ES2321125T3 - Procedimiento para la estandarizacion de ensayos de coagulacion. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la determinación de un tiempo de coagulación estandarizado de una muestra, caracterizado porque a) en el mismo sistema de ensayo local que el de la muestra a determinar se miden los tiempos de coagulación de al menos dos calibradores, para los cuales se fijaron antes tiempos de coagulación estandarizados, discretos, y b) el tiempo medido de coagulación de la muestra se transforma en un tiempo de coagulación estandarizado con ayuda de una curva de calibración, que se trazó a partir de la correspondencia de los tiempos de coagulación estándar fijados con anterioridad y los tiempos de coagulación de los calibradores medidos en el sistema de ensayo local.
Description
Procedimiento para la estandarización de ensayos
de coagulación.
La presente invención se refiere al sector del
diagnóstico de la coagulación y se refiere a un procedimiento para
la estandarización de los ensayos de coagulación in
vitro.
Los ensayos de coagulación hacen posible la
medición de la actividad de un factor individual o de varios
factores de coagulación por medición de la velocidad de formación
de fibrina in vitro, es decir fuera del cuerpo humano o
animal (coagulometría). El resultado primario de estos ensayos es un
tiempo de coagulación, que habitualmente se mide en segundos desde
el instante de la adición de un activador y/o de iones Ca^{2+} a
la muestra o, respectivamente, mezcla de muestras, hasta la
formación de un coagulo de fibrina detectable. Tiempo de coagulación
es, por tanto, una medida del potencial hemostático, la capacidad
de coagulación, de una muestra, en la que participan las
influencias de todos los factores y sustancias contenidas en la
muestra que fomentan y que impiden la coagulación y que son
captadas por el correspondiente ensayo.
Los tiempos de coagulación se pueden determinar
por métodos manuales o automáticos. En la determinación automática
está muy extendida la medición de una propiedad mecánica u óptica de
la mezcla de muestras/mezcla de reactivos, por ejemplo de la
viscosidad o turbidez. En todos los casos de medición automática se
mide de forma continua una propiedad de la mezcla de
muestras/mezcla de reactivos, y a partir de la variación de la
propiedad en función del tiempo se puede determinar, con ayuda de
procedimientos de evaluación, el tiempo de coagulación como punto
final.
Ejemplos típicos de estos ensayos de coagulación
son el tiempo de protrombina (PT), el cual también se denomina
ensayo Quick o tiempo de tromboplastina, el tiempo de tromboplastina
parcial activado (TTPA), el tiempo de trombina (TT), el tiempo de
batroxobina (BT) o el tiempo de ecarina (ECT). Estos ensayos y sus
variantes se utilizan corrientemente para el "screening" de
defectos en una zona parcial del sistema de coagulación (ensayo de
"screening", ensayos globales, ensayos de búsqueda) o para
medición de la actividad de factores individuales. [Aspecto general
en Barthels, M. y von Depka, M: Das Gerinnungskompendium, Georg
Thieme Verlag Stuttgart, 2003]. A los defectos del sistema de
coagulación, los cuales pueden tener como consecuencia una tendencia
a hemorragias o a una trombosis, pertenecen por ejemplo (a)
concentraciones o actividades muy bajas o muy elevadas de los
factores de coagulación, (b) mutantes de los factores de
coagulación, (c) concentraciones o actividades muy bajas o muy
elevadas de inhibidores, (d) mutantes de inhibidores o (e)
anticuerpos contra elementos del sistema de coagulación.
El documento de patente US 5,670,329 describe,
por ejemplo, un procedimiento para la determinación cuantitativa
del factor individual fibrinógeno de una muestra por medio del
tiempo de trombina. Para ello, se miden los tiempos de coagulación
de calibradores con contenidos conocidos de fibrinógeno, en el mismo
sistema local de ensayo que el de la muestra a determinar, y el
tiempo de coagulación medido de la muestra se transforma en el
contenido de fibrinógeno de la muestra con ayuda de una curva de
calibración, que fue trazada a partir de la correspondencia de los
contenidos conocidos de fibrinógeno y de los tiempos de coagulación
de los calibradores, medidos. El procedimiento descrito en el
documento US 5,670,329 se puede utilizar también como ensayo de
"screening" para concentraciones de fibrinógeno anormales,
siempre que el material de muestra se utilice sin diluir.
En la rutina clínica diaria se emplean ensayos
de "sceening" en primer lugar para el diagnóstico de diatesis
hemorrágicas o trombófilas, así como también para el control de
terapias con medicamentos que influyen sobre el sistema de
coagulación. Por ejemplo, la determinación de la TTPA sirve por un
lado para el "screening" de defectos de la zona de la cascada
de coagulación que se inicia por la denominada vía intrínseca y que
confluye en la vía conjunta, y la cual se compone de los factores
de coagulación FVIII, FIX, FXI, FXII, precalicreína, HMW
quininógeno, FV, FX, FII y fibrinógeno. Un resultado del TTPA por
encima del rango normal, es decir un tiempo de coagulación
prolongado, puede apuntar a un defecto de uno o varios de estos
factores, por ejemplo a un defecto de FVIII, también conocido como
hemofilia A. Por otra parte, el TTPA reacciona también de forma
sensible a la presencia de anticoagulantes como, por ejemplo, de
heparina, y por lo tanto se utiliza también para el control de las
terapias con heparina.
Para el dictamen médico del resultado de un
ensayo de coagulación, el resultado del ensayo de una muestra del
paciente se compara con un denominado rango de referencia
(denominado también rango normal). El rango de referencia de un
ensayo de coagulación se determina llevando a cabo el ensayo en un
gran número de personas aparentemente sanas (preferentemente \geq
20). Algunas de las personas sanas tendrán valores de ensayo bajos,
otras algo más altos, la mayoría de los valores oscilarán alrededor
de un valor medio. Si se representan los valores del ensayo en el
eje X y el número de personas en el eje Y, se obtiene en el caso
ideal una distribución normal. Con métodos estadísticos se
determina habitualmente el límite inferior y superior de referencia,
dentro del cual se encuentra el 90% de las personas sanas. Por lo
regular, el rango de referencia (rango normal) comprende el 90% de
los valores que se midieron en el caso de personas de referencia
sanas. Circunstancialmente, para un ensayo es necesario establecer
diferentes rangos de referencia, por ejemplo en función de la edad
o del sexo.
Si el resultado del ensayo de un paciente
difiere del rango de referencia, ello puede indicar una perturbación
del equilibrio hemostático. Una desviación del rango de referencia
del TTPA en el sentido de tiempos de coagulación más largos puede
indicar, por ejemplo, un defecto del factor VIII, una desviación del
rango de referencia del PT en el sentido de tiempos de coagulación
más cortos puede indicar, por ejemplo, un nivel incrementado del
factor II, provocado por ejemplo por una mutación en la región
promotora del gen del factor II, la cual conduce a una síntesis
incrementada de factor II.
En el control de terapias con medicamentos que
influyen sobre el sistema de coagulación, como por ejemplo la
terapia con anticoagulantes, se trata del ajuste del sistema de
coagulación del paciente a una determinada magnitud diana. En este
caso, la medicación se varía tantas veces hasta que el resultado del
ensayo de la muestra del paciente se encuentre en un denominado
rango terapéutico definido. El rango terapéutico se obtiene por lo
regular a partir de amplios estudios clínicos. Para ello se
establece un máximo de eficacia terapéutica y un mínimo de efectos
secundarios no deseados, en relación con un determinado rango de
valores del resultado diagnóstico de un ensayo o, respectivamente,
con un determinado rango de concentración del medicamento.
La inhibición medicamentosa de la capacidad de
coagulación por la administración de anticoagulantes, como por
ejemplo heparina, juega un importante papel en la profilaxis o
terapia de incidentes tromboembólicos. La eficacia de la
anticoagulación se mide por el número de incidentes tromboembólicos
no deseados en la clínica. Efectos secundarios no deseados de la
anticoagulación pueden ser las complicaciones hemorrágicas. El rango
terapéutico de los valores de un ensayo, adecuado para el control
de una terapia anticoagulante, es por lo tanto el rango de los
valores de medida del ensayo en el cual, en un estudio clínico, se
observó un mínimo de complicaciones tromboembólicas, así como
hemorrágicas.
Es conocido que los resultados de los ensayos
hemostáticos están sujetos a una varianza y, por lo tanto, no son
comparables sin más. Esta varianza radica entre otras cosas en la
utilización de diferentes reactivos y en diferencias técnicas en la
obtención del tiempo de coagulación. Así por ejemplo, para la
obtención del tiempo de protrombina (PT) se dispone de un gran
número de tromboplastinas tisulares. El PT de una misma muestra de
plasma se puede diferenciar hasta en un factor 2 según la
tromboplastina tisular empleada. Incluso en caso de la utilización
de una tromboplastina tisular especial varía el tiempo de
coagulación de una muestra según el fabricante, según la carga de
un fabricante o, en circunstancias, según el frasco de una sola
carga. Además, en el caso de la determinación automática de un
tiempo de coagulación el propio aparato de medida y el modo de
detectar el coagulo ejerce una influencia sobre el tiempo de
coagulación. La medición de una misma muestra con la misma
tromboplastina tisular con diferentes aparatos proporciona
diferentes resultados del ensayo.
En la práctica, para un ensayo de coagulación
utilizado, cada laboratorio establece rangos terapéuticos y rangos
de referencia locales, internos del laboratorio. Para hacer posible
al médico de tratamiento el enjuiciamiento del resultado de un
ensayo, junto al propio resultado del ensayo se tienen que
proporcionar también al mismo tiempo información sobre los rangos
de referencia locales o, respectivamente, los rangos terapéuticos de
un ensayo.
En el estado actual de la técnica se conocen
diferentes procedimientos de estandarización que tienen como fin
compensar las diferencias de los resultados del ensayo que dependen
de los reactivos, del fabricante, de la carga y del aparato. La
estandarización de los resultados de ensayo o, respectivamente, la
capacidad de comparación de los resultados de ensayos es
particularmente ventajosa por diferentes motivos. Por un lado, se
hace posible por ello equiparar globalmente entre sí los resultados
de ensayo que se obtuvieron en diferentes laboratorios en el marco
de estudios clínicos y, por otro lado, se simplifica sensiblemente
la interpretación de los resultados de ensayo de los pacientes.
Los procedimientos de estandarización habituales
se basan en diluciones de plasmas normales (estandarización en % de
la norma, por ejemplo en un ensayo Quick), obtención de la relación
(estandarización relativa), así como obtención de la relación
normalizada (relación normalizada internacional INR en el caso del
ensayo de protrombina.
En el caso de la utilización de diluciones de
plasma normal, se prepara primeramente una mezcla de plasma de
referencia (mezcla de plasma normal) a partir del plasma de por lo
regular al menos 20 donantes aparentemente sanos. La actividad o
respectivamente el potencial hemostático de este estándar se define
con 100% de la norma. Se preparan diluciones de este plasma
estándar en una matriz adecuada. Por ejemplo, una parte de la mezcla
de plasma normal se mezcla con dos partes de un tampón adecuado
(dilución 1:2) y se define con una actividad del 33,33% de la
norma. Por medición de la mezcla de plasma normal y la serie de
diluciones de esta mezcla se traza una curva de referencia (curva
de calibración) con ayuda del sistema de ensayo a estandarizar,
relacionando las actividades definidas en % de la norma con los
valores en bruto medidos. Para las muestras de los pacientes se
puede medir después en el sistema de ensayo estandarizado el valor
en bruto y finalmente, con ayuda de la curva de referencia, se
puede transformar en un valor calibrado o, respectivamente, en un
resultado estandarizado del ensayo, a saber en % de la
norma.
norma.
En los procedimientos de estandarización que se
basan en la obtención de una relación, en principio hay que
diferenciar dos modos de proceder. En el primer caso, para cada
muestra se realizan dos ensayos diferentes y los resultados se
disponen en forma de proporción (relación) uno de otro. Para esta
relación se pueden determinar rangos de referencia y rangos
terapéuticos. En el segundo caso, en el mismo sistema de ensayo se
obtienen el resultado de una muestra del paciente y el resultado de
una mezcla de plasma normal, y se establece la relación. Un
procedimiento de este tipo existe, por ejemplo, para la
estandarización del tiempo de protrombina (PT), en el cual la
proporción de protrombina (PR) indica la relación del PT de una
muestra del paciente al PT de un plasma normal (PR =
PT_{paciente} / PT_{normal}).
Para otra estandarización de la relación de
protrombina (PR) se creó por la Organización Mundial de la Salud
(WHO) una tromboplastina de referencia con la cual se pueden
comparar las relaciones de protrombina obtenidas con otras
tromboplastinas, de manera que la PR obtenida se podía transformar
por cálculo en una relación internacional normalizada (INR). Como
medida de la sensibilidad de un reactivo de tromboplastina en
comparación con la sensibilidad del reactivo de tromboplastina del
WHO se introdujo un factor de corrección, el índice internacional de
sensibilidad (ISI), de manera que la INR se podía calcular según la
fórmula INR = PR^{ISI}. Para el reactivo de tromboplastina del
WHO, el valor de ISI se define con 1,0, de modo que INR = PR. Para
todas las demás tromboplastinas se indican los valores ISI por los
fabricantes.
A pesar de estos esfuerzos, en una serie de
ensayos de coagulación, por ejemplo en el tiempo de tromboplastina
parcial activado (TTPA), en el tiempo de trombina (TT), en el tiempo
de batroxobina (BT) o en el tiempo de ecarina (ECT) no es posible
hasta el momento una estandarización convincente. Ciertamente que en
el pasado hubo intentos de estandarizar el TTPA, análogamente al
tiempo de protrombina, estableciendo una relación entre el TTPA de
una muestra del paciente y el TTPA de un plasma normal, y se trató
de definir el rango terapéutico para la relación de TTPA en
1,5-2,5. No obstante, el procedimiento no se
consolidó nunca, puesto que también los valores estandarizados
(relación de TTPA) presentaban una varianza demasiado grande como
para garantizar una capacidad de comparación aceptable de los
resultados de las mediciones [Brill-Edwards, P.
et al., (1993) Establishing a therapeutic range for heparin
therapy. Ann. Intern Med. 119 (2), 104-109). De
forma alternativa, análogamente al cálculo de la INR, se intentó
establecer para el tiempo de protrombina una estandarización del
TTPA a través de un reactivo de referencia [Reed, S. V. et
al. (1994) An attempt to standardize the TTPA for heparin
monitoring, using the P.T. ISI/INR system of calibration. Results of
a 13 centre study. Thromb Res. 74 (5) 515-522; van
der Velde, E. A. & Poller, L. (1995) The TTPA monitoring of
heparin - the ISTA/ICSH collaborative study. Thromb Haemost.
73(1), 73-81]. Sin embargo, los resultados
fueron ampliamente desalentadores, puesto que, de igual modo, no se
pudo conseguir ninguna posibilidad de comparación aceptable de los
resultados de medición.
Particularmente problemática es la ausencia de
estandarización de los ensayos de coagulación en el control de
terapias con anticoagulantes. La problemática se va a exponer aquí a
modo de ejemplo, en el ejemplo del control de un tratamiento con
herparina con ayuda del TTPA.
La heparina inhibe inmediatamente y en función
de la dosis el sistema de coagulación. Se utilizan heparina no
fraccionada (UFH) así como heparinas de bajo pero molecular (LMWH).
Una terapia con heparina se efectúa en el caso de incidentes
tromboembólicos que ya han tenido lugar o que se presentan de forma
aguda. Una profilaxis con heparina debe impedir la aparición de
incidentes trombóticos. Como rangos terapéuticos tanto para la
terapia con heparina, así como también para la profilaxis con
heparina se indican habitualmente los niveles de heparina a ajustar
(en UI/ml). Así, para la terapia con heparina es válido un rango
terapéutico de 0,3 - 0,7 UI/ml y para la profilaxis con heparina, un
rango terapéutico de aproximadamente 0,05 - 0,25 UI/ml.
La terapia y profilaxis con heparina,
especialmente con heparina no fraccionada se puede controlar, por un
lado, con métodos que miden directamente el nivel de heparina y
también, por otro lado, con ensayos de coagulación que miden la
influencia de la heparina sobre la capacidad de coagulación de la
sangre.
La determinación directa del nivel de heparina
se efectúa, por ejemplo, a través de métodos denominados en base
del factor Xa o de métodos anti-Xa, en los que se
mide la actividad inhibidora del factor Xa de una muestra del
paciente. Este ensayo se puede estandarizar con ayuda de estándares
internacionales de heparina y proporciona, por lo tanto, un
resultado estandarizado comparable, en forma de un valor de la
concentración en unidades internacionales por mililitro (UI/ml).
Sin embargo, este método para la determinación del nivel de heparina
no se ha impuesto en el diagnóstico rutinario, puesto que el
sistema de ensayo necesario es caro y no se dispone de él en muchos
laboratorios.
De forma alternativa, hoy en día el control de
una terapia con heparina se lleva a cabo a través de la medición
del TTPA. En el caso del control de una terapia con heparina con
ayuda del TTPA se trata de dirigir la administración de heparina de
tal modo que se obtenga un resultado del TTPA en el rango
terapéutico. Puesto que en virtud de la varianza de los valores del
TTPA, dependiente del sistema de ensayo, no existe ningún rango
terapéutico estandarizado para los valores del TTPA, es necesario
determinar el rango terapéutico para cada sistema de ensayo. Para
la determinación del rango terapéutico del ensayo de TTPA para la
heparina no fraccionada existen fundamentalmente dos posibilidades
[Nelson, D. E. (1999) Current considerations in the use of the TTPA
in monitoring unfractionated heparin. Clin. Lab Sci. 12 (6),
359-64; Olson, J. D. et al (1998) College of
American Phatologists Conference XXXI on laboratory monitoring of
anticoagulant therapy: laboratory monitoring of unfractionated
heparin therapy. Arch Pathol Lab Med. 122 (9),
782-98]:
En el denominado procedimiento
ex-vivo se toman muestra de plasma de un
grupo de pacientes tratados con heparina. De cada muestra se
determina el nivel de heparina en UI/ml en un ensayo de factor Xa y
se determina el TTPA con un sistema de ensayo. A continuación, se
lleva a cabo una regresión lineal entre las dos tandas de datos
(nivel de heparina en UI/ml y TTPA en s). El rango terapéutico en el
sistema de ensayo del TTPA es el rango de valores que corresponde
al rango de concentraciones de heparina de 0,3 - 0,7 UI/ml (véase
también Ejemplo 1). El procedimiento ex vivo es
relativamente complejo y también caro. Presupone un mayor número de
muestras de pacientes y muestras normales disponibles, así como la
disponibilidad de un método basado en el factor Xa para la
determinación del nivel de heparina.
En virtud de la desventaja del método ex
vivo, anteriormente citada, se ha impuesto en la práctica de
laboratorio un denominado método in vitro. En este
procedimiento, para la determinación del rango terapéutico de un
ensayo del TTPA se añade a una mezcla de plasma normal (se adereza
con) cantidades estandarizadas de heparina y se determina el TTPA de
las muestras, así preparadas. Sin embargo, es imprescindible tener
en cuenta que una muestra in vitro (por ejemplo plasma normal
"aderezado" con heparina) comparada con una muestra ex
vivo con igual nivel de heparina puede conducir a otros tiempos
de coagulación. Por lo tanto, para la determinación del rango
terapéutico de un ensayo de TTPA con ayuda de un procedimiento in
vitro se tienen que tener en cuenta otros límites para el
contenido de heparina de las muestras de calibración. En las
publicaciones, un rango de concentraciones de heparina ex
vivo de 0,3 - 0,7 UI/ml se corresponde con un rango in
vivo de 0,2 - 0,4 UI/ml. El procedimiento in vitro para
la determinación del rango terapéutico del TTPA para la terapia de
heparina es un procedimiento aproximado con limitada fuerza de
expresión.
Hasta el momento, los ensayos para determinar
los TTPA, TT, BT y ECT proporcionan un tiempo de coagulación que
sólo se evalúa en segundos, dependiendo siempre el resultado del
sistema de ensayo local, es decir del reactivo, carga de los
reactivos, varianza de frasco a frasco, realización del ensayo,
automatización, aparatos de medida, procedimiento de medida y
procedimientos de evaluación. Por lo tanto, apenas existe una
capacidad de comparación de los resultados del ensayo.
La presente invención tenía por objeto, por lo
tanto, poner a disposición un procedimiento in vitro que
hiciera posible la estandarización de los ensayos de coagulación y
garantizara por consiguiente la capacidad de comparación global de
los valores de ensayo que se obtuvieron con ayuda de sistemas de
ensayo diferentes (locales).
La solución conforme a la invención consiste en
la puesta a disposición de los objetivos y procedimientos descritos
en las reivindicaciones.
Bajo la expresión "tiempo de coagulación"
se debe entender en el sentido de la presente invención el resultado
de un ensayo de coagulación in vitro, en el cual se mide el
espacio de tiempo desde la adición a la muestra o a una mezcla de
muestras de un reactivo activador y/o de iones Ca^{2+} hasta la
formación perceptible de un coagulo de fibrina en segundos (s) o,
siempre que se utilice un sustrato cromógeno, el espacio de tiempo
desde la adición a la muestra de un reactivo activador y/o de iones
Ca^{2+} hasta alcanzar una variación definida de la velocidad de
absorción. La utilización de un sustrato cromógeno se conoce, por
ejemplo, en el caso de métodos para la determinación del PT (véase
por ejemplo documento EP 14 039 A1).
El procedimiento conforme a la invención
posibilita la determinación de un tiempo de coagulación
estandarizado de una muestra, transformando el tiempo de
coagulación de la muestra (resultado primario del ensayo, valor
real) en un tiempo de coagulación estandarizado (resultado
estandarizado del ensayo, valor nominal) mediante una curva de
calibración (curva de referencia).
Se prefiere particularmente un procedimiento
para la determinación de un tiempo de coagulación estandarizado del
grupo del tiempo de protrombina (PT), tiempo parcial de
tromboplastina activada (TTPA), tiempo de trombina (TT), tiempo de
batroxobina (BT) y tiempo de ecarina (ECT).
Para el trazado de la curva de calibración es
necesaria la disponibilidad de al menos dos calibradores, habiéndose
fijado antes para cada calibrador un tiempo de coagulación estándar
en segundos (s). El número de calibradores que se puede emplear no
está limitado hacia arriba.
La fijación del tiempo de coagulación estándar
de un calibrador se puede hacer de diferentes maneras. Una
posibilidad es determinar el tiempo de coagulación estándar de un
calibrador en una sola pasada de un ensayo de coagulación,
efectuándose esta pasada del ensayo bajo las condiciones definidas
de un sistema de ensayo de coagulación específico, local, es decir
que el tiempo de coagulación estándar se mide utilizando un reactivo
activador específico, una carga específica de reactivo en un
aparato de medida específico. Por ejemplo, es posible la
utilización de una carga específica del reactivo del TTPA para
determinar el TTPA de un calibrador y la correspondencia del TTPA,
medido bajo estas condiciones específicas, como tiempo de
coagulación estándar TTPA. Otra posibilidad es determinar el tiempo
de coagulación estándar de un calibrador hallando el promedio de un
gran número de resultados de un ensayo de coagulación. De forma
preferida, se utilizan para ello diferentes cargas de activador.
Pero también se pueden utilizar tipos alternativos de cargas del
activador tales como, por ejemplo, diferentes activadores del TTPA
(caolín o ácido elágico o sílice, etc.) A partir de los tiempos de
coagulación medidos en las pasadas individuales del ensayo se
calcula después, por ejemplo, el valor medio y se le asigna al
calibrador como tiempo de coagulación estándar. Preferentemente, los
tiempos de coagulación estándar de todos los calibradores que se
han de utilizar para el trazado de una curva de referencia se fijan
y se asignan de la misma manera.
Para el trazado de la curva de referencia se
utiliza preferentemente un equipo (kit) de calibradores que se
distinguen por los diferentes potenciales hemostáticos y, con ello,
por diferentes tiempos de coagulación estándar. Otro "kit"
preferido contiene un único calibrador (calibrador patrón) con un
tiempo de coagulación estándar, fijo, definido, el cual se diluye
con diferentes volúmenes de un líquido de dilución, por ejemplo una
solución tampón, por lo que se pueden preparar una serie de
calibradores que se distinguen igualmente por diferentes
potenciales hemostáticos. Preferentemente, el líquido de dilución
está contenido junto con el calibrador patrón en un "kit"
conforme a la invención.
El trazado de la curva de calibración tiene
lugar determinando los tiempos de coagulación de los calibradores
en el mismo sistema de ensayo local que el tiempo de coagulación de
una muestra que se ha de determinar. Por la correspondencia de los
tiempos de coagulación de los calibradores, determinados con
anterioridad, con los respectivos tiempos de coagulación medidos, e
interpolación o, respectivamente, extrapolación, se traza una curva
de referencia en la que, por ejemplo, en el eje X se indica el
tiempo de coagulación estándar (valor nominal) y en el eje Y el
tiempo de coagulación medido (valor real). Con ayuda de la curva de
referencia el tiempo de coagulación medido de una muestra se
transforma en un tiempo de coagulación estandarizado.
De modo particularmente preferido, se utilizan
calibradores que disponen de la misma matriz que la muestra, cuyo
tiempo de coagulación ha de ser estandarizado. El presente
procedimiento se adecua especialmente para la estandarización de
los tiempos de coagulación de muestras de plasma, de origen humano o
animal, las cuales pueden estar mezcladas con citrato. Por este
motivo, se prefieren calibradores que se fundamentan igualmente en
base de plasma, preferentemente en base de una mezcla de plasma,
pudiendo tratarse en este caso, por ejemplo, de mezclas de plasma
humano y plasma no humano. Por mezcladura de plasma humano con
diferentes proporciones de, por ejemplo, plasma de conejo y/o
plasma bovino y medición del tiempo de coagulación de una mezcla de
plasma de este tipo, el experto en la materia puede preparar
calibradores para su utilización en el procedimiento conforme a la
invención. Los calibradores de plasma pueden contener, además,
sustancias que se utilicen habitualmente en la preparación de
calibradores o controles de plasma. A ellas pertenecen, por ejemplo,
sustancias tampón tales como, por ejemplo, TRIS o HEPES, sustancias
anticoagulantes tales como citrato, y estabilizantes tales como,
por ejemplo, dextrano, y conservantes tales como, por ejemplo, azida
sódica. Para su utilización en el procedimiento conforme a la
invención los calibradores se pueden preparar en estado líquido,
congelado o liofilizado.
Una forma de ejecución especial del
procedimiento conforme a la invención se refiere a la determinación
de un tiempo de coagulación estandarizado de una muestra que
contiene una sustancia que influye sobre el sistema de coagulación.
En este tipo de sustancias se puede tratar de sustancias que inhiban
la coagulación, las cuales le son administradas a un paciente en el
transcurso de una terapia anticoagulativa o, respectivamente, que
se ensayan en el marco de un examen clínico o en un trabajo de
investigación comparable para su empleo en una terapia
anticoagulativa. En este caso, puede tratarse, por ejemplo, de
medicamentos o sustancias activas como anticoagulantes tales como
las heparinas que abarcan heparinas de alto peso molecular (UFH) no
fraccionadas, heparinas de bajo peso molecular (NMH) fraccionadas,
heparinoides semi- o totalmente sintéticos (tales como, por
ejemplo, danaparoid u Orgaran®) o pentasacáridos tal como
fondaparinux; antagonistas de la vitamina K tales como, por
ejemplo, derivados de cumarina, o tromboinhibidores directos tales
como hirudina, argatroban o melagatran. Además, se puede tratar de
inhibidores del factor Xa, naturales o sintéticos, pudiendo
utilizarse también en el caso de muchos inhibidores naturales del
factor Xa las variantes recombinantes. Ejemplos de inhibidores
naturales del factor Xa, que por lo demás se aíslan frecuentemente
de la saliva de animales hematófagos, son antistasin, un
polipéptido de la sanguijuela mejicana Haementeria
officinalis, el péptido anticoagulante Tick, un polipéptido de
la garrapata blanda Ornithodorus moubata, Yagin, un
polipéptido de la sanguijuela Hirudo medicinalis o draculin
del murciélago vampiro Desmodus rotundus. Los inhibidores
sintéticos del factor Xa pertenecen a distintas clases y se
diferencian en inhibidores diamidínicos e inhibidores dibásicos de
FXa, inhibidores mono-benzamidínicos de FXa e
inhibidores no-benzamidínicos de FXa. En la
determinación del tiempo de coagulación de muestras de pacientes
tratados con anticoagulantes se trata, entre otras cosas, de
determinar si la concentración del anticoagulante en sangre o plasma
del paciente se encuentra en el rango terapéutico.
Para la estandarización del tiempo de
coagulación de estas muestras anticoaguladas se recomienda la
utilización de un calibrador, el cual contiene una cantidad
definida de una sustancia anticoagulante, que manifiesta in
vitro una función anticoagulante. Para la estandarización del
tiempo de coagulación de muestras de, por ejemplo, pacientes
tratados con heparina se recomienda la utilización de un calibrador
al que se ha "aderezado" con una cantidad definida de
heparina. Preferentemente, un calibrador de este tipo presenta una
concentración de heparina comprendida entre 0,1 y 1,0 UI/ml.
Los siguientes ejemplos de ejecución sirven para
ilustrar el procedimiento conforme a la invención y no se deben
entender como una limitación.
Ejemplo
1
Se utilizaron muestras de plasma de pacientes
tratados con heparina y una mezcla de plasma normal. Para cada
muestra se determinó un nivel de heparina en UI/ml frente a un
adecuado estándar de heparina, en un ensayo de factor Xa (Heparina
Berichrom®, Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Alemania). Además,
se determinó el TTPA de cada muestra utilizando un reactivo
activador (fosfolípidos y ácido elágico, reactivo Dade® Actin® FSL,
Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Alemania) de la misma carga. Los
resultados de estas mediciones se exponen en la Tabla 1.
Con ayuda de Software Microsoft® Excel Versión
97 SR-2 (Microsoft Corporation, Redmond, EE.UU.) se
llevó a cabo una regresión lineal de los dos conjuntos de
datos:
TTPA [s] = a x
heparina [UI/ml] +
b
a =
58,47
b= 40,39
Con ayuda de las rectas de igualación se
determinó el rango de valores del TTPA que corresponde al rango
terapéutico generalmente conocido del nivel de heparina ex
vivo de 0,3 - 0,7 UI/ml:
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, el rango terapéutico de los
valores de TTPA abarcaba desde 57,9 a 81,3 segundos.
\newpage
Ejemplo
2
Calibrador
1
Se tomó el plasma de 20 pacientes sanos en 3,2%
de citrato de sodio, se mezcló, se tamponó con tampón HEPES 50 mM
(pH 7,5), se estabilizó con adecuados estabilizantes, se envasó en
alícuotos de 1 ml y se liofilizó. Para su utilización, el
calibrador se reconstituye con 1 ml de agua bidestilada.
Calibrador
2
A una solución de estabilizador adecuada se
añadió una cantidad definida de heparina no fraccionada (Liquemin®,
Roche Deutschland Holding GmbH, Grenzach-Wyhlen,
Alemania) de manera que se alcanzó un concentración final de 0,6
UI/ml. Con ayuda de un ensayo de factor Xa, calibrado con heparina
estándar internacional (Heparina Berichrom®, Dade Behring Marburg
GmbH, Marburg, Alemania), se determinó la actividad de la heparina
de la solución de heparina en un aparato de medidas de coagulación
automático. El ensayo del factor Xa se calibró con un estándar
internacional de heparina. La solución de heparina se envasó en
alícuotos de 1 ml y se liofilizó. Para su utilización se
reconstituyó el calibrador con 1 ml de agua bidestilada.
Para la determinación del TTPA estándar de los
dos calibradores, se determinó el TTPA de cada plasma utilizando un
reactivo activador (fosfolípidos y ácido elágico, reactivo Dade®
Actin® FSL, Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Alemania) de la
misma carga y en el mismo aparato de medidas de coagulación
(analizador de coagulación BCS®, Dade Behring Marburg GmbH, Marburg,
Alemania). Se determinaron los siguientes valores de TTPA:
\vskip1.000000\baselineskip
El valor de TTPA se asignó entonces al
respectivo calibrador como TTPA estándar discreto (valor
nominal).
Ejemplo
3
Los TTPA de los dos calibradores (véase Ejemplo
2) y de las muestras de plasma de pacientes tratados con heparina
se determinaron utilizando un reactivo activador (fosfolípidos y
ácido elágico, reactivo Dade® Actin® FSL, Dade Behring Marburg
GmbH, Marburg, Alemania) con una carga arbitraria, en un aparato de
medida de coagulación arbitrario.
A partir de la correspondencia del TTPA estándar
determinado con anterioridad (valor nominal) y del TTPA medido
paralelamente a las muestras de plasma (valor real) resultaron para
los dos calibradores los siguientes pares de valores:
\vskip1.000000\baselineskip
Por expoliación de los dos pares de valores se
trazó una curva de referencia (Fig. 1)
Entonces, con ayuda de esta curva de referencia
se transformaron los valores del TTPA primarios, medidos, de las
muestras de plasma, en valores de TTPA estandarizados (véase Tabla
5). El trazado de la curva de referencia, así como también la
transformación de los valores de medida se llevó a cabo
automáticamente por medio del aparato de medida de coagulación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Los TTPA de los dos calibradores (véase Ejemplo
2) y de las muestras de plasma de los pacientes tratados con
heparina se determinaron utilizando cuatro cargas diferentes de un
reactivo activador (fosfolípidos y ácido elágico, reactivo Dade®
Actin® FSL, Dade Behring Marburg GmbH, Marburg, Alemania) en un
aparato de medida de coagulación. Conforme al Ejemplo 3, cada valor
de medida dependiente de la carga de una muestra se transformó en
un valor de TTPA estandarizado con ayuda de la curva de calibración
en función de la carga. Las concentraciones de heparina de las
muestras de los pacientes se determinaron en un ensayo de factor Xa
(véase Ejemplo 1).
Finalmente, tanto para los valores de TTPA
medidos, como también para los valores de TTPA estandarizados se
determinó el rango de valores de TTPA que corresponde al rango
terapéutico del nivel de heparina ex vivo de 0,3 - 0,7 UI/ml
(véase Ejemplo 1) generalmente conocido.
Antes de la estandarización de los valores del
TTPA los límites superiores de los rangos terapéuticos discrepan
unos de otros, de carga a carga, hasta en un 35%. Después de la
estandarización de los valores del TTPA los límites superiores de
los rangos terapéuticos ya sólo discrepan unos de otros, de carga a
carga, en un 4%. El procedimiento conforme a la invención hace
posible una unificación de los rangos terapéuticos, por lo que los
resultados de diferentes sistemas de ensayo después de la
estandarización son comparables directamente entre sí.
Claims (12)
1. Procedimiento para la determinación de un
tiempo de coagulación estandarizado de una muestra,
caracterizado porque
- a)
- en el mismo sistema de ensayo local que el de la muestra a determinar se miden los tiempos de coagulación de al menos dos calibradores, para los cuales se fijaron antes tiempos de coagulación estandarizados, discretos, y
- b)
- el tiempo medido de coagulación de la muestra se transforma en un tiempo de coagulación estandarizado con ayuda de una curva de calibración, que se trazó a partir de la correspondencia de los tiempos de coagulación estándar fijados con anterioridad y los tiempos de coagulación de los calibradores medidos en el sistema de ensayo local.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 para
la determinación de un tiempo de coagulación estandarizado del
grupo de tiempo de protrombina (PT), del tiempo parcial de
tromboplastina activada (TTPA), del tiempo de trombina (TT), del
tiempo de batroxobina (BT) y del tiempo de ecarina (ECT).
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
2 para la determinación de un tiempo de coagulación estandarizado
de una muestra de plasma.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
3, caracterizado porque los calibradores se utilizan en base
de plasma.
5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque los calibradores se utilizan en base
de una mezcla de plasma.
6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque se utilizan calibradores que
contienen plasma humano o una mezcla de plasma humano y plasma no
humano.
7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
6 para la determinación de un tiempo de coagulación estandarizado
de una muestra que contiene una sustancia que influye sobre el
sistema de coagulación.
8. Procedimiento según la reivindicación 7 para
la determinación de un tiempo de coagulación estandarizado de una
muestra que contiene una sustancia inhibidora de la coagulación.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque la muestra contiene una sustancia del
grupo heparina, heparinoides, hirudina, argatroban, melagatran, e
inhibidores naturales o sintéticos del factor Xa.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 8 y
9, caracterizado porque al menos un calibrador contiene una
cantidad definida de una sustancia inhibidora de la coagulación.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque después de la adición de heparina al
menos un calibrador presenta una concentración de heparina de 0,1 a
1,0 UI por ml.
12. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y
11, caracterizado porque la curva de referencia se traza con
ayuda de un procedimiento de interpolación o de extrapolación.
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