 4°C. Los trombocitos se separaron por
centrifugación y se incorporaron en tampón fosfato C (0,07 mol de
fosfato/l, 8,5 g de NaCl/L, 1,0 g de EDTA/l, 1 g de azida de
sodio/l).
Seguidamente tuvo lugar una diálisis de la
suspensión de trombocitos contra 20 veces el volumen de tampón
fosfato C durante aproximadamente 24 horas. A continuación se ajustó
el número de trombocitos mediante adición de tampón fosfato C.
También se añadieron: sacarosa (10 g/l), glicina (10 g/l),
glutaminato (16,7 g/l) y albúmina humana (2 g/l).
Seguidamente tuvo lugar el llenado en frasquitos
de 5 ml con cierre de rosca estanco al aire.
Antes de la medición (medición de la extinción en
mE) se añadieron 0,5 ml de solución de ristocetina a un volumen
trasegado completo de 5 ml (21 mg/ml), con lo cual la concentración
de ristocetina en el reactivo fue de 1,91 mg/ml. El preparado de
prueba estaba compuesto de:
150 \mul de reactivo
20 \mul de plasma, y
20 \mul de solución isotónica de ClNa (al
0,9%)
Se determinó la velocidad de la caída de la
extinción (Vmax). La concentración de ristocetina en el preparado de
prueba era de 1,5 mg/ml.
Realización como en el Ejemplo 1, pero la
concentración de ristocetina en el reactivo trombocitos se ajustó
antes de la medición a 1,3 mg/ml mediante adición, con lo que la
concentración de ristocetina en el preparado de prueba era de 1,0
mg/ml (Figuras 1, 2 y 9).
Realización como en el Ejemplo 1, pero la
concentración de ristocetina en el reactivo trombocitos se ajustó
antes de la medición a 2,2 mg/ml mediante adición, con lo que l
concentración de ristocetina en el preparado de prueba era de 1,75
mg/ml (Figura 3).
Realización como en el Ejemplo 1, pero antes del
llenado de frasquitos de 5 ml con cierre atornillado hermético al
aire se añadió una cantidad de ristocetina tal que la concentración
final en el reactivo fue de 1,9 mg/ml. Esto corresponde a una
concentración de ristocetina de 1,5 mg/ml en el preparado de prueba
(Figura 5).
Claims (7)
1. Preparación líquida de trombocitos fijados con
una estabilidad de al menos 10 meses, preferiblemente de 12 meses,
consistente en una suspensión de trombocitos, tratándose los
trombocitos en la elaboración final con una sustancia inhibidora
serina-proteasa, se los fija y se los suspende en
una solución acuosa, preferentemente tamponada, que no contiene
ristocetina ni veneno de serpiente.
2. Preparación conforme a la reivindicación 1,
que también después de un almacenamiento en estado líquido en un
intervalo de tiempo de al menos 12 meses presenta una reactividad de
al menos 80% del valor inicial, medida en la prueba del cofactor
ristocetina.
3. Preparación conforme a la reivindicación 1,
para la determinación y cuantificación del Factor de von
Willebrand.
4. Preparación conforme a la reivindicación 1, en
una preparación lista para utilizarse (aproximadamente 50.000 -
2.000.000 de trombocitos/\mul).
5. Preparación conforme a la reivindicación 4,
con 200.000 - 1.000.000 de trombocitos/\mul, preferentemente de
aproximadamente 600.000 trombocitos/\mul.
6. Uso de una preparación conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 5 en la prueba del cofactor ristocetina, en el
que la concentración de ristocetina en el preparado de prueba es de
1 a 2,4 mg/ml, preferiblemente de 1,25 a 2 mg/ml.
7. Kit de prueba para una prueba del cofactor
ristocetina, en el que se halla contenido una preparación conforme a
una de las reivindicaciones 1 a 5.
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